JP7457112B2 - ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製のための酵素的方法 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
［発明の分野］
本発明は、低コスト基質であるウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄグルコサミンから、固定化された、または好ましくは共固定化された酵素を用いて、単一反応混合物において、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄグルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）を生成するための、酵素触媒工程に関する。さらに、前記工程を、サッカリド、特にヒト乳オリゴサッカリド（ＨＭＯ）、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、特に抗体、または糖ペプチド、およびバイオコンジュゲート、特に炭水化物コンジュゲートワクチン、および抗体－薬物コンジュゲートを含むＧｌｃＮＡｃ化（ＧｌｃＮＡｃｙｌａｔｅｄ）分子、および生体分子を生成するために適合させてもよい。
［発明の背景］
ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）は、多くの生物工学的適用および食品技術にとって重要な基質である。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃは、炭水化物ワクチンの生産のために、および個別化医療の成長分野において、すなわち薬物送達用のグリコナノ材料の調製のために必要である。さらに、モノクローナル抗体および他の組換えタンパク質のコア構造をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で構築するために、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃは、広く必要とされている。乳児用食品（ヒト乳）において、Ｎ－アセチルグルコサミン官能基化オリゴ糖は、ヒト乳オリゴ糖の重要な成分を含むためため、乳幼児向けの合成的に生産された乳製品にＧｌｃＮＡｃ化糖を含めることは高い需要がある（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３２（２０１６）６２～７０）。しかしながら、（年間当たりトンのオーダーでの）ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの需要が高いにもかかわらず、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの入手可能性は研究者にとってさえ非常に制限される。これまで、低エンドトキシンＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの価格は１グラムあたり１，５００ユーロを超える。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの価格が高いために、基礎および応用研究活動が妨げられるだけでなく、工業的応用も妨げられる。
ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを合成するためのバイオプロセス工学戦略は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）工程およびインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）工程に分類されることができ、５段階工程におけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの化学合成は、わずか１５％の収率に達している。微生物は、微生物の代謝の一部として、細胞内または細胞外のいずれかでＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生成するために代謝的に操作される。しかしながら、低収量、高レベルの不必要な副産物、細胞株設計に必要な時間、および複雑なスケールアップは欠点である。特に乳児食にとって規制面を考慮すると、遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の適用は、承認工程を大幅に遅らせる可能性がある。
逆に、酵素的合成は、より高い収率を有する。例えば、Ｚｈａｏらは（Ｚｈａｏ，Ｇ．，Ｇｕａｎ，Ｗ．，Ｃａｉ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｇ．，２０１０，ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ、それらの類似体、およびＧＤＰ－フコースの分取－スケール合成への酵素的経路（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ－ｓｃａｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ， ｔｈｅｉｒ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｎｄ ＧＤＰ－ｆｕｃｏｓｅ），Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５，６３６）、３つの酵素であるＮ－アセチルヘキソサミンキナーゼ（ＮａｈＫ）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンジホスホリラーゼ（ＧｌｍＵ）、および無機ジホスファターゼ（ＰｍＰｐＡ）を使用して、ＵＤＰ－ＧｌｃＮａｃ／ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、およびそれらの誘導体を、分取スケールで１０％～６５％の収率で生成した。Ｃｈｅｎらは（Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｔｈｏｎ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｙｕ，Ｈ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｌａｕ，Ｋ．，Ｑｕ，Ｊ．，Ｈｉｅ，Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，２０１１，ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ誘導体のワンポット３酵素合成（Ｏｎｅ－ｐｏｔ ｔｈｒｅｅ－ｅｎｚｙｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４７，１０８１５－１０８１７）は、同じ酵素を用いて８１％の収率を得ることを達成した。Ｓｈａｏらは（Ｓｈａｏ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｎａｈａｌｋａ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｇ．，２００２，アガロースビーズに共固定化された複数の酵素によるウリジン５’ジホスフェートＮ－アセチルグルコサミンの生体触媒合成（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｒｉｄｉｎｅ ５’ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃｏ－ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８６－２５８７）、７８％の最大収率でＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生成するために５つの固定化酵素を使用した。彼らの研究において、ＡＧＸ１（ＧｌｍＵの哺乳類型）およびＧｌｍＵを、一緒に使用して、ＧｌｃＮＡｃ－１－ホスフェートのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃへの収率を増加させた。ＡＤＰからのＡＴＰの再生を、ホスホエノールピルビン酸を使用してピルビン酸キナーゼによって行った。これらの酵素を、ウリジン５’－ジホスフェートＮ－アセチルグルコサミンの合成のためにＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズに共固定化した。酵素をロードされたＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズを、繰り返し使用したが、しかしながら、酵素は、反応中に酵素活性を失った。２０時間の反応サイクルを５回行った後、わずか５０％の生成物の収率を達成することができた。さらなる酵素的分析は、ＧｌｃＮＡｃホスフェートムターゼがビーズ上で最も安定性の低い酵素であり、そのことは全体的な収量の減少が観察された主な理由になることを明らかにした。反応において精製Ａｇｍ１の添加は、活性全体を部分的に回復することができ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの収率を７８％に増加させることができた。
Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズは、大規模合成に実用的ではない。酵素は、アガロースビーズに弱く結合され、最適なＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ生成に必要な高イオン強度の反応混合物において急速に洗い流される。酵素の浸出は、特に食品および製薬の用途のための検証過程を大幅に妨げる可能性があり、使用するたびにビーズをリチャージ（ｒｅｃｈａｒｇｅ）する必要がある。さらに、大量では毒性があるニッケルイオンは、ビーズから溶液に放出され、そのことにより、ＨＭＯＳの合成にそれらを使用することは、不可能である可能性が最も高い。Ｎｉ－ＮＴＡの浸出は低く、通常は最大１ｐｐｍと述べられているが、カラム再生およびリチャージ中に大量の有毒なＮｉが廃水に放出される。（Ｇａｂｅｒｃ－Ｐｏｒｅｋａｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２８（１１），１３０６－１３１４）。適度に強いキレート剤を用いての溶出は、Ｎｉ－ＮＴＡ浸出を促進する（Ｋｏｋｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１９，５８２，１１３３４７）。したがって、固体支持体から浸出するＮｉ（ＩＩ）の毒性は、大規模適用にとって深刻な懸念事項である。Ｎｉアガロースビーズは、有毒なＮｉ（ＩＩ）を浸出する傾向があるため、Ｎｉアガロースビーズビーズは機械的に安定していない。さらに、これらのビーズは柔軟なために機械的に安定しておらず、そのことは、高いせん断速度が、アガロースビーズを劣化させる原因になるため、攪拌槽反応器における、または圧縮による大規模なカラムパッキングにおける、当該使用を妨げる。
エポキシ活性化支持体は、酵素の表面に配置された全ての求核基、リジン、ヒスチジン、システイン、チロシンなどと化学的に反応することができ、したがって、酵素固定化に使用される（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ２００７，３５（６），１５９３－１６０１）。例えば、エポキシ官能基化樹脂に固定化された酵素は、例えば、糖供与体β－Ｄ－アラビノフラノシル－ウラシル（Ａｒａ－Ｕ）のβ－Ｄ－アラビノフラノシル－２－６－ジアミノプリン（Ａｒａ－ＤＡＭＰ）へのトランスグリコシル化反応などのトランスグリコシル化反応によるヌクレオシド類似体の生成に使用された（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂｉｏｔｒａｎｓ ２００４，２２（１），２５－３３）。
Ｃ．Ｘｉａｏ（ＰｈＤ論文、ジョージア州立大学、２０１８年１２月１０日「一般的な糖ヌクレオチドおよび治療用オリゴ糖の酵素的合成（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｕｇａｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」）は、固体支持体マクロ多孔性スチレン、オクタデシル、エポキシメタクリレート、およびエポキシブチル官能基化固体支持体に酵素ＮａｈＫおよびＡＧＸ１（アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ）の結合について報告する。酵素結合は成功したが、固定化酵素の活性は観察されなかった。
低コストで容易に入手可能な基質から出発して、費用効率の高い方法でＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生産する方法が長年にわたって必要とされている。
したがって、本発明の目的は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製のための費用効率の高い、および効率的な方法を提供することである。
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明の更に有利な特徴、態様および詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図、および実施例から明らかである。
本発明の説明
生化学において、ヌクレオチド糖はモノサッカリドの活性型としてよく知られており、グリコシル化反応において、ヌクレオチド糖はグリコシル供与体として作用することが知られている。グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）は、活性化ヌクレオチド糖から求核性グリコシル受容体分子へのサッカリド部分の転移を触媒する酵素である。したがって、生化学において、グリコシル化反応はグリコシルトランスフェラーゼによって触媒される。
グリコシル供与体として作用するために、各モノサッカリドは、例えばヌクレオチド糖、特に、ウリジンジホスフェート、グアノシンジホスフェート、またはシトシンジホスフェート、などに由来するヌクレオチドジホスホ糖の形態のように、非常にエネルギーの高い形態で存在することが不可欠である。よく知られているヌクレオチド糖の例は、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ－キシロース、ＵＤＰ－グルクロン酸、ＧＤＰ－マンノースおよびＧＤＰ－フコースである。単純なモノサッカリドの活性化ヌクレオチド糖への変換は、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）およびグリコシルモノホスフェートの酵素触媒反応によって達成されることができることはよく知られており、ここで、グリコシルモノホスフェートは、アノマー炭素にホスフェート基を含む。
ヌクレオシドジホスフェート（ＮＤＰ）－モノサッカリドを得るために、使用されるモノサッカリドは、グリコシルモノホスフェート誘導体に変換される必要がある。一般に、前記反応は、所望のモノサッカリド－１－ホスフェートを得るために、ホスホトランスフェラーゼ、および、必要に応じて、さらにホスホムターゼのような特定の酵素を適用することによって、達成されることができる。ホスホトランスフェラーゼは、リン酸化反応を触媒するＥＣ番号２．７に分類される酵素である。ホスホトランスフェラーゼは、ホスホトランスフェラーゼの受容体分子に従って更に分類される。例えば、ＥＣ２．７．１に基づくホスホトランスフェラーゼは、受容体としてアルコール基を有するホスホトランスフェラーゼである。ホスホムターゼは、イソメラーゼ、すなわちホスフェート基の内部移動を触媒することができる酵素である。ホスホトランスフェラーゼを介した基質のリン酸化が、モノサッカリド－６－ホスフェートをもたらす場合、例えば、Ｄ－マンノースまたはＤ－グルコースの場合に、それぞれ例えば、マンノース－６－ホスフェートおよびグルコース－６－ホスフェートをもたらす場合などに、ホスホムターゼは必要である。各ホスホムターゼは、その後、ホスフェート基の内部移動を触媒し、その結果、マンノース－６－ホスフェートのマンノース－１－ホスフェートへの、またはグルコース－６－ホスフェートのグルコース－１－ホスフェートへの変換を、それぞれもたらす。
キナーゼは、ホスホトランスフェラーゼファミリーの一部を形成する酵素である。キナーゼは、高エネルギーのホスフェート供与分子から特定の基質へのホスフェート基の移動を触媒する酵素である。この工程は、リン酸化として知られており、ここで、基質はホスフェート基を獲得し、高エネルギーアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）分子は、ホスフェート基を提供する。このエステル交換は、リン酸化された基質およびＡＤＰを生成する。したがって、モノサッカリド－１－ホスフェートを得るために、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼのような適切なキナーゼを、Ｎ－アセチルグルコサミンからＮ－アセチル－グルコサミン－１－ホスフェートを得るために適用し得る。
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用すると、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）およびモノサッカリド－１－ホスフェートを、それぞれのヌクレオシドジホスフェート（ＮＤＰ）－モノサッカリドに変換することができる。ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リン含有基のトランスフェラーゼ酵素であり、ＥＣ番号２．７．７に分類される。種々の天然に存在するヌクレオチドに関して、ヌクレオチド特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、当技術分野で知られており、例えば、ウリジリルトランスフェラーゼは、ウリジリル基を転移し、アデニリルトランスフェラーゼは、アデニリル基を転移し、グアニリルトランスフェラーゼは、グアニリル基を転移し、シチジリルトランスフェラーゼは、シチジリル基を転移し、チミジリルトランスフェラーゼは、チミジリル基を転移する。したがって、ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、モノサッカリド－１－ホスフェートとヌクレオシドトリホスフェートとの反応、例えば、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを得るために、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートとウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）との反応を触媒するのに適している。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの場合、ウリジルトランスフェラーゼは、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）との反応を触媒するのに適している。天然に存在するＵＤＰ－モノサッカリドに関連するウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）－モノサッカリドは、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、およびＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃである。
文献に記述されるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の前述の欠点にもかかわらず、ＮＴＰ糖に対する一般的な反応スキームの更なる欠点は、出発材料、特に、それぞれのヌクレオシドトリホスフェートが非常に高価であり、したがって合成経路は、ＮＤＰ－モノサッカリド、特にＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンのコストの大きい合成をもたらすという事実に基づく。すでに上述されたように、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンについて、当該技術において、低コストで容易に入手できる出発材料から、ヌクレオシドジホスフェートモノサッカリド、特にＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの調製のための費用効果が高く効率的な方法を提供する必要がある。
ＵＤＰモノサッカリドに関して、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃは、哺乳類において天然に存在する活性化ＵＤＰモノサッカリドに関する。したがって、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製のために、ＵＭＰは適切なヌクレオチドとして特定されており、Ｎ－アセチルグルコサミンは、適切なモノサッカリドとして特定されている。酵素触媒反応に関して、少なくとも適切な酵素が提供されなければならないことは明らかであるべきである。したがって、本発明者らは、酵素的ワンポットカスケード反応において、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生成するための適切な出発物質としてＵＭＰ、および容易に入手可能なＮ－アセチルグルコサミンを特定している。
ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを調製するための費用効果が高く効率的な方法を提供するために、ＵＭＰ（ウリジンモノホスフェート）およびＮ－アセチルグルコサミンを、図１に示されるような酵素カスケード反応において、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生成するための適切な出発材料として特定し、図１に示されるような酵素カスケード反応は、（ａ）Ｎ－アセチル－グルコサミンおよびアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ；触媒量）からのＮ－アセチルグルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）の形成、（ｂ）ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）およびウリジンモノホスフェートキナーゼからのウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）の形成、およびＵＤＰおよびポリホスフェートからのウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の形成、および（ｃ）Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートとウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）とからのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃへの反応、からなる。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびグルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で（各酵素は固体支持に固定化されている）、Ｎ－アセチルグルコサミンおよびウリジンモノホスフェートから直接的に生成することができると想定された。
驚くべきことに、本発明者らは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製に使用される酵素は、酵素の活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を保持するように、機械的に頑丈な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化されることができることを明らかにしている。特に、共有結合的に固定化された、または吸着固定化された酵素を有する頑丈な固体支持体は、一般に２０サイクルより多くのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成を可能にする。酵素の固体支持体への共有結合または吸着結合は、酵素の活性を維持しながら、酵素の洗い流しを最小限にする。機械的に安定な支持体は、固体支持体の劣化を抑制し、複数の反応サイクル中にＮｉなどの有毒物質を浸出させない。
当該多数のサイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成は、工程における大幅な改善であり、従来技術においてこれまで報告されていない。従来技術のＮｉアガロースビーズまたはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂を、かなりの量の酵素活性を失うことなく２サイクルを超えて使用することはできない（比較のために図３３および実施例４を参照）。酵素は（ヒスチジンタグを介して）親和性結合によってＮｉアガロースビーズに結合され、Ｎｉ浸出により洗い流される可能性がある。さらに、Ｎｉ ＮＴＡアガロース樹脂は、その柔らかさのために機械的に安定しておらず、そのことは、撹拌槽反応器での反応中にアガロースビーズを劣化させる。
さらに、特にＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製に使用される酵素が、機械的に頑丈な固体支持体に、共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される場合、すべての酵素の活性を高めることさえできることが明らかになっている。驚くべきことに、前記酵素がロードされた固体支持体を、先行技術と比較して複数回、または長期間にわたって継続的にＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生成に使用することができることを更に明らかにしている。驚くべきことに、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製に使用される酵素は、粗細胞溶解物または粗細胞ホモジネートから共固定化されることができることを更に明らかにしている。驚くべきことに、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの調製において、ウリジンを、ウリジンモノホスフェートの代わりに出発材料として使用することができることも明らかになっている。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Figure 0007457112000001
 Ａ）（ｉ）次の式によって表されるウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
Figure 0007457112000002
 （ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
本発明に係るウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの生成ステップＢ）は、
（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、アデノシントリホスフェートおよびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼおよびウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、および
（ｃ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンにすること、
を含む。
明らかに、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、同時に、または連続して実行され得る。また、それらの順序を（ｂ）→（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、アデノシントリホスフェートおよびポリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、および
（ｃ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンにすること、によって、
酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
より具体的には、本発明に係るウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの生成ステップＢ）は、
（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジンモノホスフェート、およびアデノシントリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ウリジンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、
（ｃ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンにすること、
を含む。
明らかに、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ１）または（ｂ２）の前に、同時に、または後に実行され得る。したがって、ステップの順序を（ｂ１）→（ｂ２）→（ａ）→（ｃ）に戻してもよい。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジンモノホスフェート、およびアデノシントリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ウリジンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、および
（ｃ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンにすること、によって、
酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための本発明の方法は、先行技術に記述される方法に対して次の重要な利点を有する：
・出発材料に関して大幅なコスト削減、すなわち、高価なＵＤＰまたはＵＴＰは必要とされない、
・方法は連続的な方法で実行されることができ、そのことにより、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを年間当たり１トン規模で提供することができる可能性がある、
