JP7252138B2 - 個別患者における炎症性疾患の治療に対する、スタチンの有効性を決定する方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明はまた、本発明の方法を実施するコンピューターソフトウェア、装置、イムノアッセイ、およびデバイスを提供する。
消散機序(resolution mechanisms)に関与できないことが、関節リウマチ、歯周病、喘息、糖尿病、および炎症性腸疾患(IBD)、さらには神経障害たとえばアルツハイマー病をはじめとする多くの慢性疾患に伴う持続性軽度炎症の根底にありうると、現在認識されている。
レゾルビン、プロテクチン、およびマレシンと称される特殊消散促進性メディエーター(specialised pro-resolving mediators)(SPM)のファミリーが発見されており、各々、自己限定炎症性白血球リッチ滲出物(self-limited inflammatory leukocyte-rich exudates)中に産生される。
それらの生合成メタボローム(metabolomes)は、急性炎症の消散期(resolution phase)に一時的にレギュレートされる。
すなわち、部位へのさらなる多形核白血球(PMN)動員を制限して(停止シグナルとして中止)、デブリ、細菌、およびアポトーシス細胞のマクロファージ取込みを増強する。
そのほか、各個別SPMは、プログラムされた消散内でさらなる特徴的性質を引き起しうる。
たとえば、レゾルビンRvE1は、歯周炎患者のヒトマクロファージの食細胞活性不全(failed phagocytic activities)をレスキューし、Dシリーズレゾルビン(すなわち、RvD1、RvD2、およびRvD5)は、宿主による細菌封込め(bacterial containment)を増強することにより、細菌の死滅およびクリアランスに必要とされる抗生物質の用量を低減する。
一方、マレシン(MaR)経路のマレシン1(MaR1)は、消散さらには組織再生を刺激し、そして、プロテクチンは、マウスにおいてウイルス複製を直接阻害することによりインフルエンザ感染症を改善する。
好中球-内皮細胞相互作用時におけるそれらの生合成は、内皮シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)により開始され、COX-2のS-ニトロシル化を介して、アトルバスタチンにより増加され、且つCOX-2阻害剤により低減された。
アトルバスタチンおよびRvTの作用は、マウスのE.コリ(E.coli)感染症において相加的であり、それらは、炎症の消散を加速して生存率を>60%増加させた。
これらの分子は、感染性炎症の消散において主要な先天性保護反応をレギュレートする。
この持続性炎症反応は、関節炎患者において心血管疾患(CVD)の発症リスクが増加する根本的原因であるとも考えられる。
これとの関連では、スタチンはCVDから保護し、最近の研究によれば、関節リウマチ患者において疾患活動性を低減することが示唆される。
この方法は、哺乳動物においてMHCクラスII発現をモジュレートするのに有効な量で、少なくとも1つのスタチンまたは機能的若しくは構造的に等価な分子を哺乳動物に投与することを含む。
哺乳動物は、I型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、または紅斑性狼瘡から選択される自己免疫疾患に罹患していてもよい。
たとえば、ランダム化プラセボ対照試験では、平均27%の相対リスク低減は3.4%の絶対リスク低減に等しい。
スタチン療法後の大きな残存リスクに対する可能な説明の1つは、ヒト集団内のスタチン反応性の不均一性でありうる。患者は、
(1)リポタンパク質代謝、主にLDL-C低減に及ぼすスタチンの効果、
(2)リポタンパク質反応に依存しないこともありうる、臨床イベント効果に関するスタチン療法に対する反応、および
(3)スタチンの使用に起因する有害作用、
の3つの点で異なりうる。
血中脂質レベルは、脂質およびコレステロールの経路において、分子の機能および活性を変化させる遺伝子変異体によりモジュレートされることが予想される。
スタチンの薬動学に影響を及ぼす、こうした遺伝子変異体などは、スタチンの反応性にも影響を及ぼしうる(Superko HR,Momary KM,Li Yら.Statins Personalized.Med.Clinics of N.Am.2012;96(1):123-139)。
本方法は、スタチンの投与前および投与後に、患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを測定することを含み、スタチン投与後のレゾルビンのレベルの増加がスタチンの有効性の指標となる。
一方、シンバスタチンを投与しても、有意なRvTのアップレギュレーションおよび関節炎症の低減はなかった。
また、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは各々、血小板-単球凝集体を含めた、全身性白血球活性化の低減(約25~60%)を起こすことも判明した。
これらのスタチンは、関節への好中球の輸送、さらには関節の単球マクロファージ数を減少させた。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、関節において、単球および単球由来マクロファージの両方で、CD11bおよび主要組織適合性複合体クラスII(MHCII)の発現において、著しい低減(~30~50%)を起こした。
RvT経路の開始酵素である、シクロオキシゲナーゼ(COX)-2の阻害剤を投与したところ、関節炎症および全身性炎症の両方に対するこれらのスタチンの保護作用が逆転した。
RvT1(7,13,20-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,18-ドコサペンタエン酸)、
