ES2956021T3 - Método enzimático para la preparación de udp-GlcNAc - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un proceso catalizado por enzimas para producir UDP-N-acetil-α-D-glucosamina (UDP-GlcNAc) a partir de sustratos de bajo costo uridina monofosfato y N-acetil-D glucosamina en una única mezcla de reacción con inmovilizados o preferentemente enzimas coinmovilizadas. También se puede utilizar uridina como material de partida en lugar de monofosfato de uridina. Además, dicho proceso puede adaptarse para producir moléculas y biomoléculas ciladas con GlcNA, incluidos sacáridos, particularmente oligosacáridos de la leche humana (HMO), proteínas, péptidos, glicoproteínas, particularmente anticuerpos o glicopéptidos, y bioconjugados, particularmente vacunas conjugadas de carbohidratos y conjugados anticuerpo-fármaco. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método enzimático para la preparación de udp-GIcNAc
Campo de la invención
[0001] La presente invención se relaciona con un proceso catalizado por enzimas para producir UDP-N-acetil-α-D-glucosamina (UDP-GlcNAc) a partir de sustratos de uridina de bajo costo. monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en una sola mezcla de reacción con enzimas inmovilizadas o preferiblemente co-inmovilizadas. Además, dicho proceso puede adaptarse para producir moléculas y biomoléculas GlcNAcilado incluyendo sacáridos, particularmente oligosacáridos de leche humana (HMO), proteínas, péptidos, glicoproteínas, particularmente anticuerpos o glicopéptidos, y bioconjugados, particularmente vacunas conjugadas de carbohidrato y conjugados anticuerpo-fármaco.
Antecedentes de la invención
[0002] La uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina (UDP-GlcNAc) es un sustrato clave para un gran número de aplicaciones biotecnológicas y tecnología alimentaria. La UDP-GIcNAc es necesaria para la producción de vacunas de carbohidratos y en el creciente campo de la medicina personalizada, es decir, la preparación de gliconanomateriales para la administración de fármacos. Además, para construir in vitro la estructura central de los anticuerpos monoclonales y otras proteínas recombinantes, se necesita ampliamente la UDP-GlcNAc. En los alimentos infantiles (leche humana), los oligosacáridos funcionalizados con N-acetilglucosamina constituyen un componente importante de los oligosacáridos de la leche humana y, por lo tanto, existe una gran demanda de incluir azúcares glcNAcilados en productos lácteos producidos sintéticamente para lactantes (Carbohydrate Research 432 (2016) 62 - 70). Sin embargo, a pesar de la gran demanda de UDP-GlcNAc (del orden de toneladas por año), la disponibilidad de UDP-GlcNAc es muy limitada, incluso para los investigadores. Hasta el momento, el precio de la UDP-GlcNAc baja en endotoxinas está por encima de los 1.500 euros el gramo. Debido al alto precio de UDP-GlcNAc, no solo se obstaculizan las actividades de investigación básica y aplicada, sino que también se dificultan las aplicaciones industriales.
[0003] Las estrategias de ingeniería de bioprocesos para sintetizar UDP-GlcNAc se pueden clasificar en procesos in vivo e in vitro: la síntesis química de UDP-GlcNAc en un proceso de cinco pasos ha alcanzado un rendimiento de solo el 15%. Los microorganismos se modifican metabólicamente para producir UDP-GlcNAc, ya sea intracelular o extracelularmente, como parte de su metabolismo. Sin embargo, los bajos rendimientos, los altos niveles de subproductos no deseados, el tiempo requerido para el diseño de la línea celular y el complicado escalado son inconvenientes. Teniendo en cuenta los aspectos regulatorios, específicamente para alimentos infantiles, la aplicación de organismos genéticamente modificados (OGM) puede retrasar severamente el proceso de aprobación.
[0004] Por el contrario, la síntesis enzimática ha mostrado mayores rendimientos. Por ejemplo, Zhao et al. (Zhao, G., Guan, W., Cai, L., Wang, PG, 2010, Enzymatic route to preparative-scale synthesis of UDP-GlcNAc/GalNAc, their analogues and GDP-fucose, Nat. Protoc. 5, 636) utilizaron tres enzimas N-acetilhexosamina quinasa (NahK), UDP-N-acetilglucosamina difosforilasa (GlmU) y difosfatasa inorgánica (PmPpA) para producir UDP-GlcNac/UDP-GalNAc y sus derivados a escala preparativa con un rendimiento del 10%-65 % Chen et al. (Chen, Y., Thon, V., Li, Y., Yu, H., Ding, L., Lau, K., Qu, J., Hie, L., Chen, X., 2011, One-pot three-enzyme synthesis of UDP-GlcNAc derivatives, Chem. Commun.
47, 10815-10817) logró obtener un rendimiento del 81% con las mismas enzimas. Mahour et al. (Mahour, R., Klapproth, J., Rexer, TF, Schildbach, A., Klamt, S., Pietzsch, M., Rapp, E., Reichl, U., 2018, Establishment of a five-enzyme cellfree cascade for the synthesis of uridine diphosphate N-acetylglucosamine, Journal of Biotechnology 283, 120-129) describe la síntesis de novo libre de células y la regeneración de UDP-GlcNAc a partir de polifosfato, UMP y GlcNAc mediante una cascada de cinco enzimas (NahK, Glc-1P uridiltransferasa (GalU), uridina monofosfato quinasa (URA6), polifosfato quinasa (PPK3) y PmPpA). Los experimentos de un recipiente demuestran la producción exitosa de UDP-GIcNAc con un rendimiento cercano al 100 %. Shao et al. (Shao, J., Zhang, J., Nahálka, J. Wang, PG, 2002, Biocatalytic synthesis of uridine 5'diphosphate N-acetylglucosamine by multiple enzymes co-immobilized on agarose beads, Chem. Commun.
2586-2587) utilizado cinco enzimas inmovilizadas para producir UDP-GlcNAc con un rendimiento máximo del 78 %. En su estudio, AGX1 (el tipo de GlmU de mamífero) y GlmU se usaron juntos para aumentar el rendimiento de GlcNAc-1-fosfato a UDPGlcNAc. La regeneración de ATP a partir de ADP se realizó mediante piruvato quinasa usando fosfoenolpiruvato. Esas enzimas se coinmovilizaron en perlas de agarosa Ni-NTA para la síntesis de uridina 5'-difosfato N-acetilglucosamina. Las perlas de agarosa Ni-NTA cargadas con enzima se usaron repetidamente, pero sin embargo perdieron actividades enzimáticas durante las reacciones. Solo se pudo lograr un rendimiento del 50% del producto después de cinco ciclos de reacción de 20 h. Ensayos enzimáticos adicionales revelaron que la mutasa de fosfato GlcNAc era la enzima menos estable en las perlas, por lo que era la razón principal de la disminución observada del rendimiento general. La adición de Agm1 purificada en la reacción podría restaurar parcialmente toda la actividad y aumentar el rendimiento de UDP-GlcNAc al 78 %.
[0005] Las perlas de agarosa Ni-NTA no son prácticas para la síntesis a mayor escala. Las enzimas se unen débilmente a las perlas de agarosa y se lavan rápidamente en mezclas de reacción de alta fuerza iónica que son necesarias para una producción óptima de UDP-GlcNAc. La lixiviación de enzimas puede dificultar gravemente los procesos de validación, específicamente para aplicaciones alimentarias y farmacéuticas, y hace que sea necesario recargar las perlas después de cada uso. Además, los iones de níquel, que son tóxicos en grandes cantidades, se liberan de las perlas a la solución; lo que hace que su uso en la síntesis de HMOS sea probablemente imposible. Aunque se afirma que la lixiviación de Ni-NTA es baja, generalmente hasta 1 ppm, se libera una gran cantidad de Ni tóxico en las aguas residuales durante la regeneración y recarga de la columna. (Gaberc-Porekar y otros, Chem. Eng. Technol. 2005, 28 (11), 1306-1314). La elución con agentes quelantes moderadamente fuertes mejora la lixiviación de Ni-NTA (Kokhan et al, Analytical Biochemistry 2019, 582, 113347). Por lo tanto, la toxicidad de la lixiviación de Ni(II) del soporte sólido es una preocupación seria para las aplicaciones a gran escala. Dado que las perlas de agarosa Ni son propensas a lixiviar Ni(II) tóxico, las perlas no son mecánicamente estables. Además, estas perlas no son mecánicamente estables debido a su blandura, lo que prohíbe su uso en reactores de tanque agitado ya que las altas velocidades de cizallamiento hacen que las perlas de agarosa se degraden, o en el relleno de columnas a gran escala debido a la compresión.
[0006] Los soportes activados con epoxi pueden reaccionar químicamente con todos los grupos nucleófilos colocados en la superficie de las enzimas: lisina, histidina, cisteína, tirosina, etc. y, por lo tanto, se utilizan para la inmovilización de enzimas (Biochem Soc Trans 2007, 35 (6), 1593 -1601). Por ejemplo, se utilizaron enzimas inmovilizadas en resinas con funcionalidad epoxi para la producción de análogos de nucleósidos mediante reacciones de transglicosilación, por ejemplo, la reacción de transglicosilación del donante de azúcar β-D-arabinofuranosil-uracilo (Ara-U) a β-D-arabinofuranosil-2-6-diaminopurina (Arα-DAMP) (Biocatalysis Biotrans 2004, 22 (1), 25-33).
[0007] C. Xiao (PhD Thesis, Georgia State University, 12-10-2018 "Enzymatic Synthesis of Common Sugar Nucleotide and Therapeutic Oligosaccharides") informa sobre la unión de las enzimas NahK y AGX1 (alanina glioxilato aminotransferasa) en soportes sólidos de estireno macroporoso, Soportes sólidos funcionalizados con octadecil, epoxi metacrilato y epoxi butilo. Mientras que la unión de la enzima tuvo éxito, no se observó actividad de las enzimas inmovilizadas.
[0008] Existe una necesidad sentida desde hace mucho tiempo de un método para producir UDP-GlcNAc de una manera rentable a partir de sustratos de bajo costo y fácilmente disponibles.
[0009] Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un método rentable y eficiente para la preparación de UDP-GlcNAc.
[0010] El objetivo de la presente invención se resuelve mediante las enseñanzas de las reivindicaciones independientes. Otras características, aspectos y detalles ventajosos de la invención son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes, la descripción, las figuras y los ejemplos de la presente solicitud.
Descripción de la invención
[0011] En bioquímica, los azúcares de nucleótidos son bien conocidos como formas activas de monosacáridos y en las reacciones de glicosilación, los azúcares de nucleótidos son conocidos por actuar como donantes de glucosilo. Las glicosiltransferasas (GTF) son enzimas que catalizan la transferencia de fracciones de sacárido desde azúcares de nucleótidos activados a moléculas aceptoras de glicosil nucleofílicas. Así, en bioquímica las reacciones de glicosilación son catalizadas por glicosiltransferasas.
[0012] Para actuar como donantes de glucosilo, es esencial que los monosacáridos respectivos estén presentes en una forma altamente energética, como por ejemplo en forma de azúcares de nucleótidos, particularmente azúcares de nucleótidos difosfo derivados de uridina difosfato, guanosina difosfato o citosina difosfato, etc. en. Ejemplos de azúcares de nucleótido bien conocidos son UDP-glucosa, UDP-galactosa, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, UDP-xilosa, ácido UDP-glucurónico, GDP-manosa y GDP-fucosa. Es bien sabido que la conversión de monosacáridos simples en azúcares de nucleótidos activados puede lograrse mediante la reacción catalizada por enzimas de un nucleósido trifosfato (NTP) y un glucosil monofosfato, en el que el glucosil monofosfato contiene un grupo fosfato en el carbono anomérico.
[0013] Para obtener un monosacárido de difosfato de nucleósido (NDP), el monosacárido usado necesita convertirse en un derivado de monofosfato de glicosilo. En general, dicha reacción se puede lograr aplicando enzimas específicas como fosfotransferasas y adicionalmente fosfomutasas, si se requiere, para obtener el monosacárido-1-fosfato deseado. Las fosfotransferasas son enzimas clasificadas con el número EC 2.7 que catalizan reacciones de fosforilación. Las fosfotransferasas se clasifican además según su molécula aceptora. Por ejemplo, las fosfotransferasas bajo EC 2.7.1 son fosfotransferasas con un grupo alcohol como aceptor. Las fosfomutasas son isomerasas, es decir, enzimas que pueden catalizar una transferencia interna de un grupo fosfato. Se requieren fosfomutasas en caso de que la fosforilación del sustrato a través de la fosfotransferasa dé como resultado un monosacárido-6-fosfato, como en el caso de D-manosa o D-glucosa, por ejemplo, manosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato, respectivamente. La fosfomutasa respectiva luego cataliza la transferencia interna del grupo fosfato que da como resultado la conversión de manosa-6-fosfato en manosa-1-fosfato o glucosa-6-fosfato en glucosa-1-fosfato, respectivamente.
[0014] Las quinasas son enzimas que forman parte de la familia de las fosfotransferasas. Las quinasas son enzimas que catalizan la transferencia de grupos fosfato de moléculas donadoras de fosfato de alta energía a sustratos específicos. Este proceso se conoce como fosforilación, donde el sustrato gana un grupo fosfato y la molécula de trifosfato de adenosina (ATP) de alta energía dona un grupo fosfato.
[0015] Esta transesterificación produce un sustrato fosforilado y ADP. Así, para obtener un monosacárido-1-fosfato, se pueden aplicar quinasas adecuadas como una N-acetilhexosamina quinasa para obtener N-acetilglucosamina-1-fosfato a partir de N-acetilglucosamina.
[0016] Con el uso de nucleotidiltransferasas, un nucleósido trifosfato (NTP) y un monosacárido-1-fosfato pueden convertirse en el nucleósido difosfato (NDP)-monosacárido respectivo. Las nucleotidiltransferasas son enzimas transferasas de grupos que contienen fósforo y se clasifican con el número CE 2.7.7. Para los diferentes naturalmente Las nucleotidiltransferasas específicas de nucleótidos de 5 nucleótidos son conocidas en la técnica, por ejemplo, las uridililtransferasas transfieren grupos uridilo, las adenililtransferasas transfieren grupos adenililo, las guanililtransferasas transfieren grupos guanililo, las citidililtransferasas transfieren grupos citidililo y las timidililtransferasas transfieren grupos timidilo. Por tanto, las nucleotidiltransferasas son adecuadas para catalizar la reacción de monosacárido-1-fosfato con nucleósido trifosfato, por ejemplo, N-acetilglucosamina 1-fosfato con uridina trifosfato (UTP) para obtener UDP-GlcNAc. En el caso de UDP-GlcNAc, una uridililtransferasa es adecuada para catalizar la reacción con trifosfato de uridina (UTP). Los monosacáridos de difosfato de uridina (UDP) que se relacionan con los monosacáridos UDP de origen natural son UDP-galactosa, UDP-GalNAc y UDP-GlcNAc.
[0017] A pesar de los inconvenientes antes mencionados de las síntesis de UDP-GlcNAc descritas en la literatura, una desventaja adicional del esquema de reacción general a los azúcares NTP se basa en el hecho de que los materiales de partida, en particular los trifosfatos de nucleósido respectivos son muy costosos y por tanto, la ruta de síntesis da como resultado una síntesis costosa de NDP-monosacáridos y en particular de UDP-N-acetil-α-D-glucosamina. Como ya se describió anteriormente, para UDP-N-acetil-α-D-glucosamina existe la necesidad en la técnica de proporcionar un método rentable y eficiente para la preparación de monosacáridos de difosfato de nucleósido, particularmente de UDP-N-acetil-a-D-glucosamina a partir de materias primas de bajo costo y fácilmente disponibles.
[0018] Con respecto a los UDP-monosacáridos, UDP-GlcNAc se refiere a azúcares UDP activados de forma natural en mamíferos. Por lo tanto, UMP se ha identificado como nucleótido adecuado y N-acetilglucosamina como monosacárido adecuado para la preparación de UDP-GlcNAc. Debe quedar claro que, con respecto a una reacción catalizada por enzimas, deben proporcionarse al menos enzimas adecuadas. Por lo tanto, los inventores han identificado UMP y N-acetilglucosamina fácilmente disponible como materiales de partida adecuados para la producción de UDP-GlcNAc en una reacción enzimática en cascada de un solo recipiente.
[0019] Con el fin de proporcionar un método rentable y eficiente para la preparación de UDP-GlcNAc, se identificaron UMP (monofosfato de uridina) y N-acetilglucosamina como materiales de partida adecuados para la producción de UDP-GlcNAc en una reacción enzimática en cascada como se muestra en Figura 1 que consiste en (a) la formación de N-acetilglucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de N-acetilglucosamina y trifosfato de adenosina (ATP; cantidad catalítica), (b) la formación de difosfato de uridina (UDP) a partir de monofosfato de uridina (UMP) y una quinasa de monofosfato de uridina y la formación de trifosfato de uridina (UTP) a partir de UDP y polifosfato, y (c) la reacción de N-acetilglucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina (UTP) a UDP-GlcNAc. Se imaginó que UDP-GlcNAc se puede producir directamente a partir de N-acetilglucosamina y uridina monofosfato en presencia de una N-acetilhexosamina quinasa, una uridina monofosfato quinasa, una polifosfato quinasa y una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, estando inmovilizada cada enzima. sobre un soporte sólido.
[0020] Sorprendentemente, los inventores han descubierto que las enzimas utilizadas en la preparación de UDP-GlcNAc pueden inmovilizarse de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente robusto de manera que retengan su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades. En particular, el soporte sólido robusto con enzimas inmovilizadas covalente o adsortivamente permite en general la síntesis de UDP-GlcNAc en más de 20 ciclos. La unión covalente o adsortiva de las enzimas al soporte sólido minimiza el lavado de las enzimas, mientras mantiene su actividad. Un soporte mecánicamente estable inhibe la degradación del soporte sólido y tampoco lixivia sustancias tóxicas, como el Ni, durante múltiples ciclos de reacción.
[0021] La síntesis de UDP-GlcNAc en un número tan grande de ciclos es una mejora significativa del proceso y no se ha informado antes en la técnica anterior. Las perlas de agarosa Ni o las resinas de agarosa Ni NTA de la técnica anterior no se pueden usar en más de dos ciclos sin perder una cantidad significativa de actividad enzimática (véanse la Fig. 33 y el Ejemplo 4 para comparación). Las enzimas se unen a las perlas de agarosa de Ni mediante unión por afinidad (a través de una etiqueta de histidina), que puede eliminarse por lavado debido a la lixiviación de Ni. Además, las resinas de agarosa Ni NTA no son mecánicamente estables debido a su blandura, lo que hace que las perlas de agarosa se degraden durante la reacción en reactores de tanque agitado.
[0022] Además, se ha encontrado que la actividad de todas las enzimas puede incluso incrementarse, en particular cuando las enzimas utilizadas en la preparación de UDP-GlcNAc se co-inmovilizan covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente robusto. Sorprendentemente, se ha descubierto además que el soporte sólido cargado con dichas enzimas se puede utilizar para la producción de UDP-GlcNAc varias veces en comparación con la técnica anterior o de forma continua durante un tiempo prolongado. Sorprendentemente, se ha encontrado además que las enzimas usadas en la preparación de UDP-GlcNAc pueden co-inmovilizarse a partir de lisado de células crudas o de homogeneizado de células crudas. Sorprendentemente, también se ha encontrado que se puede usar uridina como material de partida en lugar de monofosfato de uridina en la preparación de UDP-GlcNAc.
