JP7447117B2 - 生体由来物の製造方法、産生物の製造方法及び電圧印加装置 - Google Patents

Description

開示の技術は、生体由来物の製造方法、産生物の製造方法及び電圧印加装置に関する。

電気穿孔法は、電気パルスにより細胞膜に孔をあけることにより細胞内に物質を導入する手法であり、エレクトロポレーションとも呼ばれる。例えば、細胞懸濁液に電気パルスを印加することで細胞膜に微小な孔を開け、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）を細胞内部に導入することで、細胞の形質転換を行うことが可能である。電気穿孔法を用いて細胞内にＤＮＡ等の生体活性物質を導入する技術として、以下の技術が知られている。

例えば、特表２００４－５０００２２号公報には、細胞が流通する流路内に電極を配置した装置が記載されている。特開２０１５－８７０８号公報には、電気穿孔法によって真核藻類細胞に外来遺伝子を導入する方法において、緑藻類細胞と核酸分子を含有する溶液に対して、互いに異なる３つの条件の矩形波電気パルスを段階的に与えることが記載されている。

電気穿孔法を用いて、細胞、細胞誘導体、細胞小器官、細胞内顆粒及び小胞等の生体由来物に、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ribonucleic acid）及びタンパク質等の生体活性物質を導入するプロセスとして、バッチプロセスが広く用いられている。バッチプロセスにおいては、例えば、内壁に一対の平行平板電極が設けられたベッセルの内部に、生体由来物及び生体活性物質を含む懸濁液が収容され、平行平板電極に所定の電圧が印加される。これにより生体由来物の表面を覆う膜に微小な孔が開き、膜の透過性が高くなる。また、ここで、生体活性物質が拡散や電気泳動により透過性が高まった膜を通過することで、生体活性物質が生体由来物へ導入される。

電気穿孔法においては、平行平板電極の電極間距離が過大となると、生体活性物質の導入効率が低下することが知られている。バッチプロセスではベッセル内部の反応空間が、電極間距離によって制限されるため、平行平板電極の電極間距離を短くすると、処理できる懸濁液の量が低下する。すなわち、バッチプロセスでは、処理効率を高めることが困難であり、大量の懸濁液の処理には不適であると考えられる。

一方、平行平板電極を配置した流路中に、生体由来物及び生体活性物質を含む懸濁液を流通させるフロープロセスによれば、大量の懸濁液の処理に適していると考えられる。フロープロセスでは、平行平板電極への電圧印加により流路内に形成される電界領域を懸濁液が通過する。しかしながら、フロープロセスでは、流路内を懸濁液が流動するため、バッチプロセスに比べ生体活性物質が生体由来物へ導入されるための拡散や電気泳動が阻害される。その結果、フロープロセスではバッチプロセスに比べ生体活性物質の導入効率が低下する。

開示の技術は、１つの側面として、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることを目的とする。

開示の技術に係る生体由来物の製造方法は、生体活性物質が導入された生体由来物の製造方法であって、生体活性物質の導入前の生体由来物と、生体活性物質とを含む懸濁液が、第１の電界強度を有する第１の電界領域を通過する工程と、懸濁液が、第１の電界領域を通過した後に、第１の電界強度よりも低い第２の電界強度を有する第２の電界領域を通過する工程と、を含む。生体由来物は、ヒト由来細胞であればよく、ＨＥＫ２９３細胞が最も好ましい。開示の技術に係る製造方法によれば、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることが可能となる。本明細書中において、導入効率［％］は、生体活性物質を導入された細胞数×１００／（生細胞数＋死細胞数）によって求められる。生細胞数＋死細胞は分析に用いた総細胞数を示す。

懸濁液が第１の電界領域を通過する第１の期間は、懸濁液が第２の電界領域を通過する第２の期間と、同じか第２の期間よりも短いことが好ましく、第１の期間Ｔ１と第２の期間Ｔ２との比Ｔ１／Ｔ２が１／１０００以上１以下であることがより好ましい。これにより、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高める効果を促進させることができる。Ｔ１は、電圧を直流で与える場合は、Ｌ１を平均流量と断面積から算出される平均流速で割った期間となる。電圧をパルスで与える場合は、Ｌ１を平均流量と断面積から算出される平均流速で割った期間の間に印加されるパルスのパルス時間の合計値となる。また、Ｔ２についても、電圧を直流で与える場合は、Ｌ２を平均流量と断面積から算出される平均流速で割った期間となる。電圧をパルスで与える場合は、Ｌ２を平均流量と断面積から算出される平均流速で割った期間の間に印加されるパルスのパルス時間の合計値となる。

また、第２の電界強度Ｅ２と第１の電界強度Ｅ１との比Ｅ２／Ｅ１が１／１０００以上１未満であることが好ましく、１／１０以上１未満であることが好ましく、１／１０以上１／４未満であることが特に好ましい。これにより、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高める効果を促進させることができ、細胞生存率を高めることができる。電界強度は、オシロスコープにより測定した電圧値を電極間距離で割ることで求めることができる。

生体活性物質及び生体由来物を含む懸濁液が、第１の電界領域を通過した後であり且つ第２の電界領域を通過する前に、無電界領域を通過してもよい。これにより、懸濁液が第１の電界領域の通過後、直ちに第２の電界領域を通過する場合と比較して、生体由来物へのストレスを軽減させることが可能となる。

懸濁液が第１の電界領域を通過する第１の期間Ｔ１と、懸濁液が無電界領域を通過する第３の期間Ｔ０との比Ｔ１／Ｔ０が、１／２５０００以上１未満であることが好ましく、１／２５０００以上１／１０以下が更に好ましい。これにより、生体由来物へのストレスを軽減させる効果を促進させることが可能となる。Ｔ１／Ｔ０を１／１０以下にすることで、発熱による細胞へのダメージ蓄積による生細胞率の低下を抑制することができる。Ｔ０は好ましくは、５０ｍｓ以上５分以下であり、より好ましくは２分間である。Ｔ０を５０ｍｓ以上とすることで、過度な発熱を防ぎ細胞生存率を向上させることが可能となる。Ｔ０を５分以下とすることで、第一の電界領域を通過することで生じた細胞の孔が閉鎖する前に第二の電界領域を通過することにより、導入効率を向上させることが可能となる。Ｔ０はＬ０を平均流量と断面積から算出される平均流速で割ることで求められる。

