JP7455339B2 - 白血球捕捉デバイス - Google Patents
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Description
本発明は白血球捕捉デバイスに関する。
ＤＮＡは放射線被曝や生活環境の影響により損傷を受ける。損傷を受けたＤＮＡは癌などの疾患と密接な関係があるとされている。従来、このＤＮＡの損傷を解析するためには５ｍｌの血液を遠心分離して白血球を取り出し、染色後、スライドガラスで観察するという方法がとられている。
また、白血球等の微粒子を捕捉するためのマイクロ流路が、従来、提案されている（特許文献１参照）。特許文献１には、凹型の捕捉部を備えたマイクロ流路を用いて、固液混合物から一定以上の大きさの固体のみを捕捉、分離するフィルタ機能を有するマイクロ流路デバイスが開示されている。特許文献１においては、１つの捕捉部が１ 個または複数
の一定の大きさ以上の固体を収容し、複数の捕捉部が配置された分離部の終端までに完全に一定の大きさ以上の固体が捕捉されつくすことを目的としており、捕捉された白血球等の固体を観察しやすいように１つの捕捉部に固体を１個だけ捕捉することは考慮されていない。また、一旦捕捉部に捕捉された固体が再浮遊して捕捉部から流出しないように常に固液混合物がマイクロ流路の入口から出口に向かって流れている必要がある。
の一定の大きさ以上の固体を収容し、複数の捕捉部が配置された分離部の終端までに完全に一定の大きさ以上の固体が捕捉されつくすことを目的としており、捕捉された白血球等の固体を観察しやすいように１つの捕捉部に固体を１個だけ捕捉することは考慮されていない。また、一旦捕捉部に捕捉された固体が再浮遊して捕捉部から流出しないように常に固液混合物がマイクロ流路の入口から出口に向かって流れている必要がある。
しかしながら、従来法では５ｍｌと多い血液を必要とするため侵襲的である。また、従来法では遠心分離機等の大型装置を必要とする。そのため、その場で解析するようなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）では使うことが困難である。
また、血液含有液等の固液混合物から白血球等の特定の大きさの固体成分を捕捉部により分離、載置し、その場で解析することを目的とする場合、特許文献１に記載のマイクロ流路が有する凹型の捕捉部では、白血球等の個体成分の捕捉効率が低い。
本発明は上記のような課題を解決することを目的とする。すなわち、本発明は、遠心分離機のような大型装置を必要とせず、必要とする血液も１μｌ程度に少量とすることができ、従来技術より高い捕捉効率を有する白血球捕捉デバイスを提供することを目的とする。
本発明は以下の（１）～（４）である。
（１）血液含有液を通過させて、前記血液含有液に含まれる白血球を捕捉するチップを備える白血球捕捉デバイスであって、
前記チップは、平面部とその上に設けられた多数の凸部とを有し、入口から入った前記血液含有液が、前記チップにおける前記平面部の表面上、かつ、前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間を通過し、出口から排出されるように構成されており、
前記凸部は、前記平面部上において層状に設けられ、各層は複数の前記凸部を含んでおり、入口側の層を通過した前記血液含有液がそれに隣り合う出口側の層を通過するように構成されており、
各層において前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間の幅が２～７．５μｍに設定されている捕捉部と、８～２０μｍに設定されているバイパス部とが形成されており、
前記捕捉部を構成する２つの前記凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていて、
特定の層における全部または一部の前記バイパス部の出口側に対向して、それに隣り合う別の層の一部として前記捕捉部が配置されている、白血球捕捉デバイス。
（２）特定の層と、それに隣り合う別の層との幅が８～３０μｍである、上記（１）に記載の白血球捕捉デバイス。
（３）捕捉部の幅に対する前記バイパス部の幅の比が１より大きく３以下である、上記（１）または（２）に記載の白血球捕捉デバイス。
（４）前記凸部の入口側の端面における前記捕捉部以外の部分は層方向に平行に延びており、かつ、前記凸部における前記バイパス部を構成する端面は層方向に対して垂直方向に延びている、上記（１）～（３）のいずれかに記載の白血球捕捉デバイス。
（１）血液含有液を通過させて、前記血液含有液に含まれる白血球を捕捉するチップを備える白血球捕捉デバイスであって、