RvT2(7,12,13-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、
RvT3(7,8,13-トリヒドロキシ-9,11,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、および
RvT4(7,13-ジヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)から選択しうる。
好適には、有機溶媒は、メタノールを含みうるかまたはそれからなりうる。
脂質メディエーターは、凍結サンプルで長期貯蔵したとき不安定であり、いくつかのメディエーターのレベルは、3ヶ月間の貯蔵後に有意に(>50%)低減することが判明しているが、驚くべきことに、メタノールおよび任意選択的に他の有機溶媒を用いることにより、-75℃以下の温度で長期貯蔵したとき、これらの分子の安定性を改善しうることを見いだした。
好適には、サンプルは約-80℃以下の温度で貯蔵しうる。サンプルは少なくとも約1ヶ月間、いくつかの実施形態では少なくとも約3ヵ月間から約9ヶ月間以上まで貯蔵しうる。
好適な標識標準は、
ジュウテリウム標識5S-HETE(5S-HETE-d8)、
ジュウテリウム標識ロイコトリエンB4(LTB4-d4)、
ジュウテリウム標識リポキシンA4(LXA4-d5)、
ジュウテリウム標識レゾルビンD2(RvD2-d5)、および
ジュウテリウム標識プロスタグランジンE2(PGE2-d4)である。
液体クロマトグラフィーを用いて測定される分子の保持時間は、機器固有であることが多いが、いくつかの実施形態では、上述した、13シリーズレゾルビンの保持時間は以下の表1に示される通りでありうる。
しかしながら、より便利には、サンプル中の、少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンのレベルは、イムノアッセイを用いて測定しうる。
イムノアッセイは、マイクロ流体デバイスまたは試験ストリップで実施するように小型化しうる潜在能力を有するので、臨床現場即時検査(ポイントオブケア)用途により適しうる。
したがって、イムノアッセイが組み込まれた本発明の実施形態は、個別の患者にスタチンを処方する助けとなるようにプライマリーヘルスケア提供者によりin situで使用しうる。
したがって、存在する特異的SPMの量は、特定の検出可能な性質を備えた標識の量に影響を及ぼすであろう。
当技術分野で周知のように、標識は、放射性標識、蛍光標識、または酵素を作用させたときに着色したり、蛍光を発したり、若しくは蛍光を許容したりする色素原性若しくは化学発光性の基質を有する酵素を含みうる。
いくつかの実施形態では、標識二次抗体を結合させることにより表面で結合した、13シリーズレゾルビンを定量するサンドイッチアッセイを使用しうる。
HRPに対する好適な基質は、当技術分野で周知であり、例としては、ABTS、OPD、AmplexRed、DAB、AEC、TMB、ホモバニリン酸、およびルミノールが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ELISAイムノアッセイを使用しえ、サンドイッチELISAアッセイがとくに好ましいこともある。
そのため、いくつかの実施形態では、少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンの量は、以上に記載したように、ホモジニアスまたはヘテロジニアスな方法により直接測定しうる。
代替的に、過剰に存在する既知量の抗体を用いて、サンプル中の、13シリーズレゾルビンを溶液中で捕捉し、次いで、表面に結合したSPMへの結合により残留抗体の量を決定して、元のサンプル中の13シリーズレゾルビンの量の間接リードアウトを与える。
他の一変形形態では、少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンと既知量の標識SPMとを表面結合抗体への結合に関して競合させうる。
たとえば、抗体またはSPMは、ウェル若しくはプレートの表面上また複数の磁気若しくは非磁気ビーズの表面上に固定しうる。
このイムノアッセイは、サンプル中の13シリーズレゾルビンをキャプチャーするために、表面上にコーティングされた、および/または、サンプル中の13シリーズレゾルビンへの結合により、検出可能に変化する標識でタグ付けされた、13シリーズレゾルビンに対する抗体、またはサンプルとの混合後に、13シリーズレゾルビンに対する抗体をキャプチャーするために、表面上に固定された、サンプル中の定量されるものと同一のある量の13シリーズレゾルビンを含む。
標識された13シリーズレゾルビンは、13シリーズレゾルビンに対する抗体により、好適な表面に親和性結合させうる。
サンプルを添加すると、ある割合の標識13シリーズレゾルビンは、表面結合抗体から変位することにより、サンプル中の13シリーズレゾルビンのレベルの尺度を提供しうる。
最初に、ある割合の抗体が、サンプル中の13シリーズレゾルビンに結合するように、溶液中でサンプルと抗体とを混合する。
次いで、表面結合13シリーズレゾルビンへの結合により、残留する非結合抗体の量を測定可能である。
好適な標識は上述されているが、好ましい実施形態では、標識は、酵素を作用させたときに、着色したり、蛍光を発したり、または蛍光を許容したりする色素原性または化学発光性の基質を有する酵素でありうる。
好適には、デバイスはラボオンチップ(lab-on-a-chip)を含みうる。
好適には、少なくとも反応ゾーンに隣接してチャネルを規定するデバイスの1つ以上の部分は、そのチャネルまたはさらなるチャネルの外部に配置された、好適な検出器、たとえば、フォトダイオードなどを用いて、13シリーズレゾルビンまたは一次抗体と二次抗体との反応の検出を可能にするために、少なくとも基質の色または蛍光を包含する波長の範囲内で光透明性でありうる。
したがって、各チャネルは、異なるそれぞれの固定化一次抗体または13シリーズレゾルビンを含みうる。