[0023] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acet¡l-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
Figure imgf000005_0001
A) proporcionando una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina representada por las siguientes fórmulas
Figure imgf000005_0002
Monofosfato de uridina N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0024] La etapa de producción B) de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina según la invención comprende
(a) formar N-acetil-D-glucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de N-acetil-D-glucosamina y trifosfato de adenosina catalizados por una N-acetilhexosamina quinasa,
(b) formando trifosfato de uridina (UTP) a partir de monofosfato de uridina (UMP), trifosfato de adenosina y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa y un monofosfato de uridina quinasa; y
(c) hacer reaccionar 1-fosfato de N-acetil-D-glucosamina con trifosfato de uridina para dar UDP-N-acetil-α-D-glucosamina en presencia de una uridililtransferasa de glucosa-1-fosfato.
[0025] Aparentemente, los pasos (a) y (b) pueden realizarse simultánea o sucesivamente. Además, su orden puede revertirse a (b )^ (a )^ (c ).
[0026] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil -D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina por
(a) formar N-acetil-D-glucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de N-acetil-D-glucosamina y trifosfato de adenosina catalizados por una N-acetilhexosamina quinasa,
(b) formar trifosfato de uridina (UTP) a partir de monofosfato de uridina (UMP), trifosfato de adenosina y polifosfato catalizados por una quinasa de monofosfato de uridina y una quinasa de polifosfato; y (c) hacer reaccionar N-acetil-D-glucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina para obtener u DP-N-acetil-D-glucosamina en presencia de una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa,
donde el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable.
[0027] Más específicamente, la etapa de producción B) de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina según la invención comprende
(a) formar N-acetil-D-glucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1 -P) a partir de N-acetil-D-glucosamina y trifosfato de adenosina catalizados por una N-acetilhexosamina quinasa,
(b1) formar difosfato de uridina (UDP) a partir de monofosfato de uridina y trifosfato de adenosina catalizados por una quinasa de monofosfato de uridina;
(b2) formar trifosfato de uridina (UTP) a partir de difosfato de uridina y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y
(c) hacer reaccionar N-acetil-D-glucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina a UDP-N-acetil-D-glucosamina en presencia de glucosa-1-fosfato uridililtransferasa.
[0028] Aparentemente, el paso (a) puede llevarse a cabo antes, simultáneamente o después del paso (b1) o (b2). Por lo tanto, el orden de los pasos también puede revertirse a (b1)^(b2)^(a)^-(c).
[0029] Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetilglucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina mediante
(a) la formación de N-acetilglucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de N-acetil-D-glucosamina y trifosfato de adenosina catalizada por una N-acetilhexosamina quinasa,
(b1) formando difosfato de uridina (UDP) a partir de monofosfato de uridina y trifosfato de adenosina catalizada por una uridina monofosfato quinasa;
(b2) formar trifosfato de uridina (UTP) a partir de difosfato de uridina y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y
(c) hacer reaccionar N-acetil-D-glucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina para obtener UDP-N-acetil-D-glucosamina en presencia de una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa,
donde el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable.
[0030] El método inventivo para producir UDP-N-acetil-α-D-glucosamina tiene las siguientes ventajas significativas sobre los métodos descritos en la técnica anterior:
• reducción significativa de costos con respecto a los materiales de partida, es decir, no se requiere UDP o UTP costosos,
• el método se puede realizar de manera continua, lo que potencialmente permite proporcionar UDP-N-acetil-α-D-glucosamina en una escala de toneladas por año,
• proceso libre de células, evitando así los aspectos adversos de los OMG (regulación, etiquetado),
• uso directo de extractos libres de células, sin costes de purificación de biocatalizadores,
• el soporte sólido cargado con enzimas se puede reutilizar varias veces,
• rendimiento casi cuantitativo con respecto a N-acetil-D-glucosamina,
• la alta escalabilidad hace que el método inventivo sea útil para aplicaciones industriales.
[0031] En una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los pasos siguientes:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que al menos una enzima de el conjunto de enzimas está inmovilizado sobre un soporte sólido reutilizable y mecánicamente estable.
[0032] La inmovilización covalente o la unión covalente como se usa en el presente documento se refiere a la formación de un enlace químico covalente entre la enzima y un grupo reactivo funcional en el soporte sólido mecánicamente estable reutilizable de tal manera que la enzima se une al soporte sólido y retiene gran parte de o aumenta su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades. La unión covalente se caracteriza por formar un complejo estable entre la enzima y el soporte sólido, lo que impide que las enzimas se laven fácilmente. Más adelante se dan ejemplos de unión covalente. La inmovilización de enzimas covalentes se puede lograr con cualquier método de inmovilización de enzimas conocido en la técnica, así como con los métodos descritos en el presente documento.
[0033] Las enzimas también se pueden unir por adsorción al soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable, de modo que la enzima se una al soporte sólido y retenga gran parte de su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades o las aumente. La unión por adsorción hace uso de las interacciones físicas generadas entre el soporte sólido y la enzima que incluyen fuerzas de van der Waals, interacciones iónicas y enlaces de hidrógeno. La unión por adsorción no cambia la estructura nativa de la enzima, por lo que evita que los sitios activos de las enzimas se alteren y permite que la enzima conserve su actividad. Más adelante se dan ejemplos de unión por adsorción. La inmovilización de enzimas por adsorción se puede lograr con cualquier método de inmovilización de enzimas conocido en la técnica, así como con los métodos descritos en el presente documento.
[0034] Sin embargo, en los métodos inventivos descritos en el presente documento, las enzimas no se inmovilizan mediante la unión por afinidad al soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable. Particularmente, en los métodos inventivos descritos en el presente documento, las enzimas no se inmovilizan en soportes sólidos de Ni-NTA, como perlas de agarosa de Ni-NTA.
[0035] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es no inmovilizado por unión de afinidad sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable.
[0036] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable reutilizable, en el que el soporte sólido mecánicamente estable reutilizable no es una perla de agarosa Ni o una resina de agarosa Ni NTA.
[0037] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, formando así una preparación de enzima sólida robusta.
[0038] Así, en el contexto de la presente invención un soporte sólido mecánicamente estable reutilizable es un soporte que permite su uso múltiple dentro del método inventivo para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-a- D - glucosamina, como así como otros métodos inventivos descritos en el presente documento, de modo que todas las enzimas co-inmovilizadas covalentemente o por adsorción en el soporte sólido retengan gran parte de su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades, o las aumenten, de modo que las enzimas no se eliminen por lavado del soporte sólido. soporte sólido, y sin degradación o abrasión significativa del soporte sólido debido a esfuerzos mecánicos.
[0039] En una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalentemente sobre un soporte sólido reutilizable y mecánicamente estable.
[0040] En una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado por adsorción sobre un soporte sólido reutilizable y mecánicamente estable.
[0041] En otra forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es co-inmovilizado covalentemente sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable.
[0042] Además, las enzimas se pueden co-inmovilizar de forma covalente o por adsorción directamente desde el lisado celular bruto o el homogeneizado celular bruto en el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable y el soporte sólido se puede utilizar en un gran número de ciclos (por ejemplo, 20 ciclos por lotes y más), o cuando los métodos inventivos descritos en este documento se ejecutan continuamente, el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable se puede usar durante un tiempo prolongado. El término "soporte sólido robusto" se utiliza aquí como sinónimo de un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que i) permite la coinmovilización del conjunto de enzimas del lisado celular bruto o del homogeneizado celular bruto, ii) retiene grandes partes o aumenta el actividad de todas las enzimas co-inmovilizadas Ni) permite la síntesis del producto objetivo en un gran número de ciclos (por ejemplo, 20 ciclos por lotes y más), o cuando los métodos inventivos descritos en este documento se ejecutan continuamente, el soporte sólido se puede usar durante un tiempo prolongado.
[0043] Preferiblemente, los soportes sólidos mecánicamente estables y reutilizables se pueden usar en al menos 3 ciclos, más preferiblemente en al menos 4 ciclos, más preferiblemente en al menos 5 ciclos, más preferiblemente en al menos 6 ciclos, más preferiblemente en al menos 7 ciclos, más preferiblemente en al menos 8 ciclos, más preferiblemente en al menos 9 ciclos, más preferiblemente en al menos 10 ciclos, más preferiblemente en al menos 12 ciclos, más preferiblemente en al menos 14 ciclos, más preferiblemente en al menos 16 ciclos, más preferiblemente en al menos 18 ciclos, más preferiblemente en al menos 20 ciclos, más preferiblemente en al menos 25 ciclos, más preferiblemente en al menos 25 ciclos, más preferiblemente en al menos 30 ciclos, y lo más preferiblemente en al menos 50 ciclos de el método inventivo descrito en este documento.
[0044] Otro aspecto de la presente invención está dirigido a la GlcNAcylation de moléculas y biomoléculas que incluyen sacáridos, proteínas, péptidos, glicoproteínas o glicopéptidos, particularmente oligosacáridos de leche humana (HMO) y anticuerpos (monoclonales), que comprende los pasos de:
A) proporcionando una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y adenosina trifosfato; y
D) producir un sacárido GlcNAcilado, glicopéptido GlcNAcilado, glicoproteína GlcNAcilada, proteína GlcNAcilada, péptido GlcNAcilado o molécula pequeña GlcNAcilada a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de un N-acetilglucosaminiltransferasa,
en la que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0045] Las N-acetilglucosaminiltransferasas son parte de EC 2.4.1. subgrupo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: lipopolisacárido N-acetilglucosaminiltransferasa (LgtA) (EC 2.4.1.56); N-acetilactosaminida beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa (GCNT2) (EC. 2.4.1.150); proteína O-GIcNAc transferasa (OGT) (EC 2.4.1.255); y alfa-1,3-manosil-glicoproteína 2-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa (EC 2.4.1.101).
[0046] En una forma de realización del método de la invención para la cilación de GIcNA, se regenera UTP a partir del producto secundario UDP. Por lo tanto, solo se requieren cantidades catalíticas de UMP. Por lo tanto, el método inventivo para la cilación de GIcNA comprende los pasos de:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y adenosina trifosfato; y
D) producir un sacárido GlcNAcilado, glicopéptido GlcNAcilado, glicoproteína GlcNAcilada, proteína GlcNAcilada, péptido GlcNAcilado o molécula pequeña GlcNAcilada a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña en presencia de un N-acetilglucosaminiltransferasa;
E) reciclar el difosfato de uridina formado en la etapa D) para obtener trifosfato de uridina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0047] Preferentemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable. Dicho soporte sólido reutilizable puede funcionalizarse por ejemplo con grupos epoxi.
[0048] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se dirige a un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una quinasa de uridina monofosfato; en el que el conjunto de enzimas se coinmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, preferiblemente el conjunto de enzimas se coinmoviliza sobre un polímero funcionalizado con grupos epoxi.
[0049] Preferiblemente, una glicosiltransferasa o N-acetilglucosaminiltransferasa se coinmoviliza covalentemente o por adsorción junto con el conjunto de enzimas en el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
[0050] Como se usa en este documento, el término "polifosfato" se refiere a cualquier sal que contenga varios enlaces POP generados compartiendo esquinas de seis o más tetraédricos de fosfato (PO4), lo que lleva a la formación de cadenas largas. El término "PoliPn" se usa como sinónimo, en el que n representa la longitud de cadena promedio del número de residuos de fosfato, p. ej. PoliP25 se refiere a un polifosfato que tiene aproximadamente 25 residuos de fosfato y PoliPn se refiere a un polifosfato que tiene aproximadamente 14 residuos de fosfato.
[0051] Como se usa en el presente documento, el término "uridina monofosfato quinasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de uridina monofosfato quinasa, es decir, una uridina monofosfato quinasa cataliza la reacción de uridina monofosfato a uridina 5'-difosfato en presencia de adenosina trifosfato. La uridina monofosfato quinasa pertenece a la clase EC 2.7.4.14. La uridina monofosfato quinasa cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000010_0001
[0052] Como se usa en este documento, el término "uridina quinasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de uridina quinasa, es decir, una uridina quinasa cataliza la reacción de uridina a uridina 5'-monofosfato en presencia de trifosfato de adenosina. La uridina quinasa pertenece a la clase EC 2.7.1.48.
[0053] Como se usa en el presente documento, el término "polifosfato quinasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de polifosfato quinasa, es decir, una polifosfato quinasa cataliza las siguientes reacciones:
Figure imgf000010_0002
siendo N un nucleótido tal como guanosina, adenosina, uridina, etc. y siendo NMP un nucleósido monofosfato siendo NDP nucleósido difosfato y NTP nucleósido trifosfato.
[0054] En el caso de la uridina, la polifosfato quinasa cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000010_0003
[0055] La polifosfato quinasa pertenece a la clase EC 2.7.4.1. Los representantes de la enzima polifosfato quinasa utilizados en los métodos inventivos descritos en el presente incluyen, entre otros, polifosfato quinasa 1 (PPK1), polifosfato quinasa 2 (PPK2), polifosfato quinasa 2 de 2-dominio (2D-PPK2) y polifosfato quinasa 2 de 1-dominio (1D-PPK2) y polifosfato quinasa 3 (PPK3).
[0056] Como se usa en el presente documento, el término "uridililtransferasa" se refiere a un polipéptido que tiene una actividad de uridililtransferasa, por ejemplo, una UTP: α-D-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa que cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000010_0004
[0057] Las nucleotidiltransferasas pertenecen a la clase EC 2.7.7. Los ejemplos de uridililtransferasas conocidas incluyen, entre otros, hexosal-fosfato uridililtransferasa, que pertenece a la clase EC 2.7.7.10, xilosa-1-fosfato uridililtransferasa (GalT), que pertenece a la clase EC 2.7.7.11, uDP-glucosa hexosa-1 -fosfato uridililtransferasa (GalT), que pertenece a la clase EC 2.7.7.12, y glucosa 1-fosfato uridililtransferasa (GalU), que pertenece a la clase EC 2.7.7.9. La glucosa 1-fosfato uridililtransferasa también cataliza la transferencia de UTP a N-acetilhexosamina 1-fosfato:
Figure imgf000011_0001
[0058] Como se usa en este documento, el término "pirofosfatasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de pirofosfatasa, es decir, un polipéptido que cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000011_0002
en la que PPi se refiere a pirofosfato y Pi a fosfato.
[0059] La pirofosfatasa pertenece a la clase EC 3.6.1.1. En este contexto, el término "difosfatasa" se refiere a un polipéptido de pirofosfatasa que cataliza la hidrólisis de difosfato a fosfato.
[0060] Como se usa en el presente documento, el término "N-acetilhexosamina quinasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad quinasa, es decir, una quinasa que cataliza la siguiente fosforilación a N-acetilhexosamina 1-fosfato:
Figure imgf000011_0003
[0061] La N-acetilhexosamina quinasa pertenece a la CE clase 2.7.1.162.
[0062] Como se usa en el presente documento, el término "uracilo fosforribosiltransferasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de fosforribosiltransferasa, es decir, una transferasa que cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000011_0004
donde PRPP se refiere a una pentosa fosforilada, preferiblemente una ribosa fosforilada y lo más preferiblemente a 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato. A modo de ejemplo, la transferasa es, pero no se limita a una uracilo fosforribosiltransferasa que pertenece a la clase EC 2.4.2.9 o una AMP fosforilasa que pertenece a la clase EC 2.4.2.57, de la que también se conoce dicha actividad de transferasa.
[0063] Como se usa aquí, el término "UMP sintasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de uridina monofosfato sintetasa, es decir, una sintasa que cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000011_0005
donde OMP se refiere a orotidina 5'-fosfato. El término UMP sintasa se usa como sinónimo de orotidina 5'-fosfato descarboxilasa y esta enzima pertenece a la clase EC 4.1.1.23.
[0064] Como se usa en el presente documento, el término " orotato fosforribosiltransferasa " se refiere a un polipéptido que tiene actividad de orotato fosforribosiltransferasa, es decir, una transferasa que cataliza la siguiente reacción:
Figure imgf000011_0006
[0065] La transferasa pertenece a la clase EC 2.4.2.10.
[0066] Como se usa en el presente documento, el término "glucosiltransferasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de glicosiltransferasa, es decir, un polipéptido que cataliza la transferencia de un monosacárido desde el monosacárido NDP a sacáridos aceptores, como glucosa o N-acetilglucosamina.
[0067] Como se usa en el presente documento, el término "N-acetilglucosaminiltransferasa" se refiere a un polipéptido que tiene actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa, es decir, un polipéptido que cataliza la transferencia de una N-acetilglucosamina desde NDP-GlcNAc a sacáridos o proteínas aceptoras. Las N-acetilglucosaminiltransferasas en general pertenecen a la clase EC 2.4.1. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a lipopolisacárido N-acetilglucosaminiltransferasa (LgtA) (EC. 2.4.1.56); N-acetilactosaminida beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa (GCNT2) (EC. 2.4.1.150); proteína O-GIcNAc transferasa (OGT) (EC 2.4.1.255); alfa-1,3-manosil-glicoproteína 2-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa (EC 2.4.1.101); o p-1,3-Nacetilglucosamina transferasa (p 1,3GlcNAcT) (EC 2.4.1.149).