生体活性物質を含む懸濁液及び生体活性物質の導入前の生体由来物を含む懸濁液が、互いに異なる流路を流れ、それぞれの流路の合流点において混合された後、第１の電界領域及び第２の電界領域を通過してもよい。２種類の懸濁液を別々の流路に流通させ、合流させることで、生体由来物と生体活性物質との混合を促進させることが可能となる。

懸濁液は、流路内を流通することにより第１の電界領域及び第２の電界領域を通過し、流路の、懸濁液の流通方向と直交する断面の面積をＳ［ｍ^２］、流路の断面の周長をＣ［ｍ］、懸濁液が第１の電界領域及び第２の電界領域を通過する平均速度をｕ［ｍ／ｓ］としたとき、下記の（１）式によって定義されるせん断速度Ｄ［ｓ^－１］が、１［ｓ^－１］以上５０００［ｓ^－１］以下であることが好ましく、１［ｓ^－１］以上２０００［ｓ^－１］以下がより好ましく、１［ｓ^－１］以上１０００［ｓ^－１］以下が最も好ましい。この範囲にすることで、せん断に弱い細胞について生存性を高めることが可能となる。
Ｄ＝２ｕ・Ｃ／Ｓ ・・・（１）
せん断速度Ｄを上記の範囲にすることで、懸濁液に含まれる生体由来物が流路を流通しているときに、生体由来物に作用するせん断応力を抑制するとともに、懸濁液の時間あたりの流通量を増やすことができる。

懸濁液が、第１の電界領域及び第２の電界領域とは別の少なくとも１つの電界領域を通過する工程を更に含んでいてもよい。これにより、懸濁液が通過する電界領域における電界の条件を、よりきめ細かく設定することが可能となり、生体由来物への生体活性物質の導入効率を更に高めることが可能となる。

生体活性物質はＤＮＡであってもよい。

開示の技術に係る産生物の製造方法は、上記の製造方法によって製造された生体由来物を培養する工程と、生体由来物によって産生される産生物を抽出する工程と、を含む。開示の技術に係る製造方法によれば、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることができるので、産生物の製造効率を高めることが可能となる。ヒト由来細胞である生体由来物によって産生される産生物は、ウイルスであってもよい。

開示の技術に係る電圧印加装置は、液体を流通させるための流路と、流路の壁面に互いに対向して設けられた第１の電極対と、流路の壁面の、第１の電極対よりも液体の流通方向の下流側において、互いに対向して設けられた第２の電極対と、を備える。第１の電極対の流通方向における長さが、第２の電極対の流通方向における長さと同じか、これよりも短い。開示の技術に係る電圧印加装置によれば、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることが可能となる。第一の電極対の長さは、０．１ｃｍ以上３０ｃｍ以下であってもよく、好ましくは、０．２ｃｍ以上１０ｃｍ以下であり、より好ましくは０．５ｃｍ以上５ｃｍ以下である。第二の電極対の長さは、０．１ｃｍ以上３０ｃｍ以下であってもよく、好ましくは、０．２ｃｍ以上１０ｃｍ以下であり、より好ましくは０．５ｃｍ以上５ｃｍ以下である。

第１の電極対の流通方向の長さＬ１と、第２の電極対の流通方向の長さＬ２との比Ｌ１／Ｌ２が、１／１０００以上１以下であることが好ましく、１／２００以上１／２以下が好ましく、１／１００以上１／１０が最も好ましい。これにより、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高める効果を促進させることができる。第１のパルスは短い方がよいが、Ｌ１／Ｌ２を１／１０００以上とすることで電極加工が容易となる。

第１の電極対の流通方向の長さＬ１と、第１の電極対と第２の電極対との間の流通方向の長さＬ０との比Ｌ１／Ｌ０が、１／３００００以上１／１０以下であることが好ましく、１／２５０００以上１／１００以下が最も好ましい。これにより、生体由来物へのストレスを軽減させる効果を促進させることが可能となる。

第１の電極対の電極間距離及び第２の電極対の電極間距離が、それぞれ１０μｍ以上１０ｍｍ未満であることが好ましく、２０μｍ以上７ｍｍ以下が更に好ましく、１ｍｍ以上５ｍｍ以下が最も好ましい。これにより、第１の電極対及び第２の電極対に印加される電圧が過度に高くなること及び流路の断面積が過度に小さくなることを回避することができる。１ｍｍ以上であれば、濃縮細胞液であっても流路詰まりが発生せず、５ｍｍ以下であれば電圧をさげることが可能となる。

第１の電極対には、第１の電圧が印加され、第２の電極対には、第１の電圧よりも低い第２の電圧が印加されることが好ましい。これにより、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることが可能となる。

開示の技術に係る電圧印加装置は、流路の壁面に互いに対向して設けられた、第１の電極対及び第２の電極対とは別の少なくとも１つの電極対を更に含んでいてもよい。これにより、懸濁液が通過する電界領域における電界の条件を、よりきめ細かく設定することが可能となり、生体由来物への生体活性物質の導入効率を更に高めることが可能となる。導入する生体活性物質の大きさや電気的性質により、導入に適した電界が存在する。そのため、導入する遺伝子の数に応じて、電界領域を設けてもよい。例えば、３つ以上の遺伝子を導入する場合、電界領域を２つにしてもよいし、３つにしてもよい。

流路が少なくとも１つ以上の合流点または分岐点を有していてもよい。これにより、２種類の懸濁液を別々の流路に流通させ、合流させることで、生体由来物と生体活性物質との混合を促進させることが可能となる。

開示の技術によれば、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る電圧印加装置の構成の一例を示す平面図である。 図１Ａにおける１Ｂ－１Ｂ線に沿った断面図である。 図１Ａにおける１Ｃ－１Ｃ線に沿った断面図である。 図１Ｂの一部を拡大して示す図である。 開示の技術の他の実施形態に係る電圧印加装置の構成の一例を示す平面図である。 開示の技術の他の実施形態に係る電圧印加装置の構成の一例を示す平面図である。 開示の技術の他の実施形態に係る電圧印加装置の構成の一例を示す平面図である。 図５Ａにおける５Ｂ－５Ｂ線に沿った断面図である。 図５Ｂの一部を拡大して示す図である。 開示の技術の実施形態に係る各電界領域における電界強度の相対的な関係の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る各電界領域における電界強度の相対的な関係の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る各電界領域における電界強度の相対的な関係の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る各電界領域における電界強度の相対的な関係の一例を示す図である。 変形例に係る電圧印加装置１Ｃの構成の一例を示す断面図である。 開示の技術の他の実施形態に係る産生物製造装置の構成の一例を示す図である。 各サンプルについて取得した遺伝子導入効率及び生細胞率を示すグラフである。