チャネルは反応ゾーンを含みうる。マイクロ流体デバイスは当業者に公知である。
マイクロ流体イムノアッセイまたはタンパク質診断チップマイクロアレイのレビューは、Chin et al.2012.Lab on a Chip.2012;12:2118-2134に提供される。
臨床現場即時検査(ポイントオブケア)で、ELISAイムノアッセイを行うのに好適なマイクロ流体デバイスは、Chan CD,Laksanasopin T,Cheung YK,Steinmiller D et al.“Microfluidics-based diagnostics of infectious diseases in the developing world”.Nature Medicine.2011;17(8):1015-1019(その内容は参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。
セリバスタチンは、約0.2~0.8mgの用量で患者に投与しうる。
フルバスタチンは、約10~80mg、好ましくは20~80mgの用量で患者に投与しうる。
ロバスタチンは、約5~60mg、好ましくは10~60mgまたは20~60mgの用量で患者に投与しうる。
メバスタチンは、約25mgまでの用量で患者に投与しうる。
ピタバスタチンは、約0.5~4mg、好ましくは約1mgまたは2mgの用量で患者に投与しうる。
プラバスタチンは、約20~80mg、好ましくは40~80mgの用量で患者に投与しうる。
ロスバスタチンは、約2.5~40mg、好ましくは約5~20mgまたは10~20mgの用量で患者に投与しうる。
シンバスタチンは、約2.5~40mg、好ましくは約5~20mgまたは10~20mgの用量で患者に投与しうる。
本方法は、スタチンの投与前および投与後に患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを、コンピューターで受け取ること、および、サンプル中の少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンのレベルを比較し、スタチン投与後の少なくとも1つのレゾルビンのレベルの増加がスタチンの有効性の指標となり、比較に基づいてスタチンの有効性を表す有効性データを出力するためにソフトウェアをコンピューターで実行することを含む。
この装置は、コンピューターが組み込まれた第1のデバイスと、第2のコンピューターと、それらの間でデータを送信する第1のデバイスと第2のコンピューターとの間の通信チャネルとを含み、第1のデバイスは、スタチンの投与前および投与後に患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受け取って、通信チャネルを介してサンプルデータを第2のコンピューターに送信するように配置され、且つ第2のコンピューターは、サンプル中の少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを比較して、個別の患者に対するスタチンの有効性を決定し(スタチン投与後の少なくとも1つの、13シリーズレゾルビンのレベルの増加が有効性の指標となる)スタチンの有効性を表す有効性データを出力するソフトウェアを実行するように配置される。
動物
Charles River(Kent,UK)から、雄C57BL/6マウス(11週齢)を調達した。すべての動物に標準的検査施設の食事および水を自由に提供し、12時間明/暗サイクルを維持した。
0および2日目に、マウスに、K/BxN血清(100μL、i.p.)を投与して、炎症性関節炎を惹起した。
次いで、3、5、および7日目に、i.v.注射を介して、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン(各0.2mg/Kg)、または媒体(0.05%エタノールを含有するDPBS-/-)をマウスに与えた。
26ポイント関節炎スコアリングシステムを用いて、臨床スコアを毎日モニターした。
Norling LV,Headland SE,Dalli Jら.“Proresolving and cartilage-protective actions of resolvin D1 in inflammatory arthritis”.JCI Insight.2016;1(5):e85922に記載のように、マウスの足首/手首、蹠、および指の腫脹および発赤を毎日検査した。
指定の時間インターバルで血液および足を採取した。
各500pgのジュウテリウム化(d)内部標準:d8-5Sヒドロキシエイコサテトラエン酸、d4-ロイコトリエン(LT)B4、d5-リポキシン(LX)A4、d4-プロスタグランジン(PG)E2、およびd5-レゾルビンD2を含有する氷冷メタノールを、サンプルに添加した。
Dalli Jら.2015(ibid)、Colas RAら.2014(ibid)、およびRathod KS,Kapil V,Velmurugan Sら.“Accelerated resolution of inflammation underlies sex differences in inflammatory responses in humans”.J Clin Invest.2017;127(1):169-182に記載のように、脂質メディエーターを抽出し、プロファイリングを行った。
ヘパリンライニングシリンジを用いて心臓穿刺により全血を採取した。FcブロッキングIgGおよび蛍光標識抗体と共に、細胞を、氷上で45分間インキュベートした。
細胞を洗浄し、0.1%Live/Dead染色液と共に、氷上で、30分間インキュベートした。
全血溶解試薬キットを用いて、赤血球細胞の溶解および固定を行った。
次いで、フローサイトメトリーアナライザーを用いて染色を評価し、好適なソフトウェアを用いて分析した。
簡潔に述べると、37℃のRPMI-1640(0.5μg/mLコラゲナーゼDおよび40μg/mL DNアーゼIを含有する)中で激しく攪拌しながら、足を30分間インキュベートした。