前記チップは、平面部とその上に設けられた多数の凸部とを有し、入口から入った前記血液含有液が、前記チップにおける前記平面部の表面上、かつ、前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間を通過し、出口から排出されるように構成されており、
前記凸部は、前記平面部上において層状に設けられ、各層は複数の前記凸部を含んでおり、入口側の層を通過した前記血液含有液がそれに隣り合う出口側の層を通過するように構成されており、
各層において前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間の幅が２～７．５μｍに設定されている捕捉部と、８～２０μｍに設定されているバイパス部とが形成されており、
前記捕捉部を構成する２つの前記凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていて、
特定の層における全部または一部の前記バイパス部の出口側に対向して、それに隣り合う別の層の一部として前記捕捉部が配置されている、白血球捕捉デバイス。
（２）特定の層と、それに隣り合う別の層との幅が８～３０μｍである、上記（１）に記載の白血球捕捉デバイス。
（３）捕捉部の幅に対する前記バイパス部の幅の比が１より大きく３以下である、上記（１）または（２）に記載の白血球捕捉デバイス。
（４）前記凸部の入口側の端面における前記捕捉部以外の部分は層方向に平行に延びており、かつ、前記凸部における前記バイパス部を構成する端面は層方向に対して垂直方向に延びている、上記（１）～（３）のいずれかに記載の白血球捕捉デバイス。
本発明によれば、遠心分離機のような大型装置を必要とせず、必要とする血液も１μｌ程度に少量とすることができ、従来技術より高い捕捉効率を有する白血球捕捉デバイスを提供することができる。
本発明の白血球捕捉デバイスについて説明する。
本発明の白血球捕捉デバイスは、血液含有液を通過させて、前記血液含有液に含まれる白血球を捕捉するチップを備える白血球捕捉デバイスであって、前記チップは、平面部とその上に設けられた多数の凸部とを有し、入口から入った前記血液含有液が、前記チップにおける前記平面部の表面上、かつ、前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間を通過し、出口から排出されるように構成されており、前記凸部は、前記平面部上において層状に設けられ、各層は複数の前記凸部を含んでおり、入口側の層を通過した前記血液含有液がそれに隣り合う出口側の層を通過するように構成されており、各層において前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間の幅が２～７．５μｍに設定されている捕捉部と、８～２０μｍに設定されているバイパス部とが形成されており、前記捕捉部を構成する２つの前記凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていて、特定の層における全部または一部の前記バイパス部の出口側に対向して、それに隣り合う別の層の一部として前記捕捉部が配置されている、白血球捕捉デバイスである。
本発明の白血球捕捉デバイスは、血液含有液を通過させて、前記血液含有液に含まれる白血球を捕捉するチップを備える白血球捕捉デバイスであって、前記チップは、平面部とその上に設けられた多数の凸部とを有し、入口から入った前記血液含有液が、前記チップにおける前記平面部の表面上、かつ、前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間を通過し、出口から排出されるように構成されており、前記凸部は、前記平面部上において層状に設けられ、各層は複数の前記凸部を含んでおり、入口側の層を通過した前記血液含有液がそれに隣り合う出口側の層を通過するように構成されており、各層において前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間の幅が２～７．５μｍに設定されている捕捉部と、８～２０μｍに設定されているバイパス部とが形成されており、前記捕捉部を構成する２つの前記凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていて、特定の層における全部または一部の前記バイパス部の出口側に対向して、それに隣り合う別の層の一部として前記捕捉部が配置されている、白血球捕捉デバイスである。
本発明の白血球捕捉デバイスについて、図を用いて説明する。