[0068] Como se usa en el presente documento, "sacárido" se refiere, entre otros, a monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, pentasacárido, hexasacárido, heptasacárido, octasacárido.., oligosacárido, glicano y polisacárido. El sacárido comprende preferentemente unidades de monosacárido seleccionadas entre: D-arabinosa, D-lisosa, D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, L-lixosa, L-ribosa, L-xilosa, D-ribulosa, D-xiulosa, L-ribulosa, L-xiulosa, D-desoxirribosa, Ldesoxirribosa, D-eritrosa, D-treosa, L-glicero-D-mano-heptosa, D-glicero-D-mano-heptosa, D-alosa, D-altrosa, D-glucosa, D-manosa, D-gulosa, D-idosa, D-galactosa, D-talosa, D-psicosa, D-fructosa, D-sorbosa, D-tagatosa, 6-desoxi-L-altrosa, 6-desoxi-D-talosa, D-Fucosa, L-Fucosa, D-Ramnosa, L-Ramnosa, D-Quinovosa, Olivosa, Tivelosa, Ascarilosa, Abecuosa, Paratosa, Digitoxosa, Colitosa, D-Glucosamina, D-Galactosamina, D-Mannosamina, D-Alosamina, I-altrosamina, D-gulosamina, L-idosamina, D-talosamina, N-acetil-D-glucosamina, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-manosamina, N-acetil-D-allosamina, N-Acetil-L-altrosamina, N-Acetil-D-gulosamina, N-Acetil-L-idosamina, N-Acetil-D-talosamina, N-Acetil-D-fucosamina, N-Acetil-L-fucosamina, N-Acetil-L-ramnosamina, N-acetil-D-quinovosamina, ácido D-glucurónico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico, ácido D-alurónico, ácido L-altrurónico, ácido D-gulurónico, ácido L-gulurónico, ácido L-idurónico, ácido D-talurónico, ácido neuramínico, ácido N-acetilneuramínico, ácido N-glicolilneuramínico, Apiosa, Bacilosamina, Tevetosa, Acofriosa, Cimarosa, ácido murámico, ácido N-acetilmurámico, ácido N-glicolilmurámico, ácido 3-desoxi-lixo-heptulosárico, ácido cetodesoxioctónico y ácido cetodesoxinonónico. Preferiblemente, las unidades de monosacáridos pertenecen al siguiente grupo de α- y β-D/L-carbohidratos que comprenden o consisten en: α-D-ribopiranosa, α-D-arabinopiranosa, α-D-xilopiranosa, α-D-lixopiranosa, α-D-alopiranosa, α-D-altropiranosa, α-D-glucopiranosa, α-D-manpiranosa, α-D-glucopiranosa, α-D-idopiranosa, α-D-galactopiranosa, α-D-talopiranosa, α-D-psicopiranosa, α-D-fructopiranosa, α-D-sorbopiranosa, α-D-tagatopiranosa, α-D-ribofuranosa, α-D-arabinofuranosa, α-D-xilofuranosa, α-D-lixofuranosa, α-D-alofuranosa, α-D-Altrofuranosa, α-D-Glucofuranosa, α-D-Mannofuranosa, α-D-gulofuranosa, α-D-idofuranosa, α-D-galactofuranosa, α-D-talofuranosa, α-D-psicofuranosa, α-Dfructofuranosa, α-D-sorbofuranosa, α-D-tagatofuranosa, α-D-xilulofuranosa, α-D-ribulofuranosa, α-D-treofuranosa, α-D-ramnopiranosa, α-D-eritrofuranosa, a- D-glucosamina, ácido α-D-glucopiranurónico, β-D-ribopiranosa, β-D-arabinopiranosa, β-D-xilopiranosa, β-D-lixopiranosa, β-D-alopiranosa, β-D-altropiranosa, β-D-glucopiranosa, β-Dmanpiranosa, β-D-glucopiranosa, β-D-idopiranosa, β-D-galactopiranosa, β-D-talopiranosa, β-D-psicopiranosa, β-D-fructopiranosa, β-D-sorbopiranosa, β-D-tagatopiranosa, β-D-ribofuranosa, β-D-arabinofuranosa, β-D-xilofuranosa, β-D-lixofuranosa, β-D-ramnopiranosa, β-D-alofuranosa, β-D-altrofuranosa, β-D-glucofuranosa, β-D-manofuranosa, β-D-gulofuranosa, β-D-idofuranosa, β-D-galactofuranosa, β-D-talofuranosa, β-D-psicofuranosa, β-D-fructofuranosa, β-D-sorbofuranosa, p- D-tagatofuranosa, β-D-xilulofuranosa, β-D-ribulofuranosa, β-D-treofuranosa, β-D-eritrofuranosa, β-D-glucosamina, β-D-ácido glucopiranurónico, α-L-ribopiranosa, α-L-arabinopiranosa, α-L-xilopiranosa, α-L-lixopiranosa, α-L-alopiranosa, α-L-altropiranosa, α-L-glucopiranosa, α-L-manpiranosa, α-L-glucopiranosa, α-Lidopiranosa, α-L-galactopiranosa, α-L-talopiranosa, α-L-psicopiranosa, α-L-fructopiranosa, α-L-sorbopiranosa, α-L-tagatopiranosa, α-L-ramnopiranosa, α-L-ribofuranosa, α-L-arabinofuranosa, α-L-xilofuranosa, α-L-lixofuranosa, α-L-alofuranosa, α-L-altrofuranosa, α-L-glucofuranosa, α-L-mannofuranosa, α-L-gulofuranosa, α-L-idofuranosa, α-Lgalactofuranosa, α-L-talofuranosa, α-L-psicofuranosa, α-L-fructofuranosa, α-L-sorbofuranosa, α-L-tagatofuranosa, α-L-xilulofuranosa, α-L-ribulofuranosa, α-L-treofuranosa, α-L-eritrofuranosa, α-L-glucosamina, α-L-ácido glucopiranurónico, β-L-ribopiranosa, β-L-arabinopiranosa, β-L-xilopiranosa, p-L-lixopiranosa, β-L-alopiranosa, β-L-altropiranosa, β-L-glucopiranosa, β-L-manpiranosa, β-L-glucopiranosa, β-L-idopiranosa, β-L-galactopiranosa, β-L-talopiranosa, β-L-psicopiranosa, β-L-fructopiranosa, β-L-sorbopiranosa, β-L-tagatopiranosa, β-L-ribofuranosa, β-L-arabinofuranosa, β-L-xilofuranosa, β-L-lixofuranosa, β-L-alofuranosa, β-L-altrofuranosa, β-L-glucofuranosa, β-L-manofuranosa, β-L-gulofuranosa, β-L-idofuranosa, β-L-galactofuranosa, β-L-talofuranosa, β-L-psicofuranosa, β-L-fructofuranosa, β-L-sorbofuranosa, β-L-tagatofuranosa, β-L-xilulofuranosa, β-L-ribulofuranosa, β-L-treofuranosa, β-L-eritrofuranosa, β-L-glucosamina, ácido β-L-glucopiranurónico y β-L-ramnopiranosa.
[0069] Los sacáridos se modifican adicionalmente opcionalmente para llevar amida, carbonato, carbamato, carbonilo, tiocarbonilo, carboxi, tiocarboxi, éster, tioéster, éter, epoxi, hidroxialquilo, alquilenilo, fenileno, alquenilo, imino, imida, isourea, tiocarbamato, tiourea. y/o fracciones de urea.
[0070] Como se usa en el presente documento, el término "glucopéptido" se refiere a un péptido que contiene restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el péptido. Los restos de carbohidrato forman cadenas laterales y son O-glucosídicos conectados al grupo hidroxi de un residuo de serina o treonina o N-glucosídicos conectados al nitrógeno amido de un residuo de asparagina.
[0071] Como se usa en el presente documento, el término "glucoproteína" se refiere a un polipéptido que contiene restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el polipéptido. Los restos de carbohidrato forman cadenas laterales y son O-glucosídicos conectados al grupo hidroxi de un residuo de serina o treonina o N-glucosídicos conectados al nitrógeno amido de un residuo de asparagina.
[0072] Como se usa aquí, el término "proteína" se refiere a un polipéptido que contiene o carece de restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el polipéptido que incluye proteínas aglicosiladas y proteínas glicosiladas.
[0073] Como se usa en este documento, el término " péptido " se refiere a un péptido que contiene o carece de restos de carbohidrato unidos covalentemente a las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos que constituyen el péptido, incluidos los péptidos aglicosilados y los péptidos glicosilados.
[0074] Como se usa en este documento, el término " bioconjugado " se refiere a una construcción molecular que consiste en al menos dos moléculas que están unidas covalentemente entre sí y donde al menos una de las cuales es una biomolécula, es decir, una molécula presente en organismos que son esenciales a uno o más procesos típicamente biológicos. Ejemplos de bioconjugados son vacunas de conjugados de carbohidrato que consisten en un antígeno de carbohidrato acoplado covalentemente a una proteína transportadora y conjugados de anticuerpo y fármaco.
[0075] Como se usa en el presente documento, el término "vacuna de conjugado de carbohidrato" se refiere a un conjugado que contiene un antígeno de carbohidrato unido covalentemente a un vehículo inmunogénico. El antígeno carbohidrato puede ser, pero no se limita a un sacárido capsular bacteriano, un sacárido de una glicoproteína viral, un antígeno sacárido de esporozoos o parásitos, un antígeno sacárido de hongos patógenos o un antígeno sacárido que es específico de células cancerosas. El portador inmunogénico puede ser, pero no se limita a una proteína portadora seleccionada de toxoides, incluyendo toxoide tetánico (TT), toxoide diftérico (DT), material de reacción cruzada 197 (CRM197), proteína D de H. influenzae no tipificable, exterior complejos de proteínas de membrana del grupo B capsular de Neisseria meningitidis (OMPC), exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), toxina A de C. difficile (CDTA), proteínas neumocócicas, como la proteína A de superficie neumocócica (PspA), tríada D de histidina neumocócica (PhtD), neumolisina desintoxicada (dPly) y spr96/202l, toxina a de S. aureus y toxina Shiga 1b.
[0076] El término "soporte só lido”, Como se usa en el presente documento, se refiere a un material funcionalizado e insoluble al que se pueden unir o inmovilizar enzimas u otros reactivos, directamente o a través de un enlazador que lleva un grupo de anclaje, lo que permite que las enzimas se separen fácilmente (mediante lavado, filtración, centrifugación, etc.) del exceso de reactivos, productos de reacción solubles, subproductos o disolventes. Un soporte sólido puede estar compuesto por polímeros orgánicos tales como poliestireno, polietileno, polipropileno, polifluoroetileno, polietilenoxi y poliacrilamida, así como copolímeros e injertos de los mismos. Un soporte sólido también puede ser inorgánico, como vidrio, sílice, vidrio de poro controlado (CPG), sílice de fase inversa o metal, como oro o platino. Un soporte sólido también puede consistir en partículas magnéticas. Para obtener una descripción general de los materiales de soporte adecuados para la inmovilización de enzimas, consulte Zdarta et al. Catalysts 2018, 8, 92, y Datta et al. Biotecnología 20133:1-9.
[0077] La configuración de un soporte sólido puede ser en forma de perlas, monolitos, esferas, partículas, un lecho de partículas, una estera de fibra, gránulos, un gel, una membrana, una membrana de fibra hueca, una membrana de matriz mixta o una superficie. Las superficies pueden ser planas, sustancialmente planas o no planas. Los soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos y pueden tener características de hinchamiento o no hinchamiento. Un soporte sólido se puede configurar en forma de pozo, depresión u otro contenedor, recipiente, característica o ubicación.
[0078] La concentración de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en la solución proporcionada en el paso A) está preferentemente en el intervalo de 0,01 mM a 100.000 mM. Más preferentemente, la concentración de monofosfato de uridina y N-acetilglucosamina está preferentemente en el intervalo de 0,05 mM a 50.000 mM. Más preferentemente, la concentración de monofosfato de uridina y N-acetilglucosamina está preferentemente en el intervalo de 0,1 mM a 30.000 mM. Más preferentemente, la concentración de monofosfato de uridina y N-acetilglucosamina está preferentemente en el intervalo de 0,2 mM a 15.000 mM.
[0079] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y adenosina trifosfato;
en el que la concentración de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en la solución proporcionada en el paso A) está en el intervalo de 0,2 mM a 15.000 mM, y
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o por adsorción en un recipiente reutilizable mecánicamente. soporte sólido estable. Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0080] Preferiblemente, la concentración de las enzimas en el conjunto de enzimas está entre 0,000001 mg/mL y 100 mg/mL en base al volumen total de la solución proporcionada en el paso A).
[0081] Como producto secundario en la reacción de N-acetilglucosamina-1-fosfato con trifosfato de uridina a UDP-N-acetil-α-D-glucosamina, se forma pirofosfato (PPi). Aunque el pirofosfato es inestable en solución acuosa, solo se hidroliza lentamente en fosfato inorgánico (Pi). Una alta concentración de pirofosfato también puede inhibir la actividad de la enzima glucosa-1-fosfato uridililtransferasa involucrada en la formación de UDP-N-acetil-α-D-glucosamina. Además, el pirofosfato es conocido por su capacidad para inhibir las uridilil y guanililtransferasas. La enzima pirofosfatasa es capaz de catalizar la hidrólisis de pirofosfato a fosfato, lo que hace que la formación de UDP sea irreversible. Así, en una forma de realización preferida de la presente invención, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa.
[0082] Por lo tanto, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos: A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una A-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-A-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y A-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable. Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0083] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir uridina 5'-difosfo-A-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y A-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una A-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-A-acetilglucosamina a partir de monofosfato de uridina y A-acetilglucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina mediante
(a) la formación de A-acetilglucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de A-acetilglucosamina y trifosfato de adenosina catalizados por una A-acetilhexosamina quinasa,
(b) formando trifosfato de uridina (UTP) a partir de monofosfato de uridina (UMP), trifosfato de adenosina y polifosfato catalizados por una quinasa de monofosfato de uridina y una quinasa de polifosfato; y (c') hacer reaccionar A-acetilglucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina a UDP-A-acetil-α-D-glucosamina en presencia de glucosa-1-fosfato uridililtransferasa
(c") convertir pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa, en la que el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable. Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad. de cada enzima
[0084] Reformulado, el método inventivo para producir uridina 5'-difosfo-A-acetilglucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y A-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una A-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-A-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y A-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina mediante
(a) la formación de A-acetilglucosamina-1-fosfato a partir de A-acetilglucosamina y trifosfato de adenosina siendo catalizada por una A-acetilhexosamina quinasa,
(b1) formando difosfato de uridina a partir de monofosfato de uridina y trifosfato de adenosina siendo catalizada por una quinasa de monofosfato de uridina;
(b2) formar trifosfato de uridina a partir de difosfato de uridina y polifosfato catalizado por una cinasa de polifosfato,
(c') hacer reaccionar A-acetilglucosamina-1-fosfato con trifosfato de uridina a UDP-A-acetilglucosamina y pirofosfato en presencia de glucosa-1-fosfato uridililtransferasa; y
(c") convertir pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable reutilizable. Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente en un soporte reutilizable, soporte sólido mecánicamente estable aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0085] Preferiblemente, la pirofosfatasa utilizada en los métodos inventivos descritos en el presente documento es una pirofosfatasa inorgánica. Preferiblemente, la pirofosfatasa es una pirofosfatasa inorgánica de Pasteurella multocida (PmPpA).
[0086] El polifosfato es capaz de formar complejos solubles en agua estables con iones metálicos (por ejemplo, Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+) que inicialmente se disolvieron en medios acuosos. Este efecto se denomina secuestro y evita que los iones metálicos unidos se participando en reacciones, particularmente reacciones enzimáticas Por lo tanto, los iones metálicos secuestrados, particularmente Mg2+ y Mn2+, no pueden actuar como cofactor para las enzimas involucradas en los métodos inventivos descritos en este documento. Como la capacidad de un polifosfato particular para secuestrar un ion metálico particular disminuye al aumentar la longitud de la cadena del polifosfato, en la presente invención se prefieren los polifosfatos de cadena larga. Más preferidos son los polifosfatos que tienen al menos 14 residuos de fosfato. Los más preferidos son los polifosfatos que tienen al menos 25 residuos de fosfato.
[0087] Por lo tanto, la presente invención se dirige a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosam¡na que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetilglucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato, donde el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0088] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0089] Preferiblemente, las enzimas están presentes en una única mezcla de reacción con los demás sustratos. Así, la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina se produce en una única mezcla de reacción según otro aspecto del método inventivo.
[0090] Por lo tanto, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una mezcla que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
que proporciona un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetilglucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable.
[0091] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0092] Además, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y W-acetilglucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una W-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0093] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0094] Reformulado, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) al menos cuatro enzimas que comprenden una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0095] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0096] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetilglucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0097] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0098] El polifosfato sirve como el único portador de energía en los métodos inventivos descritos en este documento y se usa como una fuente de fosfato en la regeneración de ATP a partir de ADP utilizando una polifosfato quinasa 3 (PPK3). La regeneración de ATP se puede mejorar agregando una polifosfato quinasa de 1 dominio (1D-PPK), que también cataliza la fosforilación de ADP a ATP, preferiblemente una polifosfato quinasa 2 de 1 dominio (1D-PPK2) a la cascada enzimática del métodos inventivos. Además, los fosfatos de nucleósidos, como el ADP, son inestables en medios acuosos y tienden a hidrolizarse rápidamente. Para evitar la pérdida de ADP por hidrólisis a AMP, se puede agregar una polifosfato quinasa de 2 dominios (2D-PPK) que cataliza la fosforilación de AMP a ADP, preferiblemente una polifosfato quinasa 2 de 2 dominios (2D-PPK2) junto con una 1DPPK o solo a la cascada enzimática de la invención.
[0099] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0100] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, sin afectar la actividad enzimática de cada enzima. Más preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza en un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0101] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y una polifosfato quinasa de 2 dominios;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0102] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0103] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0104] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0105] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 2 dominios;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0106] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, sin afectar la actividad enzimática de cada enzima. Más preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0107] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios y opcionalmente una pirofosfatasa; B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0108] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0109] Como el ATP se regenera continuamente a partir de ADP y polifosfato en los métodos inventivos descritos en el presente documento, la producción de UDP-GIcNAc se puede realizar con una cantidad catalítica de ATP.
[0110] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina en una cantidad catalítica; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0111] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0112] El término "cantidad catalítica" se refiere aquí a una cantidad subestequiométrica de ATP, es decir, una cantidad de ATP que es menor que la cantidad de N-acetil-D-glucosamina utilizada en el método de la invención. Preferiblemente, una cantidad catalítica de ATP oscila entre 0,001 y 0,99 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina. Más preferiblemente, una cantidad catalítica de ATP oscila entre 0,001 y 0,9 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina. Más preferiblemente, una cantidad catalítica de rangos de ATP de 0,005 a 0,95 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina. Más preferiblemente, una cantidad catalítica de ATP oscila entre 0,01 y 0,9 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina.
[0113] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina en una cantidad catalítica; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; y
en el que en el paso A) se añade trifosfato de adenosina en una cantidad de 0,001 moles a 0,9 moles por mol de N-acetilD-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,002 moles a 0,8 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,7 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,5 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,2 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,1 moles por mol de N-acetilD-glucosamina, y lo más preferentemente en una cantidad de 0,005 moles a 0,05 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina
[0114] En una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina en una cantidad catalítica; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; y
en el que en el paso A) se añade trifosfato de adenosina en una cantidad de 0,001 moles a 0,9 moles por mol de N-acetilD-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,002 moles a 0,8 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,7 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,5 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,2 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferentemente en una cantidad de 0,003 moles a 0,1 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, y lo más preferentemente en una cantidad de 0,005 moles a 0,05 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina.
[0115] Preferentemente, el ATP está presente en la solución proporcionada en el paso A) en una concentración entre 0,05 mM y 100 mM, más preferentemente entre 0,1 mM y 90 mM, más preferentemente entre 0,1 mM y 50 mM, más preferentemente entre 0,2 mM y 20 mM, más preferentemente entre 0,2 mM y 10 mM, más preferentemente entre 0,2 mM y 5 mM, y lo más preferentemente entre 0,5 mM y 3 mM.
[0116] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina en una cantidad catalítica; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; y
donde en el paso A) la concentración de trifosfato de adenosina en la solución está en el rango de 0,5 mM a 3 mM.
[0117] En una forma de realización alternativa, se puede usar ADP o AMP en lugar de ATP en los métodos inventivos descritos en el presente documento. El ATP se genera a partir de AMP o ADP y polifosfato in situ, por lo que la producción de UDP-galactosa también se puede realizar con ADP o AMP como materiales de partida.
[0118] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acet¡l-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; donde el trifosfato de adenosina en la solución del paso A) se forma in situ a partir de monofosfato de adenosina.
[0119] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; donde el trifosfato de adenosina en la solución del paso A) se forma in situ a partir de difosfato de adenosina.
[0120] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato, en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; donde el trifosfato de adenosina en la solución del paso A) se forma in situ a partir de monofosfato de adenosina y difosfato de adenosina.
[0121] Reformulado, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato, monofosfato de adenosina y/o difosfato de adenosina y/o trifosfato de adenosina; y (iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0122] En una forma de realización alternativa, se usa ATP en exceso de N-acetil-D-glucosamina para aumentar el rendimiento de espacio-tiempo. Preferiblemente, la cantidad de ATP varía de 1 a 100 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferiblemente la cantidad de ATP varía de 1,2 a 50 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina, más preferiblemente la cantidad de ATP varía de 1,5 a 20 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina y lo más preferiblemente la cantidad de ATP varía de 2 a 10 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina.
[0123] Preferiblemente, en el método de la presente invención, la solución resultante en el paso A) tiene un valor de pH en un rango de 5,0 -10,0, preferiblemente 5,5 - 9,5, más preferiblemente 6,0 - 9,0, aún más preferiblemente 6,5 - 9,0, aún más preferido 7,0 - 9,0 y lo más preferido un valor de pH en el intervalo de 7,5 - 8,5.
[0124] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una W-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; y
donde la solución resultante en el paso A) tiene un valor de pH en el rango de 7,5 a 8,5.