単離された細胞を、70μMストレーナーに通して、2U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、および10%FBSを含有するRPMI-1640中に懸濁させ、次いで、400×gで10分間遠心分離した。
単離された細胞を、0.02%BSAおよび1%FcブロッキングIgG(v/v)を含有するDPBS-/-中に懸濁させ、そして、0.1%Live/Dead染色液と共に氷上で20分間インキュベートした。
DPBS-/-を用いて細胞を洗浄し、蛍光標識抗体と共に氷上で45分間インキュベートした。次いで、これを洗浄し、そして、1%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。
絶対計数ビーズ(Absolute counting beads)を白血球計数に使用した。
次いで、フローサイトメトリーアナライザーを用いて染色を評価し、好適なソフトウェアを用いて分析した。
ロイヤルロンドン病院(Royal London Hospital)産科病棟の産科スタッフにより臍帯を採取し(East London and The City Health Authority Research Ethics Committee Number:06/Q0605/40により承認されたプロトコル)、Gittens BR,Wright RD,Cooper D.Methods for assessing the effects of galectins on leukocyte trafficking.Methods Mol Biol.2015;1207:133-151に記載のようにヒト臍静脈内皮細胞を単離した。
次いで、インターロイキン(IL)-1βおよび腫瘍壊死因子(TNF)-α(各10ng/mL、16時間、37℃、5%CO2)と共に細胞をインキュベートした。
結果は、平均±s.e.m.として表される。一元配置ANOVAと事後ダネット、シダック、またはテューキー多重比較検定とを用いて、GraphPad Prism7(GraphPadソフトウェア)により群間差を検定した。適宜、標準媒体と比較した1標本t検定または二元配置ANOVAを使用した。
統計的有意性の基準は、p<0.05であった。
炎症性関節炎時のアトルバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンによる局所および全身のRvTの示差的(Differential)レギュレーション
最初に、アトルバスタチンが、炎症性関節炎時に、RvT形成をレギュレートするか、およびこの作用がこのスタチンに特有であるかまたは他の臨床関連スタチン、すなわち、プラバスタチンおよびシンバスタチンと共有されるかを調べた。
これを試験するために、K/BxNマウスの関節炎誘発原性血清を、0および2日目に投与した。
この血清は、急速に発生する重症の炎症性関節炎を伴うFcγ媒介免疫反応をもたらす。
関節炎マウスの足において、DシリーズレゾルビンおよびRvTを含めて、4つすべての主要バイオ活性メタボロームのメディエーターが同定された(図1B、C)。
これらのメディエーターは、基準標準または合成標準に対する保持時間(図1B)およびColas RAら.2014(ibid)に記載のMS-MSの少なくとも6つのイオン(図1C)のマッチングを含めて既報の基準に従って同定された。
これらのマウスにおいて、RvT濃度の血漿中レベルも増加することが分かり、RvT1は、アトルバスタチンおよびプラバスタチンの両方で増加し、一方、RvT4は、アトルバスタチンでのみ増加した。
この目的のために、K/BxN血清を用いて関節炎を惹起し、そして、以上に記載のようにアトルバスタチンおよびプラバスタチンをマウスに与えた。
次いで、7日目の最後のスタチン投与の2時間後に血液を採取し、そして、LMプロファイリングを用いて脂質メディエーターの同定および定量を行った。
これらのマウスでは、PGD2およびPGE2を含めて、炎症誘発性エイコサノイドの循環量の減少が見いだされた。
また、媒体処置マウスと比較したとき、末梢血RvTの顕著な増加(>100%)も、プラバスタチンが与えられたマウスの血漿LMプロファイルの評価から実証され、RvT1は最も高い増加を示した(図1Eおよび1F)。
これらのマウスでは、循環PGD2の減少(~46%)および循環PGE2の減少(~29%)も観測された。
次いで、RvTを増加させる用量のアトルバスタチンおよびプラバスタチンが、関節炎症も低減するかを調べた。
関節炎を惹起し、マウスを処置し、そして、以上に記載のように、疾患進行をモニターした。
媒体が与えられたマウスにおいて、早くも2日目に疾患の徴候が観測され、疾患重症度は6日目に11.9±0.9のスコアを有して、最大に達し、その後、7日目に疾患活動性はプラトーに達した(図3A)。
こうした疾患活動性の低減は7日目まで持続した(図3A)。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの膝関節のヘマトキシリン・エオシン(H&E)染色切片は、媒体処置マウスと比較したとき、白血球浸潤、パンヌス形成、および関節損傷の低減を示したが、これらのパラメーターは、シンバスタチンが与えられたマウスでは不変であるように思われた(図3E)。
これらのスタチンが、炎症性関節炎において全身性炎症をレギュレートするか確認するために、関節炎マウスの末梢血中の血小板-白血球凝集体のレベルをこうしたヘテロタイプ凝集体および細胞活性化とCVDとの関係を考慮して評価した。
プラバスタチンが与えられたマウスの末梢血の白血球および血小板でも類似の知見が得られ、単球CD11b発現の低減(非古典的単球で~10%および古典的単球で~40%)、血小板白血球凝集体の低減(両方の単球サブセットで~35%および好中球で~25%)、およびCD62P発現の~70%の低減を伴う血小板活性化の低減を生じた(図4)。