図１は、本発明の白血球捕捉デバイス１を示す概略図であり、図２は図１における部分Ａの拡大図であり、図３は図１におけるＢ－Ｂ線断面図である。
図１は、本発明の白血球捕捉デバイス１を示す概略図であり、図２は図１における部分Ａの拡大図であり、図３は図１におけるＢ－Ｂ線断面図である。
図１に例示する本発明の白血球捕捉デバイス１は、チップ１０と、チップ１０へ血液含有液を供給するための入口３と、チップ１０を通過した血液含有液が排出される出口５を備える。本発明の白血球捕捉デバイスの構成は図１に例示したものに限定されず、例えば図１に示す本発明の白血球捕捉デバイス１の全体が筐体に覆われていてもよい。
図１～３に示すように、本発明の白血球捕捉デバイス１におけるチップ１０は、平面部１２と、その上に設けられた多数の凸部１４とを含む。
このような本発明の白血球捕捉デバイス１では、ポンプや静水圧、電気浸透流等によって、入口３から入った血液含有液が出口５へ向かって流れるが、その過程においてチップ１０における平面部１２の表面上、かつ、凸部１４とそれに隣り合う別の凸部１４との間を流れ、特定の凸部１４間において白血球が挟まって捕捉される。
ここで血液含有液は、人間の血液を含む液体であれば特に限定されず、例えば人間の血液をリン酸緩衝液、抗凝固剤、染色液等に加えた混合液であってもよい。また、血液含有液は人間の血液そのものあってもよい。
また、凸部１４は、図１に示すように、平面部１２上において層状に設けられている。
図１では、最も入口３に近い層を第１層とし、第１層に隣り合う出口側（下流側）の層を第２層と示している。また、ある層を第Ｐ層とし、第Ｐ層に隣り合う出口側（下流側）の層を第Ｐ＋１層とし、さらに隣り合う出口側（下流側）の層を第Ｐ＋２層と示している。
また、各層は複数の凸部１４を含む。図１では各層が７個の凸部１４を含む例が示されているが、各層に含まれる凸部１４の個数は特に限定されない。さらに、層の数も特に限定されない。
図１では、最も入口３に近い層を第１層とし、第１層に隣り合う出口側（下流側）の層を第２層と示している。また、ある層を第Ｐ層とし、第Ｐ層に隣り合う出口側（下流側）の層を第Ｐ＋１層とし、さらに隣り合う出口側（下流側）の層を第Ｐ＋２層と示している。
また、各層は複数の凸部１４を含む。図１では各層が７個の凸部１４を含む例が示されているが、各層に含まれる凸部１４の個数は特に限定されない。さらに、層の数も特に限定されない。
入口３から本発明の白血球捕捉デバイス１へ入った血液含有液は平面部１２の表面上を流れ、初めに第１層における凸部１４間の流路を通過し、次に第２層における凸部１４間の流路を通過する。その後も同様にして、第Ｐ層における凸部１４間の流路を通過し、次に第Ｐ＋１層における凸部１４間の流路を通過するように構成されている。
また、図２に示すように、各層において凸部１４とそれに隣り合う凸部１４との間の幅（流路の幅）Ｌ1が２～７．５μｍに設定されている捕捉部２１と、当該幅Ｌ2が８～２０μｍに設定されているバイパス部２３とが形成されている。
図２の例では、第Ｐ層、第Ｐ＋１層、第Ｐ＋２層の各層において、複数の凸部１４の間には流路として捕捉部２１とバイパス部２３が交互に形成されている。ただし、本発明の白血球捕捉デバイスにおいて、各層に形成されている捕捉部とバイパス部とは、図２のように交互に形成されていなくてもよい。例えば層内において複数の捕捉部が連続して存在していてもよい。
さらに、特定の層におけるバイパス部２３の出口側に、それに隣り合う別の層の一部として捕捉部２１が配置されている。すなわち、図２の例では、第Ｐ層におけるバイパス部２３の出口側（下流側）に、第Ｐ＋１層における捕捉部２１が配置されている。
図２に例示するように、第Ｐ層におけるバイパス部２３と、第Ｐ＋１層における捕捉部２１とが層方向に対する垂直方向に並んで配置されていることが好ましい。より具体的には、層方向に対する垂直方向の直線を引いたときに、当該直線が第Ｐ層におけるバイパス部２３と、第Ｐ＋１層における捕捉部２１とを通過する（すなわち、当該直線が凸部１４に接しない）ように、第Ｐ層におけるバイパス部２３と、第Ｐ＋１層における捕捉部２１とが配置されていることが好ましい。
図２に例示するように、第Ｐ層におけるバイパス部２３と、第Ｐ＋１層における捕捉部２１とが層方向に対する垂直方向に並んで配置されていることが好ましい。より具体的には、層方向に対する垂直方向の直線を引いたときに、当該直線が第Ｐ層におけるバイパス部２３と、第Ｐ＋１層における捕捉部２１とを通過する（すなわち、当該直線が凸部１４に接しない）ように、第Ｐ層におけるバイパス部２３と、第Ｐ＋１層における捕捉部２１とが配置されていることが好ましい。