[0125] En una forma de realización de la presente invención, la solución proporcionada en el paso A) comprende iones Mg2+ como cofactor de la actividad catalítica del conjunto de enzimas. Preferiblemente, los iones Mg2+ están presentes en la solución proporcionada en el paso A) en una concentración entre 1 mM y 200 mM, más preferiblemente entre 1 mM y 150 mM, más preferiblemente entre 2 mM y 150 mM, más preferiblemente entre 5 mM y 100 mM, más preferentemente entre 10 mM y 90 mM, más preferentemente entre 15 mM y 80 mM, más preferentemente entre 20 mM y 80 mM y lo más preferentemente entre 20 mM y 50 mM.
[0126] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una W-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; y
donde la solución resultante en el paso A) tiene una concentración de Mg2+ en el rango de 20 mM y 80 mM, preferiblemente entre 20 mM y 50 mM.
[0127] En una forma de realización alternativa, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato, trifosfato de adenosina; y
(iii) un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una W-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable; y donde la solución resultante en el paso A) tiene una concentración de Mg2+ en el rango de 20 mM y 150 mM.
[0128] El método inventivo para producir UDP-N-acetil-α-D-glucosamina se lleva a cabo con un conjunto de enzimas inmovilizadas. A continuación, las enzimas se inmovilizan sobre un soporte sólido de modo que conserven su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades. Los soportes sólidos adecuados son, por ejemplo, perlas, monolitos, esferas, partículas, un lecho de partículas, una estera de fibra, gránulos, un gel, una membrana, una membrana de fibra hueca, una membrana de matriz mixta, una superficie u otro material en fase sólida. En una forma de realización, cada enzima, es decir, la glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, la N-acetilhexosamina quinasa, la polifosfato quinasa, la uridina monofosfato quinasa y opcionalmente la pirofosfatasa, se inmoviliza sobre un soporte sólido.
[0129] En una forma de realización, solo algunas de las enzimas del conjunto de enzimas están inmovilizadas sobre un soporte sólido. Al menos una enzima seleccionada del conjunto de enzimas que comprende la glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, la N-acetilhexosamina quinasa, la uridina monofosfato quinasa, la polifosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa se inmoviliza sobre un soporte sólido.
[0130] También se describe en el presente documento que, al menos una enzima seleccionada del conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa se inmoviliza en un soporte sólido. Preferiblemente, la polifosfato quinasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferiblemente, la uridina monofosfato quinasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferentemente, la glucosa-1-fosfato uridililtransferasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferiblemente, la N-acetilhexosamina quinasa se inmoviliza sobre un soporte sólido. Preferentemente, la pirofosfatasa se inmoviliza sobre un soporte sólido.
[0131] Sorprendentemente, se ha encontrado que la co-inmovilización del conjunto de enzimas da como resultado una mayor productividad en la producción de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina (Fig. 3) en comparación con separar inmovilización de las enzimas del conjunto de enzimas. Por lo tanto, preferiblemente, las enzimas utilizadas en los métodos inventivos descritos en el presente documento se coinmovilizan covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido. Preferiblemente, las enzimas utilizadas en los métodos de la invención descritos en el presente documento se co­ inmovilizan de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable. Preferiblemente, las enzimas utilizadas en los métodos inventivos descritos en el presente documento se co-inmovilizan de forma covalente o por adsorción sobre un soporte sólido robusto. La inmovilización de enzimas que actúan secuencialmente dentro de un espacio confinado aumenta la eficiencia catalítica de conversión debido a la reducción drástica del tiempo de difusión del sustrato. Además, la formación in situ de sustratos genera altas concentraciones locales que conducen a mejoras cinéticas y pueden equivaler a ahorros sustanciales de costos. La coinmovilización generalmente se logra mezclando las enzimas antes de la inmovilización en un soporte sólido.
[0132] La presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato.
[0133] La presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y, opcionalmente, una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato.
[0134] La presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato,
donde el soporte sólido tiene la forma de perlas, monolitos, esferas, partículas, un lecho de partículas, una estera de fibra, gránulos, un gel, una membrana, una membrana de fibra hueca, una membrana de matriz mixta o una superficie. Preferiblemente, el soporte sólido tiene forma de perlas.
[0135] En tales formas de realización, las enzimas inmovilizadas pueden facilitar la producción de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina, y después de que se completa la reacción, la enzima inmovilizada las enzimas se retienen fácilmente (p. ej., reteniendo perlas en las que se inmovilizan las enzimas) y luego se reutilizan o reciclan en ciclos posteriores. Dichos procesos biocatalíticos inmovilizados permiten una mayor eficiencia y reducción de costos. Además, el método de la invención se puede realizar de manera continua pasando la solución de alimentación del paso A) a través de un reactor que contiene el conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido.
[0136] La presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución de alimentación que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetilo-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina cinasa, una polifosfato cinasa y una uridina monofosfato cinasa, en el que el soporte sólido comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas enzimas se encuentra en un reactor químico;
B) producir uridina 5'-difosfo-W-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y W-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina pasando continuamente la solución de alimentación del paso A) a través del reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas.
[0137] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución de alimentación que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una W-acetilhexosamina cinasa, una polifosfato cinasa, una uridina monofosfato cinasa y una pirofosfatasa, en el que el soporte sólido comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas se ubica en un reactor químico;
B) producir uridina 5'-difosfo-W-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y W-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina pasando continuamente la solución de alimentación desde etapa A) a través del reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas.
[0138] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución de alimentación que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa, en donde el soporte sólido comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas se ubica en un reactor químico;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosam¡na a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina pasando continuamente la solución de alimentación desde etapa A) a través del reactor químico cargado con el soporte sólido que comprende el conjunto de enzimas inmovilizadas.
[0139] Los métodos de inmovilización de enzimas son bien conocidos en la técnica. Las enzimas se pueden unir de forma no covalente o covalente, como adsorción, unión covalente, unión iónica, unión de metales, reticulación o cristalización. Varios métodos para la conjugación e inmovilización de enzimas en soportes sólidos (p. ej., resinas, membranas, perlas, vidrio, etc.) son bien conocidos en la técnica y se describen en, p. ej., Yi et al., Process Biochemistry 2007, 42, 895; Martin et al., Applied Microbiology and Biotechnology 2007, 76, 843; Koszelewski et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2010, 63, 39; Truppo y col., Org. Process Res. Dev., 2011, 15, 1033; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, segunda edición, Academic Press (2008); Mateo et al., Biotechnology Progress, 2002, 18, 629; y Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods, In Methods in Molecular Biology, CM Niemeyer ed., Humana Press (2004).
[0140] Las enzimas utilizadas en los métodos inventivos descritos en el presente documento, a saber, glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, N-acetilhexosamina quinasa, polifosfato quinasa, uridina monofosfato quinasa, polifosfato quinasa de 1 dominio, polifosfato quinasa de 2 dominios y pirofosfatasa son bien conocidas. para el experto en la materia y se puede obtener por cualquier método bien conocido por el experto en la materia. En particular, las enzimas se pueden sobreexpresar, aislar o preparar mediante métodos recombinantes a partir de cultivos microbiológicos que comprenden cultivos bacterianos, tales como E. coli, cultivos de virus y fagos y cultivos de células eucariotas. Los métodos inventivos descritos en este documento no se limitan a las enzimas de las fuentes descritas en la sección experimental. Por lo tanto, el método inventivo se puede realizar con las enzimas enumeradas anteriormente obtenidas de varias fuentes usando técnicas comunes de expresión o aislamiento de proteínas. Además, los expertos en la técnica conocen bien cómo adaptar la preparación de las enzimas a las aplicaciones específicas en las que se utiliza el método. Por ejemplo, las enzimas enumeradas anteriormente pueden expresarse en E. coli utilizando medios de crecimiento bacteriano de origen no animal, como un caldo Luria-Bertani que comprende triptona de soja.
[0141] En una forma de realización, la glucosa-1-fosfato uridililtransferasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 4 o en SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con dicha secuencia. En una forma de realización, la N-acetilhexosamina quinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia. En una forma de realización, la polifosfato quinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con dicha secuencia. En una forma de realización, la uridina monofosfato quinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia. En una forma de realización, la polifosfato quinasa de 1 dominio comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia. En una forma de realización, la polifosfato quinasa de 2 dominios comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con dicha secuencia. En una forma de realización, la pirofosfatasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con dicha secuencia.
[0142] Por lo tanto, en una forma de realización, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y adenosina trifosfato,
la glucosa-1-fosfato uridililtransferasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia; donde la W-acetilhexosamina quinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia; donde la polifosfato quinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia, donde la uridina monofosfato quinasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia; donde la polifosfato quinasa de 1 dominio comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia; donde la polifosfato quinasa de 2 dominios comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia; donde la pirofosfatasa comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con dicha secuencia; y en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable.
[0143] Las soluciones que contienen enzimas obtenidas del proceso de fermentación, homogeneización celular o lisis celular, que normalmente se centrifugan y filtran para eliminar los restos celulares, pueden usarse directamente para inmovilizar las enzimas sobre un soporte sólido. Por lo tanto, no se requieren más pasos de purificación o aislamiento y el caldo de fermentación, el lisado celular (en bruto o purificado) o el homogeneizado celular se pueden usar para inmovilizar las enzimas en un soporte sólido de modo que conserven su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/o u otras propiedades.
[0144] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalentemente o por adsorción en un soporte sólido reutilizable y mecánicamente estable a partir de caldo de fermentación, lisado celular crudo, lisado celular purificado u homogeneizado celular.
[0145] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable a partir de un lisado celular u homogeneizado celular crudo.
[0146] Preferiblemente, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable a partir de caldo de fermentación sin purificación previa.
[0147] Reformulado, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable a partir del sobrenadante de fermentación sin purificación previa.
[0148] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-a- D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato,
en el que el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente en un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable a partir de lisado celular u homogeneizado celular.
[0149] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizados covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable a partir de lisado celular u homogeneizado celular.
[0150] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa; B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es co-inmovilizados covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable a partir de lisado celular u homogeneizado celular.
[0151] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-Dglucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una A-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa, una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios y, opcionalmente, una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-A-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y A-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es co-inmovilizados covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable a partir de lisado celular u homogeneizado celular.
[0152] Los soportes sólidos útiles para inmovilizar las enzimas utilizadas en el método de la presente invención incluyen, entre otros, perlas, monolitos, esferas, partículas, un lecho de partículas, una estera de fibra, gránulos, un gel, una membrana, una fibra hueca membrana, una membrana de matriz mixta o una superficie. Preferiblemente, el soporte sólido tiene forma de perlas.
[0153] Se prefieren los soportes sólidos que permiten la inmovilización covalente de enzimas y/o la inmovilización por adsorción de enzimas. La inmovilización covalente o la unión covalente como se usa aquí se refiere a la formación de un enlace químico covalente entre la enzima y un grupo reactivo funcional en el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable, de modo que la enzima se une al soporte sólido y retiene gran parte o aumenta su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades. Por lo tanto, los soportes sólidos que permiten la inmovilización covalente de enzimas exhiben un grupo reactivo funcional (por ejemplo, cloruro, epóxido, grupos vinilo, grupos carboxílicos, etc.) que se une a un grupo reactivo presente en una cadena lateral de los aminoácidos, ya sea directamente oa través de una molécula conectora bivalente.
[0154] Se prefieren particularmente los soportes sólidos para la unión covalente que están funcionalizados con grupos funcionales epóxido. Otros soportes sólidos preferidos incluyen, entre otros, soportes sólidos con grupos funcionales etilendiamina, con grupos funcionales epoxi y funcionalizados adicionalmente con un grupo hidrofóbico, como butilo, octilo, metilo, fenilo, por ejemplo, con grupos funcionales epóxido y grupos funcionales butilo., con grupos funcionales espaciadores amino C2, con grupos funcionales espaciadores amino C6, u otro espaciador amino como espaciador amino C3, espaciador amino C4, espaciador amino C5, espaciador amino C7, con grupos funcionales epoxi, con grupos funcionales espaciadores aniónicos/amino C6, con funciones aniónicas/amina terciaria, con funciones aniónicas/amina cuaternaria, con funciones catiónicas/sulfónicas, con funciones éster carboxílico, con funciones fenilo, con funciones octadecilo, con funciones estireno/metilo, resinas macroporosas o perlas.
[0155] El soporte sólido puede consistir en un material polimérico, un material no polimérico, por ejemplo, gel de sílice. El soporte sólido puede consistir en un material polimérico que incluye, entre otros, polimetacrilato, ácido poliacrílico, polímero acrílico, poliestireno, estireno, estireno/metacrilato y mezclas de los mismos.
[0156] Los ejemplos de soportes sólidos útiles para inmovilizar las enzimas utilizadas en el método de la presente invención incluyen, entre otros, perlas o resinas que comprenden polimetacrilato con grupos funcionales epóxido, polimetacrilato con grupos funcionales amino epóxido, polimetacrilato con grupos funcionales etilendiamina, polimetacrilato con funciones epóxido y además funcionalizado con un grupo hidrófobo, como butilo, octilo, metilo, fenilo, por ejemplo polimetacrilato con funciones epóxido y funciones butilo, polimetacrilato con funciones amino C2 espaciador, polimetacrilato con funciones amino C6 espaciador, ácido poliacrílico con funciones epoxi, polímero acrílico con funciones epoxi ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amino C6 espaciador, ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amina terciaria, poliestireno con funciones aniónicas/amina cuaternaria, poliestireno con funciones catiónicas/sulfónicas, ácido poliacrílico con funciones éster carboxílico, poliestireno con funciones fenilo, polimetacrilato con funciones octadecilo, poliestireno con funciones estireno/metilo, partículas magnéticas de sílice con función Ni-NTA, o nanopartículas magnéticas con núcleo de magnetita y dextrano cáscara con grupo funcional Ni-NTA, resinas macroporosas o perlas de estireno macroporoso o estireno/metacrilato. Aunque, en principio, cualquier soporte sólido adecuado conocido en la técnica se puede utilizar en el método inventivo, las perlas de agarosa Ni o las resinas de agarosa Ni NTA no son preferidas por las razones expuestas anteriormente.
[0157] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-A-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y A-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-d¡fosfo-N-acet¡l-α-D-glucosam¡na a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto inmovilizado de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable seleccionado de polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones amino epóxido, polimetacrilato con funciones etilendiamina, polimetacrilato con funciones epóxido y funcionalizado con un grupo hidrofóbico, como butilo, octilo, metilo, fenilo, por ejemplo polimetacrilato con funciones epóxido y funciones butilo, polimetacrilato con funciones amino C2 espaciador, polimetacrilato con funciones amino C6 espaciador, ácido poliacrílico con funciones epoxi, polímero acrílico con funciones epoxi ácido poliacrílico con aniónico/amino C6 espaciador funciones, ácido poliacrílico con funciones aniónicas/amina terciaria, poliestireno con funciones aniónicas/amina cuaternaria, poliestireno con funciones catiónicas/sulfónicas, ácido poliacrílico con funciones éster carboxílico, poliestireno con funciones fenilo, polimetacrilato con funciones octadecilo, poliestireno con funciones estireno/metilo y resinas macroporosas o perlas de estireno o estireno/metacrilato macroporosos.
[0158] Los ejemplos de soportes sólidos útiles para inmovilizar las enzimas utilizadas en el método de la invención incluyen, entre otros, Sepabeads/ReliZyme (Resindion): EC-EP, incluidos EC-EP/S y EC-EP/M, EP112/ S, EP112/M, EP113/S, EP113/M, EP403/M, EP403/S, HFA403M, HFA403S, HG403, EP400/SS EC-HG, EC-HFA, EC-EA/M, EA403/S y EC -HA incluyendo EC-HA/S y EC-HA/M; Immobeads (ChiralVision) Imm150P, IB-COV1, IB-COV2, IBCOV3, IB-AN11, IB-AN12, IB-AN13, IB-ANI4, IB-CAT1, IB-ADS1, IB-ADS2, IB-ADS3 e IB-ADS4, IB-CAT-1, IB-ANI-1, IB-ANI-2, IB-ANI-3, IB-ANI-4; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG) y partículas magnéticas (micromod GmbH): Nanomag, Sicastar-6 y Sicastar-1.5, resinas de inmovilización enzimática Lifetech™ (Purolite): Epoxi metacrilato: ECR8215, ECR8215F, ECR8215M, ECR8206, ECR8206F, ECR8206M, ECR8204, ECR8204F, ECR8204M, ECR8209, ECR8209F.. ECR8209M.. ECR8285.. ECR8285F, ECR8285M, Amino C2 o C6 metacrilato: ECR8305, ECR8305F, ECR8305M, ECR8309, ECR8309F, ECR8309M, ECR8315, ECR8315F, ECR8315M, ECR8404 ECR8404F, ECR8404M, ECT8409, ECT8409F, ECT8409M, ECR8415, ECR8415F, ECR8415M, resinas macroporosas ECR1090, ECR1091, ECR1091M, ECR1061, ECR1030, ECR1030F, ECR8806F; resinas iónicas ECR1504, ECR1508, ECR1604, ECR1640 y partículas magnéticas (micromod GmbH): Nano-mag-D y Sicastar-M-CT.
[0159] Los materiales de soporte sólido que dan como resultado perlas o resinas mecánicamente estables con enzimas inmovilizadas son los preferidos con respecto a la reutilización y/o reciclado de las perlas o resinas para la producción de UDP-GIcNAc y más preferidos con respecto a un proceso continuo de el método para la producción de UDP-GIcNAc. Un soporte sólido mecánicamente estable se caracteriza por su resistencia a la abrasión, al estrés mecánico y es adecuado para un número elevado de ciclos, como al menos 10, más preferiblemente al menos 12, más preferiblemente al menos 14, más preferiblemente al menos 16, más preferiblemente al menos 18, y lo más preferiblemente al menos 20 ciclos. Podría demostrarse que la inmovilización de enzimas a través de la unión covalente a un soporte sólido proporciona perlas o resinas mecánicamente estables, lo que ha demostrado ser particularmente adecuado para la reutilización y/o el reciclaje de las resinas o perlas con enzimas inmovilizadas para la producción de UDP-GlcNAc. Sorprendentemente se ha encontrado que con perlas o resinas que comprenden un polímero con funciones epóxido, como por ejemplo, pero sin limitarse a polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones amino epóxido, polimetacrilato con funciones etilendiamina, polimetacrilato con funciones epóxido grupos y funciones butilo ácido poliacrílico con funciones epoxi, polímero acrílico con funciones epoxi, que permiten inmovilizar la unión covalente de las enzimas, se pueden obtener resinas o perlas mecánicamente robustas.
[0160] Por lo tanto, se prefieren soportes sólidos mecánicamente estables y reutilizables en forma de perlas o resinas con enzimas inmovilizadas en relación con la coinmovilización del conjunto de enzimas del lisado de células crudas o del homogeneizado de células crudas, y con respecto a la retención de grandes partes. de o aumentando la actividad de todas las enzimas co-inmovilizadas y con respecto a la reutilización y/o reciclado de las perlas o resinas para la producción de UDP-GlcNAc y con respecto a un proceso continuo del método para la producción de UDP-GlcNAc. Los soportes sólidos se caracterizan, entre otras cosas, por su resistencia a la abrasión, la tensión mecánica y son adecuados para un número elevado de ciclos, como al menos 10, más preferiblemente al menos 12, más preferiblemente al menos 14, más preferiblemente al menos 16, más preferiblemente al menos 18, y lo más preferiblemente al menos 20 ciclos. Podría demostrarse que la inmovilización de enzimas a través de la unión covalente a un soporte sólido proporciona perlas o resinas mecánicamente robustas, lo que ha demostrado ser particularmente adecuado para la reutilización y/o el reciclaje de las resinas o perlas con enzimas inmovilizadas para la producción de UDP- GlcNAc, que permite la coinmovilización del conjunto de enzimas del lisado celular crudo y que retiene gran parte o aumenta la actividad de todas las enzimas coinmovilizadas. Sorprendentemente se ha encontrado que con perlas o resinas que comprenden funciones epóxido, funciones amino epóxido, funciones etilendiamina, o funciones epóxido y un grupo hidrófobo, como las funciones butilo, octilo, metilo, fenilo, butilo que permiten la unión covalente de las enzimas a inmovilizar, pueden obtenerse perlas o resinas sólidas robustas.