シンバスタチンは、白血球CD11b発現を有意にレギュレートしなかったが、古典的単球と血小板とにより形成されるヘテロタイプ凝集体および血小板CD62P発現を低減させた(図4)。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、全身性炎症をレギュレートして、炎症性関節炎時に循環する単球、好中球、および血小板の活性化を減衰させることが、これらの結果から実証される。
媒体のみが与えられたマウスと比較したとき、こうした細胞上のCD11bの低減およびMHCII発現の著しい減少も見られた(図5A)。媒体処置マウスと比較したとき、アトルバスタチンを摂取したマウスにおいて、好中球の輸送が減少することが分かった(図5B)。
こうしたマウスでは、スタチン投与は、好中球のCD11b発現およびMHCII発現をダウンレギュレートするが、統計的有意性に達しないことが分かった(図5B)。
単球由来のマクロファージの数、さらには活性化マーカーCD11bおよびMHCIIの発現の有意な低下も、関節へのマクロファージ輸送の評価から実証さマイクロれた(図5C)。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンにより発揮される保護作用における、RvTの寄与を評価するために、次いで、RvT経路の開始酵素であるCOX-2の阻害がプラバスタチンおよびアトルバスタチンの保護作用を逆転するかを調べた。
セレコキシブ投与はまた、アトルバスタチンのみを摂取したマウスと比較したとき、循環血小板上のCD62P発現を増加させた(図7C)。
COX-2の阻害は、関節において白血球の輸送および活性化に及ぼすアトルバスタチンの作用を逆転し、炎症関節に動員される非古典的単球(図7D)、好中球(図7E)、および単球由来マクロファージ(図7F)の数を増加させた。
こうした白血球上の活性化マーカーの発現は、アトルバスタチンのみが与えられたマウスと比較したとき、セレコキシブ阻害後に増加した(図7D~F)。
ここで、COX-2阻害は、循環する白血球および血小板の活性化プロファイルを媒体のみを摂取したマウスで観測されるものに戻すことが分かった。
同様に、関節における白血球の輸送および活性化は、媒体処置マウスに見いだされるものに類似したレベルに増加した。
これらのSPMの組織中および血中の濃度のアップレギュレーションは、関節の疾患活動性さらには関節の白血球の輸送および活性化の低減に関連付けられた。
そのほか、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは両方とも、全身性炎症を低減し、血小板、単球、および好中球の活性化を低減した。
これらのスタチンの保護作用は、COX-2の阻害により逆転された。
注目すべきこととして、シンバスタチンは、RvTを増加させず、そして、関節疾患および白血球反応のレギュレーションの鈍化作用を示した。
関節および全身におけるこれらの消散促進性メディエーターの増加は、浮腫、白血球および血小板の活性化をはじめとする局所性および全身性の炎症の各種局面を弱める、こうした3つの各スタチンの能力に関連付けられた。
そのため、これらの結果から、関節炎において炎症をレギュレートするアトルバスタチンおよびプラバスタチンの新規な作用機序が立証されるとともに、患者において局所性および血管性の炎症を制御するスタチンの有効性を測定する新規な機能的バイオマーカーが提供される。
個別の患者において炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価する本発明に係る方法は、図8に例示される。
最初に、第1の好適な生物学的サンプルを患者から採取する(工程20)。
本実施例では、生物学的サンプルは血漿サンプルであるが、他の実施形態では、サンプルは、患者から採取された全血若しくは血清または好適な組織サンプルでありうる。
本発明によれば、医薬品として市販するためまたは臨床試験において治験医薬品(IMP)として使用するためのどちらかで使用が承認されているいずれかのスタチンを投与しうる。
その推奨された初回用量または維持用量に準拠してスタチンを投与しうる。好適には、その推奨初回用量に準拠してスタチンを投与しうる。
本実施例では、アトルバスタチンは10mgまたは20mgの用量で使用される。
しかしながら、他の実施形態では、異なるスタチンを使用しうる。
患者への投与量は、臨床診療に従って調整しうる。
本実施例では、規定の時間は2~3時間であるが、この場合も、異なる実施形態では他の時間を使用しうる。
時間は、スタチンの薬理学的効果を顕在化させるのに十分な程度に長くすべきである。
本実施例では、逆相液体クロマトグラフィーエレクトロスプレータンデム質量分析(LC-MS/MS)により、第1および第2のサンプル中の4つの13シリーズレゾルビン(RvT1、RvT2、RvT3、およびRvT4)のレベルを測定する。
本発明の異なる実施形態では、4つ未満の13シリーズレゾルビン、すなわち1つ、2つ、または3つの13シリーズレゾルビンを分析しうる。
第1および第2のサンプル中の13シリーズレゾルビンのレベルを定量する本方法の詳細は、Colas RAら.2014(ibid)およびDalliら.2015(ibid)(その内容は参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている。
ヘパリン処理血液の遠心分離(2000g、10分間)により血漿を得て、以下に記載の固相抽出前に、4体積のメタノール中に配置する。
次いで、サンプルを、-20℃で45分間保持して、タンパク質を沈殿させ、その後、遠心分離する(2000g、4℃、10分間)。
上清を採取し、37℃に設定された水浴および15psi以下の流量の窒素供給を備えた自動蒸発システムでメタノール含有量を温和な窒素ストリーム中1mL未満にする。次いで、サンプルを遠心分離する(2000g、4℃、10分間)。