・無細胞工程であり、そのことにより不利なＧＭＯ態様（規制、ラベリング）を防ぐ、
・無細胞抽出物の直接使用であり、生体触媒精製のためのコストはない、
・酵素がロードされた固体支持体は、複数回再利用されることができる、
・Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに関してほぼ定量的な収率である、
・高い拡張性は、本発明の方法を産業適用に有用にする。
一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供するこ、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットのうちの少なくとも一つの酵素は、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に固定化される。
本明細書で使用される共有結合固定化または共有結合は、酵素が固体支持体に付着し、当該活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を大部分保持する、または増加させるように、酵素と再利用可能な機械的に安定な固体支持体上の官能反応基との間の共有化学結合の形成を指す。共有結合は、酵素と固体支持体との間に安定な複合体を形成することによって特徴付けられ、そのことは酵素が容易に洗い流されることを妨ぐ。共有結合の例を、以下にさらに示す。共有結合酵素固定化は、当技術分野で知られている任意の酵素固定化方法、および本明細書に記述される方法を用いて達成されることができる。
酵素が固体支持体に付着し、当該活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を大部分保持する、または増加させるように、酵素は、再利用可能な機械的に安定な固体支持体への吸着によって結合されることもできる。吸着結合は、ファンデルワールス力、イオン相互作用、および水素結合を含む、固体支持体と酵素との間に生成される物理的相互作用を使用する。吸着結合は酵素の天然の構造を変えないため、酵素の活性部位を乱すことを防ぎ、酵素が活性を保持できるようにする。吸着結合の例を以下に更に示す。吸着酵素固定化は、当技術分野で知られている任意の酵素固定化の方法、およびに本明細書に記述の方法で達成されることができる。
しかしながら、本明細書に記述の本発明の方法において、酵素は、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体への親和性結合によって固定化されない。特に、本明細書に記述の本発明の方法において、酵素は、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズなどのＮｉ－ＮＴＡ固体支持体に固定化されていない。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に親和性結合によって固定化されない。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットのうちの少なくとも一つの酵素は、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化され、ここで、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体は、ＮｉアガロースビーズまたはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂ではない。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化され、そのことにより、頑丈な固体酵素調製物を形成する。
したがって、本発明の文脈において、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための本発明の方法、および本明細書に記述される他の本発明の方法の範囲内で、複数回の使用を可能にする支持体であり、例えば、固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着固定化される全ての酵素は、酵素の活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を大部分保持する、または増加させ、例えば、酵素は、機械的ストレスによる固体支持体の著しい劣化または摩耗なしに、固体支持体から洗い流されないようにする。
一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される。
一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に吸着固定化される。
他の実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化される。
さらに、酵素は、再利用可能な機械的に安定な固体支持体に、粗細胞溶解物または粗細胞ホモジネートから、直接、共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化されることができ、固体支持体は多数のサイクル（例えば、２０バッチサイクル以上）で使用されることができ、または本明細書に記述される本発明の方法を連続的に実行する場合、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体を、長期間にわたって使用することができる。用語「頑丈な固体支持体」は、本明細書において、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体の同義語として使用され、ｉ）粗細胞溶解物または粗細胞ホモジネートからの酵素のセットの共固定化を可能にし、ｉｉ）共固定化された全ての酵素の活性を大部分保持する、または増加させ、ｉｉｉ）多数のサイクル（例えば、２０バッチサイクル以上）での標的生成物の合成を可能にする、または本明細書に記述の本発明の方法を連続的に実行する場合、固体支持体を長期間にわたって使用することができる。
好ましくは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体を、少なくとも３サイクル、より好ましくは、少なくとも４サイクル、より好ましくは、少なくとも５サイクル、より好ましくは、少なくとも６サイクル、より好ましくは、少なくとも７サイクル、より好ましくは、少なくとも８サイクル、より好ましくは、少なくとも９サイクル、より好ましくは、少なくとも１０サイクル、より好ましくは、少なくとも１２サイクル、より好ましくは、少なくとも１４サイクル、より好ましくは、少なくとも１６サイクル、より好ましくは、少なくとも１８サイクル、より好ましくは、少なくとも２０サイクル、より好ましくは、少なくとも２５サイクル、より好ましくは、少なくとも２５サイクル、より好ましくは、少なくとも３０サイクル、および最も好ましくは、少なくとも５０サイクルで本明細書に記述の本発明の方法において使用することができる。
本発明の更なる態様は、サッカリド、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチド、特にヒト乳オリゴサッカリド（ＨＭＯ）および（モノクローナル）抗体を含む分子および生体分子のＧｌｃＮＡｃ化に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、および
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＥＣ２．４．１．サブグループの一部である。例は、リポポリサッカリドＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＬｇｔＡ）（ＥＣ２．４．１．５６）、Ｎ－アセチルラクトサミニドベータ－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＣＮＴ２）（ＥＣ．２．４．１．１５０）、タンパク質Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴ）（ＥＣ２．４．１．２５５）、およびアルファ－１，３－マンノシル－糖タンパク質２－ベータ－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１０１）、を含むが、これらに限定されない。
ＧｌｃＮＡｃ化のための本発明の方法の一実施形態において、ＵＴＰは副産物ＵＤＰから再生される。したがって、触媒量のＵＭＰのみが必要とされる。したがって、ＧｌｃＮＡｃ化のための本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、および
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
Ｅ）ウリジントリホスフェートを得るために、ステップＤ）において形成されたウリジンジホスフェートを再利用すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共固定化される。前記再利用可能な固体支持体を、例えば、エポキシ基を用いて官能基化することができる。
したがって、本発明の更なる態様は、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセットに向けられ、ここで、酵素のセットは、再利用可能な機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化され、好ましくは、酵素のセットは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに共固定化される。
好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼ、またはＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に酵素のセットと共に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される。
［発明の詳細な説明］
定義
本明細書で使用される場合、用語「ポリホスフェート」は、６個以上のホスフェート（ＰＯ４）四面体の角共有によって生成されたいくつかのＰ－Ｏ－Ｐ結合を含む任意の塩を指し、長鎖の形成につながる。用語「ポリＰｎ」は、同義語として使用され、ここで、ｎは、ホスフェート残基の数の平均鎖長を表し、例えば、ポリＰ２５は、約２５個のホスフェート残基を有するポリホスフェートを指し、およびポリＰ１４は、約１４個のホスフェート残基を有するポリホスフェートを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ウリジンモノホスフェートキナーゼ」は、またはウリジンモノホスフェートキナーゼ活性を有するポリペプチドを指し、すなわち、ウリジンモノホスフェートキナーゼは、アデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートのウリジン５’－ジホスフェートへの反応を触媒する。ウリジンモノホスフェートキナーゼは、ＥＣクラス２．７．４．１４に属する。ウリジンモノホスフェートキナーゼは、次の反応：
Figure 0007457112000003
 を触媒する。
本明細書で使用される場合、用語「ウリジンキナーゼ」は、またはウリジンキナーゼ活性を有するポリペプチドを指し、すなわち、ウリジンキナーゼは、アデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンのウリジン５’－モノホスフェートへの反応を触媒する。ウリジンキナーゼは、ＥＣクラス２．７．１．４８に属する。
本明細書で使用される場合、用語「ポリホスフェートキナーゼ」は、ポリホスフェートキナーゼ活性を有するポリペプチドを指し、すなわち、ポリホスフェートキナーゼは、次の反応：
Figure 0007457112000004
 を触媒し、ここで、Ｎは、例えば、グアノシン、アデノシン、ウリジンなどのヌクレオチドであり、ＮＭＰはヌクレオシドモノホスフェートであり、ＮＤＰはヌクレオシドジホスフェートであり、ＮＴＰはヌクレオシドトリホスフェートである。
ウリジンの場合、ポリホスフェートキナーゼは次の反応：
Figure 0007457112000005
 を触媒する。
ポリホスフェートキナーゼはＥＣクラス２．７．４．１に属する。本明細書に記述の本発明の方法において使用されるポリホスフェートキナーゼ酵素の代表は、ポリホスフェートキナーゼ１（ＰＰＫ１）、ポリホスフェートキナーゼ２（ＰＰＫ２）、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ウリジリルトランスフェラーゼ」は、ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを指し、例えば、次の反応：
Figure 0007457112000006
 を触媒するＵＴＰ：α－Ｄ－グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼである。
ヌクレオチジルトランスフェラーゼはＥＣクラス２．７．７に属する。既知のウリジリルトランスフェラーゼの例は、ＥＣクラス２．７．７．１０に属するヘキソース１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、ＥＣクラス２．７．７．１１に属するキシロース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、ＥＣクラス２．７．７．１２に属するＵＤＰ－グルコースヘキソース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、およびＥＣクラス２．７．７．９に属するグルコース１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＵ）を含むが、これらに限定されない。グルコース１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼは、ＵＴＰのＮ－アセチルヘキソサミン１－ホスフェートへの転移も触媒する：
Figure 0007457112000007
本明細書で使用される場合、用語「ピロホスファターゼ」は、ピロホスファターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応：
Figure 0007457112000008
 を触媒するポリペプチドを指し、
ここで、ＰＰｉはピロホスフェートを指し、Ｐｉはホスフェートを指す。
ピロホスファターゼはＥＣクラス３．６．１．１に属する。これに関連して、用語「ジホスファターゼ」は、ジホスフェートのホスフェートへの加水分解を触媒するピロホスファターゼポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ」は、キナーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、Ｎ－アセチルヘキソサミン１－ホスフェートへの次のリン酸化を触媒するキナーゼを指す：
Figure 0007457112000009
Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼは、ＥＣクラス２．７．１．１６２に属する。
本明細書で使用される場合、用語「ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ」は、ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応：
Figure 0007457112000010
 を触媒するトランスフェラーゼを指し、
ここで、ＰＲＰＰは、リン酸化ペントース、好ましくはリン酸化リボース、おおび最も好ましくは５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェートを指す。例示的に、トランスフェラーゼは、ＥＣクラス２．４．２．９に属するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはＥＣクラス２．４．２．５７に属するＡＭＰホスホリラーゼであり、これらのトランスフェラーゼ活性も知られているが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ＵＭＰシンターゼ」は、ウリジンモノホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応：
Figure 0007457112000011
 を触媒するシンターゼを指し、
ここで、ＯＭＰはオロチジン５’－ホスフェートを指す。用語ＵＭＰシンターゼは、オロチジン５’－ホスフェートデカルボキシラーゼの同義語として使用され、この酵素はＥＣクラス４．１．１．２３に属する。
本明細書で使用される場合、用語「オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ」は、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、次の反応：
Figure 0007457112000012
 を触媒するトランスフェラーゼを指す。トランスフェラーゼは、ＥＣクラス２．４．２．１０に属する。
本明細書で使用される場合、用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、ＮＤＰ－モノサッカリドから、受容体サッカリド、例えば、グルコースまたはＮ－アセチルグルコサミンなどへのモノサッカリドの転移を触媒するポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ」は、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、ＮＤＰ－ＧｌｃＮＡｃから、受容体サッカリドまたはタンパク質へのＮ－アセチルグルコサミンの転移を触媒するポリペプチドを指す。Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、一般にＥＣクラス２．４．１に属する。例は、リポポリサッカリド Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＬｇｔＡ）（ＥＣ．２．４．１．５６）、Ｎ－アセチルラクトサミニドベータ－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＣＮＴ２）（ＥＣ．２．４．１．１５０）、タンパク質 Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴ）（ＥＣ２．４．１．２５５）、アルファ－１，３－マンノシル－糖タンパク質 ２－ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１０１）、またはβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミントランスフェラーゼ（β１，３ＧｌｃＮＡｃＴ）（ＥＣ２．４．１．１４９）、を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「サッカリド」は、モノサッカリド、ジサッカリド、トリサッカリド、テトラサッカリド、ペンタサッカリド、ヘキササッカリド、ヘプタサッカリド、オクタサッカリド．．．、オリゴサッカリド、グリカンおよびポリサッカリドを指すが、これらに限定されない。
サッカリドは、Ｄ－アラビノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リキソース、Ｌ－リボース、Ｌ－キシロース、Ｄ－リブロース、Ｄ－キシルロース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｄ－デオキシリボース、Ｌ－デオキシリボース、Ｄ－エリトロース、Ｄ－スレオース、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－グロース、Ｄ－イドース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－プシコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトース、６－デオキシ－Ｌ－アルトロース、６－デオキシ－Ｄ－タロース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－ラムノース、Ｌ－ラムノース、Ｄ－キノボース、オリボース、チベロス、アスカリロース、アベクオース、パラトース、デジトキソース、コリトース、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－マンノサミン、Ｄ－アロサミン、ｌ－アルトロサミン、Ｄ－グロサミン、Ｌ－イドサミン、Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－アロサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－アルトロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－イドサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ラムノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－キノボサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｄ－ガラクトロン酸、Ｄ－マンヌロン酸、Ｄ－アルロン酸、Ｌ－アルトルロン酸、Ｄ－グルロン酸、Ｌ－グルロン酸、Ｌ－イズロン酸、Ｄ－タルロン酸、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、アピオース、バシロサミン、テベトース、アコフリオース、シマロース、ムラミン酸、Ｎ－アセチルムラミン酸、Ｎ－グリコリルムラミン酸、３－デオキシ－リキソ－ヘプツロサル酸、ケトデオキシオクトン酸、およびケトデオキシノノン酸、から選択されるモノサッカリド単位を好ましくは含む。好ましくは、モノサッカリド単位は、α－Ｄ－リボピラノース、α－Ｄ－アラビノピラノース、α－Ｄ－キシロピラノース、α－Ｄ－リキソピラノース、α－Ｄ－アロピラノース、α－Ｄ－アルトロピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－マンピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－イドピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－タロピラノース、α－Ｄ－プシコピラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ソルボピラノース、α－Ｄ－タガトピラノース、α－Ｄ－リボフラノース、α－Ｄ－アラビノフラノース、α－Ｄ－キシロフラノース、α－Ｄ－リキソフラノース、α－Ｄ－アロフラノース、α－Ｄ－アルトロフラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－グロフラノース、α－Ｄ－イドフラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、α－Ｄ－タロフラノース、α－Ｄ－プシコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－ソルボフラノース、α－Ｄ－タガトフラノース、α－Ｄ－キシルロフラノース、α－Ｄ－リブロフラノース、α－Ｄ－スレオフラノース、α－Ｄ－ラムノピラノース、α－Ｄ－エリスロフラノース、α－Ｄ－グルコサミン、α－Ｄ－グルコピラヌロン酸、β－Ｄ－リボピラノース、β－Ｄ－アラビノピラノース、β－Ｄ－キシロピラノース、β－Ｄ－リキソピラノース、β－Ｄ－アロピラノース、β－Ｄ－アルトロピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－マンピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－イドピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－タロピラノース、β－Ｄ－プシコピラノース、β－Ｄ－フルクトピラノース、β－Ｄ－ソルボピラノース、β－Ｄ－タガトピラノース、β－Ｄ－リボフラノース、β－Ｄ－アラビノフラノース、β－Ｄ－キシロフラノース、β－Ｄ－リキソフラノース、β－Ｄ－ラムノピラノース、β－Ｄ－アロフラノース、β－Ｄ－アルトロフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－グロフラノース、β－Ｄ－イドフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－タロフラノース、β－Ｄ－プシコフラノース、β－Ｄ－フルクトフラノース、β－Ｄ－ソルボフラノース、β－Ｄ－タガトフラノース、β－Ｄ－キシルロフラノース、β－Ｄ－リブロフラノース、β－Ｄ－スレオフラノース、β－Ｄ－エリスロフラノース、β－Ｄ－グルコサミン、β－Ｄ－グルコピラヌロン酸、α－Ｌ－リボピラノース、α－Ｌ－アラビノピラノース、α－Ｌ－キシロピラノース、α－Ｌ－リキソピラノース、α－Ｌ－アロピラノース、α－Ｌ－アルトロピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－マンピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－イドピラノース、α－Ｌ－ガラクトピラノース、α－Ｌ－タロピラノース、α－Ｌ－プシコピラノース、α－Ｌ－フルクトピラノース、α－Ｌ－ソルボピラノース、α－Ｌ－タガトピラノース、α－Ｌ－ラムノピラノース、α－Ｌ－リボフラノース、α－Ｌ－アラビノフラノース、α－Ｌ－キシロフラノース、α－Ｌ－リキソフラノース、α－Ｌ－アロフラノース、α－Ｌ－アルトロフラノース、α－Ｌ－グルコフラノース、α－Ｌ－マンノフラノース、α－Ｌ－グロフラノース、α－Ｌ－イドフラノース、α－Ｌ－ガラクトフラノース、α－Ｌ－タロフラノース、α－Ｌ－プシコフラノース、α－Ｌ－フルクトフラノース、α－Ｌ－ソルボフラノース、α－Ｌ－タガトフラノース、α－Ｌ－キシルロフラノース、α－Ｌ－リブロフラノース、α－Ｌ－スレオフラノース、α－Ｌ－エリスロフラノース、α－Ｌ－グルコサミン、α－Ｌ－グルコピラヌロン酸、β－Ｌ－リボピラノース、β－Ｌ－アラビノピラノース、β－Ｌ－キシロピラノース、β－Ｌ－リキソピラノース、β－Ｌ－アロピラノース、β－Ｌ－アルトロピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－マンピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－イドピラノース、β－Ｌ－ガラクトピラノース、β－Ｌ－タロピラノース、β－Ｌ－プシコピラノース、β－Ｌ－フルクトピラノース、β－Ｌ－ソルボピラノース、β－Ｌ－タガトピラノース、β－Ｌ－リボフラノース、β－Ｌ－アラビノフラノース、β－Ｌ－キシロフラノース、β－Ｌ－リキソフラノース、β－Ｌ－アロフラノース、β－Ｌ－アルトロフラノース、β－Ｌ－グルコフラノース、β－Ｌ－マンノフラノース、β－Ｌ－グロフラノース、β－Ｌ－イドフラノース、β－Ｌ－ガラクトフラノース、β－Ｌ－タロフラノース、β－Ｌ－プシコフラノース、β－Ｌ－フルクトフラノース、β－Ｌ－ソルボフラノース、β－Ｌ－タガトフラノース、β－Ｌ－キシルロフラノース、β－Ｌ－リブフラノース、β－Ｌ－スレオフラノース、β－Ｌ－エリスロフラノース、β－Ｌ－グルコサミン、β－Ｌ－グルコピラヌロン酸、およびβ－Ｌ－ラムノピラノースを含む、またはからなるα－およびβ－Ｄ／Ｌ－炭水化物のグループに属する。
サッカリドは、アミド、カーボネート、カルバメート、カルボニル、チオカルボニル、カルボキシ、チオカルボキシ、エステル、チオエステル、エーテル、エポキシ、ヒドロキシアルキル、アルキレニル、フェニレン、アルケニル、イミノ、イミド、イソ尿素、チオカルバメート、チオ尿素および／または尿素部分を持つように更に任意に修飾される。
本明細書で使用される場合、用語「糖ペプチド」は、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合した炭水化物部分を含むペプチドを指す。炭水化物部分は、側鎖を形成し、およびセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基に結合したＯ－グリコシド、またはアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ－グリコシドのいずれかである。
本明細書で使用される場合、用語「糖タンパク質」は、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合した炭水化物部分を含むポリペプチドを指す。炭水化物部分は、側鎖を形成し、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基に結合したＯ－グリコシド、またはアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ－グリコシドのいずれかである。
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」は、アグリコシル化タンパク質およびグリコシル化タンパク質を含むポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合した炭水化物部分を含む、または欠くポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、アグリコシル化ペプチドおよびグリコシル化ペプチドを含む、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合した炭水化物部分を含む、または欠くペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「バイオコンジュゲート」は、互いに共有結合される少なくとも２つの分子からなる分子構築物を指し、ここで、２つの分子のうちの少なくとも１つは生体分子、すなわち、１つ以上の典型的な生物学的工程に必須である生物において存在する分子である。例示的なバイオコンジュゲートは、担体タンパク質に共有結合した炭水化物抗原、および抗体薬物コンジュゲートからなる炭水化物コンジュゲートワクチンである。