[0161] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto inmovilizado de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente en perlas o resinas mecánicamente estables y reutilizables que comprenden grupos funcionales epóxido, grupos funcionales amino epóxido, grupos funcionales etilendiamina o grupos funcionales epóxido y un grupo hidrofóbico, tal como grupos funcionales butilo, octilo, metilo, fenilo, butilo.
[0162] Las resinas o perlas activadas con epoxi permiten la unión covalente multipunto entre una enzima y la resina o perla. Preferentemente, la columna vertebral de la resina está compuesta por metacrilato con porosidades de 0,01 nm a 10000 nm o de 0,1 A a 100000 A. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina o perla funcionalizada con epoxi, por ejemplo, una resina o perla de metacrilato epoxi, puede ser de 30 nm a 60 nm. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina o perla de metacrilato epoxi puede ser de 40 nm a 60 nm. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina o perla funcionalizada con epoxi, por ejemplo, una resina o perla de metacrilato epoxi, puede ser de 50 nm a 60 nm. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina o perla funcionalizada con epoxi, por ejemplo, una resina o perla de metacrilato epoxi, puede ser de 60 nm a 120 nm. en un preferido En la forma de realización, la porosidad de una resina o perla funcionalizada con epoxi, por ejemplo, una resina o perla de metacrilato epoxi, puede ser de 120 nm a 180 nm. La resina o perla funcionalizada con epoxi, por ejemplo una resina o perla de metacrilato epoxi, puede formar enlaces covalentes muy estables con diferentes grupos proteicos, tales como amino, tiol, fenólico, preferiblemente en condiciones de temperatura y pH muy suaves. Las resinas son preferiblemente mecánicamente estables y la resina con enzimas inmovilizadas se puede usar preferiblemente en un tanque agitado o en un reactor de columna.
[0163] Resinas amínicas, tales como resinas funcionalizadas con amino C2 o resinas funcionalizadas con amino C6 u otras resinas amínicas como amino C3, amino C4, amino C5, amino C7, etc., como por ejemplo, pero sin limitación, resinas de metacrilato de amino C2 o las resinas de metacrilato C6 amino pueden preactivarse, por ejemplo, con glutaraldehído y luego usarse en la inmovilización covalente de la enzima. La reacción de los grupos aldehido con los grupos amino de las enzimas forma bases de Schiff, lo que da como resultado una unión covalente multipunto. También se puede lograr un enlace por reducción con borohidruros. Así, una inmovilización reversible puede volverse irreversible por medio de la etapa de reticulación: la enzima puede adsorberse sobre el soporte y luego reticularse utilizando, por ejemplo, glutaraldehído. La enzima entrecruzada o la enzima entrecruzada puede cubrir el soporte como una red. Las resinas funcionalizadas con amino, tales como resinas de metacrilato amino C2 o resinas de metacrilato amino C6 tienen porosidades preferiblemente en el rango de 30 nm a 180 nm o 300 A a 1800 A. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina funcionalizada con amino, tal como una resina o perla de metacrilato de amino C2 o de una resina o perla de metacrilato de amino C6, puede ser de 30 nm a 60 nm. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina funcionalizada con amino, tal como una resina o perla de metacrilato de amino C2 o de una resina o perla de metacrilato de amino C6, puede ser de 60 nm a 120 nm. En una forma de realización preferida, la porosidad de una resina funcionalizada con amino, tal como una resina o perla de metacrilato de amino C2 o de una resina o perla de metacrilato de amino C6, puede ser de 120 nm a 180 nm.
[0164] Otro método para la inmovilización irreversible es la activación de grupos funcionales hidroxilo, como por ejemplo para resinas o perlas funcionalizadas con 1,2-diol.
[0165] Así, se prefieren especialmente perlas o resinas que comprenden polimetacrilato con funciones epóxido y polimetacrilato con funciones amino epóxido. Preferiblemente las perlas o resinas que comprenden polimetacrilato con funciones epóxido son hidrófilas. Se prefiere particularmente la inmovilización de enzimas covalentes. En formas de realización preferidas, las perlas o resinas no se funcionalizan con grupos apolares, como grupos butilo u octadecilo. En formas de realización preferidas, las resinas o perlas son hidrófilas.
[0163] Preferentemente, el soporte sólido está compuesto por una resina o perlas seleccionadas entre: perlas separadas (Resindion): EC-EP, EP113/M, EP403/M, EP403/S, HFA403, EA403, HA403, EC-EA/M y EC-HA; inmobeads (ChiralVision) IB-COV1, IB-COV2, IB-COV3, IB-ANI1, IB-AN11, IB-CAT1; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG), resinas de inmovilización enzimática (Purolite): Epoxi metacrilato: ECR8215, ECR8215F, ECR8215M, ECR8206, ECR8206F, ECR8206M, ECR8204, ECR8204F, ECR8204M, ECR8209, ECR8209F, ECR8209M, ECR8285, ECR8285F, ECR8285M, Metacrilato Amino C2 o C6: ECR8305, ECR8305F, ECR8305M, ECR8309, ECR8309F, ECR8309M, ECR8315, ECR8315F, ECR8315M, ECR8404 ECR8404F, ECR8404M, ECT8409, ECT8409F, ECT8409M, ECR8415, ECR8415F, ECR8415M.
[0167] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto inmovilizado de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina, en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción en un soporte sólido mecánicamente estable reutilizable seleccionado de EC-EP, EP113/M, EP403/M, EP403/S, HFA403, EA403, HA403, EC-EA/M y EC-HA, IB- COV1, IBCOV2, IB-COV3, IB-AN11, IB-AN11, IB-CAT1; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG), resinas de inmovilización enzimática (Purolite): Epoxi metacrilato: ECR8215, ECR8215F, ECR8215M, ECR8206, ECR8206F, ECR8206M, ECR8204, ECR8204F, ECR8204M, ECR8209, ECR8209F, ECR8209M, ECR8285, ECR8285F, ECR8285M, Metacrilato Amino C2 o C6: ECR8305, ECR8305F, ECR8305M, ECR8309, ECR8309F, ECR8309M, ECR8315, ECR8315F, ECR8315M, ECR8404 ECR8404F, ECR8404M, ECT8409, ECT8409F, ECT8409M, ECR8415, ECR8415F y ECR8415M.
[0168] Preferentemente, el soporte sólido está compuesto por una resina o perlas seleccionadas entre: perlas separadas (Resindion): EC-EP, EP113/M, EP403, EP403/M, EP403/S, EC-HFA, HFA403, HFA403/M, HFA 403/S, immobeads (ChiralVision) IB-COV2, IB-COV3, (Purolite) ECR8215, ECR8215F, ECR8215M, ECR8204F, ECR8204M, ECR8204, ECR8209F, ECR8209M, ECR8209; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG).
[0169] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es hidrofílico. Preferiblemente, las enzimas se inmovilizan en el soporte sólido mediante unión covalente.
[0170] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es una resina o perla de metacrilato funcionalizado.
[0171] Por lo tanto, la presente invención se dirige preferentemente a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetilα-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es una resina o perla funcionalizada que comprende grupos funcionales epóxido o grupos funcionales amino epóxido. Preferiblemente, el soporte sólido es una resina o perla que comprende un polímero con funciones epóxido o funciones amino epóxido. Más preferentemente, el soporte sólido es una resina o perla que comprende un polímero con funciones epóxido.
[0172] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente en un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y adenosina trifosfato,
donde el soporte sólido es una resina funcionalizada o perla que comprende un polímero con funciones epóxido o funciones amino epóxido.
[0173] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es una resina o perla de metacrilato funcionalizado que comprende funciones epóxido o funciones amino epóxido.
[0174] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es compuesto por una resina o perlas seleccionadas de sepabeads (Resindion): EC-EP, EP403, EP403/M, EP403/S, EC-HFA, HFA403, HFA403/M, HFA 403/S, immobeads (ChiralVision) IB-COV2, IB-COV3, (Purolite) ECR8215, ECR8215F, ECR8215M, ECR8204F, ECR8204M, ECR8204, ECR8209F, ECR8209M, ECR8209; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG).
[0175] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es compuesto por una resina o perlas seleccionadas de: sepabeads (Resindion): EC-EP, EP403/M, EP403/S, EC-HFA, HFA403, HFA403/M, HFA 403/S, immobeads (ChiralVision) IB-COV2, IB -COV3, (Purolite) ECR8215, ECR8215F, ECR8215M, ECR8204F, ECR8204M, ECR8204, ECR8209F, ECR8209M, ECR8209; Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG).
[0176] Además, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es compuesto por perlas o resinas que comprenden polimetilmetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones epóxido, polimetacrilato con funciones amino epóxido, polimetacrilato con funciones etilendiamina, polimetacrilato con funciones amino C2, polimetacrilato con funciones amino C6, ácido poliacrílico con funciones epoxi grupos, ácido poliacrílico con grupos funcionales espaciadores aniónicos/amino C6.
[0177] En una forma de realización, las enzimas se inmovilizan covalentemente sobre un polímero de metacrilato funcionalizado con grupos epoxi como soporte sólido. Un polímero de metacrilato de este tipo posee una alta resistencia mecánica que lo hace adecuado para su uso en reactores en ciclos o ciclos múltiples. Los grupos epoxi forman enlaces covalentes muy estables con las enzimas de la cascada UDP-GIcNAc de modo que retienen su actividad, especificidad de sustrato, estereoselectividad y/u otras propiedades, minimizando así el lavado prematuro de las enzimas durante la síntesis. Así, los inventores han demostrado que la conversión completa de N-acetil-D-glucosamina y UMP en UDP-N-acetil-D-glucosamina puede lograrse incluso si el soporte sólido sobre el que se inmovilizan covalentemente las enzimas se reutiliza en ciclos múltiples.
[0178] Además, los inventores han descubierto sorprendentemente que la actividad enzimática puede incluso aumentarse cuando se utiliza como soporte sólido un polímero de metacrilato funcionalizado con grupos epoxi en más de 3 ciclos discontinuos. Por lo tanto, la reutilización de dicho soporte sólido en múltiples corridas o ciclos mejora significativamente la productividad de los métodos inventivos descritos aquí (ver Figura 33).
[0179] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas inmovilizadas covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
donde el soporte sólido es compuesta por perlas o resinas que comprenden polimetacrilato con funciones amino epóxido o polimetacrilato con funciones epóxido. Preferiblemente, dicho soporte sólido tiene un tamaño de partícula entre 100 μm y 300 μm. Preferiblemente, dicho soporte sólido tiene un diámetro de poro entre 40 nm y 60 nm. Preferiblemente, dicho soporte sólido se selecciona de HFA403/S o EP403/S.
[0180] Preferiblemente, las enzimas se coinmovilizan en un polímero funcionalizado con grupos epoxi que se pueden usar en reactores en ciclos o ciclos múltiples. Preferiblemente, las enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido pueden usarse en al menos 3 ciclos, más preferiblemente en al menos 4 ciclos, más preferiblemente en al menos 5 ciclos, más preferiblemente en al menos 6 ciclos, más preferiblemente en al menos 7 ciclos, más preferiblemente en al menos 8 ciclos, más preferiblemente en al menos 9 ciclos, más preferiblemente en al menos 10 ciclos, más preferiblemente en al menos 12 ciclos, más preferiblemente en al menos 14 ciclos, más preferiblemente en al menos 16 ciclos, más preferiblemente en al menos 18 ciclos, más preferiblemente en al menos 20 ciclos, más preferiblemente en al menos 25 ciclos, más preferiblemente en al menos 25 ciclos, más preferiblemente en al menos 30 ciclos, y lo más preferiblemente en al menos 50 ciclos. Preferiblemente, las enzimas se co-inmovilizan sobre un soporte sólido y pueden usarse en al menos 3 - 10, preferiblemente 5 - 12, más preferiblemente 7 -14, más preferiblemente 9 - 16 e incluso más preferiblemente al menos 10 - 20 ejecuciones o ciclos.
[0181] En formas de realización preferidas, las perlas epoxi o la resina con un conjunto de enzimas inmovilizadas, preferiblemente un conjunto de enzimas co-inmovilizadas, permiten en general la síntesis de UDP-GIcNAc en más de 3 ciclos, preferiblemente más de 5 ciclos, preferiblemente más de 10 ciclos, y preferiblemente incluso más de 20 ciclos. La síntesis de UDP-GIcNAc en un número tan grande de ciclos es una mejora significativa del proceso y no se ha informado antes en la técnica anterior. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 33 y como se demuestra en el Ejemplo 4, las perlas de agarosa Ni o las resinas de agarosa Ni NTA no son soportes sólidos mecánicamente estables reutilizables según la presente invención y no pueden reutilizarse en más de 2 ciclos. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, las perlas de Ni agarosa o las resinas de Ni NTA agarosa no son las preferidas. Preferiblemente, un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable no se relaciona con perlas de agarosa Ni o resinas de agarosa Ni NTA.
[0182] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; donde el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre un polímero funcionalizado con grupos epoxi.
[0183] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; donde el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre un polímero funcionalizado con grupos amino epoxi.
[0184] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas también comprende una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios.
[0185] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se dirige a un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; en donde el conjunto de enzimas está co-inmovilizado sobre un polímero de metacrilato funcionalizado con grupos epoxi.
[0186] Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; en donde el conjunto de enzimas está co-inmovilizado sobre un polímero de metacrilato funcionalizado con grupos amino epoxi.
[0187] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas también comprende una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios.
[0188] Preferiblemente, el polímero de metacrilato tiene forma de perlas. Preferiblemente, las perlas tienen un tamaño de partícula en el rango de 150 μm a 300 μm. Preferiblemente, el polímero de metacrilato es poroso con un diámetro de poro entre 600 A y 1200 A. En una forma de realización, el polímero de metacrilato es de baja porosidad y tiene un diámetro de poro entre 300 A y 600 A. En una forma de realización, el polímero de metacrilato es de baja porosidad y tiene un diámetro de poro entre 450 A y 650 A. En una forma de realización, el polímero de metacrilato es de alta porosidad y tiene un diámetro de poro entre 1200 A y 1800 A. En una forma de realización, el polímero de metacrilato se funcionaliza adicionalmente con grupos butilo. En una forma de realización, el polímero de metacrilato se funcionaliza adicionalmente con un grupo hidrofóbico como butilo, metilo, fenilo, octilo.
[0189] En una forma de realización adicional de la presente invención, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetilα-D-glucosamina comprende el paso adicional C):
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina.
[0190] En una forma de realización adicional de la presente invención, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetilα-D-glucosamina comprende el paso adicional C):
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina por cromatografía de intercambio iónico.
[0191] Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0192] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0193] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios.
[0194] Preferiblemente, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina,
en la que al menos una enzima del conjunto de enzimas está inmovilizada sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0195] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable. Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0196] Preferiblemente, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0197] Preferiblemente, la presente invención se dirige además a un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas coinmovilizadas covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina,
donde el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre un soporte sólido a partir de lisado celular. Más preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0198] En una forma de realización de la presente invención, la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina se produce a partir de uridina y N-acetilglucosamina. Así, el monofosfato de uridina en el paso A) de los métodos inventivos se obtiene a partir de uridina, fosfato de adenosina y una enzima uridina quinasa. Así, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i') uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una uridina quinasa, una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0199] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0200] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas está inmovilizado o coinmovilizado sobre un soporte sólido.
[0201] En una forma de realización de la presente invención, la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina se produce a partir de uracilo, 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato (PRPP) y N-acetil-D-glucosamina. Así, el monofosfato de uridina en el paso A) de los métodos inventivos se obtiene a partir de uracilo, 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato y una enzima uracilo fosforribosiltransferasa. Así, el método para producir uridina 5'-difosfo-W-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i') uracilo, fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato, y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una uracilo fosforribosiltransferasa, una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0202] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0203] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas está inmovilizado o coinmovilizado sobre un soporte sólido.
[0204] En una forma de realización de la presente invención, la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosam¡na se produce a partir de ácido orótico, 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato (PRPP) y N-acetil-D-glucosamina. El ácido orótico se fosforila en presencia de una orotato fosforribosiltransferasa y la oritidina 5'-fosfato (OMP) formada se descarboxila a uridina monofosfato mediante una UMP sintasa. Así, el monofosfato de uridina en el paso A) de los métodos inventivos se obtiene a partir de ácido orótico, 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato, una orotato fosforribosiltransferasa y una enzima UMP sintasa. Así, el método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i') ácido orótico, fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato, y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una orotato fosforribosiltransferasa, una UMP sintasa, una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas es inmovilizado covalente o adsortivamente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0205] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0206] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas está inmovilizado o coinmovilizado sobre un soporte sólido.
Sacáridos glcNAcilados, glicopéptidos GIcNAcilados, glicoproteínas GIcNAciladas, proteínas GIcNAciladas, péptidos GlcNAcilados, bioconjugados GlcNAcilados y moléculas pequeñas GlcNAciladas.
[0207] En otro aspecto de la presente invención, los métodos inventivos descritos en el presente documento son útiles para producir sacáridos GlcNAcilados, glicopéptidos GlcNAcilados, glicoproteínas GlcNAcilados, proteínas GlcNAcilados, péptidos GlcNAcilados o moléculas pequeñas GlcNAciladas. GlcNAcilación como se usa aquí se refiere a la funcionalización de un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña con N-acetil-D-glucosamina por reacción catalizada enzimáticamente con UDP-N-acetil-α-D-glucosamina. Las glicosiltransferasas son enzimas que catalizan la reacción entre UDP-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible de un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido o molécula pequeña.
[0208] Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en la que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0209] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0210] Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas polifosfato y adenosina trifosfato, C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina,
D) produciendo un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una pequeña molécula GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0211] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0212] Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y opcionalmente una pirofosfatasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina,
D) que produce un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña formando un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetilα-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0212] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0214] La glicosiltransferasa cataliza la reacción de UDP-GIcNAc con un grupo hidroxilo disponible de un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña, formando así un sacárido GlcNAcilado, glicopéptido GlcNAcilado, glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada y difosfato de uridina (UDP) como producto secundario. Siendo el UDP un producto intermedio formado en el paso B), concretamente en el paso (b2') se puede reutilizar o reciclar.
[0215] Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas co-inmovilizadas sobre un soporte sólido que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina mediante
(a) la formación de N-acetilglucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de N-acetilglucosamina y trifosfato de adenosina catalizados por una N-acetilhexosamina quinasa,
(b1) formando difosfato de uridina (UDP) a partir de monofosfato de uridina y trifosfato de adenosina catalizados por una quinasa de monofosfato de uridina;
(b2) formar trifosfato de uridina (UTP) a partir de difosfato de uridina y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y
(c) hacer reaccionar N-acetilglucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina para dar UDP-N-acetilglucosamina en presencia de glucosa-1-fosfato uridililtransferasa;
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y una sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glucopéptido, glucoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa; E) reciclar el difosfato de uridina formado in situ para formar trifosfato de uridina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0216] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0217] Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa y una pirofosfatasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina mediante
(a) la formación de N-acetilglucosamina 1-fosfato (GlcNAc-1-P) a partir de N-acetilglucosamina y trifosfato de adenosina catalizados por una W-acetilhexosamina quinasa,
(b1) formando difosfato de uridina (UDP) a partir de monofosfato de uridina y trifosfato de adenosina catalizados por una quinasa de monofosfato de uridina;
(b2) formar trifosfato de uridina (UTP) a partir de difosfato de uridina y polifosfato catalizados por una polifosfato quinasa; y
(c') hacer reaccionar N-acetilglucosamina 1-fosfato con uridina trifosfato para dar UDP-N-acetilglucosamina en presencia de glucosa-1-fosfato uridililtransferasa;
(c") convertir pirofosfato en fosfato en presencia de una pirofosfatasa;
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una glicosiltransferasa;
E) reciclar el difosfato de uridina formado in situ para formar trifosfato de uridina,
donde el conjunto de enzimas es covalentemente o inmovilizado por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable reutilizable.