次いで、37℃に設定された水浴および15psi以下の流量の窒素供給を備えた自動抽出システムにサンプルを配置し、以下のように産物を抽出する。
次いで、9mLのH2O(pH3.5、HCl)をサンプルに添加し、コンディショニングされたC18カラムに酸性化溶液を急速にロードし、4mLのH2Oで洗浄して酸を中和する。
次いで、5mLのヘキサンを添加し、9mLのメチルホルメートで産物を溶出させる。
自動蒸発システムを用いて産物を乾固させ、LC-MS/MS自動注入のためにメタノール-水(50:50vol/vol)中にただちに懸濁させる。
当業者であれば代替の好適なLC-MS/MS装置を利用可能である。
50℃に維持されたカラムオーブン内にC18カラムを保持し、溶媒Aとして、0.01%酢酸を含有する水と溶媒Bとして0.01%酢酸を含有するおよびメタノールとからなる移動相を用いて、RvT脂質メディエーターを溶出させる。
80:20(A:B)の移動相を用いて、カラムを平衡化し、12秒間にわたり、50:50(A:B)にランプさせる(ramped)。このグラジエントを2分間維持し、次いで、続く9分間にわたり80:20(A:B)にランプさせる(ramped)。
次いで、このグラジエントを、続く3.5分間にわたり維持し、その後、98:2(A:B)にランプさせる(ramping)。
最後に、このグラジエントを5.4分間維持してカラムを洗浄する。プロセス全体を通して流量を0.5mL/minに維持する。
スケジュール化MRMウィンドウは90秒間であり、各脂質メディエーターパラメーターは個別に最適化される。
一方、第1のサンプルと比較して、第2のサンプルのRvTレベルの増加がないのは、投与されたスタチンが、個別の患者に無効であることを示唆する(工程70)。
図9および10を参照して、本発明のさまざまな態様のさらなる例を以下に説明する。
この場合、マイクロ流体デバイス110に組み込まれたイムノアッセイは、患者Pから得られた血液サンプルB中の少なくとも1つの13シリーズレゾルビン(RvT)のレベルを測定するために使用される。
具体的には、マイクロ流体デバイス110は、チャネル検査および光学シグナル取得を可能にする、透明生体適合性エラストマーのポリジメチルシロキサン(PDMS)の少なくとも1つの層112を含み、ガラススライド114に結合する。
本実施例では、マイクロ流体デバイス110は、4つのマイクロチャネル120a~dを有し、その1つは、血液サンプルB中の異なるそれぞれのRvT(RvT1、RvT2、RvT3、RvT4)のレベルを測定する。
以上の実施例2の場合と同様に、本実施例の変形形態では、マイクロ流体デバイスは、4つ未満のマイクロチャネル、たとえば、対応する数のRvTのレベルを測定するために、1、2、または3つのマイクロチャネルを有しうる。
好適には、マイクロチャネル120a~dは、以下に記載のように、サンプルBおよびデバイスに添加された試薬の混合を促進するために、反応ゾーン150a~dにおいてサーペンタイン(serpentine)でありうる。
マイクロチャネル120a~dおよび入口ポート140a~dは、サンプルおよび試薬のフロー制御に好適なマイクロバルブを備える。
フォトダイオード175a~dは、第1のコンピューター200に接続された好適なインターフェース120に接続される。
インターフェース120は、フォトダイオード175a~dからシグナルを受信してそうしたシグナルを表すコンピューター可読データを第1のコンピューター200に送信するように配置される。
インターフェース120は、好適なデータケーブルにより、第1のコンピューター200に物理的に接続しうる。
代替的に、インターフェース120は、たとえば、Bluetooth(登録商標)などのいずれかの好適な無線データ転送方法により、第1のコンピューター200に無線で接続しうる。
いくつかの実施形態では、第1のコンピューターは、ハンドヘルドデバイスを含みうる。
第1のコンピューター200がハンドヘルドデバイスである場合、ソフトウェアはアプリケーションでありうる。
本実施形態では、データ通信チャネル300はインターネットを含むが、他の実施形態では、第1および第2のコンピューター200、400は、ローカルまたはワイドエリアネットワークで相互接続しうる(図示せず)。
第1および第2のコンピューター200、400は、データ通信ケーブルを介して互いに物理的に接続しうるか、またはたとえばIEEE802.11a,b,g,nやBluetooth(登録商標)などの好適な無線データ通信技術を用いて、無線で相互接続しうる。
好適には、第1および第2のコンピューター200、400の各々は、好適なモデムを介してインターネット300に接続される。
サンプルBは、マイクロ流体デバイス110のサンプル入口ポート125に配置される。
サンプルは、毛管作用によりマイクロチャネル120a~dに吸い込まれる。
代替実施形態では、サンプルBは、マイクロポンプを用いてまたは減圧下などでマイクロチャネル120a~dに能動的に吸い込みうる。
異なるRvTは、各反応ゾーン150a~dでキャプチャーされる。
サンプルBは、好適な時間にわたり、反応ゾーンで抗体と共にインキュベートされる。
次いで、洗浄溶液をマイクロチャネル120a~dに導入して、非結合サンプルを除去する。
マイクロチャネル120a~dから廃棄された物質は、ドレイン130を介してデバイス110から除去される。
第2の抗体の各々は、当業者に周知の方法により、ホースラディッシュペルオキシダーゼでタグ付けされる。
第2のモノクローナル抗体は、反応ゾーン150a~dの表面にキャプチャーされたRvTと共にインキュベート可能である。
次いで、マイクロチャネル120a~dは、再び洗浄される。
好適な基質は、当業者に公知であるが、本実施例では、ホースラディッシュペルオキシダーゼを作用させたときに蛍光を発するルミノールを使用する。
蛍光は、インターフェース180により受信されるシグナルを発生する、フォトダイオード175により検出される。
蛍光の強度は、チャネル120a~dの各々において固定化されたRvTに結合される第2の抗体の量の指標となる。