以下、本開示の技術の実施形態について図面を参照しつつ説明する。尚、各図面において、実質的に同一又は等価な構成要素又は部分には同一の参照符号を付している。なお、本明細書において、生体由来物とは、ヒト由来細胞である。細胞はヒトＴ細胞、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＳＦ９、ＥＢ６６、Ｄａｕｄｉ、Ｈｅｌａ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫであってもよい。生体活性物質とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質等の、生体由来物に導入されることにより、生体由来物に何らかの作用をもたらす物質である。例えば、プラスミド、線形ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質があり、特にプラスミド、ｍＲＮＡ、線形ＤＮＡが好ましい。

［第１の実施形態］
図１Ａは、開示の技術の第１の実施形態に係る電圧印加装置１の構成の一例を示す平面図である。図１Ｂは、図１Ａにおける１Ｂ－１Ｂ線に沿った断面図である。図１Ｃは、図１Ａにおける１Ｃ－１Ｃ線に沿った断面図である。図２は、図１Ｂの一部を拡大して示す図である。

電圧印加装置１は、電気穿孔法による生体由来物への生体活性物質の導入に用いられる装置である。例えば、生体由来物の一例である細胞に、生体活性物質の一例であるＤＮＡを導入することにより、新たな遺伝的な特徴を持つ新たな細胞を作製することが可能となる。

図１Ｂに示すように、電圧印加装置１は、互いに対向するように設けられた上壁部１１及び下壁部１２を有する。電圧印加装置１は、上壁部１１及び下壁部１２の間に形成された流路２０を有する。上壁部１１には流路２０に連通する流入口２１及び流出口２２が設けられている。流入口２１は、流路２０の一端側に設けられ、流出口２２は流路２０の他端側に設けられている。電圧印加装置１の使用時において、生体活性物質導入前の生体由来物及び生体活性物質を含む懸濁液（以下、単に懸濁液という）が、流入口２１に注入され、流路２０を流通した後、流出口２２から流出する。本実施形態において、流路２０の、懸濁液の流通方向と直交する断面の面積は一定とされており、従って、流路２０を流通する懸濁液の流速は一定とされている。

上壁部１１の流路２０側の表面には、上部電極３１Ａが設けられ、下壁部１２の流路２０側の表面には、上部電極３１Ａと対向する下部電極３２Ａが設けられている。上部電極３１Ａ及び下部電極３２Ａにより電極対３０Ａが構成される。電極対３０Ａは、いわゆる平行平板電極の形態を有する。電極対３０Ａは、開示の技術における第１の電極対の一例である。

上壁部１１には、上部電極３１Ａに接続され、上壁部１１の厚さ方向に貫通する導電体からなるビア３３Ａが設けられている。上壁部１１の流路２０とは反対側の表面には、ビア３３Ａを介して上部電極３１Ａに電気的に接続された配線３４Ａ及びパッド３５Ａが設けられている。同様に、下壁部１２には、下部電極３２Ａに接続され、下壁部１２の厚さ方向に貫通する導電体からなるビア３６Ａが設けられている。下壁部１２の流路２０とは反対側の表面には、ビア３６Ａを介して下部電極３２Ａに電気的に接続された、図示しない配線及びパッドが設けられている。このパッド及び上壁部１１に設けられたパッド３５Ａに対して外部電源を用いて電圧を印加することにより、電極対３０Ａに電圧が印加され、上部電極３１Ａと下部電極３２Ａとの間の空間に、電界強度Ｅ１を有する電界領域４０Ａが形成される（図２参照）。電界領域４０Ａは、開示の技術における第１の電界領域の一例である。電界領域４０Ａにおける電界の向きは、例えば、上部電極３１Ａから下部電極３２Ａに向かう方向であってもよい。

また、上壁部１１の流路２０側の表面には、電極対３０Ａよりも、流路２０を流通する懸濁液の流通方向（以下、単に流通方向という）の下流側に、上部電極３１Ｂが設けられている。下壁部１２の流路２０側の表面には、上部電極３１Ｂと対向する下部電極３２Ｂが設けられている。上部電極３１Ｂ及び下部電極３２Ｂにより電極対３０Ｂが構成される。電極対３０Ｂは、いわゆる平行平板電極の形態を有する。電極対３０Ｂは、開示の技術における第２の電極対の一例である。

上壁部１１には、上部電極３１Ｂに接続され、上壁部１１の厚さ方向に貫通する導電体からなるビア３３Ｂが設けられている。上壁部１１の流路２０とは反対側の表面には、ビア３３Ｂを介して上部電極３１Ｂに電気的に接続された配線３４Ｂ及びパッド３５Ｂが設けられている。同様に、下壁部１２には、下部電極３２Ｂに接続され、下壁部１２の厚さ方向に貫通する導電体からなるビア３６Ｂが設けられている。下壁部１２の流路２０とは反対側の表面には、ビア３６Ｂを介して下部電極３２Ｂに電気的に接続された、図示しない配線及びパッドが設けられている。このパッド及び上壁部１１に設けられたパッド３５Ｂに対して外部電源を用いて電圧を印加することにより、電極対３０Ｂに電圧が印加され、上部電極３１Ｂと下部電極３２Ｂとの間の空間に電界強度Ｅ２を有する電界領域４０Ｂが形成される（図２参照）。電界領域４０Ｂは、開示の技術における第２の電界領域の一例である。電界領域４０Ｂにおける電界の向きは、例えば、上部電極３１Ｂから下部電極３２Ｂに向かう方向であってもよい。