図１、図２に示す例では、入口側（上流側）から流れてきて第Ｐ層に到達した血液含有液に含まれる白血球は、原則、捕捉部２１を通過できないので、白血球の少なくとも一部は第Ｐ層の捕捉部２１で捕捉される。白血球が捕捉されると当該捕捉部２１は閉塞する。一方、白血球以外の成分（赤血球、血小板等）は第Ｐ層の捕捉部２１を通過して第Ｐ＋１層に到達する。また、第Ｐ層に到達した血液含有液に含まれる全ての成分はバイパス部２３を通過できる。よって、第Ｐ層の捕捉部２１で捕捉されなかった白血球は第Ｐ層のバイパス部２３を通過して第Ｐ＋１層に到達し、その少なくとも一部は第Ｐ＋１層における捕捉部２１で捕捉される。ここで、第Ｐ層におけるバイパス部２３の出口側（下流側）に、第Ｐ＋１層における捕捉部２１が配置されているので、第Ｐ層のバイパス部２３を通過した白血球は、第Ｐ＋１層の捕捉部２１で捕捉されやすい。
図１、図２に示すような平面図において、凸部１４は矩形または略矩形（矩形をベースにして、その四隅の角の一部が直線によって切り落とされて面取りされている形状や、矩形の四隅における少なくとも一部の角が削られて丸みを帯びた形状）であることが好ましい。ここで直線によって切り落とされた面取り部分および丸みを帯びるように削られた面取り部分の面積は、捕捉する白血球の面積（投影面積）より小さいことが好ましい。
また、図２に例示するように、捕捉部２１を構成する２つの凸部１４における入側部分が、捕捉部２１の奥へ向かって連続的に徐々に狭くなるように面取りされている。この場合、捕捉部によって白血球が捕捉されやすくなるからである。また、一旦捕捉部に捕捉された白血球は変形して面取り部分に嵌まり込んでいるため、捕捉部から流出しにくいからである。
面取りされてなる直線がなす角度は、層方向に対して垂直な方向（入口から出口に向かう方向）に対して３０～６０度であることが好ましい。ここで面取りが直線的ではなく、例えば匙面取りや丸面取りである場合、その接線がなす角度の平均値が３０～６０度であることが好ましい。この角度が３０度よりも小さいとバイパス部２３への白血球が流れる速度が早くなり、捕捉効率が低くなる傾向がある。また、この角度が６０度よりも大きいと、１つの捕捉部２１で複数の白血球が捕捉されてしまう確率が高くなる傾向がある。
面取りは、捕捉部２１の奥に向かって徐々に狭くなっていれば、捕捉部を構成する２つの凸部の両方の入側部分が面取りされていても、片方の入側部分だけが面取りされていても構わないし、両方の入側部分が面取りされている場合、面取りの角度が同じであっても異なっていても構わない。
また、図２に例示するように、捕捉部２１を構成する２つの凸部１４における入側部分が、捕捉部２１の奥へ向かって連続的に徐々に狭くなるように面取りされている。この場合、捕捉部によって白血球が捕捉されやすくなるからである。また、一旦捕捉部に捕捉された白血球は変形して面取り部分に嵌まり込んでいるため、捕捉部から流出しにくいからである。
面取りされてなる直線がなす角度は、層方向に対して垂直な方向（入口から出口に向かう方向）に対して３０～６０度であることが好ましい。ここで面取りが直線的ではなく、例えば匙面取りや丸面取りである場合、その接線がなす角度の平均値が３０～６０度であることが好ましい。この角度が３０度よりも小さいとバイパス部２３への白血球が流れる速度が早くなり、捕捉効率が低くなる傾向がある。また、この角度が６０度よりも大きいと、１つの捕捉部２１で複数の白血球が捕捉されてしまう確率が高くなる傾向がある。
面取りは、捕捉部２１の奥に向かって徐々に狭くなっていれば、捕捉部を構成する２つの凸部の両方の入側部分が面取りされていても、片方の入側部分だけが面取りされていても構わないし、両方の入側部分が面取りされている場合、面取りの角度が同じであっても異なっていても構わない。
凸部１４が矩形または略矩形である場合、すでに微粒子が捕捉されている捕捉部２１に到達した別の白血球が、凸部１４の端面に沿って層方向へ移動し、バイパス部２３から下流側の隣の層へ移動して、下流側の層における捕捉部２１で捕捉されやすい。この結果、白血球の捕捉効率が高まることを、本発明者は見出した。
特に、図２に示す場合のように、捕捉部２１を構成する２つの凸部１４における入側部分が、捕捉部２１の奥へ向かって連続的に徐々に狭くなるように（好ましくは直線的に）面取りされていて、かつ、凸部１４の入口側の端面における捕捉部２１以外は層方向に平行に延びており、かつ、バイパス部２３は層方向に垂直方向に延びていると、この効果が顕著となり、白血球の捕捉効率がより高まるので好ましい。
凸部１４が矩形または略矩形ではない場合（例えば円形や楕円形等の場合）、その外形にＲが含まれるので、そのＲに沿って白血球が移動してしまい、下流側の隣の層における捕捉部２１へ移動しない可能性がある。