本明細書で使用される場合、用語「炭水化物コンジュゲートワクチン」は、免疫原性担体に共有結合した炭水化物抗原を含むコンジュゲートを指す。炭水化物抗原は、細菌莢膜サッカリド、ウイルス糖タンパク質のサッカリド、胞子虫類または寄生生物のサッカリド抗原、病原性真菌のサッカリド抗原、または癌細胞に特異的なサッカリド抗原でありうるが、これらに限定されない。免疫原性担体は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差－反応性材料１９７（ＣＲＭ１９７）、分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のタンパク質Ｄ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜グループＢの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＥＰＡ）のエキソトキシンＡ、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＣＤＴＡ）、肺炎球菌タンパク質、例えば、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌ヒスチジントライアド（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉａｄ）Ｄ（ＰｈｔＤ）、無毒化ニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）（ｄＰｌｙ）、およびｓｐｒ９６／２０２１など、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）α毒素およびシガトキシン（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ）１ｂであることができるが、これらに制限されない。
本明細書で使用される用語「固体支持体」は、不溶性の官能基化された材料を指し、固体支持体に対して酵素または他の試薬は、直接的に、または固定基を有するリンカーを介して、付着または固定化されてもよく、酵素が過剰な試薬、可溶性反応生成物、副生成物、または溶媒から（洗浄、濾過、遠心分離などによって）容易に分離されることを可能にする。固体支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなど、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトから構成されることができる。固体支持体は、無機物、例えば、ガラス、シリカ、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などであることもできる。固体支持体は、磁性粒子からなることもできる。酵素固定化に適切な支持材料の概要については、Ｚｄａｒｔａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ２０１８，８，９２、およびＤａｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１３ ３：１－９を参照する。
固体支持体の構造は、ビーズ、モノリス、球、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、または面の形態であることができる。面は、平面、実質的に平面、または非平面であることができる。固体支持体は、多孔質または非多孔質であることができ、膨潤または非膨潤特性を有することができる。固体支持体は、ウェル、くぼみ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、機構（ｆｅａｔｕｒｅ）、または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）の形態で構成されることができる。
ステップＡ）において提供される溶液中のウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、好ましくは、０．０１ｍＭから１００，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンの濃度は、好ましくは、０．０５ｍＭから５０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンの濃度は、好ましくは、０．１ｍＭから３０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンの濃度は、好ましくは、０．２ｍＭから１５，０００ｍＭの範囲である。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること；
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、ステップＡ）において提供される溶液中のウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、０．２ｍＭから１５，０００ｍＭの範囲であり、ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に、共固定化されることにより、各酵素における活性を大部分増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素のセットにおける酵素の濃度は、ステップＡ）において提供される溶液の総量に基づいて、０．０００００１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間である。
Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスフェートとウリジントリホスフェートとを反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンにする反応の副産物として、ピロホスフェート（ＰＰｉ）が形成される。しかし、ピロホスフェートは水溶液中で不安定であり、無機ホスフェート（Ｐｉ）にゆっくりと加水分解するだけである。高濃度のピロホスフェートは、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン形成に関与するグルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ酵素の活性も阻害し得る。さらに、ピロホスフェートは、ウリジリルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼを阻害する当該能力のために知られている。酵素ピロホスファターゼは、ピロホスフェートのホスフェートへの加水分解を触媒することができ、そのことにより、ＵＤＰ形成を効果的に不可逆的にする。したがって、本発明の好ましい実施形態において、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。
したがって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に、または吸着的に固定化される。好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）（ａ）Ｎ－アセチルグルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、アデノシントリホスフェートおよびポリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、および
（ｃ’）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下で、ピロホスフェートをホスフェートに変換すること
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンを生成するための本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）（ａ）Ｎ－アセチルグルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートを形成すること、
（ｂ１）ウリジンモノホスフェート、およびアデノシントリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジンジホスフェートを形成すること、
（ｂ２）ウリジンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェートを形成すること、
（ｃ’）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下で、ピロホスフェートをホスフェートに変換すること
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、本明細書に記述の本発明の方法において使用されるピロホスファターゼは、無機ピロホスファターゼである。好ましくは、ピロホスファターゼは、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（ＰｍＰｐＡ）由来の無機ピロホスファターゼである。
ポリホスフェートは、水性媒体に最初に溶解された金属イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋／３＋など）と安定な水溶性の複合体を形成することができる。この効果は金属イオン封鎖（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）と呼ばれ、結合金属イオンが反応において、特に酵素反応において関与するのを防ぐ。したがって、隔離された金属イオン、特にＭｇ２＋およびＭｎ２＋は、本明細書に記述の本発明の方法に関与する酵素の補因子として作用することができない。特定のポリホスフェートにおける特定の金属イオンを隔離する能力は、ポリホスフェートの鎖長の増加とともに減少するため、長鎖ポリホスフェートは、本発明において好ましい。より好ましくは、少なくとも１４個のホスフェート残基を有するポリホスフェートである。最も好ましくは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有するポリホスフェートである。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートであり、ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素は、他の基質との単一の反応混合物中に存在する。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンは、本発明の方法の更なる態様に従って、単一の反応混合物中で生成される。
したがって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む混合物を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
さらに、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセット
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む少なくとも４つの酵素
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
ポリホスフェートは、本明細書に記述の本発明の方法における唯一のエネルギー担体として機能し、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を使用するＡＤＰからのＡＴＰの再生においてホスフェート源として使用される。ＡＴＰの再生は、本発明の方法における酵素カスケードに、ＡＤＰのＡＴＰへのリン酸化も触媒する１－ドメインポリホスフェートキナーゼ（１Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）を加えることによって高められることができる。さらに、ＡＤＰなどのヌクレオシドホスフェートは、水性媒体中で不安定であり、急速に加水分解する傾向がある。ＡＭＰへの加水分解によるＡＤＰの損失を防ぐために、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化を触媒する２－ドメインポリホスフェートキナーゼ（２Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を、１Ｄ－ＰＰＫと共に、または単独で本発明の酵素カスケードに加えることができる。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および１－ドメインホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、各酵素の酵素活性に影響を与えることなく、共有結合的に共固定化される。より好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および１－ドメインホスフェートキナーゼ、および２－ドメインホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および１－ドメインホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、各酵素の酵素活性に影響を与えることなく、共有結合的に共固定化される。より好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
ＡＴＰは、本明細書に記述の本発明の方法においてＡＤＰおよびポリホスフェートから連続的に再生されるため、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生成は、触媒量のＡＴＰを用いて実施することができる。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、および触媒量のアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化されることにより、各酵素における活性の大部分を増加させる、または保持する。
用語「触媒量」は、本明細書において、準化学量論量のＡＴＰ、すなわち、本発明の方法において使用されるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの量よりも少ないＡＴＰの量を指す。好ましくは、ＡＴＰの触媒量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり０．００１モルから０．９９モルの範囲である。より好ましくは、ＡＴＰの触媒量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００１モルから０．９モルの範囲である。より好ましくは、ＡＴＰの触媒量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００５モルから０．９５モルの範囲である。より好ましくは、ＡＴＰの触媒量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．０１モルから０．９モルの範囲である。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、および触媒量のアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）において、アデノシントリホスフェートは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり０．００１モルから０．９モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００２モルから０．８モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．７モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．５モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．２モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．１モルの量で、および最も好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００５モルから０．０５モルの量で、加えられる。
一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、触媒量のおよびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）において、アデノシントリホスフェートは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり０．００１モルから０．９モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００２モルから０．８モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．７モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．５モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．２モルの量で、より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００３モルから０．１モルの量で、および最も好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００５モルから０．０５モルの量で、加えられる。
好ましくは、ＡＴＰは、ステップＡ）において提供される溶液中に、０．０５ｍＭから１００ｍＭの間、より好ましくは０．１ｍＭから９０ｍＭの間、より好ましくは０．１ｍＭから５０ｍＭの間、より好ましくは０．２ｍＭから２０ｍＭの間、より好ましくは０．２ｍＭから１０ｍＭの間、より好ましくは０．２ｍＭから５ｍＭの間、および最も好ましくは０．５ｍＭから３ｍＭの間で存在する。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、および触媒量のアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）において、溶液中のアデノシントリホスフェートの濃度は、０．５ｍＭから３ｍＭの範囲である。
代替的な実施形態において、ＡＤＰまたはＡＭＰを、本明細書に記述の本発明の方法において、ＡＴＰの代わりに使用することができる。ＡＴＰは、ＡＭＰまたはＡＤＰ、およびポリホスフェートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成されるため、ＵＤＰ－ガラクトースの生成を、ＡＤＰまたはＡＭＰと共に出発物質としても実行することができる。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）における溶液中のアデノシントリホスフェートは、アデノシンモノホスフェートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成される。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される；
ここで、ステップＡ）における溶液中のアデノシントリホスフェートは、アデノシンジホスフェートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成される。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）における溶液中のアデノシントリホスフェートは、アデノシンモノホスフェートおよびアデノシンジホスフェートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成される。
言い換えると、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシンモノホスフェート、および／またはアデノシンジホスフェート、および／またはアデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
代替的な実施形態において、ＡＴＰは、空時収量を増加させるために、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの量を超えて使用される。好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり１モルから１００モルの範囲であり、より好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり１．２モルから５０モルの範囲であり、より好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり１．５モルから２０モルの範囲であり、および最も好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モルあたり２モルから１０モルの範囲である。
好ましくは、本発明の方法において、ステップＡ）において結果的に得られる溶液は、ｐＨ５．０～１０．０、好ましくはｐＨ５．５～９．５、より好ましくはｐＨ６．０～９．０、更により好ましくはｐＨ６．５～９．０、更により好ましくはｐＨ７．０～９．０の範囲のｐＨ値、および最も好ましくはｐＨ値７．５～８．５の範囲のｐＨ値を有する。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）において結果的に得られる溶液は、ｐＨ７．５～８．５の範囲のｐＨ値を有する。
本発明の一実施形態において、ステップＡ）において提供される溶液は、酵素のセットの触媒活性のために補因子としてＭｇ２＋イオンを含む。好ましくは、Ｍｇ２＋イオンは、ステップＡ）で提供される溶液中に、１ｍＭから２００ｍＭの間、より好ましくは１ｍＭから１５０ｍＭの間、より好ましくは２ｍＭから１５０ｍＭの間、より好ましくは５ｍＭからｖ１００ｍＭの間、より好ましくは１０ｍＭから９０ｍＭの間、より好ましくは１５ｍＭから８０ｍＭの間、より好ましくは２０ｍＭから８０ｍＭの間、および最も好ましくは２０ｍＭから５０ｍＭの間、の濃度で存在する。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）において結果的に得られる溶液は、２０ｍＭから８０ｍＭの間、好ましくは、２０ｍＭから５０ｍＭの間の範囲のＭｇ２＋濃度を有する。
代替的な実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、アデノシントリホスフェート；および
（ｉｉｉ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセット、
を含む溶液を提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化され、または吸着固定化され、
ここで、ステップＡ）において結果的に得られる溶液は、２０ｍＭから１５０ｍＭの範囲のＭｇ２＋濃度を有する。
ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための本発明の方法は、固定化酵素のセットを用いて実行される。酵素は、その後、酵素の活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性を保持するように、固体支持体に固定化される。適切な固体支持体は、例えば、ビーズ、モノリス、球、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、面または他の固相材料などである。一実施形態において、各酵素、すなわち、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼは、固体支持体に固定化される。
一実施形態において、酵素のセットのうちの酵素のいくつかのみが固体支持体に固定化される。グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む酵素のセットから選択される少なくとも１つの酵素は、固体支持体に固定化される。
さらに、本明細書に記述されるのは、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチル－ヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む酵素のセットから選択される少なくとも１つの酵素は、固体支持体に固定化される、ということである。好ましくは、ポリホスフェートキナーゼは、固体支持体に固定化される。好ましくは、ウリジンモノホスフェートキナーゼは、固体支持体に固定化される。好ましくは、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼは、固体支持体に固定化される。好ましくは、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼは、固体支持体に固定化される。好ましくは、ピロホスファターゼは、固体支持体に固定化される。
驚くべきことに、酵素のセットの共固定化は、酵素のセットのうちの酵素における別々の固定化と比較して、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの生産において、より高い生産性をもたらすことを明らかにしている（図３）。したがって、好ましくは、本明細書に記載の本発明の方法において使用される酵素は、固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される。好ましくは、本明細書に記述の本発明の方法において使用される酵素は、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される。好ましくは、本明細書に記述の本発明の方法において使用される酵素は、頑丈な固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される。限られた空間内で連続的に作用する酵素の固定化は、基質の拡散時間が劇的に減少するため、変換における触媒効率を向上させる。さらに、基質のインサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成は、動力学的増強につながる高い局所濃度を生成し、実質的なコスト削減に相当する可能性がある。共固定化は、通常、固体支持体に固定化する前に酵素を混合することによって達成される。
本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含む。
本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含み、固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含む。
本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含み、固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化されるされる酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、ビーズ、モノリス、球、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、または面の形を有する。好ましくは、固体支持体は、ビーズの形を有する。
当該実施形態において、固定化酵素は、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの生成を促進することができ、反応が完了した後、固定化酵素は、（例えば、酵素が固定化されているビーズを保持することによって）容易に保持され、その後、続く実行において再使用（ｒｅｕｓｅｄ）または再利用（ｒｅｃｙｃｌｅｄ）される。当該固定化生体触媒工程は、更なる効率およびコスト削減を可能にする。さらに、本発明の方法は、ステップＡ）の供給溶液を、固体支持体上に固定化された酵素のセットを含む反応器に通すことによって、連続的な方法で実施されることができる。
本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む供給溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含み、固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される酵素のセットを提供すること、ここで、固定化された酵素のセットを含む固体支持体は、化学反応器に位置する、
Ｂ）ステップＡ）からの供給溶液を、固定化された酵素のセットを含む固体支持体を装備された化学反応器に連続的に通すことによって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含む。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む供給溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼを含み、固体支持体に共有結合的に共固定化される、または吸着固定化される酵素のセットを提供すること、ここで、固定化された酵素のセットを含む固体支持体は、化学反応器に位置される、
Ｂ）ステップＡ）からの供給溶液を、固定化された酵素のセットを含む固体支持体を装備された化学反応器に連続的に通すことによって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含む。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む供給溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含み、固体支持体に共有結合的に、または吸着的に共固定化される酵素のセットを提供すること、ここで、固定化された酵素のセットを含む固体支持体は、化学反応器に位置される、
Ｂ）ステップＡ）からの供給溶液を、固定化された酵素のセットを含む固体支持体を装備された化学反応器に連続的に通すことによって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含む。
酵素固定化の方法は、当技術分野でよく知られている。酵素は、例えば、吸着、共有結合、イオン結合、金属結合、架橋または結晶化などの非共有結合的または共有結合的に結合されることができる。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素の結合および固定化の様々な方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７，４２，８９５；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，７６，８４３；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６３，３９；Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２０１１，１５，１０３３；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００２，１８，６２９；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）などに記述される。