電極対３０Ａには電圧Ｖ１が印加され、電極対３０Ｂには電圧Ｖ１よりも低い電圧Ｖ２が印加される。電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂに印加される電圧は、直流電圧であってもよいし、交流電圧であってもよい。本実施形態において、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂの電極間距離ｄは同一とされており、従って、電極対３０Ｂによって形成される電界領域４０Ｂの電界強度Ｅ２は、電極対３０Ａによって形成される電界領域４０Ａの電界強度Ｅ１よりも低くなるように設定される。これにより、電界領域４０Ｂにおいて生体由来物の膜透過性を維持しつつ、生体活性物質の電気泳動が促進される。電界強度Ｅ１は、開示の技術における第１の電界強度の一例であり、電界強度Ｅ２は開示の技術における第２の電界強度の一例である。

ここで、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂの電極間距離ｄが過度に長くなると、電界領域４０Ａ及び電界領域４０Ｂにおいて所望の電界強度を得るために電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂに印加される電圧が高くなる。電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂに印加される電圧が過度に高くなると、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂが劣化しやすくなる。一方、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂの電極間距離ｄが過度に短くなると、流路２０の断面積が小さくなり、大量の懸濁液を処理することが困難となる。電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂの電極間距離ｄは、１０μｍ以上１０ｍｍ未満であることが好ましい。これにより、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂに印加される電圧が過度に高くなること及び流路２０の断面積が過度に小さくなることを回避することができる。

流路２０を流通する懸濁液は、電界領域４０Ａを通過した後に電界領域４０Ｂを通過する。電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１は、電極対３０Ｂの流通方向の長さＬ２と同じか、これよりも短いことが好ましい（Ｌ１≦Ｌ２）。換言すれば、懸濁液が電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１は、懸濁液が電界領域４０Ｂを通過する期間Ｔ２と同じか、これよりも短いことが好ましい。また、電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１と、電極対３０Ｂの流通方向の長さＬ２との比Ｌ１／Ｌ２が、１／１０００以上１以下であることが好ましい。換言すれば、懸濁液が電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１と、懸濁液が電界領域４０Ｂを通過する期間Ｔ２との比Ｔ１／Ｔ２が１／１０００以上１以下であることが好ましい。期間Ｔ１は、開示の技術における第１の期間の一例であり、期間Ｔ２は、開示の技術における第２の期間の一例である。

また、電極対３０Ａと電極対３０Ｂとの間の領域には、電極対が設けられておらず、電界強度が実質的にゼロとされる無電界領域４１が形成されている。ここで、電界強度が実質的にゼロであるとは、無電界領域４１に隣接する電界領域４０Ａ及び電界領域４０Ｂにおける電界の影響が、無電界領域４１に及び得ることを意味する。電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１は、電極対３０Ａと電極対３０Ｂとの間の領域（すなわち無電界領域４１）の流通方向の長さＬ０よりも短いことが好ましい（Ｌ１＜Ｌ０）。換言すれば、懸濁液が電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１は、懸濁液が無電界領域４１を通過する期間Ｔ０よりも短いことが好ましい。また、電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１と、電極対３０Ａと電極対３０Ｂとの間の領域の流通方向の長さＬ０との比Ｌ１／Ｌ０が、１／１０００以上１未満であることが好ましい。換言すれば、懸濁液が電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１と、懸濁液が無電界領域４１を通過する期間Ｔ０との比Ｔ１／Ｔ０が１／１０００以上１未満であることが好ましい。上記の範囲にすることで、異なる電界領域が他の電界領域へ及ぼす影響を緩和することができる。

また、流路２０の、懸濁液の流通方向と直交する断面の面積をＳ［ｍ^２］、流路２０の上記断面の周長をＣ［ｍ］、懸濁液が電界領域４０Ａ及び電界領域４０Ｂを通過する平均速度をｕ［ｍ／ｓ］としたとき、下記の（１）式によって定義されるせん断速度Ｄ［ｓ^－１］が、１［ｓ^－１］以上５０００［ｓ^－１］以下であることが好ましく、１［ｓ^－１］以上２０００［ｓ^－１］以下がより好ましく、１［ｓ^－１］以上１０００［ｓ^－１］以下が更に好ましい。せん断速度Ｄを上記の範囲にすることで、懸濁液に含まれる生体由来物が流路２０を流通しているときに、生体由来物に作用するせん断応力を抑制するとともに、懸濁液の時間あたりの流通量を稼ぐことができる。
Ｄ＝２ｕ・Ｃ／Ｓ ・・・（１）

電圧印加装置１の使用時において、電極対３０Ａには電圧Ｖ１が印加され、電極対３０Ｂには電圧Ｖ１よりも小さい電圧Ｖ２が印加される。そして、生体活性物質の導入前の生体由来物と生体活性物質とを含む懸濁液が、流入口２１に注入される。流入口２１に注入された懸濁液は、流路２０を経由して流出口２２から流出する。電圧印加装置１を使用することで、以下に説明する開示の技術の実施形態に係る生体由来物の製造方法が実現される。

開示の技術の実施形態に係る生体由来物の製造方法は、生体活性物質の導入前の生体由来物と、生体活性物質とを含む懸濁液が、電界強度Ｅ１を有する電界領域４０Ａを通過する工程と、懸濁液が、電界領域４０Ａを通過した後に、電界強度Ｅ１よりも低い電界強度Ｅ２を有する電界領域４０Ｂを通過する工程と、を含む。流入口２１から注入された懸濁液が、流路２０を流動する間に、上記の各工程における処理が行われる。すなわち、電圧印加装置１によれば、電気穿孔法による生体由来物への生体活性物質の導入がフロープロセスにより行われる。

懸濁液が、電界強度が比較的高い電界領域４０Ａを通過することで、生体由来物の表面を覆う膜（例えば細胞膜）に孔が開くことにより膜の透過性が高くなる。このとき、一部の生体活性物質が拡散や電気泳動により透過性が高まった膜を通過することで、生体活性物質が生体由来物へ導入される。その後、懸濁液が、電界強度が比較的低い電界領域４０Ｂを通過することで、膜の透過性を維持したまま、生体活性物質の電気泳動がさらに起こり、生体由来物への導入が促進される。すなわち、開示の技術の実施形態に係る電圧印加装置１及び生体由来物の製造方法によれば、懸濁液が単一の電界領域を通過する場合と比較して、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることが可能となる。