[0218] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable reutilizable aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0219] Debido al reciclado del subproducto difosfato de uridina en los métodos de cilación de GlcNA inventivos descritos en el presente documento, se requieren cantidades más bajas de monofosfato de uridina en la solución proporcionada en el paso A). Por lo tanto, en una forma de realización, la relación molar de monofosfato de uridina a N-acetil-D-glucosamina está entre 0,0001 y 0,999, más preferiblemente entre 0,001 y 0,99, más preferiblemente entre 0,005 y 0,95, más preferiblemente entre 0,001 y 0,95 y lo más preferiblemente entre 0,001 y 0,95. 0,005 y 0,98. En una forma de realización, la relación molar de monofosfato de uridina a N-acetil-D-glucosamina es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de monofosfato de uridina a N-acetilglucosamina es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de monofosfato de uridina a N-acetilglucosamina es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de monofosfato de uridina a N-acetil-D-glucosamina es 0,5.
[0220] Preferiblemente, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una pequeña molécula GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionando una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa;
F) aislar el sacárido GlcNAcilado, el glucopéptido GlcNAcilado, la glicoproteína GlcNAcilada, la proteína GlcNAcilada, el péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o la pequeña molécula GicNAcilada,
donde el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0221] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0222] Preferiblemente, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa; una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios, y opcionalmente una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-W-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y W-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un sacárido glcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o pequeño molécula en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa;
F) aislar el sacárido GIcNAcilado, el glucopéptido GIcNAcilado, la glicoproteína GIcNAcilada, la proteína GIcNAcilada, el péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GIcNAcilado o la pequeña molécula GIcNAcilada,
donde el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0223] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0224] Preferiblemente, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa; una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios, y opcionalmente una pirofosfatasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
C) aislar la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina,
D) que produce un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña formando un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetilα-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa;
F) aislar el sacárido GIcNAcilado, el glucopéptido GIcNAcilado, la glicoproteína GIcNAcilada, la proteína GIcNAcilada, el péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GIcNAcilado o la pequeña molécula GIcNAcilada,
donde el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0225] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0226] Preferiblemente, el polifosfato es un polifosfato de cadena larga que tiene al menos 25 residuos de fosfato.
[0227] Preferiblemente, la concentración de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en la solución proporcionada en el paso A) está en el rango de 0,2 mM a 5000 mM.
[0228] Preferiblemente, la concentración de las enzimas en el conjunto de enzimas está entre 0,0001 mg/mL y 100 mg/mL en base al volumen total de la solución proporcionada en el paso A).
[0229] Preferiblemente, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa, una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en la que el conjunto de enzimas y, opcionalmente, la N-acetilglucosaminiltransferasa se inmovilizan de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0230] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0231] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas también comprende una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, cada enzima del conjunto de enzimas y la glicosiltransferasa se coinmovilizan sobre el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0232] Preferiblemente, el método para producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionando un conjunto de enzimas que comprenden una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una W-acetilglucosaminiltransferasa,
en la que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0233] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0234] En una forma de realización, los sacáridos de leche GlcNAcilado se producen mediante los métodos inventivos descritos en este documento. Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un sacárido GlcNAcilado de la leche a partir de la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un sacárido de la leche mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido de la leche, en la presencia de una W-acetilglucosaminiltransferasa,
en la que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable.
[0235] Preferiblemente, el sacárido de leche GlcNAcilado es un oligosacárido de leche humana.
[0236] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable. Preferiblemente, el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0237] Preferiblemente, los sacáridos de la leche se seleccionan del grupo que comprende N-acetillactosamina (LacNAc), Lacto N-triosa (LNT II), Lacto-N-neotetraosa (LNnT), Lacto-N-tetraosa (Ln T), Lacto-N-fucopentaosa I (LNFP I), Lacto-N-fucopentaosa II (LNFP II), Lacto-N-fuconeopentaosa III (LNFP III), Lacto-N-fuconeopentaosa V (LNFP V), Lacto-N-difucohexaosa II (LNDFH II)), lacto-N-hexaosa (LNH), lacto-N-neohexaosa (LNnH), fucosil-lacto-N-neohexaosa I (F-LNH I) , fucosil-lacto-N-neohexaosa II (F-LNH II), difucosil-lacto-N-hexaosa I (DF-LNH I), difucosil--lacto-N-hexaosa II (Df LNH II) , difucosil--para-lacto-N-neohexaosa (DF-para-LWnH), T-trifucosil-lacto-N-hexaosa (TF-LNH), a2,6-sialillacto W-neotetraosa (LSTc), a2,6-sialillacto-N-tetraosa (LSTa), sialillacto-N-tetraosa b (LSTb), disialil-lacto-N-hexaosa (DSLNH), fucosil--a2,6-sialillacto-N-tetraosa (F-LSTa), fucosil-sialil-lacto-N-neohexaosa I (FS-LNnH I), fucosil-disialillacto-N-hexaosa II (FDS-LNH II) (ver FIG. 32).
[0238] En una forma de realización, las vacunas de conjugados de carbohidratos glcNAcilados se producen mediante los métodos inventivos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un GlcNAcilado vacuna conjugada de carbohidratos a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y una vacuna conjugada de carbohidratos mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina y un grupo hidroxilo disponible del antígeno de carbohidrato de la vacuna conjugada, en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
donde el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0239] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima. Preferiblemente, la N-acetilglucosaminiltransferasa también se inmoviliza covalentemente sobre el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0240] Preferiblemente, la vacuna de conjugado de carbohidrato es un conjugado de CRM197 seleccionado de un sacárido neumocócico, un sacárido de H. influenzae tipo B y un sacárido de W. meningitidis serotipo A, C, W o Y; un conjugado de TT seleccionado de un sacárido neumocócico, un sacárido de tipo B de H. influenzae y un sacárido de serotipo A, C, W o Y de W. meningitidis; un conjugado de DT seleccionado de un sacárido neumocócico, un sacárido de H. influenzae tipo B y un sacárido de W. meningitidis serotipo A, C, W o Y, un conjugado de proteína D de sacárido neumocócico o un conjugado de OMPC de sacárido tipo B de H. influenzae, en donde el sacárido neumocócico se selecciona preferiblemente de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.
[0241] En una forma de realización, los conjugados de fármaco de anticuerpo GlcNAcilado se producen mediante los métodos inventivos descritos en este documento. Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y
proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una W-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un GlcNAcilado conjugado de anticuerpo y fármaco a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un conjugado de anticuerpo y fármaco mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina y un grupo hidroxilo disponible del anticuerpo y fármaco conjugado, en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o por adsorción sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0242] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima. Preferiblemente, la N-acetilglucosaminiltransferasa también se inmoviliza covalentemente sobre el soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0243] Preferiblemente, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal y un agente citotóxico.
[0244] En una forma de realización, las proteínas terapéuticas GlcNAcilado se producen mediante los métodos inventivos descritos en este documento. Por lo tanto, en una forma de realización, el método inventivo comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir una proteína GlcNAcilada terapéutica a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y una proteína terapéutica mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina y un grupo hidroxilo disponible de la proteína terapéutica, en la presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en la que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0245] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0246] Preferiblemente, la proteína terapéutica es una proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Preferiblemente, la proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas es un anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que incluye anticuerpos monoclonales biespecíficos y fármacos basados en anticuerpos. Preferiblemente, el anticuerpo no está completamente GlcNAcilado. Preferiblemente, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en:
3F8, 8H9, Arcitumomab, Ascrinvacumab, Aselizumab, Atezolizumab, Atidortoxumab, Atinuma, Atorolimumab, Avelumab, Azintuxizumab vedotin, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, BCD-100, Bectumomab, Begelomab, Belantamab mafodotin, Belimumab, Bemarituzuma, Benralizumab, Berlimatoxumab, Bermekimab, Bersanlimab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Bezlotoxumab, Biciromab, Bimagrumab, Bimekizumab, Birtamimab, Bivatuzumab mertansine, Bleselumab, Blinatumomab, Blontuvetmab, Blosozumab, Bococizumab, Brazikumab, Brentuximab vedotin, Briakinumab, Brodalumab, Brolucizumab, brontictuzumab, burosumab, cabiralizumab, camidanlumab tesirina, camrelizumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab ravtansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, carotuximab, catumaxomab, cBR96-doxorrubicina inmunoconjugada, cedelizumab, cemiplimab, cergutuzumab amunaleukin, certolizumab pegol, cetrelimab, cetuximab, Cibisatamab, Cirmtuzumab, Citatuzumab bogatox, Cixutumumab, Clazakizumab, Clenoliximab, Clivatuzumab tetraxetan, Codrituzumab, Cofetuzumab pelidotin, Coltuximab ravtansine, Conatumumab, Concizumab, Cosfroviximab, CR6261, Crenezumab, Crizanlizumab, Crotedumab, Cusatuzumab, Dacetuzumab, Daclizumab, Dalotuzumab, Dapirolizumab pegol, daratumumab, dectrekumab, demcizumab, denintuzumab mafodotina, Denosumab, Depatuxizumab mafodotina, Derlotuximab biotina, Detumomab, Dezamizumab, Dinutuximab, Diridavumab, Domagrozumab, Dorlimomab aritox, Dostarlima, Drozitumab, DS-8201, Duligotuzumab, Dupilumab, Durvalumab, Dusigitumab, Duvortuxizumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Eldelumab, Elezanumab, Elgemtumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Emactuzumab, Emapalumab, Emibetuzumab, Emicizumab, Enapotamab vedotin, Enavatuzumab, Enfortumab vedotin, Enlimomab pegol, Enoblituzumab, Enokizumab, Enoticumab, Ensituximab, Epitumomab cituxetan, Epratuzumab, Ep tinezumab, erenumab, erlizumab, ertumaxomab, Etaracizumab, Etigilimab, Etrolizumab, Evinacumab, Evolocumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Faricimab, Farletuzumab, Fasinumab, FBTA05, Felvizumab, Fezakinumab, Fibatuzumab, Ficlatuzumab, Figitumumab, Firivumab, Flanvotumab, Fletikumab, Flotetuzumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fremanezumab, Fresolimumab, Frovocimab, Frunevetmab, Fulranumab, Futuximab, Galcanezumab, Galiximab, Gancotama, Ganitumab, Gantenerumab, Gatipotuzumab, Gavilimomab, Gedivumab, Gemtuzumab ozogamicina, Gevokizumab, Gilvetmab, Gimsilumab, Girentuximab, Glembatumumab vedotin, Golimumab, gomiliximab, gosuranemab, guselkumab, lanalumab, Ibalizumab, IB1308, Ibritumomab tiuxetan, Icrucumab, Idarucizumab, Ifabotuzumab, Igovomab, Iladatuzumab vedotin, IMAB362, Imalumab, Imaprelimab, Imciromab, Imgatuzumab, Inclacumab, Indatuximab ravtansine, Indusatumab vedotin, Inebilizumab, Inflix imab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, intetumumab, lomab-B, Ipilimumab, Iratumumab, Isatuximab, Iscalimab, Istiratumab, Itolizumab, Ixekizumab, Keliximab, Labetuzumab, Lacnotuzumab, Ladiratuzumab vedotina, Lampalizumab, Lanadelumab, Landogrozumab, Laprituximab emtansina, Larcaviximab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lendalizumab, lenvervimab, lenzilumab, lerdelimumab, leronlimab, Lesofavumab, Letolizumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lifastuzumab vedotina, Ligelizumab, Lilotomab satetraxetan, Lintuzumab, Lirilumab, Lodelcizumab, Lokivetmab, Loncastuximab tesirina, Lorvotuzumab mertansina, Losatuxizumab vedotina, Lucatumumab, Lulizumab pegol, Lumiliximab, Lumretuzumab, Lupartumab amadotina, Lutikizumab, Mapatumumab, Margetuximab, Marstacima, Maslimomab, Matuzumab, Mavrilimumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mirikizumab, Mirvetuximab soravtansina, Mitumomab, Modotuximab, Mogamulizumab, Monalizumab, Morolimumab, Mosunetuzumab, Motavizumab, Moxetumomab pasudotox, Muromonab-CD3, Nacolomab tafenatox, Namilumab, Naptumomab estafenatox, Naratuximab emtansina, Narnatumab, Natalizumab, Navicixizumab, Navivumab, Naxitamab, Nebacumab, Necitumumab, Nemolizumab, NEOD001, Nerelimomab, Nesvacumab, Netakimab, Nimotuzumab, Nirsevimab, Nivolumab, Nofetumomab merpentan, Obiltoxaximab, Obinutuzumab, Ocaratuzumab, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Oleclumab, Olendalizumab, Olokizumab, Omalizumab, Omburtamab, OMS721, Onartuzumab, Ontuxizumab, Onvatilimab, Opicinumab, Oportuzumab monatox, Oregovomab, Orticumab, Otelixizumab, Otilimab, Otlertuzumab, Oxelumab, Ozanezumab, Ozoralizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Pamrevlumab, Panitumumab, Pankomab, Panobacumab, Parsatuzumab, Pascolizumab, Pasotuxizumab, Pateclizumab, Patritumab, PDR001, Pembrolizumab, Pemtumomab, Perakizumab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pidilizumab, Pinatuzumab vedotin, Pintumomab, Placulumab, Plozalizumab, Pogalizumab, Polatuzumab vedotin, Ponezumab, Porga viximab, prasinezumab, prezalizumab, priliximab, Pritoxaximab, Pritumumab, PRO 140, Quilizumab, Racotumomab, Radretumab, Rafivirumab, Ralpancizumab, Ramucirumab, Ranevetmab, Ranibizumab, Ravagalimab, Ravulizumab, Raxibacumab, Refanezumab, Regavirumab, Relatlimab, Remtolumab, Reslizumab, Rilotumumab, Rinucumab, Risankizuma b, rituximab, rivabazumab pegol, Rmab, Robatumumab, Roledumab, Romilkimab, Romosozumab, Rontalizumab, Rosmantuzumab, Rovalpituzumab tesirina, Rovelizumab, Rozanolixizumab, Ruplizumab, SA237, Sacituzumab govitecan, Samalizumab, Samrotamab vedotin, Sarilumab, Satralizumab, Satumomab pendetide, Secukinumab, Selic relumab, seribantumab, setoxaximab, setrusumab, Sevirumab, SGN-CD19A, SHP647, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuximab, Simtuzumab, Siplizumab, Sirtratumab vedotin, Sirukumab, Sofituzumab vedotin, Solanezumab, Solitomab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Spartalizumab, Stamulumab, Sulesomab, Suptavumab, Sutimlimab, Suvizumab, suvratoxumab, tabalumab, Tacatuzumab tetraxetan, Tadocizumab, Talacotuzumab, Talizumab, Tamtuvetmab, Tanezumab, Taplitumomab paptox, Tarextumab, Tavolimab, Tefibazumab, Telimomab aritox, Telisotuzumab vedotin, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Tepoditamab, Teprotumumab, Tesidolumab, Tetulomab, Teze pelumab, TGN1412, tibulizumab, tigatuzumab, Tildrakizumab, Timigutuzumab, Timolumab, Tiragotumab, Tislelizumab, Tisotumab vedotin, TNX-650, Tocilizumab, Tomuzotuximab, Toralizumab, Tosatoxumab, Tositumomab, Tovetumab, Tralokinumab, Trastuzumab, Trastuzumab emtansina, TRBS07, Tregalizumab, Tremelimumab, Trevogrumab, Tucotuzumab celmoleucina, Tuvirumab, Ublituximab, Ulocuplumab, Urelumab, Urtoxazumab, Ustekinumab, Utomilumab, Vadastuximab talirina, Vanalimab, Vandortuzumab vedotina, Vantictumab, Vanucizumab, Vapaliximab, Varisacumab, Varlilumab, Vatelizumab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Vesencumab, Visilizumab, Vobarilizumab, Volociximab, Vonlerolizumab, Vopratelimab, Vorsetuzumab mafodotin, Votumumab, Vunakizumab, Xentuzumab, XMAB-5574, Zalutumumab, Zanolimumab, Zatuximab, Zenocutuzumab, Ziralimumab, Zolbetuximab (=IMAB36, Claudiximab) y Zolimomab aritox.
[0247] Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa. Preferiblemente, el conjunto de enzimas también comprende una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferiblemente, el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa y una polifosfato quinasa de 1 dominio y/o una polifosfato quinasa de 2 dominios. Preferentemente, cada enzima del conjunto de enzimas y la N-acetilglucosaminiltransferasa se coinmovilizan sobre el soporte sólido.
[0248] En una forma de realización preferida, el método inventivo comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un GlcNAcilado anticuerpo de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un anticuerpo mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible de la anticuerpo, en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable.
[0249] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0250] En una forma de realización preferida, el método inventivo comprende los siguientes pasos:
A) proporcionar una solución que comprende
(i) monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina;
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa; y
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
D) producir un anticuerpo GIcNAcilado a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un anticuerpo mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina y un grupo hidroxilo disponible del anticuerpo, en la presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa;
E) reciclar el difosfato de uridina formado in situ para formar trifosfato de uridina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
[0251] Preferiblemente, el conjunto de enzimas se co-inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable, aumentando o reteniendo así una gran fracción de la actividad de cada enzima.
[0252] Debido al reciclaje del difosfato de uridina subproducto en los métodos de GIcNAcilación de la invención descritos en el presente documento, se requieren cantidades más bajas de UMP en la solución proporcionada en el paso A). Así, en una forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina está entre 0,0001 y 0,999, más preferiblemente entre 0,0005 y 0,995, más preferiblemente entre 0,001 y 0,995, más preferiblemente entre 0,002 y 0,99 y lo más preferiblemente entre 0,05 y 0,98. En una forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina es 0,05. En una forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina es 0,1. En una forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina es 0,2. En una forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina es 0,5.
[0253] En otra forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina está entre 1 y 10, más preferiblemente entre 1,2 y 8, más preferiblemente entre 1,5 y 7, más preferiblemente entre 1,6 y 6 y lo más preferiblemente entre 2 y 5. En una forma de realización, la relación molar de UMP a N-acetil-D-glucosamina es 1,5. En una forma de realización, la relación molar de UMP a W-acetil-D-glucosamina es 2. En una forma de realización, la relación molar de UMP a W-acetil-D-glucosamina es 5. En una forma de realización, la relación molar de UMP a W-acetil-D-glucosamina es 10.