マイクロ流体デバイス110は、マイクロチャネル120a~dの各々のRvTレベルを定量できるように当業者に公知の方法で検量しうる。
好適には、スタチンは、その推奨された初回用量または維持用量に準拠して投与される。
スタチンの投与の詳細は以上に記載されるので、ここでは繰り返さない。
第2のサンプル中のRvTレベルを同じように測定し、レベルを表すデータを計算して第1のコンピューター200により記憶する。
第2のサンプル中のRvTレベルが第1のサンプルと比べて増加している場合、スタチンは、患者Pにおいて炎症性障害を治療するのに有効であると評価され、このことを示すデータは、第2のコンピューターから第1のコンピューター200に返信され、その保存および/または試験者への表示が行われる。
第1および第2のサンプル中のRvTレベルの比較の結果に基づいて、患者にスタチンを処方しうる。
一方、第2のサンプル中のRvTレベルが第1のサンプル中のレベルと比べて有意に増加していない場合、スタチンは、患者Pにおいて炎症性病態を治療するのに有効でないと評価される。
次いで、たとえば、翌日に異なるスタチンを用いて試験を繰り返しうる。
しかしながら、本発明の変形形態では、マイクロ流体デバイスは、ホモジニアスイムノアッセイおよび/または競合イムノアッセイを行うように配置しうる。
反応ゾーン150a~dとサンプル採取ポート125との間の各マイクロチャネル120a~dでは、サンプルBとそれぞれのRvTに対する既知量の一次抗体とを混合しうる。
一次抗体は過剰に提供され、その後、続いて、残留抗体は、サンプル中の対応するRvTと効果的に競合して、反応ゾーン150a~dの表面結合RvTと反応するであろう。
洗浄後、それぞれの一次抗体に特異的な入口ポート140a~dを介して、標識二次抗を各反応ゾーン150a~dに導入する。
以上に記載したように、二次抗体は、EIAに使用するのに好適な酵素、たとえば、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどでタグ付けされる。
次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼに対する好適な基質を、反応ゾーン150a~dに導入して、以上に記載のように蛍光または色の強度を測定することにより、サンプルとの反応後に残留する二次抗体の量を測定可能である。
ヒト血清をスナップ凍結して窒素下で貯蔵するか(以下の方法1)またはジュウテリウム標識内部標準を含有するメタノール中に配置するか(方法2)のどちらかを行った。
図11に示されるインターバルで、脂質メディエーターを抽出して、指定の産物の濃度を決定した。次いで、これらと追加の処理を行うことなく、サンプルをスナップ凍結したときの既報の値(参照)とを比較した。結果は、n=1つの実験および3つの決定値の平均であり、図11に例示される。
a)適切な方法に従って血清を調製する。
b)血清を採取して適切な容器に移す。
c)適切な時間にわたりチューブを窒素でパージして血清の上のヘッドスペースの空気を窒素で置き換える。注:この工程は、サンプルを室温超の温度に暴露することなくサンプル採取直後に実施する必要がある。
d)凍結するまで液体窒素中に配置することによりサンプルをただちにスナップ凍結する。
e)チューブを適切な容器に移して-80℃以下で貯蔵する。注:いずれの時点でもサンプルの解凍および再凍結を行なわない。
a)各1mLの血清に対して、メタノールを調製するために、各500pgのジュウテリウム標識内部標準を、4mlの質量分析グレードのメタノールに添加する。
b)使用前少なくとも1時間、-20℃で貯蔵する。
c)適切な方法に従って血清を調製する。
d)血清を採取して、適切な容器に移す。
e)1mLの血清に対してジュウテリウム標識内部標準を含有するメタノール4mLを添加する。
f)サンプルをただちに処理する場合、脂質メディエーター抽出前少なくとも45分間、これらを-20℃で置く。
g)サンプルを貯蔵する場合、これらを-80℃以下で貯蔵する。
Colas RAら.2014(ibid)。
Claims (18)
- 個別の患者において炎症性病態の治療において使用されるスタチンの有効性を評価するための方法であって、前記スタチンの投与前および投与後に前記患者から得られた生物学的サンプル中の、RvT1(7,13,20-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,18-ドコサペンタエン酸)、RvT2(7,12,13-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、RvT3(7,8,13-トリヒドロキシ-9,11,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、およびRvT4(7,13-ジヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)から選択される、少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを測定することを含み、前記スタチンの投与後の前記レゾルビンの前記レベルの増加が前記スタチンの有効性の指標となる、方法。