懸濁液が電界領域４０Ａ及び４０Ｂの双方を通過する間に、懸濁液に印加される単位体積あたりの総エネルギーＥ［Ｊ／μＬ］は、下記の（２）式によって与えられる。（２）式において、Ｖ１［Ｖ］は電極対３０Ａに印加される電圧パルスの電圧値であり、Ｉ１［Ａ］は電極対３０Ａに電圧パルスを印加したときに電極対３０Ａに流れる電流値であり、Ｔ１［ｓｅｃ］は電極対３０Ａに印加される電圧パルスのパルス幅である。Ｖ２［Ｖ］は電極対３０Ｂに印加される電圧パルスの電圧値であり、Ｉ２［Ａ］は電極対３０Ｂに電圧パルスを印加したときに電極対３０Ｂに流れる電流値であり、Ｔ２［ｓｅｃ］は電極対３０Ｂに印加される電圧パルスのパルス幅であり、Ｍ［μＬ］は、 電界領域４０Ａ及び４０Ｂを通過する懸濁液の体積である。
Ｅ＝（Ｖ１×Ｉ１×Ｔ１＋Ｖ２×Ｉ２×Ｔ２）／Ｍ ・・・（２）
懸濁液に印加される総エネルギーＥは、生体由来物への生体活性物質の導入効率及び生体由来物の生存率に強い影響を与える。生体活性物質の導入効率及び生体由来物の生存率を高めるために、懸濁液に印加される総エネルギーＥは、０．０１［Ｊ／μＬ］以上０．３０［Ｊ／μＬ］以下であることが好ましく、０．０１［Ｊ／μＬ］以上０．２０［Ｊ／μＬ］以下であることがより好ましく、０．０２［Ｊ／μＬ］以上０．１３［Ｊ／μＬ］以下であることが最も好ましい。

また、電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１を、電極対３０Ｂの流通方向の長さＬ２と同じか、これよりも短くすることで、懸濁液が高電界の電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１を、懸濁液が低電界の電界領域４０Ｂを通過する期間Ｔ２と同じか、これよりも短くすることができる。期間Ｔ２を期間Ｔ１に対して同じか長くすることで、電気泳動による生体由来物への生体活性物質の導入を促進させることができる。Ｌ１／Ｌ２またはＴ１／Ｔ２を１／１０００以上１以下とすることで、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高める効果が顕著に発揮される。例えば、低電界の電界領域４０Ｂを形成するために電極対３０Ｂに印加される電圧パルスとして、パルス幅が比較的長い電圧パルスが要求される場合、Ｌ１≦Ｌ２またはＴ１≦Ｔ２であることが好ましい。一方、高電界の電界領域４０Ａを形成するために電極対３０Ａに印加される電圧パルスを複数回に亘って印加することが要求される場合には、Ｌ１＞Ｌ２またはＴ１＞Ｔ２であることが好ましい。

また、開示の技術の実施形態に係る電圧印加装置１及び生体由来物の製造方法によれば、懸濁液が、電界領域４０Ａを通過した後、電界領域４０Ｂを通過する前に、無電界領域４１を通過する。懸濁液が、電界強度が比較的高い電界領域４０Ａを通過した後に、無電界領域４１を経由して電界領域４０Ｂを通過することで、電界領域４０Ａの影響が電界領域４０Ｂへ及ぶことを抑制することができる。

また、開示の技術の実施形態に係る電圧印加装置１によれば、電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１と、電極対３０Ａと電極対３０Ｂとの間の流通方向の長さＬ０との比Ｌ１／Ｌ０及び懸濁液が電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１と、懸濁液が無電界領域４１を通過する期間Ｔ０との比Ｔ１／Ｔ０を、それぞれ１／１０００以上１未満とすることで、それぞれの電界領域の効果が顕著に発揮される。

［第２の実施形態］
図３は、開示の技術の第２の実施形態に係る電圧印加装置１Ａの構成の一例を示す平面図である。

電圧印加装置１Ａは、２つの流入口２１及び２１Ａを有する。流入口２１Ａは、流路２０Ａに連通しており、流路２０Ａは、流路２０に接続されている。すなわち、流路２０は、流路２０Ａと合流する合流点２４を有する。

電圧印加装置１Ａの使用時において、例えば、生体活性物質の導入前の生体由来物を含む懸濁液が流入口２１に注入され、生体活性物質を含む懸濁液が流入口２１Ａに注入される。２種類の懸濁液が、互いに異なる流路２０Ａ及び２０を流れ、合流点２４において混合された後、電界領域４０Ａ及び前記電界領域４０Ｂを通過する。このように、２種類の懸濁液を別々の流路に流通させ、合流させることで、生体由来物へのダメージを抑え、生体由来物の生存率を増加させることができる。さらに導入された細胞の生存率向上につながるため、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることができる。

また、図４に示すように、電圧印加装置１Ａは、２つの流出口２２及び２２Ａを有していてもよい。流出口２２Ａは、流路２０Ｂに連通しており、流路２０Ｂは、流路２０に接続されている。すなわち、流路２０は、流路２０Ｂに分岐する分岐点２５を有する。図４に示す電圧印加装置１Ａによれば、電界領域４０Ａ及び電界領域４０Ｂを通過した懸濁液は、流出口２２及び２２Ａからそれぞれ流出する。このように流出口を２つ持たせることで複数の培養容器に供給することが可能となる。

［第３の実施形態］
図５Ａは、開示の技術の第３の実施形態に係る電圧印加装置１Ｂの構成の一例を示す平面図である。図５Ｂは、図５Ａにおける５Ｂ－５Ｂ線に沿った断面図である。電圧印加装置１Ｂは、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂに加え、電極対３０Ｃ及び電極対３０Ｄを更に含む。本実施形態において、懸濁液の流通方向の上流側から順に、電極対３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄが設けられている。図６は、図５Ｂの一部を拡大して示す図である。

電極対３０Ｃ及び電極対３０Ｄは、それぞれ、電極対３０Ａ及び電極対３０Ｂと同様、平行平板電極の形態を有する。すなわち、電極対３０Ｃは、上壁部１１の流路２０側の表面に設けられた上部電極３１Ｃと、下壁部１２の流路２０側の表面に設けられ、上部電極３１Ｃと対向する下部電極３２Ｃとを含んで構成されている。同様に、電極対３０Ｄは、上壁部１１の流路２０側の表面に設けられた上部電極３１Ｄと、下壁部１２の流路２０側の表面に設けられ、上部電極３１Ｄと対向する下部電極３２Ｄとを含んで構成されている。