本明細書に記述される本発明の方法において使用される酵素、すなわち、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼは、当業者によく知られており、当業者によく知られている任意の方法によって得られることができる。特に、酵素は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ウイルス、およびファージ培養物、並びに真核細胞培養物などの細菌培養物を含む微生物学的培養物から組換え法によって、過剰発現され、単離され、または調製されることができる。本明細書に記述される本発明の方法は、実験のセクションに記述される供給源からの酵素に限定されない。したがって、本発明の方法を、一般的なタンパク質発現または単離技術を使用して様々な供給源から得られた上記に記載された酵素を用いて行うことができる。さらに、方法が使用される特定の用途に対して酵素の調製を適応させることは当業者によく知られている。例えば、上記に記載された酵素は、例えば、大豆由来のトリプトンを含むルリア－ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロスなどの非動物由来の細菌増殖培地を使用することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されることができる。
一実施形態において、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ウリジンモノホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、１－ドメインポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、２－ドメインポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
したがって、一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含、ここで、ポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ウリジンモノホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、１－ドメインポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、２－ドメインポリホスフェートキナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ピロホスファターゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、酵素のセットは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
発酵工程、細胞均質化、または細胞溶解から得られた酵素含有溶液は、細胞残屑を除去するために、通常、遠心分離され、および濾過され、固体支持体に酵素を固定化するために直接使用されることができる。したがって、更なる精製ステップ、または単離ステップは必要なく、発酵ブロス、（粗または精製）細胞溶解物、または細胞ホモジネートを、酵素が、酵素の活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性を保持するように、固体支持体に酵素を固定化するために使用することができる。
したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞溶解物、精製細胞溶解物、または細胞ホモジネートから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること；
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、粗細胞溶解物、または細胞ホモジネートから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に固定化される。
好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、事前の精製無しに、発酵ブロスから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、事前の精製無しに、発酵上清から、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、細胞溶解物または細胞ホモジネートから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、細胞溶解物または細胞ホモジネートから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む固体支持体に固定化される酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、細胞溶解物または細胞ホモジネートから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること；および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素のセットを提供すること；
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、細胞溶解物または細胞ホモジネートから、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化される、または吸着共固定化される。
本発明の方法において使用される酵素を固定化するために有用な固体支持体は、ビーズ、モノリス、球、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜または面を含むが、これらに限定されない。好ましくは、固体支持体は、ビーズの形態を有する。
好ましくは、酵素の共有結合固定化および／または酵素の吸着固定化を可能にする固体支持体である。本明細書に使用される共有結合固定化または共有結合は、酵素と、再利用可能な機械的に安定な固体支持体における官能反応基との間の、例えば、酵素が固体支持体に付着し、酵素の活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を大部分保持する、または増加させるような、共有化学結合の形成を指す。したがって、酵素の共有結合固定化を可能にする固体支持体は、直接または二価リンカー分子を介してアミノ酸の側鎖に存在する反応性基に結合する官能反応性基（例えば、塩化物、エポキシド、ビニル基、カルボキシ基など）を示す。
特に好ましくは、エポキシド官能基を用いて官能化される共有結合のための固体支持体である。更に好ましい固体支持体は、エチレンジアミン官能基を有する固体支持体、エポキシ官能基を有し、更に、例えば、ブチル、オクチル、メチル、フェニルなどの疎水性基を用いて官能基化された固体支持体、例えばエポキシド官能基およびブチル官能基を有する固体支持体、アミノＣ２スペーサー官能基、アミノＣ６スペーサー官能基、または、例えば、アミノＣ３スペーサー、アミノＣ４スペーサー、アミノＣ５スペーサー、アミノＣ７スペーサーなどの他のアミノスペーサーを有する固体支持体、エポキシ官能基を有する固体支持体、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有する固体支持体、アニオン性／三級アミン官能基を有する固体支持体、アニオン性／四級アミン官能基を有する固体支持体、カチオン性／スルホン性官能基を有する固体支持体、カルボン酸エステル官能基を有する固体支持体、フェニル官能基を有する固体支持体、オクタデシル官能基を有する固体支持体、スチレン／メチル官能基、マクロ多孔性樹脂、またはビーズを有する固体支持体、を含むが、これらに限定されない。
固体支持体は、ポリマー材料、非ポリマー材料、例えば、シリカゲルからなり得る。固体支持体は、ポリメタクリレート、ポリアクリル酸、アクリルポリマー、ポリスチレン、スチレン、スチレン／メタクリレート、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されないポリマー材料からなり得る。
本発明の方法において使用される酵素を固定化するのに有用な固体支持体の例は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基を有し、更に、例えば、ブチル、オクチル、メチル、フェニルなどの疎水性基を用いて官能化されたポリメタクリレート、例えば、エポキシド官能基およびブチル官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ２スペーサー官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、エポキシ官能基を有するアクリルポリマー、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン官能基を有するポリスチレン、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、Ｎｉ－ＮＴＡ官能基を有する磁性シリカ粒子、またはマグネタイトのコアおよびＮｉ－ＮＴＡ官能基を有するデキストランシェルを有する磁性ナノ粒子、マクロ多孔性スチレンまたはスチレン／メタクリレートのマクロ多孔性樹脂またはビーズ、を含むが、これらに限定されない。原則として、当該技術分野で知られている任意の適切な固体支持体を、本発明の方法において使用することができるが、ＮｉアガロースビーズまたはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂は、上記の理由のために好ましくない。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）固定化される酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基を有し、更に、例えば、ブチル、オクチル、メチル、フェニルなどの疎水性基を用いて官能化されたポリメタクリレート、例えば、エポキシド官能基およびブチル官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ２スペーサー官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、エポキシ官能基を有するアクリルポリマー、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン官能基を有するポリスチレン、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、およびマクロ多孔性スチレンまたはスチレン／メタクリレートのマクロ多孔性樹脂またはビーズ、から選択される再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に固定化される。
本発明の方法において使用される酵素を固定化するために有用な例示的な固体支持体は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）／レリザイム（ＲｅｌｉＺｙｍｅ）（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））、ＥＣ－ＥＰ／ＳおよびＥＣ－ＥＰ／Ｍを含むＥＣ－ＥＰ、ＥＰ１１２／Ｓ、ＥＰ１１２／Ｍ、ＥＰ１１３／Ｓ、ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＨＦＡ４０３Ｍ、ＨＦＡ４０３Ｓ、ＨＧ４０３、ＥＰ４００／ＳＳ ＥＣ－ＨＧ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＥＣ－ＥＡ／Ｍ、ＥＡ４０３／Ｓ、並びにＥＣ－ＨＡ／ＳおよびＥＣ－ＨＡ／Ｍを含むＥＣ－ＨＡ、イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））Ｉｍｍ１５０Ｐ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ２、ＩＢ－ＡＮＩ３、ＩＢ－ＡＮＩ４、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３およびＩＢ－ＡＤＳ４、ＩＢ－ＣＡＴ－１、ＩＢ－ＡＮＩ－１、ＩＢ－ＡＮＩ－２、ＩＢ－ＡＮＩ－３、ＩＢ－ＡＮＩ－４、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）、および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ））：ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、シキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびシキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５、酵素固定化樹脂ライフテック（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）（商標）（プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））、エポキシメタクリレート：ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０６Ｆ、ＥＣＲ８２０６Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２８５Ｆ、ＥＣＲ８２８５Ｍ、アミノＣ２またはＣ６メタクリレート：ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８３０５Ｆ、ＥＣＲ８３０５Ｍ、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｍ、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｍ、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８４０４Ｆ、ＥＣＲ８４０４Ｍ、ＥＣＴ８４０９、ＥＣＴ８４０９Ｆ、ＥＣＴ８４０９Ｍ、ＥＣＲ８４１５、ＥＣＲ８４１５Ｆ、ＥＣＲ８４１５Ｍ、マクロ多孔性樹脂ＥＣＲ１０９０、ＥＣＲ１０９１、ＥＣＲ１０９１Ｍ、ＥＣＲ１０６１、ＥＣＲ１０３０、ＥＣＲ１０３０Ｆ、ＥＣＲ８８０６Ｆ、イオン性樹脂ＥＣＲ１５０４、ＥＣＲ１５０８、ＥＣＲ１６０４、ＥＣＲ１６４０、および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ））：ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）－Ｄおよびシキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－Ｍ－ＣＴ、を含むが、これらに限定されない。
酵素が固定化された機械的に安定なビーズまたは樹脂を結果的にもたらす固体支持材料は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生産のためのビーズまたは樹脂の再使用（ｒｅｕｓｅ）および／または再利用（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）に関して好ましく、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生成のための方法における連続的な工程に関してより好ましい。機械的に安定な固体支持体は、摩耗、機械的応力に対する抵抗性に特徴付けられ、多数のサイクル、例えば、少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、より好ましくは少なくとも１６サイクル、より好ましくは少なくとも１８サイクル、および最も好ましくは少なくとも２０サイクルに適している。固体支持体への共有結合による酵素の固定化は、機械的に安定したビーズまたは樹脂を提供することができ、このことは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生成のために固定化酵素を有するビーズまたは樹脂の再使用（ｒｅｕｓｅ）および／または再利用（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）に特に適していることが示されている。驚くべきことに、エポキシド官能基を有するポリマー、例えば、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基およびブチル官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、エポキシ官能基を有するアクリルポリマー、などを含むが、これらに限定されないビーズまたは樹脂を用いて、固定化されるために酵素の共有結合を可能にし、機械的に頑丈な樹脂またはビーズを得ることが可能であることを明らかにしている。
したがって、酵素が固定化されたビーズまたは樹脂の形態の再利用可能な機械的に安定な固体支持体は、粗細胞溶解物または粗細胞ホモジネートからの酵素のセットの共固定化に関して、共固定化された全ての酵素の活性を大部分保持する、または増加させることに関して、およびＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生産のためのビーズまたは樹脂の再使用（ｒｅｕｓｅ）および／または再利用（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）に関して、およびＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生成方法における連続的な工程に関して好ましい。固体支持体は、とりわけ、摩耗、機械的応力に対する抵抗性に特徴付けられ、多数のサイクル、例えば、少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、より好ましくは少なくとも１６サイクル、より好ましくは少なくとも１８サイクル、および最も好ましくは少なくとも２０サイクルに適している。固体支持体への共有結合による酵素の固定化は、機械的に頑丈なビーズまたは樹脂を提供することを示すことができ、このことは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの生産のために固定化酵素を有する樹脂またはビーズの再使用（ｒｅｕｓｅ）および／または再利用（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）に特に適していることが示され、このことは、粗細胞溶解物から酵素のセットの共固定化を可能にし、このことは、共固定化された全ての酵素の活性を大部分保持する、または増加させる。驚くべきことに、エポキシド官能基、アミノエポキシド官能基、エチレンジアミン官能基、または、エポキシド官能基およびブチル、オクチル、メチル、フェニル、ブチル官能基などの疎水性基を含むビーズまたは樹脂を用いて、固定化されるための酵素の共有結合を可能にし、頑丈な固体樹脂またはビーズを得ることができることを明らかにしている。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）固定化される酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、エポキシド官能基、アミノエポキシド官能基、エチレンジアミン官能基、または、エポキシド官能基およびブチル、オクチル、メチル、フェニル、ブチル官能基などの疎水性基を含む再利用可能な、機械的に安定なビーズまたは樹脂に共有結合的に固定化される。
エポキシ活性化樹脂またはビーズは、酵素と樹脂またはビーズとの間の多点共有結合を可能にする。好ましくは、樹脂骨格は、０．０１ｎｍから１００００ｎｍ、または０．１Åから１０００００Åの多孔性を有するメタクリレートから構成される。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、３０ｎｍから６０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、エポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、４０ｎｍから６０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、５０ｎｍから６０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、６０ｎｍから１２０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、１２０ｎｍから１８０ｎｍであり得る。エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズは、好ましくは非常に穏やかなｐＨおよび温度条件下で、種々のタンパク質基、例えば、アミノ、チオール、フェノールなどと非常に安定な共有結合を形成し得る。樹脂は、好ましくは機械的に安定であり、固定化酵素を有する樹脂は、好ましくは、撹拌槽またはカラム反応器において使用されてもよい。
アミノ樹脂、例えば、アミノＣ２官能基化樹脂またはアミノＣ６官能基化樹脂など、または他のアミノ樹脂、例えば、アミノＣ３、アミノＣ４、アミノＣ５、アミノＣ７など、例えば、限定されないがアミノＣ２メタクリレート樹脂またはアミノＣ６メタクリレート樹脂などは、例えばグルタルアルデヒドによって事前に活性化されてもよく、その後、酵素の共有結合固定化に使用されてもよい。酵素におけるアミノ基とのアルデヒド基の反応はシッフ塩基を形成し、そのことは多点共有結合を結果的にもたらす。結合は、水素化ホウ素を用いて還元によっても達成され得る。したがって、可逆的固定化は、架橋ステップの方法によって不可逆的になり得、酵素は、担体に吸着されてもよく、その後、例えば、グルタルアルデヒドを使用することによって架橋されてもよい。架橋酵素または架橋酵素は、ネットのように担体を覆うことが可能である。アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂またはアミノＣ６メタクリレート樹脂などは、好ましくは、３０ｎｍから１８０ｎｍまたは３００Åから１８００Åの範囲の多孔性を有する。好ましい実施形態において、アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂またはビーズなどの多孔性、またはアミノＣ６メタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、３０ｎｍから６０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂またはビーズの多孔性、またはアミノＣ６メタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、６０ｎｍから１２０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂またはビーズの多孔性、またはアミノＣ６メタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、１２０ｎｍから１８０ｎｍであり得る。
不可逆的な固定化のための他の方法は、例えば、１，２－ジオール官能基化樹脂またはビーズなどのヒドロキシル官能基の活性化である。
したがって、特に好ましくは、エポキシド官能基を有するポリメタクリレートおよびアミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である。好ましくは、エポキシド官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂は、親水性である。共有結合酵素固定化は特に好ましい。好ましい実施形態において、ビーズまたは樹脂は、非極性基、例えば、ブチルまたはオクタデシル基などを用いて官能基化されない。好ましい実施形態において、樹脂またはビーズは親水性である。
好ましくは、固体支持体は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＨＦＡ４０３、ＥＡ４０３、ＨＡ４０３、ＥＣ－ＥＡ／Ｍ、およびＥＣ－ＨＡ、イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＣＡＴ１、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）、酵素固定化樹脂（プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））、エポキシメタクリレート：ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０６Ｆ、ＥＣＲ８２０６Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２８５Ｆ、ＥＣＲ８２８５Ｍ、アミノＣ２またはＣ６メタクリレート：ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８３０５Ｆ、ＥＣＲ８３０５Ｍ、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｍ、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｍ、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８４０４Ｆ、ＥＣＲ８４０４Ｍ、ＥＣＴ８４０９、ＥＣＴ８４０９Ｆ、ＥＣＴ８４０９Ｍ、ＥＣＲ８４１５、ＥＣＲ８４１５Ｆ、ＥＣＲ８４１５Ｍから選択される樹脂、またはビーズから構成される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）固定化される酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＨＦＡ４０３、ＥＡ４０３、ＨＡ４０３、ＥＣ－ＥＡ／Ｍ、およびＥＣ－ＨＡ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＣＡＴ１、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）、酵素固定化樹脂（プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））、エポキシメタクリレート：ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０６Ｆ、ＥＣＲ８２０６Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２８５Ｆ、ＥＣＲ８２８５Ｍ、アミノＣ２またはＣ６メタクリレート：ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８３０５Ｆ、ＥＣＲ８３０５Ｍ、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｍ、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｍ、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８４０４Ｆ、ＥＣＲ８４０４Ｍ、ＥＣＴ８４０９、ＥＣＴ８４０９Ｆ、ＥＣＴ８４０９Ｍ、ＥＣＲ８４１５、ＥＣＲ８４１５Ｆ、およびＥＣＲ８４１５Ｍから選択される再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、固体支持体は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３（プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））、ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）から選択される樹脂、またはビーズから構成される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は親水性である。好ましくは、酵素は、共有結合を介して固体支持体に固定化される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、官能基化されたメタクリレート樹脂、またはビーズである。
したがって、本発明は好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、エポキシド官能基またはアミノエポキシド官能基を含む官能基化樹脂またはビーズである。好ましくは、固体支持体は、エポキシド官能基またはアミノエポキシド官能基を有するポリマーを含む樹脂またはビーズである。より好ましくは、固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリマーを含む樹脂またはビーズである。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、エポキシド官能基またはアミノエポキシド官能基を有するポリマーを含む官能基化樹脂またはビーズである。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、エポキシド官能基またはアミノエポキシド官能基を含む官能基化メタクリレート樹脂またはビーズである。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３（プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）から選択される樹脂、またはビーズから構成される。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、セパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３（プロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（ＲｏｈｍＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）から選択される樹脂、またはビーズから構成される。
更に、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメチルメタクリレート、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ２官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ６官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、を含むビーズ、または樹脂から構成される。