特に、図２に示す場合のように、捕捉部２１を構成する２つの凸部１４における入側部分が、捕捉部２１の奥へ向かって連続的に徐々に狭くなるように（好ましくは直線的に）面取りされていて、かつ、凸部１４の入口側の端面における捕捉部２１以外は層方向に平行に延びており、かつ、バイパス部２３は層方向に垂直方向に延びていると、この効果が顕著となり、白血球の捕捉効率がより高まるので好ましい。
凸部１４が矩形または略矩形ではない場合（例えば円形や楕円形等の場合）、その外形にＲが含まれるので、そのＲに沿って白血球が移動してしまい、下流側の隣の層における捕捉部２１へ移動しない可能性がある。
捕捉部２１の幅Ｌ1は２～７．５μｍであるが、３～６μｍであることが好ましく、４
～５μｍであることがより好ましい。
また、バイパス部２３の幅Ｌ2は８～２０μｍであるが、８．５～１５μｍであること
が好ましく、９～１０μｍであることがより好ましい。
なお、幅Ｌ1および幅Ｌ2は、各層において凸部１４とそれに隣り合う凸部１４との間の最短距離を意味するものとする。
～５μｍであることがより好ましい。
また、バイパス部２３の幅Ｌ2は８～２０μｍであるが、８．５～１５μｍであること
が好ましく、９～１０μｍであることがより好ましい。
なお、幅Ｌ1および幅Ｌ2は、各層において凸部１４とそれに隣り合う凸部１４との間の最短距離を意味するものとする。
また、捕捉部２１の幅Ｌ1に対するバイパス部２３の幅Ｌ2の比（Ｌ2／Ｌ1）が１より大きく３以下であることが好ましく、１．５～２．５であることがより好ましい。この場合、バイパス部２３への流れが適度に抑制され、捕捉部で白血球が捕捉されやすくなるからである。
また、第Ｐ層と第Ｐ＋１層との幅Ｌ3は８～３０μｍであることが好ましく、９～１０
μｍであることがより好ましい。
なお、幅Ｌ3は、第Ｐ層と第Ｐ＋１層との最短距離を意味するものとする。
また、捕捉部２１の入側の面取り部分の最大幅Ｌ4は、１０～３５μｍであることが好
ましく、１５～２５μｍであることがより好ましい。
μｍであることがより好ましい。
なお、幅Ｌ3は、第Ｐ層と第Ｐ＋１層との最短距離を意味するものとする。
また、捕捉部２１の入側の面取り部分の最大幅Ｌ4は、１０～３５μｍであることが好
ましく、１５～２５μｍであることがより好ましい。
図３に示される凸部１４の高さｈは８～３０μｍであることが好ましく、９～１５μｍであることがより好ましい。
チップの大きさや材質は特に限定されない。例えばシリコーンゴム、アクリル樹脂、ポリカーボネート、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート等の樹脂から形成されていてよく、樹脂がガラス等の基板に貼り付けられた態様のものであることが好ましい。
＜白血球捕捉デバイスの作成＞
以下に示す手順で、バイパス部および捕捉部の幅が表１に示す値となる６種類のチップを備える白血球捕捉デバイスを作製した。なお、全ての白血球捕捉デバイスにおける特定の層と、それに隣り合う別の層との幅（図２でいう幅Ｌ3）は、全て１０μｍとなるよう
にした。
以下に示す手順で、バイパス部および捕捉部の幅が表１に示す値となる６種類のチップを備える白血球捕捉デバイスを作製した。なお、全ての白血球捕捉デバイスにおける特定の層と、それに隣り合う別の層との幅（図２でいう幅Ｌ3）は、全て１０μｍとなるよう
にした。
初めに、スピナーを用いて板状のシリコーンウエハーの表面に感光性樹脂（SU-8 3050、日本化薬社製）を均一に塗布した。
次に、特定のマスクを通して感光性樹脂に紫外線を照射した。
次に、紫外線を当てたシリコーンウエハー上の感光性樹脂を９５℃でベイクした。
次に、developer（SU-8 Developer、日本化薬社製）を用いて、紫外線未照射部を除去し、モールドを作製した。
次に、モールドにシリコーンゴム（SILPOT184、ダウコーニング社製）を流し込んだ。
次に、１００℃で０．５時間の条件でシリコーンゴムを加硫した。
次に、シリコーンウエハーからシリコーンゴムを剥がして流路形成チップを形成した。
次に、入口および出口となる箇所にパンチ穴を開け、流体導入部を作製して、白血球捕捉デバイスを作製した。
次に、特定のマスクを通して感光性樹脂に紫外線を照射した。
次に、紫外線を当てたシリコーンウエハー上の感光性樹脂を９５℃でベイクした。
次に、developer（SU-8 Developer、日本化薬社製）を用いて、紫外線未照射部を除去し、モールドを作製した。
次に、モールドにシリコーンゴム（SILPOT184、ダウコーニング社製）を流し込んだ。
次に、１００℃で０．５時間の条件でシリコーンゴムを加硫した。