上壁部１１の流路２０とは反対側の表面には、ビア３３Ｃを介して上部電極３１Ｃに電気的に接続された配線３４Ｃ及びパッド３５Ｃが設けられている。下壁部１２の流路２０とは反対側の表面には、ビア３６Ｃを介して下部電極３２Ｃに電気的に接続された、図示しない配線及びパッドが設けられている。このパッド及び上壁部１１に設けられたパッド３５Ｃに対して外部電源を用いて電圧を印加することにより、電極対３０Ｃに電圧が印加され、上部電極３１Ｃと下部電極３２Ｃとの間の空間に電界強度Ｅ３を有する電界領域４０Ｃが形成される（図６参照）。

同様に、上壁部１１の流路２０とは反対側の表面には、ビア３３Ｄを介して上部電極３１Ｄに電気的に接続された配線３４Ｄ及びパッド３５Ｄが設けられている。下壁部１２の流路２０とは反対側の表面には、ビア３６Ｄを介して下部電極３２Ｄに電気的に接続された、図示しない配線及びパッドが設けられている。このパッド及び上壁部１１に設けられたパッド３５Ｄに対して外部電源を用いて電圧を印加することにより、電極対３０Ｄに電圧が印加され、上部電極３１Ｄと下部電極３２Ｄとの間の空間に電界強度Ｅ４を有する電界領域４０Ｄが形成される（図６参照）。流路２０を流通する懸濁液は、電界領域４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄの順で通過する。

図７Ａ～図７Ｄは、それぞれ、電界領域４０Ａ～４０Ｄにおける電界強度Ｅ１～Ｅ４の相対的な関係の一例を示す図である。例えば、図７Ａ及び図７Ｂに示すように、懸濁液の流通方向の上流側から下流側に向けて電界強度が段階的に低下するように電界強度Ｅ１～Ｅ４が設定されていてもよい。図７Ａに示す例では、電界強度Ｅ１～Ｅ４について、Ｅ１＞Ｅ２＞Ｅ３＞Ｅ４の関係が成立している。図７Ｂに示す例では、Ｅ１＞Ｅ２＝Ｅ３＞Ｅ４の関係が成立している。また、図７Ｃに示すように、懸濁液の流通方向に沿って、電界強度が相対的に高い領域と低い領域が交互に並ぶように電界強度Ｅ１～Ｅ４が設定されていてもよい。図７Ｃに示す例では、電界強度Ｅ１～Ｅ４について、Ｅ１＝Ｅ３＞Ｅ２＝Ｅ４の関係が成立している。また、図７Ｄに示すように、懸濁液の流通方向の上流側から下流側に向けて電界強度が段階的に上昇した後、電界強度が段階的に低下するように電界強度Ｅ１～Ｅ４が設定されていてもよい。図７Ｄに示す例では、電界強度Ｅ１～Ｅ４について、Ｅ１＜Ｅ２＝Ｅ３＞Ｅ４の関係が成立している。本実施形態に係る電圧印加装置１Ｂにおいては、電界強度が相対的に高い電界領域の流通方向下流側に隣接して電界強度が相対的に低い電界領域が配置されている区間が、流路２０内に少なくとも１箇所存在するように、電界強度Ｅ１～Ｅ４が設定されていればよい。

電極対３０Ａ～３０Ｄの流通方向の長さＬ１～Ｌ４は、当該電極対において形成される電界強度が高くなる程、短くなるように構成されていてもよい。換言すれば、懸濁液が、各電界領域４０Ａ～４０Ｄを通過する各期間Ｔ１～Ｔ４は、当該電界領域における電界強度が高くなる程、短くなるように構成されていてもよい。例えば、図７Ａに例示するように、電界強度Ｅ１～Ｅ４について、Ｅ１＞Ｅ２＞Ｅ３＞Ｅ４の関係が成立している場合には、Ｌ１≦Ｌ２≦Ｌ３≦Ｌ４となるように、電極対３０Ａ～３０Ｄの流通方向の長さＬ１～Ｌ４が設定されていてもよい。または、Ｔ１≦Ｔ２≦Ｔ３≦Ｔ４となるように、各電界領域４０Ａ～４０Ｄを通過する各期間Ｔ１～Ｔ４が設定されていてもよい。

また、電界強度が最大となる電界領域を形成する電極対の流通方向の長さをＬ_ｍｉｎ、電界強度が最小となる電界領域を形成する電極対の流通方向の長さをＬ_ｍａｘとすると、Ｌ_ｍｉｎとＬ_ｍａｘとの比Ｌ_ｍｉｎ／Ｌ_ｍａｘが１／１０００以上１以下であることが好ましい。換言すれば、懸濁液が、電界強度が最大となる電界領域を通過する期間をＴ_ｍｉｎ、懸濁液が、電界強度が最小となる電界領域を通過する期間をＴ_ｍａｘとすると、Ｔ_ｍｉｎとＴ_ｍａｘとの比Ｔ_ｍｉｎ／Ｔ_ｍａｘが１／１０００以上１以下であることが好ましい。これにより、最大電圧による修復不可能な程度の膜開孔を抑制し、電気泳動による生体由来物への生体活性物質の導入を促進させることができる。

本実施形態に係る電圧印加装置１Ｂにおいて、電極対３０Ａと電極対３０Ｂとの間、電極対３０Ｂと電極対３０Ｃとの間、電極対３０Ｃと電極対３０Ｄとの間には、それぞれ、電極対が設けられておらず、電界強度が実質的にゼロとされる無電界領域４１が形成されている。本実施形態において、互いに隣接する電極対間の各領域（すなわち、各無電界領域４１）の長さＬ０は、互いに同一とされている。

電界強度が最大となる電界領域を形成する電極対の流通方向の長さＬ_ｍｉｎは、無電界領域４１の流通方向の長さＬ０よりも短いことが好ましい。換言すれば、懸濁液が電界強度が最大となる電界領域を通過する期間をＴ_ｍｉｎは、懸濁液が無電界領域４１を通過する期間Ｔ０よりも短いことが好ましい。また、Ｌ_ｍｉｎとＬ０との比Ｌ_ｍｉｎ／Ｌ０及びＴ_ｍｉｎとＴ０との比Ｔ_ｍｉｎ／Ｔ０が、それぞれ１／１０００以上１未満であることが好ましい。上記の範囲にすることで、異なる電界領域が他の電界領域へ及ぼす影響を緩和することができる。