- 前記生物学的サンプル中の2つ以上の前記13シリーズレゾルビンの前記レベルが測定される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプル中の3つまたは4つすべての前記13シリーズレゾルビンの前記レベルが測定される、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが血液、血清、または血漿のサンプルである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプル中の前記少なくとも1つの13シリーズレゾルビンの前記レベルが、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)を用いて測定される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の内部標識標準が前記サンプルに添加され、且つ定量が前記1つ以上の標識標準を用いて構築された線形回帰曲線を用いて行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記サンプル中の前記少なくとも1つの13シリーズレゾルビンの前記レベルが、イムノアッセイを用いて測定される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イムノアッセイが酵素イムノアッセイ(EIA)である、請求項7に記載の方法。
- 前記イムノアッセイが競合的または非競合的である、請求項7または請求項8に記載の方法。
- 前記スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンから選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スタチンの投与後に患者から得られたサンプルが、前記スタチンの投与の少なくとも30分間後に採取しうる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スタチンの投与後に患者から得られたサンプルが、前記スタチンの投与の少なくとも1時間後に採取しうる、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スタチンの投与後に患者から得られたサンプルが、前記スタチンの投与の少なくとも2時間後に採取しうる、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記炎症性病態が心血管疾患(CVD)または関節リウマチである、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 個別の患者において炎症性病態の治療に使用される、スタチンの有効性を評価するコンピューター実装方法であって、前記方法が、前記スタチンの投与前および投与後に前記患者から得られた生物学的サンプル中の、RvT1(7,13,20-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,18-ドコサペンタエン酸)、RvT2(7,12,13-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、RvT3(7,8,13-トリヒドロキシ-9,11,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、およびRvT4(7,13-ジヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)から選択される、少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータをコンピューターで受け取ることと、
前記サンプル中の前記少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを比較(前記スタチンの投与後の前記少なくとも1つのレゾルビンのレベルの増加が、前記スタチンの有効性の指標となる)し、そして、前記比較に基づいて、前記スタチンの有効性を表す有効性データを出力するために、ソフトウェアを前記コンピューターで実行することと、を含む、方法。 - コンピューターによる実行時に、請求項15に記載の方法を前記コンピューターに行わせる命令を含むコンピュータープログラム。
- 個別の患者において、炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価するコンピューター装置であって、前記装置が、コンピューターが組み込まれた第1のデバイスと、第2のコンピューターと、それらの間でデータを送信する前記第1のデバイスと前記第2のコンピューターとの間の通信チャネルと、を含み、前記第1のデバイスが、前記スタチンの投与前および投与後に前記患者から得られた生物学的サンプル中の、RvT1(7,13,20-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,18-ドコサペンタエン酸)、RvT2(7,12,13-トリヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、RvT3(7,8,13-トリヒドロキシ-9,11,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)、およびRvT4(7,13-ジヒドロキシ-8,10,14,16Z,19Z-ドコサペンタエン酸)から選択される、少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受け取って、前記通信チャネルを介して前記サンプルデータを前記第2のコンピューターに送信するように配置され、且つ前記第2のコンピューターが、前記サンプル中の前記少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルを比較して、前記個別の患者に対する前記スタチンの有効性を決定し、前記スタチンの投与後の前記少なくとも1つの13シリーズレゾルビンのレベルの増加が有効性の指標となり、前記スタチンの有効性を表す有効性データを出力するソフトウェアを実行するように配置される、コンピューター装置。
- 前記第2のコンピューターが、前記通信チャネルを介して、前記有効性データを前記第1のデバイスにまたは第3のコンピューターに送信するように配置される、請求項17に記載のコンピューター装置。
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