次に、シリコーンウエハーからシリコーンゴムを剥がして流路形成チップを形成した。
次に、入口および出口となる箇所にパンチ穴を開け、流体導入部を作製して、白血球捕捉デバイスを作製した。
＜接合＞
光源（L 12530-01、浜松ホトニクス株式会社製）を用いて、流路形成チップが形成されたガラス基板との双方に真空紫外光を１５秒照射した。そして、双方の照射面を張り合わせることでチップを作製した。
作製したチップを蛍光顕微鏡で観察して得た拡大写真を図４に示す。
光源（L 12530-01、浜松ホトニクス株式会社製）を用いて、流路形成チップが形成されたガラス基板との双方に真空紫外光を１５秒照射した。そして、双方の照射面を張り合わせることでチップを作製した。
作製したチップを蛍光顕微鏡で観察して得た拡大写真を図４に示す。
＜実験＞
成人男性から得た末梢血をＰＢＳ（リン酸緩衝液、和光純薬工業社製）で２倍に希釈した。
次に、希釈した血液を１μｌ～２μｌ、チップの入口に滴下し、静水圧により送液した。
次に、１時間ほど静置後に不要な血液を除去、ＰＢＳを滴下し送液した。これにより捕捉された白血球以外の物質を取り除いた。
次に、ＰＢＳを取り除き、ＤＮＡ結合染色液（ＤＡＰＩ）を滴下し、３０分静置した。
成人男性から得た末梢血をＰＢＳ（リン酸緩衝液、和光純薬工業社製）で２倍に希釈した。
次に、希釈した血液を１μｌ～２μｌ、チップの入口に滴下し、静水圧により送液した。
次に、１時間ほど静置後に不要な血液を除去、ＰＢＳを滴下し送液した。これにより捕捉された白血球以外の物質を取り除いた。
次に、ＰＢＳを取り除き、ＤＮＡ結合染色液（ＤＡＰＩ）を滴下し、３０分静置した。
そして、６種類の白血球捕捉デバイスの各々について、蛍光顕微鏡でチップを観察して、白血球が捕捉されているか否かを確認した。結果を表１に示す。表１では、少なくとも１か所以上の補足部で白血球の１細胞補足が確認できるものを「〇」、いずれの補足部でも１細胞補足が確認できないものを「×」と示した。
また、実施例１および実施例２のチップについて、蛍光顕微鏡で観察して得た暗転蛍光の拡大写真を図５および図６に示す。図５の拡大倍率は、図４の場合と同一である。図６はデバイス全体の像である。図５および図６における白点が白血球を表している。図５および図６から実施例１および実施例２において、白血球の１細胞捕捉が達成されたことが確認できた。実施例３および実施例４についても実施例１および実施例２と同様に蛍光顕微鏡で観察したところ、白血球の１細胞捕捉が達成されたことが確認できた。
一方で捕捉部およびバイパス部の幅が広すぎる比較例１、２の場合、白血球は十分に捕捉できなかった。
また、実施例１および実施例２のチップについて、蛍光顕微鏡で観察して得た暗転蛍光の拡大写真を図５および図６に示す。図５の拡大倍率は、図４の場合と同一である。図６はデバイス全体の像である。図５および図６における白点が白血球を表している。図５および図６から実施例１および実施例２において、白血球の１細胞捕捉が達成されたことが確認できた。実施例３および実施例４についても実施例１および実施例２と同様に蛍光顕微鏡で観察したところ、白血球の１細胞捕捉が達成されたことが確認できた。
一方で捕捉部およびバイパス部の幅が広すぎる比較例１、２の場合、白血球は十分に捕捉できなかった。
＜比較評価＞
本発明による白血球捕捉デバイスにおける白血球の捕捉効率を従来技術と比較することを目的として、本発明による白血球捕捉デバイスと、特許文献１に記載されるような従来技術の凹型の捕捉部を有するマイクロ流路デバイスとを作成し、比較評価実験を実施した。マイクロ流路デバイスの捕捉部およびバイパス部の概略図を図７に示す。
捕捉効率を評価するための指標としては、［式１］および［式２］で示される二つの指標を採用した。
単一捕捉捕捉部率（％）＝［単一捕捉捕捉部数］／［観察範囲内の捕捉部の数］×１００ ・・・［式１］
単一捕捉白血球率（％）＝［単一捕捉白血球数］／［観察範囲内に存在する白血球の数］×１００ ・・・［式２］
観察範囲内の捕捉部の数は、比較評価の対象となる白血球捕捉デバイスやマイクロ流路デバイスに設定した観察範囲内に存在する捕捉部の数を示す。単一捕捉捕捉部数は、観察範囲内で白血球が１つだけ捕捉された捕捉部の数を示す。単一捕捉白血球数は、観察範囲内で１つの捕捉部に１つだけ捕捉された白血球の数を示し、単一捕捉捕捉部数と等しい。観察範囲内に存在する白血球の数は、観察範囲内に存在する全ての白血球の数を示し、捕捉部に１つだけ捕捉された白血球だけでなく、１つの捕捉部に複数個捕捉された白血球や、捕捉部外の流路に存在する白血球を含む。