電圧印加装置１Ｂを使用することにより実現される本実施形態に係る生体由来物の製造方法は、生体活性物質の導入前の生体由来物と生体活性物質とを含む懸濁液が、３つ以上の電界領域を通過する。これにより、懸濁液が通過する電界領域における電界の条件を、よりきめ細かく設定することが可能となり、生体由来物への生体活性物質の導入効率を更に高めることが可能となる。

なお、本実施形態では、懸濁液が、４つの電界領域を通過する場合を例示したが、懸濁液が通過する電界領域は、３つまたは５つ以上であってもよい。

また、上記の第１～第３の実施形態において、懸濁液が、各電界領域を通過する期間の調整を、各電極対の流通方向の長さによって行う場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。図８は、変形例に係る電圧印加装置１Ｃの構成の一例を示す断面図である。図８に示すように、比較的高い電界強度を有する電界領域４０Ａにおける流路２０の断面積は、比較的低い電界強度を有する電界領域４０Ｂにおける流路２０断面積よりも小さくてもよい。これにより、懸濁液が電界領域４０Ａを通過する速度は、懸濁液が電界領域４０Ｂを通過する速度よりも速くなる。従って、例えば、電極対３０Ａの流通方向の長さＬ１と、電極対３０Ｂの流通方向の長さＬ２とが、同じである場合、懸濁液が電界領域４０Ａを通過する期間Ｔ１は、懸濁液が電界領域４０Ｂを通過する期間Ｔ２よりも短くなる。このように、流路２０の断面積によっても、懸濁液が各電界領域を通過する期間の調整を行うことが可能である。
また、第１～第３の実施形態において、電気穿孔法による生体由来物への生体活性物質の導入をフロープロセスにより行う場合を例示したが、バッチ処理によって行ってもよい。バッチ処理においては、例えば、生体由来物と生体活性物質とを含む懸濁液が、１つの電界領域を通過する工程が１つの処理単位なり、この工程を電界強度を段階的に変化させて複数回に亘って行う。

［第４の実施形態］
以下に、開示の技術の第４の実施形態に係る産生物の製造方法について説明する。本実施形態に係る産生物の製造方法は、上記した第１～第３の実施形態に係る製造方法によって製造された生体由来物（すなわち、生体活性物質が導入された生体由来物）を培養する工程と、培養された生体由来物によって産生される産生物を抽出する工程と、を含む。産生物は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、センダイウイルスであってもよい。最も好ましくは、アデノ随伴ウイルスである。

図９は、開示の技術の第４の実施形態に係る産生物製造装置２００の構成の一例を示す図である。以下の説明では、産生物製造装置２００により、抗体を産生する細胞を用いて抗体を製造する場合を例示する。すなわち、抗体を産生する細胞は、上記した第１～第３の実施形態に係る製造方法によって、所望の品質を有する抗体を産生させるために有用なＤＮＡが導入された生体由来物である。

抗体の発現に用いる細胞としては、特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。

動物細胞において、発現させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体及び抗VLA4抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ及びサル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体及びbispecific抗体など人為的に改変した抗体も含む。

得られた抗体又はその断片は、均一にまで精製することができる。抗体又はその断片の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。

産生物製造装置２００は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器１１０と、培養容器１１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜１２４を有する第１のフィルタ部１２０と、第１のフィルタ膜１２４によって阻止された成分を培養容器１１０に戻す第１の循環流路としての流路１５２とを含む。産生物製造装置２００は、更に、細胞懸濁液の第１のフィルタ膜１２４を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜１３４を有する第２のフィルタ部１３０と、第２のフィルタ膜１３４を透過した成分を培養容器１１０に戻す第２の循環流路としての流路１５４と、第２のフィルタ膜１３４によって阻止された成分を回収する回収流路１５６、１５７と、を有する。

培養容器１１０は、抗体の発現に用いる細胞と培地とを含む細胞懸濁液を収容する容器である。培養容器１１０の内部には、撹拌翼１１１を有する撹拌装置が設けられている。撹拌翼１１１を回転させることで、培養容器１１０の内部に細胞とともに収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。

流路１５１は、一端が培養容器１１０の底部に接続され、他端が第１のフィルタ部１２０の流入口１２０ａに接続されている。流路１５１の途中には、培養容器１１０に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、第１のフィルタ部１２０に送るポンプＰ１が設けられている。

第１のフィルタ部１２０は、容器１２１と、容器１２１内の空間を供給側１２２と透過側１２３とに隔て、培養容器１１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜１２４と、を備える。また、第１のフィルタ部１２０は、供給側１２２において、細胞懸濁液が流入する流入口１２０ａと細胞懸濁液が流出する流出口１２０ｂとを有する。培養容器１１０から抜き出された細胞懸濁液は、流入口１２０ａから容器１２１の内部に流入して流出口１２０ｂから容器１２１の外部に流出する間に第１のフィルタ膜１２４上を通過する。第１のフィルタ部１２０は、膜分離処理の対象となる液体を第１のフィルタ膜１２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、透過成分を透過側に送るタンジェンシャルフロー（クロスフロー）方式による膜分離処理を行う。第１のフィルタ膜１２４による膜分離処理の方式である、タンジェンシャルフロー方式は、培養容器から抜き出された細胞懸濁液が第１のフィルタ膜１２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液が第１のフィルタ膜１２４の膜面に沿って平行に交互に往復する流れを形成するものであってもよい。

細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの大きい成分は、第１のフィルタ膜１２４を透過せず、流出口１２０ｂから容器１２１の外部に流出し、流路１５２を介して培養容器１１０の内部に戻される。すなわち、培養容器１１０から抜き出された細胞懸濁液のうち、第１のフィルタ膜１２４によって阻止された成分は、流路１５２を介して培養容器１１０の内部に戻される。一方、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの小さい成分は、第１のフィルタ膜１２４を透過して、透過側１２３に設けられた排出口１２０ｃから容器１２１の外部に排出される。第１のフィルタ部１２０の透過側１２３には、ポンプＰ２が設けられた流路１５３が接続されており、透過側１２３に排出された成分は、流路１５３を介して第２のフィルタ部１３０に送られる。