一実施形態において、酵素は、固体支持体としてエポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレートポリマーに共有結合的に固定化される。当該メタクリレートポリマーは、複数の実行またはサイクルにおいて反応器での使用に適したものにする高い機械的強度を有する。エポキシ基は、酵素の活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性を保持するように、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃカスケードの酵素と非常に安定な共有結合を形成し、そのことにより、合成中の酵素の早期の洗い流しを最小限にする。したがって、本発明者らは、酵素が共有結合的に固定化された固体支持体を、複数のサイクルで再利用した場合でも、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびＵＭＰのＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンへの完全な変換を達成することができることを示している。
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレートポリマーを、固体支持体として３バッチサイクルより多く使用する場合、酵素活性を向上させることさえできることを明らかにしている。したがって、複数の実行またはサイクルにおける前記固体支持体の再利用は、本明細書に記述される本発明の方法における生産性を大幅に改善する（図３３を参照）。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、固体支持体は、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、またはエポキシド官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂から構成される。好ましくは、前記固体支持体は、１００μｍから３００μｍの間の粒子サイズを有する。好ましくは、前記固体支持体は、４０ｎｍから６０ｎｍの間の孔径を有する。好ましくは、前記固体支持体は、ＨＦＡ４０３／ＳまたはＥＰ４０３／Ｓから選択される。
好ましくは、酵素は、複数の実行またはサイクルにおいて反応器で使用され得るエポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに共固定化される。好ましくは、固体支持体に共固定化された酵素を、少なくとも３サイクル、より好ましくは、少なくとも４サイクル、より好ましくは、少なくとも５サイクル、より好ましくは、少なくとも６サイクル、より好ましくは、少なくとも７サイクル、より好ましくは、少なくとも８サイクル、より好ましくは、少なくとも９サイクル、より好ましくは、少なくとも１０サイクル、より好ましくは、少なくとも１２サイクル、より好ましくは、少なくとも１４サイクル、より好ましくは、少なくとも１６サイクル、より好ましくは、少なくとも１８サイクル、より好ましくは、少なくとも２０サイクル、より好ましくは、少なくとも２５サイクル、より好ましくは、少なくとも２５サイクル、より好ましくは、少なくとも３０サイクル、および最も好ましくは、少なくとも５０サイクルで、使用してもよい。好ましくは、酵素は、固体支持体に共固定化され、少なくとも３～１０、好ましくは５～１２、より好ましくは７～１４、より好ましくは９～１６、およびさらにより好ましくは少なくとも１０～２０の実行またはサイクルで使用されてもよい。
好ましい実施形態において、固定化された酵素のセット、好ましくは共固定化された酵素のセットを有するエポキシビーズまたは樹脂は、一般に、３サイクルより多い、好ましくは５サイクルより多い、好ましくは１０サイクルより多い、および好ましくはさらに２０サイクルより多いＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成を可能にする。当該多数のサイクルのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成は、工程の大幅な改善であり、従来技術においてこれまで報告されていない。例えば、図３３に示され、実施例４に実証されるように、Ｎｉアガロースビーズ、またはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂は、本発明に係る再利用可能な機械的に安定な固体支持体ではなく、２サイクルより多く再利用されることはできない。したがって、上記のように、Ｎｉアガロースビーズ、またはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂は、好ましくない。好ましくは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体は、Ｎｉアガロースビーズ、またはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂に関連していない。
したがって、本発明の更なる態様は、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセットに向けられ、ここで、酵素のセットは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに共固定化される。
したがって、本発明の更なる態様は、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセットに向けられ、ここで、酵素のセットは、アミノエポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに共固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼも含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。
したがって、本発明の更なる態様は、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセットに向けられ、ここで、酵素のセットは、エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレートポリマーに共固定化される。
したがって、本発明の更なる態様は、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセットに向けられ、ここで、酵素のセットは、アミノエポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレートポリマーに共固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼも含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。
好ましくは、メタクリレートポリマーはビーズの形態を有する。好ましくは、ビーズは、１５０μｍ～３００μｍの範囲の粒子サイズを有する。好ましくは、メタクリレートポリマーは、６００Å～１２００Åの間の孔径を有する多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、３００Å～６００Åの間の孔径を有する低多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、４５０Å～６５０Åの間の孔径を有する低多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、１２００Å～１８００Åの間の孔径を有する高多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、ブチル基を用いてさらに官能基化される。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、疎水性基、例えば、ブチル、メチル、フェニル、オクチルなどを用いて更に官能基化される。
本発明の更なる実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、付加的なステップＣ）：
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
を含む。
本発明の更なる実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、付加的なステップＣ）：
Ｃ）イオン交換クロマトグラフィーによって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
を含む。
したがって、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。
好ましくは、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼを含む、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
を含み、
ここで、酵素のセットのうちの少なくとも一つの酵素は、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、本発明は更に、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法に向けられ、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に固定化される、または吸着固定化される、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
を含み、
ここで、細胞溶解物からの酵素のセットは、固体支持体に共固定化される。より好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
本発明の一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンは、ウリジンおよびＮ－アセチルグルコサミンから生成される。したがって、本発明の方法のステップＡ）におけるウリジンモノホスフェートは、ウリジン、アデノシンホスフェートおよびウリジンキナーゼ酵素から得られる。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、
ウリジンキナーゼ、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に、共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、を更に含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体に固定化される、または共固定化される。
本発明の一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンは、ウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート（ＰＲＰＰ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンから生成される。したがって、本発明の方法のステップＡ）におけるウリジンモノホスフェートは、ウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素から得られる。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ’）ウラシル、ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、
ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に、共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、を更に含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体に固定化される、または共固定化される。
本発明の一実施形態において、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンは、オロチン酸、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート（ＰＲＰＰ）およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンから生成される。オロチン酸は、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下でリン酸化され、形成されたオリチジン５’－ホスフェート（ＯＭＰ）は、ＵＭＰシンターゼによってウリジンモノホスフェートに脱炭酸される。したがって、本発明の方法のステップＡ）におけるウリジンモノホスフェートは、オロチン酸、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート、オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびＵＭＰシンターゼ酵素から得られる。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ’）オロチン酸、ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、
オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰ－シンターゼ、グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、を更に含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体に固定化される、または共固定化される。
ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲートおよびＧｌｃＮＡｃ化小分子。
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の本発明の方法は、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成するために有用である。本明細書で使用されるＧｌｃＮＡｃ化は、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンとの酵素触媒反応による、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを用いたサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチドまたは小分子の官能基化を指す。グリコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間の反応を触媒する酵素である。
したがって、本発明の一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に、共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
したがって、本発明の一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼを含む、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンを単離すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
したがって、本発明の一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼを含む、酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
グリコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃとサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との反応を触媒することにより、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子、および副生成物としてウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）を形成する。ステップＢ）、具体的にはステップ（ｂ’）において形成される中間体生成物であるＵＤＰは、その後、再使用（ｒｅｕｓｅｄ）または再利用（ｒｅｃｙｃｌｅｄ）されることができる。
したがって、本発明の一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む固体支持体に共固定化される酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）（ａ）Ｎ－アセチルグルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、およびアデノシントリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ウリジンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、および
（ｃ）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンにすること、
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
Ｅ）ウリジントリホスフェートを形成するために、インサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたウリジンジホスフェートを再利用すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
したがって、本発明の一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびピロホスファターゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）（ａ）Ｎ－アセチルグルコサミンおよびアデノシントリホスフェートから、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼによって触媒されて、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジンモノホスフェート、およびアデノシントリホスフェートから、ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ウリジンジホスフェート、およびポリホスフェートから、ポリホスフェートキナーゼによって触媒されて、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を形成すること、および
（ｃ’）グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートをウリジントリホスフェートと反応させてＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンにすること、
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下で、ピロホスフェートをホスフェートに変換すること、
によって、酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、バイオコンジュゲートペプチド、または小分子から、グリコシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
Ｅ）ウリジントリホスフェートを形成するために、インサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたウリジンジホスフェートを再利用すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
本明細書に記述の本発明のＧｌｃＮＡｃ化法における副生成物ウリジンジホスフェートの再利用のために、より少量のウリジンモノホスフェートは、ステップＡ）において提供される溶液に必要とされる。したがって、一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するウリジンモノホスフェートのモル比は、０．０００１から０．９９９の間、より好ましくは０．００１から０．９９の間、より好ましくは０．００５から０．９５の間、より好ましくは０．００１から０．９５の間、および最も好ましくは０．００５から０．９８の間である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するウリジンモノホスフェートのモル比は０．０５である。一実施形態において、Ｎ－アセチルグルコサミンに対するウリジンモノホスフェートのモル比は０．１である。一実施形態において、Ｎ－アセチルグルコサミンに対するウリジンモノホスフェートのモル比は０．２である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するウリジンモノホスフェートのモル比は０．５である。
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
Ｆ）ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を単離すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
Ｆ）ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を単離すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および任意にピロホスファターゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを単離すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
Ｆ）ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を単離すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、ポリホスフェートは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有する長鎖ポリホスフェートである。
好ましくは、ステップＡ）において提供される溶液中のウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、０．２ｍＭから５，０００ｍＭの範囲である。
好ましくは、酵素のセット中の酵素の濃度は、ステップＡ）において提供される溶液の総量に基づいて、０．０００１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの間である。
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットおよび任意にＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼも含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットのうちの各酵素およびグリコシルトランスフェラーゼは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共固定化される。
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成する方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化乳サッカリドは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、および乳サッカリドから、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、乳サッカリドの利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化乳サッカリドを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ化乳サッカリドは、ヒト乳オリゴサッカリドである。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、乳サッカリドは、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、ラクト－Ｎ－トリオース（ＬＮＴ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコネオペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコネオペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（Ｆ－ＬＮＨ Ｉ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ＬＮＨ ＩＩ）、ジフコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ）、ジフコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＤＦ－ＬＮＨ ＩＩ）、ジフコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＤＦ－パラ－ＬＮｎＨ）、Ｔ－トリフコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＴＦ－ＬＮＨ）、α２，６－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴｃ）、α２，６－シアリルラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＳＴａ）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴｂ）、ジシアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＤＳ－ＬＮＨ）、フコシル－－α２，６－シアリルラクト－Ｎ－テトラオース（Ｆ－ＬＳＴａ）、フコシル－シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＦＳ－ＬＮｎＨ Ｉ）、フコシル－ジシアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＤＳ－ＬＮＨ ＩＩ）を含む群から選択される（図３２参照）。
一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化炭水化物コンジュゲートワクチンは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、および炭水化物コンジュゲートワクチンから、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、コンジュゲートワクチンにおける炭水化物抗原の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化炭水化物コンジュゲートワクチンを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。好ましくは、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化もされる。
好ましくは、炭水化物コンジュゲートワクチンは、肺炎球菌サッカリド、インフルエンザ菌Ｂ型サッカリド、および髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、ＷまたはＹサッカリドから選択されるＣＲＭ１９７コンジュゲート、肺炎球菌サッカリド、インフルエンザ菌Ｂ型サッカリド、および髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、ＷまたはＹサッカリドから選択されるＴＴコンジュゲート、肺炎球菌サッカリド、インフルエンザ菌Ｂ型サッカリド、および髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、ＷまたはＹサッカリドから選択されるＤＴコンジュゲート、肺炎球菌サッカリドタンパク質Ｄコンジュゲート、またはインフルエンザ菌Ｂ型サッカリドＯＭＰＣコンジュゲート、であり、ここで、肺炎球菌サッカリドは、好ましくは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される。
一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化抗体薬コンジュゲートは、本明細書に記述の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、および抗体薬コンジュゲートから、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、抗体薬コンジュゲートの利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化抗体薬コンジュゲートを生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。好ましくは、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化もされる。
好ましくは、抗体薬コンジュゲートは、モノクローナル抗体および細胞毒性薬を含む。