Descripción de las figuras:
[0254]
Figura 1: muestra la cascada multienzimática a través de la cual se sintetiza enzimáticamente UDP-N-acetil-a-D-glucosamina a partir de sustratos de bajo coste N-acetil-D-glucosamina, polifosfato y UMP. La cascada de reacción consta de (a) la formación de N-acetilglucosamina-1-fosfato (GlcNAc-1P) a partir de N-acetil-D-glucosamina y ATP, (b) la formación de trifosfato de uridina (UTP) a partir de UMP y polifosfato, y (c) la reacción de N-acetilglucosamina 1-fosfato con trifosfato de uridina a UDP-N-acetil-α-D-glucosamina. Opcionalmente se puede añadir una difosfatasa inorgánica (PmPpa) a la cascada de reacción para hidrolizar el pirofosfato PPi que inhibe la enzima glucosa 1-fosfato uridililtransferasa. La cascada también se puede extender agregando un 1D-PPK2 para ayudar a la conversión de ADP a ATP. Además, la cascada se puede extender agregando un 2D-PPK2 para activar la fosforilación de AMP a ADP. Además, la cascada se puede extender agregando 1D-PPK2 y 2DPPK2 para inhibir la hidrólisis frecuente de los fosfatos de adenosina.
Figura 2: muestra un esquema de reacción ejemplar del método inventivo para producir UDP-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de uridina o uracilo y 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato. La formación de UMP a partir de uridina es catalizada por la uridina quinasa y la formación de UMP a partir de uracilo es catalizada por la uracilo fosforribosiltransferasa.
Figura 3: muestra la comparación de la productividad para la síntesis de UDP-GlcNAc con enzimas inmovilizadas por separado y coinmovilización del conjunto de enzimas. La coinmovilización da como resultado una productividad mucho mayor.
Figura 4 muestra los resultados del cribado en soporte sólido de la síntesis de UDP-GIcNAc en un primer ciclo. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 5 muestra los resultados del cribado en soporte sólido de la síntesis de UDP-GIcNAc en un segundo ciclo. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 6 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas coinmovilizadas en resina ECR8285, una resina de metacrilato funcionalizada con grupos butilo y epoxi, en nueve ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 7 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas en resina Eupergit CM - una resina de metacrilato/acrilamida funcionalizada con grupos epoxi - en nueve ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 8 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-HFA - una resina de metacrilato funcionalizada con grupos amino epoxi- en nueve ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 9 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina ECR8215F -una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en nueve ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 10 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-HFA 403/M - una resina de metacrilato funcionalizada con grupos amino epoxi- en nueve ciclos. Las productividades se midieron por HPAECUV.
Figura 11 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina ECR8209F -una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi - en nueve ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 12 muestra A) un diagrama de la cantidad de proteína unida al soporte sólido epoxi determinada mediante la cuantificación de la proteína en el sobrenadante después de la inmovilización de varios soportes sólidos. Se siguieron los protocolos estándar de cuantificación de proteínas BCA; B) un diagrama de la cantidad de proteína unida al soporte sólido iónico y de adsorción determinada mediante la cuantificación de la proteína en el sobrenadante después de la inmovilización de varios soportes sólidos. Se siguieron los protocolos estándar de cuantificación de proteínas BCA; y C) un diagrama de la cantidad de proteína unida al soporte sólido activado con glutaraldehído determinado cuantificando la proteína en el sobrenadante después de la inmovilización de varios soportes sólidos. Se siguieron los protocolos estándar de cuantificación de proteínas BCA.
Figura 13 muestra A) Cromatograma HPAEC-UV de la cuantificación de UDP-GlcNAc (y otros reactivos). El cromatograma que se muestra es de una reacción catalizada por la cascada de enzimas inmovilizada en Eupergit CM; B) Cromatogramas HPAECUV de cuantificación de UDP-GIcNAc (y otros reactivos). El cromatograma que se muestra es de una reacción catalizada por la cascada de enzimas inmovilizadas en IB-ADS1, IB-CAt , ECR1504, IB-AN11; C) Cromatograma HPa Ec UV de la cuantificación de UDP-GIcNAc (y otros reactivos). El cromatograma que se muestra es de una reacción catalizada por la cascada de enzimas inmovilizadas en ECR8315F activo por glutaraldehído.
Figura 14 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-EP - una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos en 3 series. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 15 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas en resina EP403/M - una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi - en 20 ciclos en 3 series. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 16 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina COV1 - una resina poliacrílica funcionalizada con grupos butilo/epoxi - en 10 ciclos en 3 series. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 17 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina COV2 -una resina poliacrílica funcionalizada con grupos epoxi - en 10 ciclos en 3 series. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 18 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina COV3 -una resina poliacrílica funcionalizada con grupos epoxi- en 10 ciclos en 3 series. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 19 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina Eupergit CM -una resina acrílica funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 20 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina ECR8215F -una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 21 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina ECR8204F -una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 22 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina ECR8209F -una resina de metacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 23 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina ECR8285F -una resina de metacrilato funcionalizada con grupos butilo/epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 24 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EP403/S -una resina de polimetacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 25 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EP400/SS -una resina de polimetacrilato funcionalizada con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 26 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-HFA 403/M -una resina de polimetacrilato funcionalizada con grupos amino epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 27 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-HFA 403/S -una resina de polimetacrilato funcionalizada con grupos amino epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 28 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-HFA/S -una resina de polimetacrilato funcionalizada con grupos amino epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 29 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina EC-HFA/M -una resina de polimetacrilato funcionalizada con grupos amino epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 30 muestra los resultados de la síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas co-inmovilizadas sobre resina Immobead 150P -un copolímero de resina de metacrilato funcionalizado con grupos epoxi- en 20 ciclos. Las productividades se midieron por HPAEC-UV.
Figura 31 muestra un esquema de flujo de trabajo para la cascada completa de UDP-GIcNAc que comienza con la mezcla de las biomasas que contienen las enzimas sobreexpresadas para llevar a cabo la reacción de síntesis de UDP-GIcNAc en un soporte sólido. El flujo de trabajo también es adecuado para seleccionar varios soportes sólidos para la inmovilización de enzimas.
Figura 32 muestra sacáridos de leche humana GIcNAc ejemplares.
Figura 33 muestra la actividad de las perlas EP403/S, EC-Ep /M y Ni-NTA hasta 20 ciclos para la síntesis de UDPGIcNAc. Los experimentos de Ni-NTA se llevaron a cabo por triplicado.
Figura 34 muestra los productos intermedios y el producto formado en la cascada de UDP-GIcNAc del Ejemplo 5. (A) UDP-GIcNAc; (B) UMP, UDP y UTP; (C) ADP y ATP. Los experimentos se realizaron por triplicado; las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 35 muestra eductos, productos intermedios y productos formados en el experimento de aumento de escala de UDP-GIcNAc del Ejemplo 5. (A) uridina; (B) UDP-GIcNAc; (C) UMP; (D) UDP; (E) UTP; (F) ATP; y (G) ADP.
Figura 36 muestra la cantidad total relativa de proteína unida a cada perla. Los experimentos se realizaron por triplicado; la barra de errores representa la desviación estándar.
Figura 37 muestra cromatogramas de productos de reacción para la síntesis de UDP-GlcNAc inventiva en cada perla de soporte sólido ensayada.
Figura 38 muestra los resultados de la prueba de actividad en diferentes perlas. Los experimentos se realizaron por triplicado, excepto Relizyme HFA 403/S y Relizyme HFA 403/M, de los cuales se muestra el promedio de tres ciclos consecutivos; la barra de errores representa la desviación estándar.
Figura 39 muestra los resultados de la prueba de actividad en cada perla seleccionada durante 10 ciclos de reacción consecutivos.
[0255] Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la invención.
Abreviaturas y Acrónimos
[0256]
ADP adenosina 5'-difosfato
AMP adenosina 5'-monofosfato
ATP adenosina 5'-trifosfato
dH2O agua desionizada
NahK N-acetilhexosamina quinasa
UDP uridina 5'-difosfato
UMP uridina 5'-monofosfato
UTP uridina 5'-trifosfato
GIcNAc N-acetil-D-glucosamina
PoliP polifosfato
PPi pirofosfato
Pi pirofosfato
PPK2 polifosfato quinasa 2
PPK3 polifosfato quinasa 3
1D-PPK2 polifosfato quinasa 2 de 1 dominio
2D-PPK2 polifosfato quinasa 2 de 2 dominios
GalU glucosa 1-fosfato uridililtransferasa
URA6 uridina monofosfato quinasa
UPP uracilo fosforribosiltransferasa
PmPpA Pasteurella multocida pirofosfatasa inorgánica
Productos quím icos y reactivos
[0257] A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich y eran de la mayor pureza disponible. Los soportes sólidos se obtuvieron de Resindion, ChiralVision, Rohm GmbH & Co. KG y micromod GmbH.
Ejemplo 1: Preparación de enzimas
[0258] La vía metabólica sintética libre de células manipulada consta de cinco enzimas (Fig. 1), todas producidas por E. coli BL21 Gold (DE3). Las enzimas se eligieron de acuerdo con la literatura: NahK (EC 2.7.1.162) de Bifidobacterium longum para fosforilar GIcNAc; GalU (EC 2.7.7.9) de E. coli K-12 MG1655 como GlcNAc-1P uridililtransferasa; URA6 (EC 2.7.4.14) de Arabidopsis thaliana para la regeneración in situ de UDP de UMP; PPK3 (EC 2.7.4.1) de Ruegeria pomeroyi para la recuperación in situ de portadores de energía, ADP y UDP, a sus conjugados de trifosfato; y PmPpA (EC 3.6.1.1) de Pasteurella multocida Pm70 para la descomposición del pirofosfato inhibidor de GalU. Los detalles de todas las enzimas utilizadas se dan en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1 Enzimas utilizadas en este ejemplo
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Transformación, cultivo, expresión
[0259] Para todas las expresiones génicas E. coli BL21 Gold (DE3) se utilizó como organismo huésped.
Plásmidos y cultivos madre
[0260] Las soluciones madre de todos los cultivos de E.coli que portaban los plásmidos (pET28a con resistencia a la kanamicina) con las secuencias génicas estaban disponibles a partir de estudios anteriores [1, 2]. Las soluciones madre contenían 50% de glicerol y se mantuvieron a -20°C.
[0261] El gen y las secuencias de proteínas correspondientes se obtuvieron de la base de datos UniProt: PmPpA (P57918), NahK (E4R3E3), GalU (P0AEP3), PPK3 (Q5LSN8) y URA6 (O04905). Se usó el software Gene Designer 2.0 (Gene Designer, DNA 2.0, Menlo Park, California) para optimizar el uso de codones de secuencias de nucleótidos para la expresión en E. coli. Las secuencias resultantes fueron sintetizadas de novo y clonadas por GeneArt™ (Thermo Fisher Scientific, Regensburg, Alemania). Se usaron los siguientes sitios de restricción para la subclonación en el vector pET-28a(+): Ncol y Xhol para GaIU, NahK y PmPpA (enzimas que llevan una etiqueta de hexahistidina C-terminal (etiqueta His)), Ndel y Xhol con PPK3 y URA6 (para una etiqueta His N-terminal). Después de la transformación de los plásmidos en E. coli, se aisló el ADN y se comprobó la precisión de las construcciones mediante secuenciación génica (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania).
Expresión de enzimas
[0262] Para la expresión génica heteróloga, se extrajeron alícuotas de las soluciones madre y se extendieron sobre placas de agar LB que contenían el antibiótico correspondiente. Las placas se cultivaron durante la noche a 37°C. Se utilizaron cultivos únicos para inocular precultivos (que contenían 50 μg/ml de kanamicina) en matraces agitadores con deflectores. Los cultivos se hicieron crecer típicamente hasta una DO600 de aproximadamente 4,2. Los cultivos de expresión principal que contenían 50 μg/ml de kanamicina se inocularon normalmente con un precultivo al 1 % y se cultivaron a 37 °C hasta una DO600 de alrededor de 0,6 - 0,8. A continuación, se cambió la temperatura a 16-20°C y se indujo la expresión con típicamente IPTG 0,4 mM. Típicamente, después de 20 h, los cultivos se recogieron típicamente a 6000 x g durante 30 min a 4°C. Los medios utilizados fueron medios TB excepto GalU (medios LB) (ver tabla 2).
Tabla 2 Medios utilizados en este ejemplo
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Purificación de enzimas
[0263] Los plásmidos pET28a y pET100/D-TOPO albergan una etiqueta His6 N-terminal y, por lo tanto, la enzima se purifica con cromatografía de afinidad de iones metálicos utilizando el sistema ÁKTAstart y las columnas HisTrap High-Performance o Fast-Flow (volumen de columna de 1 ml) de GE Healthcare. Para la purificación de las enzimas se lisaron las células por sonicación en lisis (HEPES 50 mM (pH 7,5), Mg2+ 10 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM y glicerol al 5%).
[0264] Se utilizó imidazol (500 mM) como eluyente en eluciones isocráticas (HEPES 50 mM (pH 7,5), Mg2+ 10 mM, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM y glicerol al 5%). Se utilizaron las condiciones estándar recomendadas por los fabricantes. Después de la purificación, las concentraciones de enzimas se analizaron mediante ensayos BCA y se evaluaron mediante geles SDS.
Ejemplo 2: Preparación heterogénea de UDP-N-acetil-α-D-glucosamina
Mediciones
[0265] Se utilizó cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) con UV (260 nm) y detección amperométrica pulsada (PAD) para medir las concentraciones de reactivos. Para la separación y cuantificación de analitos, se desarrolló un método de elución en gradiente escalonado y se realizó una separación cromatográfica validada con un flujo de sistema de 0,5 ml/min utilizando una columna pelicular no porosa CarboPac PA1 (250 x 2 mm). El sistema HPAEC (ICS5000), así como todas las columnas, los componentes y el software se adquirieron de Thermo Scientific (Waltham, EE. UU.).
Experimento A
[0266] Se probó una amplia gama de soportes sólidos comercialmente disponibles (ver Tabla 3) para la co-inmovilización de las enzimas usadas en la síntesis inventiva de UDP-N-acetil-α-D-glucosamina (ver Figura 1) y se evaluó su efecto sobre la síntesis de UDP-N-acetil-α-D-glucosamina.
Tabla 3: Tabla de soportes sólidos ensayados en el Experimento A
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[0267] Para probar la cascada multienzimática en varios gránulos cargados con enzimas, se añadió una masa dada (ver Tabla 3) de cada resina a un tubo de baja unión de 2 ml. Después de aprox. 2 h de incubación con tampón de lisis (ver Tabla 4), se eliminó el sobrenadante [paso de equilibrio]. Posteriormente, se agregaron 0,5 mL de lisado celular a cada tubo y se incubaron durante la noche (aprox. 12 h) a 4 °C. Después de la incubación, las perlas se lavaron (3 veces) y se añadió tampón de bloqueo (glicina 2 M). Las perlas se incubaron durante 24 h a temperatura ambiente con el tampón de bloqueo. Posteriormente, se eliminó el tampón de bloqueo y las perlas se lavaron con tampón de lisis tres veces.
Tabla 4: Tampones utilizados para la inmovilización de biocatalizadores en el Experimento A
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[0268] Se transfirieron 200 μL de la solución de alimentación (ver Tabla 5) que contenía sustratos a cada tubo que contenía las perlas. Las reacciones se llevaron a cabo durante unas 17 ha 30°C y bajo agitación (600 rpm). A continuación, se midieron las concentraciones de UDP-N-acetil-α-D-glucosamina mediante HPAEC-UV/PAD. Los resultados se muestran en la Figura 4.
Tabla 5. Concentración de reactivos en la solución de alimentación del Experimento A
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[0269] Para evaluar la reutilización de las perlas, después del primer ciclo, se eliminó el sobrenadante y las perlas se lavaron una vez con tampón Lysis. Posteriormente, se agregaron 200 μL de solución de alimentación a las perlas. Las reacciones se llevaron a cabo durante alrededor de 10 h a 30°C y bajo agitación (600 rpm). Los resultados se representan en la Figura 5. Se muestra que las enzimas co-inmovilizadas en varias perlas disponibles comercialmente son útiles para la reutilización y proporcionan perlas mecánicamente robustas con enzimas coinmovilizadas.
[0270] Después del segundo ciclo, se seleccionaron ciertas perlas para evaluar su reutilización adicional. Los resultados se muestran en las Figuras 6 a 11.
Experimento B
Inmovilización de enzimas
[0271] Las enzimas inmovilizadas a menudo se pueden separar de las soluciones y reutilizar. Además, pueden exhibir una mayor actividad y pueden usarse para una amplia gama de procesos, como la síntesis continua en reactores de lecho empacado. Se probó una amplia gama de soportes sólidos comercialmente disponibles para la co-inmovilización de la cascada multienzimática UDP-GIcNAc.
Tabla 6 Tabla de soportes sólidos ensayados en el Experimento B (epoxi)
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Tabla 7 Tabla de soportes sólidos ensayados en el Experimento B (otros)
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(Continuación)
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(Continuación)
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[0272] Los soportes sólidos se dividen aquí en tres grupos dependiendo de su mecanismo de inmovilización: a) soportes epoxi (incluyendo amino-epoxi), b) soportes iónicos y de adsorción yc) soportes activados con glutaraldehído. Además, se probaron tres proporciones diferentes de soporte sólido a proteína para cada soporte sólido para encontrar las proporciones óptimas: serie 1, serie 2 y serie 3 (ver Tabla 8 - Tabla 11).
Tabla 8: Proporción de solución madre de proteína analizada a soporte sólido
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Tabla 9: Selección de soportes epoxi (incluyendo amino-epoxi) probados
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Tabla 10: Selección de soportes iónicos y de adsorción probados
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Tabla 11: Selección de soportes activados con glutaraldehído probados
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[0273] Se siguió el siguiente protocolo para el experimento: la biomasa que contenía las enzimas sobreexpresadas se mezcló [ver tabla 13, paso 1] y se centrifugó 6000 x g durante 30 min a 4 °C [paso 2]. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de inmovilización/lisis hasta un volumen de 150 mL (ver tabla 12) [paso 3]. Las células se lisaron por sonicación [paso 4]. Después de la sonicación, la suspensión se centrifugó a 12000 x g durante 45 min a 4 °C [paso 5] para eliminar los restos celulares, seguido de filtración a través de filtros de 1,2 mm y 0,8 mm. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y se mantuvo en hielo. La concentración de proteína total del sobrenadante (solución madre de proteína) fue de 14,5 (+/- 0,5) mg/mL. Se añadió una masa determinada de cada inmovilizador a un tubo de baja unión de 2 mL. Los soportes funcionalizados con amino se activaron con glutaraldehído mediante incubación en tampón de activación durante 1 hora para generar soportes activados con glutaraldehído (grupo c). Los soportes sólidos se lavaron dos veces con tampón de lavado A (para soportes epoxi y soportes de glutaraldehído) y tampón de lavado B. (para soportes iónicos y de adsorción) y equilibrado durante 1 hora con tampón de inmovilización/lisis. Posteriormente, se añadió lisado celular a cada tubo y se incubó durante la noche (~ 36 h) a 4 °C [paso 6]. Los soportes con las enzimas inmovilizadas se lavaron (3 veces) con tampón de lavado [paso 7]. Además, los soportes epoxi se incubaron con tampón de bloqueo (glicina 2 M) durante 24 h [paso 8]. Posteriormente, se descartó el tampón de bloqueo y se lavaron los soportes con el tampón de lavado A tres veces.
Tabla 12: Tampones utilizados para la inmovilización de biocatalizadores.
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Tabla 13: Composición de las mezclas de biomasa utilizadas en el paso 1.
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[0274] La cantidad de proteína unida al soporte sólido se determinó cuantificando la proteína en el sobrenadante después de la inmovilización. Se siguieron los protocolos estándar de cuantificación de proteínas BCA. Los resultados para varias resinas (véanse las Tablas 9-11) se muestran en las Figuras 12A-12C.