また、白血球が捕捉部に捕捉されたかどうかは、図８（ａ）に示す本発明による白血球捕捉デバイスの捕捉部と、図８（ｂ）に示す従来技術のマイクロ流路デバイスの捕捉部において、それぞれ図内の赤線で示す、一つの捕捉部を構成する一組の凸部を囲む最小の矩形内に白血球が一部でも入っていれば捕捉されていると判定する。
これらの指標を捕捉効率の評価指標として採用した理由は以下のとおりである。
本発明による白血球捕捉デバイスの活用場面として想定されるＤＮＡ損傷評価などの蛍光画像解析においては、画像解析を画像処理プログラム等により自動解析することを考慮すると、一つの捕捉部に白血球が一つだけ捕捉された白血球の数が、解析に使用する蛍光顕微鏡等の一視野内に少なくとも解析に必要な個数以上で、できるだけ多く存在することが望ましい。また、画像処理プログラムの作製のし易さを考慮すると、分離、整列が完了した時点で、捕捉部外の流路に白血球が残らないことが望ましい。
すなわち、上記に示した望ましい二つの性質を評価するために、観察範囲内の捕捉部のうちで細胞が１つだけ捕捉された捕捉部の割合である単一捕捉捕捉部率、および観察範囲内に捕捉された細胞のうちで捕捉部に１つだけ捕捉された細胞の割合である単一捕捉白血球率、という二種類の指標を捕捉効率の評価指標とすることとした。
本発明による白血球捕捉デバイスにおける白血球の捕捉効率を従来技術と比較することを目的として、本発明による白血球捕捉デバイスと、特許文献１に記載されるような従来技術の凹型の捕捉部を有するマイクロ流路デバイスとを作成し、比較評価実験を実施した。マイクロ流路デバイスの捕捉部およびバイパス部の概略図を図７に示す。
捕捉効率を評価するための指標としては、［式１］および［式２］で示される二つの指標を採用した。
単一捕捉捕捉部率（％）＝［単一捕捉捕捉部数］／［観察範囲内の捕捉部の数］×１００ ・・・［式１］
単一捕捉白血球率（％）＝［単一捕捉白血球数］／［観察範囲内に存在する白血球の数］×１００ ・・・［式２］
観察範囲内の捕捉部の数は、比較評価の対象となる白血球捕捉デバイスやマイクロ流路デバイスに設定した観察範囲内に存在する捕捉部の数を示す。単一捕捉捕捉部数は、観察範囲内で白血球が１つだけ捕捉された捕捉部の数を示す。単一捕捉白血球数は、観察範囲内で１つの捕捉部に１つだけ捕捉された白血球の数を示し、単一捕捉捕捉部数と等しい。観察範囲内に存在する白血球の数は、観察範囲内に存在する全ての白血球の数を示し、捕捉部に１つだけ捕捉された白血球だけでなく、１つの捕捉部に複数個捕捉された白血球や、捕捉部外の流路に存在する白血球を含む。
また、白血球が捕捉部に捕捉されたかどうかは、図８（ａ）に示す本発明による白血球捕捉デバイスの捕捉部と、図８（ｂ）に示す従来技術のマイクロ流路デバイスの捕捉部において、それぞれ図内の赤線で示す、一つの捕捉部を構成する一組の凸部を囲む最小の矩形内に白血球が一部でも入っていれば捕捉されていると判定する。
これらの指標を捕捉効率の評価指標として採用した理由は以下のとおりである。
本発明による白血球捕捉デバイスの活用場面として想定されるＤＮＡ損傷評価などの蛍光画像解析においては、画像解析を画像処理プログラム等により自動解析することを考慮すると、一つの捕捉部に白血球が一つだけ捕捉された白血球の数が、解析に使用する蛍光顕微鏡等の一視野内に少なくとも解析に必要な個数以上で、できるだけ多く存在することが望ましい。また、画像処理プログラムの作製のし易さを考慮すると、分離、整列が完了した時点で、捕捉部外の流路に白血球が残らないことが望ましい。
すなわち、上記に示した望ましい二つの性質を評価するために、観察範囲内の捕捉部のうちで細胞が１つだけ捕捉された捕捉部の割合である単一捕捉捕捉部率、および観察範囲内に捕捉された細胞のうちで捕捉部に１つだけ捕捉された細胞の割合である単一捕捉白血球率、という二種類の指標を捕捉効率の評価指標とすることとした。
＜白血球捕捉デバイスとマイクロ流路デバイスの作成＞
前述の実施例１～４の場合と同様の手順により、本発明による白血球捕捉デバイスを備えたチップを実施例５として作成し、同様の手順により凹型の捕捉部を有するマイクロ流路デバイスを備えるチップを比較例３として作成した。各チップの捕捉部およびバイパス部等のサイズを表２に示す。図２のＬ1、図７のＬ1'がそれぞれ捕捉部の幅を示し、図２
のＬ2、図７のＬ2'がそれぞれバイパス部の幅を示し、図２のＬ3、図７のＬ3'がそれぞれ層間の距離を示し、図２のＬ4、図７のＬ4'がそれぞれ捕捉部の入側部分の最大幅を示す
。
前述の実施例１～４の場合と同様の手順により、本発明による白血球捕捉デバイスを備えたチップを実施例５として作成し、同様の手順により凹型の捕捉部を有するマイクロ流路デバイスを備えるチップを比較例３として作成した。各チップの捕捉部およびバイパス部等のサイズを表２に示す。図２のＬ1、図７のＬ1'がそれぞれ捕捉部の幅を示し、図２