一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ化治療用タンパク質は、本明細書に記載の本発明の方法によって生成される。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、および治療用タンパク質から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、治療用タンパク質の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化治療用タンパク質を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましくは、治療用タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質である。好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は、抗体である。好ましくは、抗体は、二重特異性モノクローナル抗体および抗体に基づく薬物を含むモノクローナル抗体である。好ましくは、抗体は完全にＧｌｃＮＡｃ化されていない。好ましくは、治療用タンパク質は、３Ｆ８、８Ｈ９、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アチドルトクスマブ（Ａｔｉｄｏｒｔｏｘｕｍａｂ）、アチヌマ（Ａｔｉｎｕｍａ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、アジンツキシズマブ ベドチン（Ａｚｉｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バピネズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ＢＣＤ－１００、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベゲロマブ（Ｂｅｇｅｌｏｍａｂ）、ベランタマブ マフォドチン（Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベマリツズマ（Ｂｅｍａｒｉｔｕｚｕｍａ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルリマトクスマブ（Ｂｅｒｌｉｍａｔｏｘｕｍａｂ）、ベルメキマブ（Ｂｅｒｍｅｋｉｍａｂ）、ベルサンリマブ（Ｂｅｒｓａｎｌｉｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシリソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビルタミマブ（Ｂｉｒｔａｍｉｍａｂ）、ビバツズブ マータンサイン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブレセルマブ（Ｂｌｅｓｅｌｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ボコシズマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ）、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ブロンチクツズマブ（Ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、ブロスマブ（Ｂｕｒｏｓｕｍａｂ）、カビラリズマブ（Ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ）、カミダンルマブテシリン（Ｃａｍｉｄａｎｌｕｍａｂｔｅｓｉｒｉｎｅ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カンツズマブ メルタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブ ラブタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、カプロマブ ペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、カルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カロツキシマブ（Ｃａｒｏｔｕｘｉｍａｂ）、カツマクソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ｃＢＲ９６－ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）免疫複合体、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、セルグツズマブ アムナルーキン（Ｃｅｒｇｕｔｕｚｕｍａｂ ａｍｕｎａｌｅｕｋｉｎ）、セルトリズマブ ペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セトレリマブ（Ｃｅｔｒｅｌｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、シビサタマブ（Ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ）、シルムツズマブ（Ｃｉｒｍｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブ ボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブ テトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コドリツズマブ（Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コフェツズマブ ペリドチン（Ｃｏｆｅｔｕｚｕｍａｂ ｐｅｌｉｄｏｔｉｎ）、コルツキシマブ ラブタンシン（Ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、コスフロビキシマブ（Ｃｏｓｆｒｏｖｉｘｉｍａｂ）、ＣＲ６２６１、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、クリザンリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）、クロテドゥマブ（Ｃｒｏｔｅｄｕｍａｂ）、クサツズマブ（Ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダピロリズマブ ペゴル（Ｄａｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デクレクマブ（Ｄｅｃｔｒｅｋｕｍａｂ）、デムチズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ マフォドチン（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、デパツキシズマブ マフォドチン（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デロツキシマブ ビオチン（Ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ ｂｉｏｔｉｎ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、デザミズマブ（Ｄｅｚａｍｉｚｕｍａｂ）、ディヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ディリダブマブ（Ｄｉｒｉｄａｖｕｍａｂ）、ドマグロズマブ（Ｄｏｍａｇｒｏｚｕｍａｂ）、ドリモマブ アリトックス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ドスタリマ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、ＤＳ－８２０１、ドゥリゴツズマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｚｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、ドゥルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ドゥシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デュボルツキシズマブ（Ｄｕｖｏｒｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルデルマブ（Ｅｌｄｅｌｕｍａｂ）、エレザヌマブ（Ｅｌｅｚａｎｕｍａｂ）、エルゲムツマブ（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エマクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）、エミベツズマブ（Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ（Ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ）、エナポタマブ ベドチン（Ｅｎａｐｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンフォルツマブ ベドチン（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エンリモマブ ペゴル（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブ シツセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）、エリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、エチギリマブ（Ｅｔｉｇｉｌｉｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、エクスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）、ファレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、
フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィバツズマブ（Ｆｉｂａｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フィリブマブ（Ｆｉｒｉｖｕｍａｂ）、ファランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フレチクマブ（Ｆｌｅｔｉｋｕｍａｂ）、フロテツズマブ（Ｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、フロボシマブ（Ｆｒｏｖｏｃｉｍａｂ）、フルネベトマブ（Ｆｒｕｎｅｖｅｔｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガンコタマ（Ｇａｎｃｏｔａｍａ）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガティポツズマブ（Ｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲディブマブ（Ｇｅｄｉｖｕｍａｂ）、ゲムツズマブ オゾガミシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ゲボキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）、ギルベトマブ（Ｇｉｌｖｅｔｍａｂ）、ギムシルマブ（Ｇｉｍｓｉｌｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ ベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ゴスラネマブ（Ｇｏｓｕｒａｎｅｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、イアナルマブ（Ｉａｎａｌｕｍａｂ）、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ＩＢＩ３０８、イブリツモマブ チウセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イダルシズマブ（Ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ）、イファボツズマブ（Ｉｆａｂｏｔｕｚｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イラダツズマブ ベドチン（Ｉｌａｄａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ（Ｉｍａｌｕｍａｂ）、イマプレリマブ（Ｉｍａｐｒｅｌｉｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブ ラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インダサツマブ ベドチン（Ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブ オゾガミシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イオマブ（Ｉｏｍａｂ）－Ｂ、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、イスカリマブ（Ｉｓｃａｌｉｍａｂ）、イスチラツマブ（Ｉｓｔｉｒａｔｕｍａｂ）、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イクセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ラクノツズマブ（Ｌａｃｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、ラジラツズマブ ベドチン（Ｌａｄｉｒａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、ラナデルマブ（Ｌａｎａｄｅｌｕｍａｂ）、ランドグロズマブ（Ｌａｎｄｏｇｒｏｚｕｍａｂ）、ラプリツキシマブ エムタンシン（Ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ラルカビキシマブ（Ｌａｒｃａｖｉｘｉｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レンダリズマブ（Ｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、レンベルビマブ（Ｌｅｎｖｅｒｖｉｍａｂ）、レンジルマブ（Ｌｅｎｚｉｌｕｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レロンリマブ（Ｌｅｒｏｎｌｉｍａｂ）、レソファブマブ（Ｌｅｓｏｆａｖｕｍａｂ）、レトリズマブ（Ｌｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、レクサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リファスツズマブ ベドチン（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リロトマブ サテトラキセタン（Ｌｉｌｏｔｏｍａｂ ｓａｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロキベトマブ（Ｌｏｋｉｖｅｔｍａｂ）、ロンカスツキシマブ テシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロルボツズマブ メルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ロサツキシズマブ ベドチン（Ｌｏｓａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルリズマブ ペゴル（Ｌｕｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ルムレツズマブ（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、ルパルツマブ アマドチン（Ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ ａｍａｄｏｔｉｎ）、ルチキズマブ（Ｌｕｔｉｋｉｚｕｍａｂ）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、マルスタシマ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、ミルベツキシマブ ソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モドツキシマブ（Ｍｏｄｏｔｕｘｉｍａｂ）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モナリズマブ（Ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モスネツズマブ（Ｍｏｓｕｎｅｔｕｚｕｍａｂ）、モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブ パスドックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）－ＣＤ３、ナコロマブ タフェナトックス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブ エスタフェナトックス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナラツキシマブ エムタンシン（Ｎａｒａｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ナビシキシズマブ（Ｎａｖｉｃｉｘｉｚｕｍａｂ）、ナビブマブ（Ｎａｖｉｖｕｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）、ネバクマブ（Ｎｅｂａｃｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＮＥＯＤ００１、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ネタキマブ（Ｎｅｔａｋｉｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニルセビマブ（Ｎｉｒｓｅｖｉｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブ メルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オビルトキサキシマブ（Ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オドゥリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オレクルマブ（Ｏｌｅｃｌｕｍａｂ）、オレンダリズマブ（Ｏｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、オムブルタマブ（Ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）、ＯＭＳ７２１、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンバチリマブ（Ｏｎｖａｔｉｌｉｍａｂ）、オピシヌマブ（Ｏｐｉｃｉｎｕｍａｂ）、オポルツズマブ モナトックス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パムレブルマブ（Ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パンコマブ（Ｐａｎｋｏｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツムマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、FＰＤＲ００１、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、ピディリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピナツズマブ ベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、プロザリズマブ（Ｐｌｏｚａｌｉｚｕｍａｂ）、ポガリズマブ（Ｐｏｇａｌｉｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ ベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ポネズマブ（Ｐｏｎｅｚｕｍａｂ）、ポルガビキシマブ（Ｐｏｒｇａｖｉｘｉｍａｂ）、プラシネズマブ（Ｐｒａｓｉｎｅｚｕｍａｂ）、プレザリズマブ（Ｐｒｅｚａｌｉｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ １４０、キリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラルパンシズマブ（Ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラネベトマブ（Ｒａｎｅｖｅｔｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラバガリマブ（Ｒａｖａｇａｌｉｍａｂ）、ラブリズマブ（Ｒａｖｕｌｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レファネズマブ（Ｒｅｆａｎｅｚｕｍａｂ）、レガビルマブ（Ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）、レムトルマブ（Ｒｅｍｔｏｌｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リヌクマブ（Ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、リババズマブ ペゴル（Ｒｉｖａｂａｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ラマブ（Ｒｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレドゥマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロミルキマブ（Ｒｏｍｉｌｋｉｍａｂ）、ロモソズマブ（Ｒｏｍｏｓｏｚｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロスマンツズマブ（Ｒｏｓｍａｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロバルピツズマブ テシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、
ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、ＳＡ２３７、サシツズマブ ゴビデカン（Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サムロタマブ ベドチン（Ｓａｍｒｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サトラリズマブ（Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブ ペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、セリクレルマブ（Ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セトルスマブ（Ｓｅｔｒｕｓｕｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＳＨＰ６４７、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、シルトラツマブ ベドチン（Ｓｉｒｔｒａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、ソフィツズマブ ベドチン（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スプタブマブ（Ｓｕｐｔａｖｕｍａｂ）、スチムリマブ（Ｓｕｔｉｍｌｉｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、スブラトクスマブ（Ｓｕｖｒａｔｏｘｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブ テトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タラコツズマブ（Ｔａｌａｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ パプトックス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、タレクスツマブ（Ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、タボリマブ（Ｔａｖｏｌｉｍａｂ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブ アリトックス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テリソツズマブ ベドチン（Ｔｅｌｉｓｏｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、テポジタマブ（Ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、テシドルマブ（Ｔｅｓｉｄｏｌｕｍａｂ）、テツロマブ（Ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、テゼペルマブ（Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チブリズマブ（Ｔｉｂｕｌｉｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、チミグツマブ（Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、チモルマブ（Ｔｉｍｏｌｕｍａｂ）、チラゴツマブ（Ｔｉｒａｇｏｔｕｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、チソツマブ ベトチン（Ｔｉｓｏｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トムゾツキシマブ（Ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ）、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トサトクスマブ（Ｔｏｓａｔｏｘｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トベツマブ（Ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ エムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、トレボグルマブ（Ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ツコツズマブ セルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウロクプルマブ（Ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、バダスツキシマブ タリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、バナリマブ（Ｖａｎａｌｉｍａｂ）、バンドルツズマブ ベドチン（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バンチクツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バリサクマブ（Ｖａｒｉｓａｃｕｍａｂ）、バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボバリリズマブ（Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボンレロリズマブ（Ｖｏｎｌｅｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ボプラテリマブ（Ｖｏｐｒａｔｅｌｉｍａｂ）、ボルセツズマブ マフォドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ブナキズマブ（Ｖｕｎａｋｉｚｕｍａｂ）、クエンツズマブ（Ｘｅｎｔｕｚｕｍａｂ）、ＸＭＡＢ－５５７４、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ゼノクツズマブ（Ｚｅｎｏｃｕｔｕｚｕｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾルベツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）（＝ＩＭＡＢ３６、クラウジキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ））、およびゾリモマブ アリトックス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）からなる群から選択される。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼおよび／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼも含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼ、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼを更に含む。好ましくは、酵素のセットのうちの各酵素およびＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、固体支持体に共固定化される。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、および抗体から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、抗体の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化抗体を生成すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、次のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン；
（ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェート
を含む溶液を提供すること、および
グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、および
Ｂ）酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン、および抗体から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、抗体の利用可能なヒドロキシル基との間に、Ｏ－グリコシド結合を形成することによって、ＧｌｃＮＡｃ化抗体を生成すること、