Reacciones
[0275] Para ensayar la cascada multienzimática -en varios soportes inmovilizados-, se transfirió solución de alimentación (ver tabla 14) que contenía sustratos a los tubos que contenían los biocatalizadores. Para mantener una relación de volumen de alimentación a masa de soporte sólido de 1, se añadieron los siguientes volúmenes de alimentación: 100 μl (serie 1), 250 μl (serie 2) y 500 μl (serie 3). Las reacciones se llevaron a cabo durante alrededor de 20-25 h a 30°C y agitando en un mezclador rotatorio (8 rpm). Para evaluar las reacciones, se eliminó el sobrenadante y luego se midieron las concentraciones de UDP-GIcNAc mediante HPAEC-UV/PAD. Para la cuantificación por HAPEC-UV/PAD se diluyó una alícuota de 3 μl con 100 μl de agua desionizada y luego se inyectó. Los cromatogramas de ejemplo se muestran en la Fig. 13A-C. Los soportes sólidos se lavaron con 1 mL de agua desionizada 2 veces antes de iniciar la siguiente reacción.
Tabla 14: Concentración de reactivos en la solución de alimentación.
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Resultados
Inmovilización de enzimas
[0276] Los resultados de la reacción se muestran en las Figuras 14 - 30. Debe tenerse en cuenta que encontrar el soporte sólido óptimo siempre se reduce a ensayo y error experimental, ya que existe un conocimiento insuficiente sobre la inmovilización de enzimas para predecir el soporte sólido óptimo [3].
[0277] El hallazgo sorprendente fue que la cascada multienzimática mostró actividad cuando se co-inmovilizó en una amplia gama de soportes epoxi. Los soportes epoxi que se probaron y mostraron actividad variaron en la matriz de soporte, tamaño de partícula, tamaño de poro y contenido de oxirano. Otros soportes sólidos en los que las enzimas se inmovilizan por adsorción hidrofóbica, interacción iónica o entrecruzamiento covalente con glutaraldehído mostraron muy poca o ninguna actividad, lo que implica que al menos una de las cinco enzimas clave es poco activa o inactiva. Además, la cascada multienzimática fue activa sobre soportes epoxi cuando se utilizó una amplia gama de diferentes proporciones de proteínas a soportes sólidos. Para la síntesis de UDP-GIcNAc, muchos de los soportes epoxi cargados con las enzimas podrían usarse en más de 20 ciclos de reacción sin volver a inmovilizar las enzimas en los soportes.
Tabla 15: Soportes epóxicos ensayados. (+) indicando que la cascada multienzimática estaba activa o (-) inactiva.
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Tabla 16: Soportes iónicos y de adsorción probados: (+) indica que la cascada multienzimática estaba activa o (-) inactiva.
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Tabla 17: Soportes activados con glutaraldehído probados. (+) indicando que la cascada multienzimática estaba activa o (-) inactiva. Los soportes activados con glutaraldehído son soportes con grupos reactivos con amina que fueron activados por glutaraldehído para generar una unión covalente entre la proteína y el soporte sólido.
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Ejemplo 3: Acoplam iento de la cascada
[0278] La cascada se puede acoplar a GIcNAc-transferasas (EC 2.7.1.X) para transferir GIcNAc a moléculas aceptoras. Las moléculas aceptoras pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales. Para el acoplamiento se puede añadir GIcNAc-transferasa soluble, se puede coinmovilizar una GIcNAc-transferasa en el mismo soporte y/o se puede inmovilizar la GIcNAc-transferasa en un soporte adicional y luego añadirse a la reacción.
Ejemplo 4: Síntesis de UDP-GlcNAc mediante una cascada multienzimática inmovilizada sobre soportes sólidos de Ni-NTA
[0279] Las enzimas de la vía de síntesis de UDP-GIcNAc se produjeron de forma recombinante en E. coli como se detalla anteriormente. La biomasa se mezcló como se detalla en la Tabla 18A y se homogeneizó durante 8 minutos a 800-1000 psi en 150 ml de tampón de lisis (ver Tabla 18B). El lisado celular se centrifugó (7000 x g, 45 min) y el sobrenadante que contenía las enzimas se filtró (filtro de 1,8 μm). Se determinó una concentración de proteína total de 10 mg/mL. Para preparar la inmovilización, se transfirieron 500 μL de la suspensión de perlas de Ni-NTA a tubos Eppendorf de 2 mL y se equilibraron con tampón de lisis que contenía además imidazol 10 mM. La inmovilización en Ni-NTA se llevó a cabo incubando 1,5 ml de lisado con las perlas preequilibradas en tampón de inmovilización (tampón de lisis más imidazol 10 mM). Después de la inmovilización, las perlas se lavaron tres veces con tampón de lavado (ver Tabla 18C).
Tabla 18: A. Mezcla de biomasa utilizada para la inmovilización. B. Tampón de lisis. C. Tampón de lavado
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[0280] Se llevó a cabo un ciclo de reacción para evaluar la actividad de las perlas. Cada una de las reacciones se llevó a cabo durante 20-25 horas a 30°C y con agitación a 600 rpm. Para iniciar una reacción, se añadieron 250 μL de la solución de alimentación a las perlas lavadas (Tabla 19). Entre los experimentos, se eliminó el sobrenadante y las perlas se lavaron 2 veces con 1 mL de agua desionizada.
Tabla 19: Solución de alimento para la síntesis de UDP-GlcNAc
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[0281] La cascada de UDP-GIcNAc inmovilizada en perlas de Ni-NTA muestra una actividad decreciente para nueve reacciones (ver Figura 33). Se detecta alguna actividad residual en las reacciones número 10 y 11, pero es insignificante en comparación con la actividad en las perlas de epoxi. En resumen, la cascada inmovilizada sobre una amplia gama de soportes sólidos con funciones epoxi muestra una actividad extendida en comparación con las perlas de Ni-NTA. En consecuencia, las perlas de epoxi se pueden reutilizar con mayor frecuencia y, por lo tanto, son más económicas.
Ejemplo 5: Síntesis de UDP-GIcNAc a partir de uridina y GlcNAc
[0282] La cascada para la síntesis de UDP-GIcNAc a partir de uridina se muestra en la Figura 2. La cascada contiene seis enzimas y siete reacciones. La uridina (Uri), N-acetilglucosamina (GlcNAc), polifosfato (PolyPn) se utilizan como sustratos principales, incluida la cantidad catalítica de trifosfato de adenina (ATP).
Producción recombinante de enzimas
[0283] La lista de los plásmidos usados en este estudio se muestra en la Tabla 20. LOBSTR E. coli células competentes (Kerafast, EE. UU.) se utilizaron como huésped de expresión. Las células se transformaron según el protocolo de choque térmico. La fermentación realizada en medio TB se suplementó con MgSO41,5 mM y el antibiótico correspondiente. Las células se cultivaron a 37 °C hasta que se observó una DO600 de 0,8-1,0. Posteriormente, se llevó a cabo la inducción con IPTG 0,4 mM, seguido de un cultivo de 20-24 h a 16 °C.
[0284] Al final del cultivo, las células se recogieron por centrifugación (7000 3g, 20 minutos) y los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (tampón MOPS 50 mM, NaCl 300 mM, MgCh 10 mM, imidazol 10 mM y 5% glicerol a pH 7,4) y se rompieron con un homogeneizador de alta presión (Maximator, Alemania) (pasadas 3 veces a 800-1000 psi). La purificación con etiqueta His se realizó en base a cromatografía de afinidad de metal inmovilizado con el instrumento ÁKTA start (GE Health care Life Sciences, Uppsala, Suecia) en combinación con columnas HisTrap HP de 1 ml o 5 ml (GE Health care Life Sciences, Suecia). El tampón de unión contiene: tampón MOPS 50 mM, NaCl 300 mM, MgCl2 10 mM, imidazol 10 mM y glicerol al 5% a pH 7,4. Y el tampón de elución consta de tampón MOPS 50 mM, NaCl 300 mM, MgCl210 mM, imidazol 250 mM y glicerol al 5% a pH 7,4.
[0285] Con el fin de eliminar el imidazol del tampón de elución y concentrar la solución enzimática, el intercambio de tampón se realizó con la unidad de filtro centrífugo Amicon® Ultra-15 - corte de MW de 3 KDa (Merck, Alemania). El tampón de intercambio contenía: tampón MOPS 50 mM, NaCl 300 mM, MgCh 10 mM, glicerol al 5% a pH 7,4. Posteriormente, la solución de retenido (enzima concentrada) se mezcló 1:1 con glicerol para tener la solución de enzima final en glicerol al 50 % y las enzimas se almacenaron a -20 °C.
Tabla 20. Enzimas utilizadas en este ejemplo, su origen y expresión de plásmidos
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Experimento A: Síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas purificadas
[0286] Las reacciones se realizaron a 200 μL, 37 °C y 550 rpm. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: UDK, 0,07 mg/mL; URA6/PPK3, 0,11 mg/ml; NAHK, 0,18 μg/ml; GLMU, 0,2 μg/ml; PmPpa, 0,05 μg/ml; uridina, 68 mM; GlcNAc, 68 mM; ATP, 2,1 mM; PoliPn, 21 mM; Tris-HCl (pH, 8,5), 150 mM; MgCh, 75 mM. La producción exitosa de UDPGIcNAc y la concentración de los intermedios de la cascada se muestran en la Figura 34. UDP-GIcNAc se produjo con un rendimiento cuantitativo que da como resultado una concentración final de ~ 40 g/L.
Experimento B: Síntesis a gran escala de UDP-GicNAc
[0287] Para la preparación del lisado celular para la síntesis de UDP-GIcNAc se mezclaron las siguientes biomasas: UDK, 6,65 g; URA6/PPK3, 9,26 g; NAHK, 11,23 g; GLMU, 6,9 g; PmPpa, 4,94 g en 200 ml de tampón HEPES 50 mM (pH 8,1), NaCl 400 mM y glicerol al 5%. La mezcla se pasó tres veces a través de un homogeneizador de alta presión. El extracto libre de células se centrifugó a 11.000 x g durante 45 min. Posteriormente, se llevaron a cabo experimentos preliminares a pequeña escala (200 μL) para encontrar una cantidad adecuada de lisado para la síntesis. Los hallazgos basados en la síntesis de 200 μL se usaron directamente para la síntesis a escala de 4 litros que se correlaciona con un factor de escala de 20,000x.
[0288] Para llevar a cabo un experimento a gran escala de 4 litros, se seleccionó un biorreactor esterilizable en autoclave de vidrio de pared simple de siete litros (Applikon, Países Bajos), equipado con dos impulsores de paletas inclinadas para llevar a cabo la producción a gran escala.
[0289] Las condiciones de síntesis fueron las siguientes: Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), uridina 62 mM, GIcNAc 62, ATP 1,6 mM, PolyPn 18 mM, MgCh 75 mM y una carga proteica total de 0,5 g/L en la forma de lisado celular. La reacción se llevó a cabo a 37 °C ambiente y 120 rpm. Para comprender el efecto del aumento de escala en el rendimiento de la cascada, se llevó a cabo un experimento paralelo de 200 μL. El curso temporal de los intermedios en cascada se muestra en la Figura 35.
Experimento C: Síntesis de UDP-GIcNAc con enzimas inmovilizadas
[0290] Para acercar el proceso a una futura aplicación industrial, se llevó a cabo la inmovilización usando lisado celular que contenía todas las enzimas necesarias (como se describió anteriormente). La solución de lisado celular fue la misma que se usó en la síntesis a escala de 4 L de UDP-GIcNAc. La lista de perlas utilizadas en este estudio como soporte para la co-inmovilización de la enzima se describe en la Tabla 21.
Tabla 21. Perlas de soporte só lido utilizadas en este experimento para la co-inmovilización de enzimas
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[0291] En promedio, 200 mg de perlas (Tabla 21) se transfirieron a un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml, seguido de adición de 0,6 ml de solución de lisado celular que contiene enzimas para la síntesis de UDP-GIcNAc. La proporción de perlas (masa) sobre la proteína total fue de aproximadamente 20. Después de 24 h de incubación a temperatura ambiente con mezcla rotacional a intervalos (~ cada 6 h), se eliminó la solución que contenía la enzima. Posteriormente, las perlas se lavaron tres veces con un tampón de lavado que contenía una alta concentración de sal (Tris-HCl 200 mM (pH 8,5) y NaCl 600 mM) para eliminar las proteínas unidas débilmente. Posteriormente, las perlas se incubaron durante 24 h en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 200 mM (pH 8,5) y NaCl 300 mM) para bloquear los sitios de unión desacoplados. El porcentaje de proteína unida se ilustra en la Figura 36.
[0292] La solución de alimentación para evaluar la actividad de las enzimas inmovilizadas contenía: Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), MgCl2 75 mM, uridina 25 mM, GlcNAc 25 mM, ATP 5 mM, PoliPn 10 mM. Se agregaron 250 μL de solución de alimentación a las perlas y se incubaron a 37 °C y 600 rpm durante 24 h. Para confirmar que las seis enzimas se unen en su forma activa al soporte sólido, se controló la reacción con cada perla de soporte sólido. El cromatograma de la reacción con cada perla se muestra en la Figura 37. Los resultados de la prueba de actividad de cada perla se resumen en la Figura 38. Por lo tanto, se seleccionaron las siguientes perlas como perlas de buen rendimiento: Relizyme EP 113/M, ECR 8204F, ECR 8204M, ECR 8215M, ECR 8209F y ECR 8209M.
[0293] Para evaluar uno de los factores más importantes en el uso de enzimas inmovilizadas, la estabilidad en varios ciclos, se evaluó la actividad de las perlas antes mencionadas en diferentes ciclos. En cada ciclo, se añadieron 250 μL de solución de alimentación (TrisHCl 200 mM (pH 8,5), MgCh 75 mM, uridina 25 mM, GlcNAc 25 mM, ATP 5 mM, PolyPn 10 mM) a cada vial que contenía perlas y se incubó a 600 rpm. y 37 °C durante 24 h. Posteriormente, se eliminaron los líquidos y las perlas se lavaron con agua dos veces para evitar cualquier remanente de ciclos anteriores. La actividad de cada microesfera en 10 ciclos se muestra en la Figura 39. Se ha demostrado que las microesferas analizadas Relizyme EP 113/M, ECR 8204F, ECR 8204M, ECR 8215M, ECR 8209F y ECR 8209M son activas durante 10 ciclos consecutivos sin perder actividad significativamente. En promedio, en cada ciclo, UDP-GIcNAc se acumula en el sobrenadante con una concentración de ~ 7 g/L.
Experimento D: Acoplamiento de la cascada de UDP-GIcNAc a la p-1,3-N-acetilglucosamina transferasa
[0294] En este experimento, la cascada de reacción para la síntesis de UDP-GIcNAc a partir de uridina y GlcNAc (como se muestra en la Figura 2) se acopló a una p-1,3-N-acetilglucosamina transferasa (p1,3GlcNAcT) para sintetizar lacto-N triosa (LNT II) en un solo recipiente.
[0295] Las condiciones experimentales fueron las siguientes: Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), lactosa 30 mM, uridina 5 mM, GIcNAc 40 mM, ATP 1,1 mM, PolyPn 12 mM, MgCh 50 mM y las siguientes enzimas: UDK (0,06 μg/μL), URA6/PPK3 (0,11 μg/μL), NAHK (0,14 μg/μL), GLMU (0,21 μg/μL), PmPpa (0,04 μg/μL), p1,3GlcNAcT (0,06 μg/μL) con volumen final de 250 ml. Después de 48 h de incubación a 30 °C, se produjo LNT II con una concentración final de 4,7 mM (2,5 g/L).
1. Mahour, R., et al., Establishment of a five-enzyme cell-free cascade for the synthesis of uridine diphosphate Nacetylglucosamine. Journal of Biotechnology, 2018. 283: p. 120-129.
2. Rexer, T.F.T., et al., One pot synthesis of GDP-mannose by a multi-enzyme cascade for enzymatic assembly of lipid-linked oligosaccharides. Biotechnology and Bioengineering, 2018. 115(1): p. 192-205.
3. Liese, A. y L. Hilterhaus, Evaluation of immobilized enzymes for industrial applications. Chemical Society reviews, 2013. 42(15): p. 6236-6249

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina que comprende los siguientes pasos:
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A) proporcionar una solución que comprende
(i) uridina monofosfato y N-acetil-D-glucosamina representada por lo siguiente fórmulas
Figure imgf000062_0002
(ii) polifosfato y trifosfato de adenosina; y proporcionar un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina quinasa, una polifosfato quinasa y una uridina monofosfato quinasa;
B) producir uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina a partir de monofosfato de uridina y N-acetilglucosamina en presencia del conjunto de enzimas, polifosfato y trifosfato de adenosina,
en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza de forma covalente o adsortiva sobre un soporte sólido reutilizable, mecánicamente estable.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el conjunto de enzimas se co-inmoviliza sobre el soporte sólido.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el conjunto de enzimas se inmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable, reutilizable.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, donde el soporte sólido está compuesto por perlas o resinas que comprenden un polímero con funciones epóxido, con funciones amino epóxido, con funciones etilendiamina, con funciones amino C2, con funciones amino C6, con funciones espaciadoras aniónicas/amino C6.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que el soporte sólido es un polímero funcionalizado con grupos epoxi.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que el conjunto de enzimas comprende además una pirofosfatasa.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que el conjunto de enzimas se co-inmoviliza directamente sobre un soporte sólido a partir de caldo de fermentación, lisado celular crudo, lisado celular purificado u homogeneizado celular.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en el que el conjunto de enzimas comprende además una polifosfato quinasa 2 de un dominio y/o en el que el conjunto de enzimas comprende además una polifosfato quinasa 2 de dos dominios.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que la concentración de trifosfato de adenosina en la solución proporcionada en el paso A) está en el intervalo de 0,001 moles a 0,9 moles por mol de N-acetil-D-glucosamina y/o la concentración de monofosfato de uridina y N-acetil-D-glucosamina en la solución proporcionada en el paso A) está en el intervalo de 0,2 mM a 15.000 mM.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, en el que la uridina 5'-difosfo-N-acetil-α-D-glucosamina se produce en una sola mezcla de reacción.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en el que el monofosfato de uridina en el paso A) se obtiene a partir de (i) uridina, trifosfato de adenosina y una uridina quinasa; o (ii) uracilo, 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato y una uracilo fosforribosiltransferasa; o (iii) a partir de ácido orótico, 5-fosfo-α-D-ribosa 1-difosfato, una orotato fosforribosiltransferasa y una UMP transferasa.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 que comprende además el paso de
D) producir un sacárido GlcNAcilado, un glicopéptido GlcNAcilado, una glicoproteína GlcNAcilada, una proteína GlcNAcilada, un péptido GlcNAcilado, un bioconjugado GlcNAcilado o una molécula pequeña GlcNAcilada a partir de uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina y un sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña mediante la formación de un enlace O-glucosídico entre la uridina 5'-difosfo-N-acetilglucosamina y un grupo hidroxilo disponible del sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña en presencia de una N-acetilglucosaminiltransferasa.
13. El método según la reivindicación 12, en el que el sacárido, glicopéptido, glicoproteína, proteína, péptido, bioconjugado o molécula pequeña es un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal; o un oligosacárido de leche humana o un bioconjugado, preferiblemente una vacuna de conjugado de carbohidrato o un conjugado de fármaco de anticuerpo.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, que comprende además el paso de
E) reciclar el difosfato de uridina formado en el paso D) para obtener el trifosfato de uridina.
15. Un conjunto de enzimas que comprende una glucosa-1-fosfato uridililtransferasa, una N-acetilhexosamina cinasa, una polifosfato cinasa y una uridina monofosfato cinasa, en el que el conjunto de enzimas se coinmoviliza covalentemente sobre un soporte sólido mecánicamente estable y reutilizable.
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