のＬ2、図７のＬ2'がそれぞれバイパス部の幅を示し、図２のＬ3、図７のＬ3'がそれぞれ層間の距離を示し、図２のＬ4、図７のＬ4'がそれぞれ捕捉部の入側部分の最大幅を示す
。
＜実験＞
前述の実施例１～４の場合と同様の手順により実験を実施した。
前述の実施例１～４の場合と同様の手順により実験を実施した。
２種類のチップについて、蛍光顕微鏡でチップを観察して、それぞれ同じ数の捕捉部を含む観察範囲において、観察範囲内に存在する捕捉部数、観察範囲内に存在する白血球数、単一捕捉白血球数（単一捕捉捕捉部数）、をそれぞれ計数し、式１、および式２により捕捉効率を評価した。チップごとの捕捉効率を表３に示す。また、図９（ａ）に本発明の白血球捕捉デバイスのチップの観察対象範囲に捕捉された白血球の様子を、図９（ｂ）に従来技術のマイクロ流路デバイスのチップの観察対象範囲に捕捉された白血球の様子を示す。各図において蛍光を発している粒子の一つ一つが白血球である。
表３に示すとおり、本比較評価実験により、実施例５の単一捕捉捕捉部率が比較例３と比較して６８％高く、単一捕捉白血球率が５３％高いことが示され、本発明による白血球捕捉デバイスは、従来法と比較して、白血球等の固体成分の捕捉効率が極めて高いことが確認できた。
この差は、本発明の捕捉部を構成する２つの凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていることにより、従来技術における捕捉部のような凹型の構造と比較して、静水圧により捕捉部の奥の方に押し込まれた細胞を両側から挟み込む効果を生じることとなり、一度捕捉された細胞の離脱や一つの捕捉部への複数個の細胞の捕捉を起こしにくいことにより生じたものであると推察される。
この差は、本発明の捕捉部を構成する２つの凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていることにより、従来技術における捕捉部のような凹型の構造と比較して、静水圧により捕捉部の奥の方に押し込まれた細胞を両側から挟み込む効果を生じることとなり、一度捕捉された細胞の離脱や一つの捕捉部への複数個の細胞の捕捉を起こしにくいことにより生じたものであると推察される。
この出願は、２０２０年９月２９日に出願された日本出願特願２０２０－１６３３７８を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
１ 本発明の白血球捕捉デバイス
３ 入口
５ 出口
１０ チップ
１２ 平面部
１４ 凸部
２１ 捕捉部
２３ バイパス部
３ 入口
５ 出口
１０ チップ
１２ 平面部
１４ 凸部
２１ 捕捉部
２３ バイパス部
Claims (4)
- 血液含有液を通過させて、前記血液含有液に含まれる白血球を捕捉するチップを備える白血球捕捉デバイスであって、
前記チップは、平面部とその上に設けられた多数の凸部とを有し、入口から入った前記血液含有液が、前記チップにおける前記平面部の表面上、かつ、前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間を通過し、出口から排出されるように構成されており、
前記凸部は、前記平面部上において層状に設けられ、各層は複数の前記凸部を含んでおり、入口側の層を通過した前記血液含有液がそれに隣り合う出口側の層を通過するように構成されており、
各層において前記凸部とそれに隣り合う別の前記凸部との間の幅が２～７．５μｍに設定されている捕捉部と、８～２０μｍに設定されているバイパス部とが形成されており、
前記捕捉部を構成する２つの前記凸部における入口側の入側部分の幅が、前記捕捉部の奥へ向かって徐々に狭くなるように面取りされていて、
特定の層における全部または一部の前記バイパス部の出口側に対向して、それに隣り合う別の層の一部として前記捕捉部が配置されている、白血球捕捉デバイス。 - 特定の層と、それに隣り合う別の層との幅が８～３０μｍである、請求項１に記載の白血球捕捉デバイス。
- 捕捉部の幅に対する前記バイパス部の幅の比が１より大きく３以下である、請求項１または２に記載の白血球捕捉デバイス。
- 前記凸部の入口側の端面における前記捕捉部以外の部分は層方向に平行に延びており、かつ、前記凸部における前記バイパス部を構成する端面は層方向に対して垂直方向に延びている、請求項１～３のいずれかに記載の白血球捕捉デバイス。
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