Ｅ）ウリジントリホスフェートを形成するために、インサイチュ（ｉｎ－ｓｉｔｕ）形成されたウリジンジホスフェートを再利用すること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に固定化される、または吸着固定化される。
好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化されることにより、各酵素の活性の大部分を増加させる、または保持する。
本明細書に記述の本発明のＧｌｃＮＡｃ化法における副生成物ウリジンジホスフェートの再利用のために、少量のＵＭＰは、ステップＡ）において提供される溶液に必要とされる。したがって、一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は、０．０００１から０．９９９の間、より好ましくは０．０００５から０．９９５の間、より好ましくは０．００１から０．９９５の間、より好ましくは０．００２から０．９９の間、および最も好ましくは０．０５から０．９８の間である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は０．０５である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は０．１である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は０．２である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は０．５である。
他の実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は、１から１０の間、より好ましくは１．２から８の間、より好ましくは１．５から７の間、より好ましくは１．６から６の間、および最も好ましくは２から５の間である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は１．５である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は２である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は５である。一実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに対するＵＭＰのモル比は１０である。
図の説明：
図１は、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンが低コストの基質であるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ポリホスフェート、およびＵＭＰから酵素的に合成される多酵素カスケードを示す。反応カスケードは、（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびＡＴＰからのＮ－アセチルグルコサミン－１－ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ－１Ｐ）の形成、（ｂ）ＵＭＰおよびポリホスフェートからウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の形成、および（ｃ）Ｎ－アセチルグルコサミン１－ホスフェートとウリジントリホスフェートとの反応でＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンにすること、からなる。任意に、酵素グルコース１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼを阻害するピロホスフェートＰＰｉを加水分解するために、無機ジホスファターゼ（ＰｍＰｐａ）を、反応カスケードに加えることができる。カスケードを、ＡＴＰへのＡＤＰの変換を助けるために１Ｄ－ＰＰＫ２を添加することによって拡張することもできる。さらに、カスケードを、ＡＤＰへのＡＭＰのリン酸化を活性化するために２Ｄ－ＰＰＫ２を添加することによって拡張することができる。さらに、カスケードを、アデノシンホスフェートの頻繁な加水分解を阻害するために、１Ｄ－ＰＰＫ２および２ＤＰＰＫ２を添加することによって拡張することができる。 図２は、ウリジンまたはウラシル、および５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェートから出発してＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための本発明の方法の例示的な反応スキームを示す。ウリジンからのＵＭＰの形成は、ウリジンキナーゼによって触媒され、およびウラシルからのＵＭＰの形成は、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼによって触媒される。 図３は、個別に固定化された酵素、および酵素のセットの共固定化を用いたＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成の生産性の比較を示す。共固定化は、結果的に大幅に高い生産性をもたらす。 図４は、最初のサイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の固体支持体スクリーニングの結果を示す。生産性は、ＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図５は、２番目のサイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の固体支持体スクリーニングの結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図６は、ＥＣＲ８２８５樹脂－ブチル基およびエポキシ基の両方を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、９サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図７は、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）ＣＭ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート／アクリルアミド樹脂－に共固定化された酵素を用いた、９サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図８は、ＥＣ－ＨＦＡ樹脂－アミノエポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、９サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図９は、ＥＣＲ８２１５Ｆ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、９サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１０は、ＥＣ－ＨＦＡ４０３／Ｍ樹脂－アミノエポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、９サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１１は、ＥＣＲ８２０９Ｆ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、９サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１２は、Ａ）いくつかの固体支持体の固定化後に上清中のタンパク質を定量化することによって測定されたエポキシ固体支持体に結合されたタンパク質の量の図を示す。標準的なＢＣＡタンパク質定量化プロトコルに従った。 Ｂ）いくつかの固体支持体の固定化後に上清中のタンパク質を定量化することによって測定されたイオン性、および吸着固体支持体に結合されたタンパク質の量の図を示す。標準的なＢＣＡタンパク質定量化プロトコルに従った。 Ｃ）いくつかの固体支持体の固定化後に上清中のタンパク質を定量化することによって測定されたグルタルアルデヒド活性化固体支持体に結合されたタンパク質の量の図を示す。標準的なＢＣＡタンパク質定量化プロトコルに従った。 図１３は、Ａ）ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ（および他の反応物）の定量化のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す。示されるクロマトグラムは、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）ＣＭに固定化された酵素カスケードによって触媒された反応からのものである。 Ｂ）ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ（および他の反応物）の定量化のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムである。示されるクロマトグラムは、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＣＡＴ、ＥＣＲ１５０４、ＩＢ－ＡＮＩ１に固定化された酵素カスケードによって触媒された反応からのものである。 Ｃ）ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ（および他の反応物）の定量化のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムである。示されるクロマトグラムは、グルタルアルデヒドによって活性化されたＥＣＲ８３１５Ｆに固定化された酵素カスケードによって触媒された反応からのものである。 図１４は、ＥＣ－ＥＰ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、３シリーズで２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１５は、ＥＰ４０３／Ｍ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、３シリーズで２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１６は、ＣＯＶ１樹脂－ブチル／エポキシ基を用いて官能基化されたポリアクリル樹脂－に共固定化された酵素を用いた、３シリーズで１０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１７は、ＣＯＶ２樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたポリアクリル樹脂－に共固定化された酵素を用いた、３シリーズで１０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１８は、ＣＯＶ３樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたポリアクリル樹脂－に共固定化された酵素を用いた、３シリーズで１０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図１９は、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）ＣＭ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたアクリル樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２０は、ＥＣＲ８２１５Ｆ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２１は、ＥＣＲ８２０４Ｆ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２２は、ＥＣＲ８２０９Ｆ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２３は、ＥＣＲ８２８５Ｆ樹脂－ブチル／エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２４は、ＥＰ４０３／Ｓ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたポリメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２５は、ＥＰ４００／ＳＳ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたポリメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２６は、ＥＣ－ＨＦＡ４０３／Ｍ樹脂－アミノエポキシ基を用いて官能基化されたポリメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２７は、ＥＣ－ＨＦＡ４０３／Ｓ樹脂－アミノエポキシ基を用いて官能基化されたポリメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２８は、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ樹脂－アミノエポキシ基を用いて官能基化されたポリメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図２９は、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｍ樹脂－アミノエポキシ基を用いて官能基化されたポリメタクリレート樹脂－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図３０は、イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄ）１５０Ｐ樹脂－エポキシ基を用いて官能基化されたメタクリレート樹脂のコポリマー－に共固定化された酵素を用いた、２０サイクルにおけるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成の結果を示す。生産性はＨＰＡＥＣ－ＵＶによって測定された。 図３１は、過剰発現した酵素を含むバイオマスを混合することから始まり、固体支持体でのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成反応を実行するまでの、完全なＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃカスケードのワークフロースキームを示す。ワークフローは、酵素固定化のための様々な固体支持体をスクリーニングするためにも適している。 図３２は、例示的なＧｌｃＮＡｃヒト乳サッカリドを示す。 図３３は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成のために、２０サイクルまでのＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＥＰ／Ｍ、およびＮｉ－ＮＴＡビーズの活性を示す。Ｎｉ－ＮＴＡ実験を３回行った。 図３４は、実施例５のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃカスケードで形成された中間体および生成物を示す。（Ａ）ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、（Ｂ）ＵＭＰ、ＵＤＰ、およびＵＴＰ、（Ｃ）ＡＤＰおよびＡＴＰを示す。実験を３回行い、エラーバーは標準偏差を表す。 図３５は、実施例５のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃスケールアップ実験において形成された抽出物、中間体、および生成物を示す。（Ａ）ウリジン、（Ｂ）ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、（Ｃ）ＵＭＰ、（Ｄ）ＵＤＰを示す。 図３５は、実施例５のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃスケールアップ実験において形成された抽出物、中間体、および生成物を示す。（Ｅ）ＵＴＰ、（Ｆ）ＡＴＰ、および（Ｇ）ＡＤＰを示す。 図３６は、各ビーズに結合されたタンパク質の相対総量を示す。実験を３回行い、エラーバーは標準偏差を表す。 図３７は、試験された各固体支持ビーズでの本発明のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成についての反応生成物のクロマトグラムを示す。 図３７は、試験された各固体支持ビーズでの本発明のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成についての反応生成物のクロマトグラムを示す。 図３７は、試験された各固体支持ビーズでの本発明のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成についての反応生成物のクロマトグラムを示す。 図３８は、種々のビーズでの活性試験の結果を示す。実験は、レリザイム（Ｒｅｌｉｚｙｍｅ）ＨＦＡ４０３／Ｓおよびレリザイム（Ｒｅｌｉｚｙｍｅ）ＨＦＡ４０３／Ｍを除いて３回行い、これらの３回連続サイクルの平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。 図３９は、各選択されたビーズにおける１０回の連続反応サイクルでの活性試験の結果を示す。 図３９は、各選択されたビーズにおける１０回の連続反応サイクルでの活性試験の結果を示す。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがって、当該実施のための好ましい方法を構成すると見なされることができることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様の（ｌｉｋｅ）または類似の（ｓｉｍｉｌａｒ）結果を得ることを理解すべきである。
本発明の様々な態様における更なる修正および代替的な実施形態は、この明細書を考慮して当業者に明らかであろう。したがって、この明細書は、実例としてのみ解釈されるべきであり、当業者に本発明を実施する一般的な方法を教示することを目的としている。本明細書に示され、および記述される本発明の形態は、実施形態の例とされるべきであることを理解するべきである。全ては、本発明におけるこの明細書の利益を得た後に当業者に明らかになるように、要素および材料は、本明細書に説明された、および記載されたものと代わってもよく、部分および工程を逆にしてもよく、本発明の具体的な特徴を独立して利用してもよい。変更を、以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される要素において行ってもよい。
実施例
略語および頭字語
ＡＤＰ アデノシン５’－ジホスフェート
ＡＭＰ アデノシン５’－モノホスフェート
ＡＴＰ アデノシン５’－トリホスフェート
ｄＨ２Ｏ 脱イオン化水
ＮａｈＫ Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ
ＵＤＰ ウリジン５’－ジホスフェート
ＵＭＰ ウリジン５’－モノホスフェート
ＵＴＰ ウリジン５’－トリホスフェート
ＧｌｃＮＡｃ Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
ポリＰ ポリホスフェート
ＰＰｉ ピロホスフェート
Ｐｉ ホスフェート
ＰＰＫ２ ポリホスフェートキナーゼ２
ＰＰＫ３ ポリホスフェートキナーゼ３
１Ｄ－ＰＰＫ２ １－ドメインポリホスフェートキナーゼ２
２Ｄ－ＰＰＫ２ ２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２
ＧａｌＵ グルコース１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ
ＵＲＡ６ ウリジンモノホスフェートキナーゼ
ＵＰＰ ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ
ＰｍＰｐＡ パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）無機ピロホスファターゼ
化学物質および試薬
特に明記しない限り、全ての化学物質および試薬は、シグマ－アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手され、入手可能な最高の純度のものであった。固体支持体は、レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）、キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ）、ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）、およびマイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）から入手した。
実施例１：酵素の調製
工学的無細胞合成代謝経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ゴールド（Ｇｏｌｄ）（ＤＥ３）によって全て生成された５つの酵素（図１）からなる。酵素は文献に従って選択された：ＧｌｃＮＡｃをリン酸化するために、ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）からのＮａｈＫ（ＥＣ２．７．１．１６２）；ＧｌｃＮＡｃ－１Ｐウリジリルトランスフェラーゼとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＭＧ１６５５からのＧａｌＵ（ＥＣ２．７．７．９）；ＵＭＰからのＵＤＰのインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）再生のための、アラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＵＲＡ６（ＥＣ２．７．４．１４）；エネルギー担体、ＡＤＰおよびＵＤＰの、それらのトリホスフェートコンジュゲートへのインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）回復のための、ルエゲリア ポメロイ（Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｐｏｍｅｒｏｙｉ）からのＰＰＫ３（ＥＣ２．７．４．１）；およびピロホスフェートを阻害するＧａｌＵの分解のための、パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｐｍ７０からのＰｍＰｐＡ（ＥＣ３．６．１．１）。使用されたすべての酵素の詳細を、以下の表１に与える。
Figure 0007457112000013
形質転換、培養、発現
全ての遺伝子発現について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ゴールド（ＤＥ３）を宿主生物として使用した。
遺伝子発現
プラスミドおよびストック培養物
遺伝子配列を有するプラスミド（カナマイシン耐性を有するｐＥＴ２８ａ）を持つ全てのＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）培養物のストック溶液は、以前の研究から入手可能であった［１，２］。ストック溶液は５０％のグリセロールを含み、－２０℃で保持された。
遺伝子および対応するタンパク質配列を、ユニポット（ＵｎｉＰｒｏｔ）データベースから得た：ＰｍＰｐＡ（Ｐ５７９１８）、ＮａｈＫ（Ｅ４Ｒ３Ｅ３）、ＧａｌＵ（Ｐ０ＡＥＰ３）、ＰＰＫ３（Ｑ５ＬＳＮ８）、およびＵＲＡ６（Ｏ０４９０５）。遺伝子デザイナー（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）２．０ソフトウェア（ジーンデザイナー社（Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）、ＤＮＡ ２．０、メンロパーク、カリフォルニア州）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためのヌクレオチド配列におけるコドン使用を最適化するために使用した。結果的に得られた配列を、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成し、ジェーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、レーゲンスブルク、ドイツ）によってクローン化した。ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）へのサブクローニングのために次の制限部位を使用した：ＧａｌＵ、ＮａｈＫ、ＰｍＰｐＡ（Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を持つ酵素）のためのＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ、ＰＰＫ３およびＵＲＡ６を有するＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｎ末端Ｈｉｓタグの場合）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのプラスミドの形質転換後、ＤＮＡを単離し、コンストラクトの正確さを、遺伝子シーケンシング（ユーロフィン ジェノミクス社（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、エーバースベルグ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）、ドイツ）によって確認した。
酵素発現
異種遺伝子発現のために、アリコートをストック溶液から取り出し、対応する抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに広げた。プレートを、３７℃で一晩培養した。単一培養物を、バッフルを備えた振とうフラスコ内にて前培養物（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）に植菌するために使用した。培養物を、典型的に、約４．２のＯＤ６００まで増殖した。５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む主な発現培養物を、典型的に、１％の前培養物と共に植菌し、３７℃でＯＤ６００が約０．６～０．８になるまで培養した。温度を、その後１６℃～２０℃に変更し、発現を、典型的に、０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。典型的に、２０時間後、培養物を、典型的に、６０００×ｇで３０分間、４℃で採取した。使用された培地は、ＧａｌＵ（ＬＢ培地）を除いてＴＢ培地であった（表２を参照）。
Figure 0007457112000014
酵素精製
プラスミドｐＥＴ２８ａおよびｐＥＴ１００／Ｄ－ＴＯＰＯは、Ｎ－末端ヒス（Ｈｉｓ）６タグを有し、したがって、酵素は、ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からのＡＫＴＡスタート（ｓｔａｒｔ）システム、およびヒストラップ（ＨｉｓＴｒａｐ）高性能（Ｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）または高速流（Ｆａｓｔ－Ｆｌｏｗ）カラム（１ｍＬカラム容量）を使用してイオン金属親和性クロマトグラフィーを用いて精製される。酵素の精製のために、細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍｇ２＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）で超音波処理することによって溶解した。
イミダゾール（５００ｍＭ）を、アイソクラティック溶出における溶出液として使用した（５０ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍｇ２＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）。製造業者によって推奨される標準条件を使用した。精製後、酵素濃度をＢＣＡ分析によって試験し、ＳＤＳ－ゲルによって評価した。
実施例２：ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの不均一調製
測定
ＵＶ（２６０ｎｍ）およびパルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）を有する高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を、反応物の濃度を測定するために利用した。分析物の分離および定量のために、ステップグラジエント溶出法が開発され、実証されたクロマトグラフィー分離を、非多孔質ペリキュラーカラム カルボパック（ＣａｒｂｏＰａｃ）ＰＡ１（２５０×２ｍｍ）を使用して、０．５ｍＬ／分のシステムフローで実行した。ＨＰＡＥＣシステム（ＩＣＳ５０００）、並びに全てのカラム、構成要素、およびソフトウェアを、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ウォルサム、米国）から購入した。
実験Ａ
広範囲の市販の固体支持体（表３を参照）を、本発明のＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン合成（図１を参照）において使用される酵素の共固定化について試験し、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンの合成に対するそれらの効果を評価した。
Figure 0007457112000015
Figure 0007457112000016
様々な酵素をロードされたビーズにおける多酵素カスケードを試験するために、各樹脂の所定の質量（表３を参照）を、２ｍＬの低結合チューブに添加した。溶解緩衝液との約２時間のインキュベーション後（表４参照）、上清を除去した［平衡化ステップ］。その後、０．５ｍＬの細胞溶解物を、各チューブに添加し、４℃で一晩（約１２時間）インキュベーションした。インキュベーション後、ビーズを洗浄し（３回）、ブロッキング緩衝液（２Ｍグリシン）を添加した。ビーズを、ブロッキング緩衝液と共に室温で２４時間インキュベーションした。その後、ブロッキング緩衝液を除去し、ビーズを、溶解緩衝液を用いて３回洗浄した。
Figure 0007457112000017
基質を含む２００μＬの供給溶液（表５を参照）を、ビーズを含む各チューブに移した。反応を、３０℃で約１７時間、および振とう下で（６００ｒｐｍ）行った。その後、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミン濃度を、ＨＰＡＥＣ－ＵＶ／ＰＡＤによって測定した。結果を図４に示す。
Figure 0007457112000018
ビーズの再利用性を評価するために、最初のサイクルの後、上清を除去し、ビーズを、溶解緩衝液を用いて１回洗浄した。その後、２００μＬの供給溶液を、ビーズに添加した。反応を、３０℃で約１０時間、および振とう下（６００ｒｐｍ）で行った。結果を図５に示す。いくつかの市販のビーズに共固定化された酵素は、再利用に有用であり、共固定化酵素を有する機械的に頑丈なビーズを提供することが示される。
２回目のサイクル後、特定のビーズを選択し、ビーズの更なる再利用可能性を評価した。結果を図６～図１１に示す。
実験Ｂ
酵素固定化
固定化酵素は、しばしば、溶液から分離され、再利用されることができる。さらに、それらはより高い活性を示す可能性があり、広範な工程、例えば、充填層反応器における連続合成などのために使用されることができる。広範な市販の固体支持体を、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ多酵素カスケードの共固定化について試験した。
Figure 0007457112000019
Figure 0007457112000020
Figure 0007457112000021
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Figure 0007457112000033
固体支持体は、固定化支持体の固定化機構に応じて、ここでは３つのグループに分けられる：ａ）エポキシ（アミノエポキシを含む）支持体、ｂ）イオン性＆吸着支持体、ｃ）グルタルアルデヒド活性化支持体。さらに、３つの異なる固体支持体の対タンパク質比を、各固体支持体について試験し、最適な比率を明らかにした：シリーズ１、シリーズ２、およびシリーズ３（表８～表１１参照）。
Figure 0007457112000034
Figure 0007457112000035
Figure 0007457112000036
Figure 0007457112000037
実験は次のプロトコルに従った。過剰発現された酵素を含むバイオマスを混合し［表１３を参照、ステップ１］、６０００×ｇで、３０分間、４℃で遠心分離した［ステップ２］。細胞沈殿物を、固定化／溶解緩衝液に再懸濁し、１５０ｍＬの容量にした（表１２を参照）［ステップ３］。細胞を、超音波処理によって溶解した［ステップ４］。超音波処理後、スラリーを、１２０００×ｇで、４５分間、４℃で遠心分離し［ステップ５］、細胞片を除去し、続いて、１．２μｍおよび０．８μｍフィルターに通してろ過した。遠心分離後、上清を取り除き、氷上で保持した。上清（タンパク質ストック溶液）における総タンパク質濃度は、１４．５（＋／－０．５）ｍｇ／ｍＬであった。各イモビライザーにおける所定の質量を、２ｍＬの低結合チューブに加えた。アミノ官能化支持体を、グルタルアルデヒド活性化支持体（グループｃ）を生成するために、グルタルアルデヒドと共に活性化緩衝液中で１時間インキュベーションすることにより活性化させた。固体支持体を、洗浄緩衝液Ａ（エポキシ支持体およびグルタルアルデヒド支持体用）および洗浄緩衝液Ｂ（イオン性＆吸着支持体用）を用いて２回洗浄し、固定化／溶解緩衝液を用いて１時間平衡化した。その後、細胞溶解物を各チューブに加え、４℃で一晩（～３６時間）インキュベーションした［ステップ６］。固定化酵素を有する支持体を、洗浄緩衝液を用いて洗浄した（３回）［ステップ７］。さらに、エポキシ支持体を、ブロッキング緩衝液（２Ｍグリシン）と共に２４時間インキュベーションした［ステップ８］。その後、ブロッキング緩衝液を捨て、支持体を、洗浄緩衝液Ａを用いて３回洗浄した。
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Figure 0007457112000039
固体支持体に結合したタンパク質の量を、固定化後の上清中のタンパク質を定量化することによって測定した。標準的なＢＣＡタンパク質定量化プロトコルを行った。いくつかの樹脂の結果（表９～１１を参照）を、図１２Ａ～１２Ｃに示す。
反応
多酵素カスケードを試験するために－固定化された様々な支持体で－基質を含む供給溶液（表１４を参照）を、生体触媒を含むチューブに移した。固体支持体の供給量対質量比を１に保つために、次の供給量を添加した：１００μｌ（シリーズ１）、２５０μＬ（シリーズ２）、および５００μＬ（シリーズ３）。反応を、約２０～２５時間、３０℃で、回転ミキサー（８ｒｐｍ）で振とうしながら行った。反応を評価するために、上清を除去し、その後、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ濃度を、ＨＰＡＥＣ－ＵＶ／ＰＡＤによって測定した。ＨＡＰＥＣ－ＵＶ／ＰＡＤによる定量化のために、３μｌのアリコートを、１００μｌの脱イオン化水を用いて希釈し、その後、注入した。クロマトグラムの例を、図１３Ａ～Ｃに示す。次の反応を開始する前に、固体支持体を、１ｍＬの脱イオン化水を用いて２回洗浄した。
Figure 0007457112000040
結果
酵素固定化
反応の結果を、図１４～図３０に示す。注意すべきは、最適な固体支持体を予測するための酵素の固定化についての知識が不十分であるため、最適な固体支持体を見つけることは常に実験的な試行錯誤に至っているということである［３］。
驚くべき発見は、多酵素カスケードが広範囲のエポキシ支持体に共固定化された場合に活性を示したということであった。試験され、活性を示したエポキシ支持体は、支持体マトリックス、粒子サイズ、孔サイズ、およびオキシラン含有量において異なった。酵素が疎水性吸着、イオン相互作用、またはグルタルアルデヒドとの共有結合的架橋によって固定化される他の固体支持体は、活性をほとんど、または全く示さず、このことは、５つの主要な酵素の少なくとも１つは、ほとんど活性がない～不活性であることを示す。さらに、多酵素カスケードは、広範な種々の比率のタンパク質対固体支持体が使用される場合に、エポキシ支持体において活性を有した。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成に関して、酵素をロードされた多くのエポキシ支持体を、支持体に酵素を再固定化することなく、２０を超える反応サイクルで使用することができる。
Figure 0007457112000041
Figure 0007457112000042
Figure 0007457112000043
実施例３：カスケードの結合
カスケードは、ＧｌｃＮＡｃを受容体分子に移動させるために、ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．１．Ｘ）と結合することができる。受容体分子は、例えばモノクローナル抗体であることができる。結合可溶性ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼを加えることができるために、ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼを、同じ支持体に共固定化することができ、および／またはＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼを、追加の支持体に固定化し、その後、反応に加えることができる。
実施例４：Ｎｉ－ＮＴＡ固体支持体に固定化された多酵素カスケードによるＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成
ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成経路における酵素を、以前に詳しく述べたように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え技術によって生成した。バイオマスを、表１８Ａに詳しく述べられるように混合し、１５０ｍＬの溶解緩衝液中で、８分間、８００～１０００ｐｓｉで均質化した（表１８Ｂを参照）。細胞溶解物を、遠心分離し（７０００×ｇ、４５分）、酵素を含む上清を、ろ過した（１．８μｍフィルター）。１０ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度を決定した。固定化の準備のために、５００μＬのＮｉ－ＮＴＡビーズスラリーを、それぞれ２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、付加的に１０ｍＭのイミダゾールを含む溶解緩衝液を用いて平衡化した。Ｎｉ－ＮＴＡにおける固定化は、固定化緩衝液（溶解緩衝液および１０ｍＭイミダゾール）中で事前に平衡化したビーズと共に１．５ｍＬの溶解物をインキュベーションすることによって行った。固定化後、ビーズを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した（表１８Ｃを参照）。
Figure 0007457112000044
反応サイクルを、ビーズの活性を評価するために行った。各反応を、３０℃で２０～２５時間、６００ｒｐｍで振とうしながら行った。反応を開始するために、２５０μＬの供給溶液を、洗浄したビーズに添加した（表１９）。実験の間に、上清を除去し、ビーズを１ｍＬの脱イオン化水を用いて２回洗浄した。
Figure 0007457112000045
Ｎｉ－ＮＴＡビーズに固定化されたＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃカスケードは、９つの反応について活性の低下を示す（図３３参照）。いくつかの残留活性は、反応番号１０および１１において検出可能であるが、エポキシビーズにおける活性と比較して無視できる。要約すると、エポキシ官能基を有する広範な固体支持体に固定化されたカスケードは、Ｎｉ－ＮＴＡビーズと比較して拡張された活性を示す。その結果として、エポキシビーズはより頻繁に再使用されることができ、したがって、より経済的である。
実施例５：ウリジンおよびＧｌｃＮＡｃからのＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成
ウリジンからＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを合成するためのカスケードを、図２に示す。カスケードは、６つの酵素および７つの反応物を含む。ウリジン（Ｕｒｉ）、Ｎ－アセチル－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ポリホスフェート（ポリＰｎ）は、主要な基質として使用され、触媒量のアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）を含む。
酵素の組換え生成
この研究において使用されたプラスミドのリストを、表２０に示す。ＬＯＢＳＴＲ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテントセル（ケラファスト社（Ｋｅｒａｆａｓｔ）、米国）を、発現宿主として使用した。細胞を、熱ショックプロトコルに基づいて形質転換した。発酵を、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４および対応する抗生物質を有するＴＢ培地補助剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）で行った。細胞を、０．８～１．０のＯＤ６００が観察されるまで３７℃で培養した。その後、誘導を、０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて行い、１６℃で２０～２４時間培養した。
培養の最後に、細胞を遠心分離（７０００×ｇ、２０分）によって回収し、細胞沈殿物を、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール、ｐＨ７．４）に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（マキシメーター社（Ｍａｘｉｍａｔｏｒ）、ドイツ）（８００～１０００ｐｓｉで３回通過）によって破壊した。ヒス（Ｈｉｓ）－タグ精製を、アクタ（ＡＫＴＡ）スタート機器（ＧＥ ヘルスケアライフサイエンシーズ社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ウプサラ、スウェーデン）を用いて、１ｍＬまたは５ｍＬヒストラップ（ＨｉｓＴｒａｐ）ＨＰ（ＧＥ ヘルスケアライフサイエンスズ社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、スウェーデン）カラムと組み合わせて固定化金属親和性クロマトグラフィーに基づいて行った。結合緩衝液は、ｐＨ ７．４で、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロールを含む。また、溶出緩衝液は、ｐＨ７．４で、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロールからなる。
溶出緩衝液からイミダゾールを除去し、酵素溶液を濃縮するために、緩衝液交換を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）－１５遠心フィルターユニット－３ＫＤａ ＭＷカットオフ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ）を用いて行った。交換緩衝液は、ｐＨ７．４で、５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロールを含んだ。その後、濃縮液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（濃縮酵素）を、グリセロールと１：１で混合し、最終酵素溶液を５０％グリセロール溶液にし、酵素を－２０℃で保存した。
Figure 0007457112000046
実験Ａ：精製酵素を用いたＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成
反応を２００μＬ、３７℃、５５０ｒｐｍで行った。反応条件は次の通りであった：ＵＤＫ、０．０７μｇ／μＬ；ＵＲＡ６／ＰＰＫ３、０．１１μｇ／μＬ；ＮＡＨＫ、０．１８μｇ／μＬ；ＧＬＭＵ、０．２μｇ／μＬ；ＰｍＰｐａ、０．０５μｇ／μＬ；ウリジン、６８ｍＭ；ＧｌｃＮＡｃ、６８ｍＭ；ＡＴＰ、２．１ｍＭ；ポリＰｎ、２１ｍＭ；トリス－ＨＣｌ（ｐＨ，８．５）、１５０ｍＭ；ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの成功した生成およびカスケード中間体の濃度を、図３４に示す。ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃは、定量的収率で生成され、結果的に～４０ｇ／Ｌの最終濃度をもたらす。
実験Ｂ：ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの大規模合成
ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成のための細胞溶解物を調製するために、以下のバイオマスを混合した：ＵＤＫ、６．６５ｇ；ＵＲＡ６／ＰＰＫ３、９．２６ｇ；ＮＡＨＫ、１１．２３ｇ；ＧＬＭＵ、６．９ｇ；ＰｍＰｐａ、２００ｍＬの５０ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ８．１）中に４．９４ｇ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、および５％グリセロール。混合物を、高圧ホモジナイザーに３回通した。無細胞抽出物を、１１，０００×ｇで４５分間遠心分離した。その後、予備実験を、合成のために適した溶解物の量を見つけるために、小規模（２００μＬ）で行った。２００μＬ合成に基づく結果を、２０，０００×倍率に相関する４リットル規模合成のために直接使用した。
４リットルの大規模実験を行うために、２つのピッチド－ブレードインペラー（ｐｉｔｃｈｅｄ－ｂｌａｄｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒｓ）を備えた、７リットルの単層ガラスのオートクレーブ可能なバイオリアクター（アプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）、オランダ）を選択し、大規模生成を行った。
合成条件は次のとおりであった：２００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６２ｍＭウリジン、６２ＧｌｃＮＡｃ、１．６ｍＭ ＡＴＰ、１８ｍＭポリＰｎ、７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および細胞溶解物の形での０．５ｇ／Ｌの総タンパク質ロード。反応を、３７℃室、１２０ｒｐｍで行った。カスケードの実行に対するスケールアップの影響を理解するために、同様の２００μＬ実験を行った。カスケード中間体の時間経過を、図３５に示す。
実験Ｃ：固定化酵素を用いたＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成
工程を将来の産業的応用により近づけるために、固定化を、全ての必要な酵素を含む細胞溶解物を使用して行った（上述の通り）。細胞溶解物溶液は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの４Ｌスケール合成において使用されたものと同じであった。酵素の共固定化の支持体として、この研究において使用されたビーズのリストを、表２１に記述する。
Figure 0007457112000047
Figure 0007457112000048
平均で、２００ｍｇのビーズ（表２１）を、新しい２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、続いて、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成のために酵素を含む０．６ｍＬの細胞溶解物溶液を添加した。総タンパク質に対するビーズの比率（質量）は、約２０であった。間隔（ｉｎｔｅｒｖａｌ）回転混合（～６時間ごと）しながら室温で２４時間インキュベーションした後、酵素含有溶液を除去した。その後、ビーズを、弱く結合したタンパク質を除去するために、高濃度の塩（２００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および６００ｍＭ ＮａＣｌ）を含む洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した。その後、ビーズを、結合されていない結合部位をブロックするために、保存緩衝液（２００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および３００ｍＭ ＮａＣｌ）で２４時間インキュベーションした。結合されたタンパク質の割合を図３６で説明する。
固定化酵素の活性を評価するための供給溶液は、２００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭウリジン、２５ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭポリＰｎを含んだ。２５０μＬの供給溶液をビーズに加え、３７℃、６００ｒｐｍで２４時間インキュベーションした。全ての６つの酵素が、酵素の活性型で固体支持体に結合することを確認するために、各固体支持体ビーズとの反応をモニタリングした。各ビーズとの反応のクロマトグラムを図３７に示す。各ビーズの活性試験の結果を図３８に要約する。したがって、次のビーズを良好な実行ビーズとして選択した：レリザイム（Ｒｅｌｉｚｙｍｅ）ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、およびＥＣＲ８２０９Ｍ。
固定化酵素を使用することにおいて最も重要な要素の１つである様々なサイクルでの安定性を評価するために、前述のビーズの活性を、種々のサイクルで評価した。各サイクルにおいて、２５０μＬの供給溶液（２００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭウリジン、２５ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ポリＰｎ）を、ビーズを含む各バイアルに添加し、６００ｒｐｍおよび３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、液体を除去し、ビーズを、水を用いて２回洗浄し、前のサイクルからの任意の持ち越しを回避した。１０サイクルでの各ビーズの活性を、図３９に示す。試験されたビーズ レリザイム（Ｒｅｌｉｚｙｍｅ）ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、およびＥＣＲ８２０９Ｍは、重大に活性を失うことなく１０サイクル連続して活性を有することが証明されている。平均して、各サイクルにおいて、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃは、～７ｇ／Ｌの濃度で上清に蓄積される。
実験Ｄ：ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃカスケードのβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミントランスフェラーゼへの結合
この実験において、（図２に示されるような）ウリジンおよびＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの合成のための反応カスケードを、単一ポットでラクト－Ｎ－トリオース（ＬＮＴ ＩＩ）を合成するために、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（β１，３ＧｌｃＮＡｃＴ）と結合した。
実験条件は、最終容量２５０μＬで、次の通り：２００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３０ｍＭラクトース、５ｍＭウリジン、４０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、１．１ｍＭ ＡＴＰ、１２ｍＭポリＰｎ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２および次の酵素：ＵＤＫ（０．０６μｇ／μＬ）、ＵＲＡ６／ＰＰＫ３（０．１１μｇ／μＬ）、ＮＡＨＫ（０．１４μｇ／μＬ）、ＧＬＭＵ（０．２１μｇ／μＬ）、ＰｍＰｐａ（０．０４μｇ／μＬ）、β１，３ＧｌｃＮＡｃＴ（０．０６μｇ／μＬ）であった。３０℃で４８時間インキュベーション後、ＬＮＴＩＩを、４．７ｍＭ（２．５ｇ／Ｌ）の最終濃度で生成した。
１．Ｍａｈｏｕｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ウリジンジホスフェートＮ－アセチルグルコサミンの合成のための５酵素無細胞カスケードの確立（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｆｉｖｅ－ｅｎｚｙｍｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃａｓｃａｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８．２８３：ｐ．１２０－１２９．
２．Ｒｅｘｅｒ，Ｔ．Ｆ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，脂質結合オリゴサッカリドの酵素的集合のための多酵素カスケードによるＧＤＰ－マンノースのワンポット合成（Ｏｎｅ ｐｏｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＧＤＰ－ｍａｎｎｏｓｅ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉ‐ｅｎｚｙｍｅ ｃａｓｃａｄｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄ‐ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１８．１１５（１）：ｐ．１９２－２０５．
３．Ｌｉｅｓｅ，Ａ．およびＬ．Ｈｉｌｔｅｒｈａｕｓ，産業適用のための固定化酵素の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１３．４２（１５）：ｐ．６２３６－６２４９．

Claims (14)

  1. ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成するための方法であって、次のステップ：
    Figure 0007457112000049
     Ａ）（ｉ）次の式によって表されるウリジンモノホスフェート、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
    Figure 0007457112000050
     （ｉｉ）ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートを含む溶液を提供すること、および
    グルコース－１－ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼ、を含む酵素のセットを提供すること、
    Ｂ）前記酵素のセット、ポリホスフェート、およびアデノシントリホスフェートの存在下で、ウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチルグルコサミンからウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンを生成すること、
    を含み、
    ここで、前記酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に、共有結合的に共固定化される、または吸着的に共固定化される、方法。
  2. 前記酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記固体支持体は、エポキシド官能基を有する、アミノエポキシド官能基を有する、エチレンジアミン官能基を有する、アミノＣ２官能基を有する、アミノＣ６官能基を有する、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有する、ポリマーを含むビーズまたは樹脂から構成される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記固体支持体は、エポキシ基を用いて官能基化されるポリマーである、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞溶解物、精製細胞溶解物、または細胞ホモジネートから、固体支持体に直接共固定化される、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２をさらに含み、および／または、前記酵素のセットは、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２をさらに含む、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ステップＡ）において提供される溶液中のアデノシントリホスフェートの濃度は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン１モル当たり０．００１モル～０．９モルの範囲であり、および／または、ステップＡ）において提供される溶液中のウリジンモノホスフェートおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミンは、単一の反応混合物中で生成される、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ステップＡ）におけるウリジンモノホスフェートは、（ｉ）ウリジン、アデノシントリホスフェート、およびウリジンキナーゼ、または（ｉｉ）ウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、または（ｉｉｉ）オロチン酸、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－ジホスフェート、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびＵＭＰトランスフェラーゼ、から得られる、請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の方法であって、以下のステップ
    Ｄ）ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミン、およびサッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミンと、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ＧｌｃＮＡｃ化サッカリド、ＧｌｃＮＡｃ化糖ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化糖タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド、ＧｌｃＮＡｃ化バイオコンジュゲート、またはＧｌｃＮＡｃ化小分子を生成すること、
    を更に含む、方法。
  12. 前記サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子は、抗体またはモノクローナル抗体、またはヒト乳オリゴサッカリド、またはバイオコンジュゲートである、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１１または請求項１２に記載の方法であって、以下のステップ
    Ｅ）ウリジントリホスフェートを得るために、ステップＤ）において形成されたウリジンジホスフェートを再利用すること、
    を更に含む、方法。
  14. グルコース－１－ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミンキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ、およびウリジンモノホスフェートキナーゼを含む酵素のセットであって、ここで、前記酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体に共有結合的に共固定化される、セット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Chem. Commun.，2002年，pp.2586-2587
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