本実施形態に係る産生物製造装置２００において、第１のフィルタ膜１２４は、細胞と、細胞培養に不要な成分と、を分離する目的で用いられる。細胞培養に不要な成分として、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等が挙げられる。すなわち、第１のフィルタ膜１２４は、細胞の死骸、細胞の破砕物、ＤＮＡ、ＨＣＰ、抗体、老廃物等の細胞培養に不要な成分を透過させる一方、細胞の透過を阻止するのに好適な分離性能を有している。なお、培養容器１１０内で培養される細胞のサイズは、２０μｍよりも大きいことが想定される。また、細胞の死骸及び細胞の破砕物のサイズは、１μｍ以上１０μｍ以下であることが想定される。また、ＤＮＡ、ＨＣＰ及び抗体のサイズは、数十ｎｍ程度であることが想定される。

第１のフィルタ膜１２４の平均孔径は、０を超えており且つ２０μｍ以下であることが好ましく、０．０５μｍ以上１０μｍ以下がより好ましく、０．１μｍ以上９μｍ以下が更に好ましく、２μｍ以上８μｍ以下が最も好ましい。第１のフィルタ膜１２４の平均孔径を２０μｍ以下とすることで、細胞が第１のフィルタ膜１２４を透過してしまうリスクを低減することができ、培養容器１１０内の細胞数の減少を抑制することができる。なお、第１のフィルタ膜１２４の平均孔径は、メッシュを使用する場合は９５％分離粒子径で、ＭＦ膜もしくはＵＦ膜を用いる場合は水銀圧入法で測定することができる。

第１のフィルタ膜１２４として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。第１のフィルタ膜１２４として、メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器１１０内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器１１０内における細胞の増殖性を高めることができる。

また、第１のフィルタ膜１２４として、精密濾過膜及び限外濾過膜等の中空糸膜を用いることができる。第１のフィルタ膜１２４として中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減することができる。また、第１のフィルタ膜１２４に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減することができる。これらより、細胞のロスを低減することができる。

第１のフィルタ部１２０の透過側は、流路１５３を介して第２のフィルタ部１３０の供給側１３２に接続されている。流路１５３の途中には、バルブＱ１、Ｑ２及びポンプＰ２が設けられている。バルブＱ１、Ｑ２は、第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液を、第１のフィルタ部１２０から第２のフィルタ部１３０に送る場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。

第２のフィルタ部１３０は、容器１３１と、容器１３１内の空間を供給側１３２と透過側１３３とに隔て、第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜１３４と、を備える。また、第２のフィルタ部１３０は、供給側１３２において、細胞懸濁液が流入する流入口１３０ａを有する。第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液は、流入口１３０ａから容器１３１の内部に流入する。本実施形態において、第２のフィルタ部１３０は、供給側１３２の液体の略全量を濾過するデッドエンド方式による膜分離処理を行う。

第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液に含まれる比較的サイズの大きい成分は、第２のフィルタ膜１３４を透過せず、第２のフィルタ膜１３４の膜面または第２のフィルタ部１３０の供給側１３２に残留する。一方、第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液に含まれる比較的サイズの小さい成分は、第２のフィルタ膜１３４を透過して透過側１３３に透過する。第２のフィルタ部１３０の透過側１３３には、排出口１３０ｃが設けられており、排出口１３０ｃには流路１５４が接続されている。第２のフィルタ膜１３４を透過した成分は、排出口１３０ｃから容器１３１の外部に排出され、流路１５４を介して培養容器１１０に戻される。流路１５４は、一端が排出口１３０ｃに接続され、他端が培養容器１１０に接続されている。

第２のフィルタ膜１３４は、第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液に含まれる、抗体を含む培養に不要な成分と、培地とを分離する目的で用いられる。すなわち、第２のフィルタ膜１３４は、抗体を含む細胞培養に不要な成分の透過を阻止するのに好適な分離性能を有している。

第２のフィルタ膜１３４の平均孔径は、１μｍ以下であることが好ましく、０．１μｍ以下であることがより好ましく、０．０５μｍ以下であることが更に好ましく、０．０１μｍ以下であることが最も好ましい。第２のフィルタ膜１３４の平均孔径を、１μｍ以下とすることで、抗体を含む細胞培養に不要な成分が流路１５４を介して培養容器１０に戻るリスクを低減することができる。なお、第２のフィルタ膜１３４の平均孔径は、メッシュを使用する場合は９５％分離粒子径で、ＭＦ膜もしくはＵＦ膜を用いる場合は水銀圧入法で測定することができる。

第２のフィルタ膜１３４として、中空糸精密濾過膜（ＭＦ膜：Microfiltration Membrane）を用いることができる。第２のフィルタ膜１３４として中空糸精密濾過膜を用いることで、中空糸限外濾過膜を用いる場合と比較して、目詰まりが発生するリスクを低減することができる。

また、第２のフィルタ膜１３４として、中空糸限外濾過膜（ＵＦ膜：Ultrafiltration Membrane）を用いることができる。第２のフィルタ膜１３４として中空糸限外濾過膜を用いることで、中空糸精密濾過膜を用いる場合と比較して、抗体を含む細胞培養に不要な成分を効果的に捕集することができる。

流路１５４の途中には、第２のフィルタ部１３０の透過側１３３の近傍にバルブＱ３が設けられている。バルブＱ３は、第２のフィルタ膜１３４を透過した成分を培養容器１１０に送る場合に開状態に制御され、それ以外の場合は閉状態に制御される。

本実施形態に係る産生物製造装置２００は、第２のフィルタ膜１３４によって阻止された抗体を含む細胞培養に不要な成分を回収する回収手段を有する。上記の回収手段は、逆洗流路１５５、ポンプＰ３、回収流路１５６、１５７及び回収タンク１４０を含んで構成されている。

逆洗流路１５５は、バルブＱ３の入側と出側をバイパスするバイパス流路を形成している。ポンプＰ３は、逆洗流路１５５の途中に設けられており、通常の膜分離処理の際に発生する液流とは逆向きの、第２のフィルタ部１３０の透過側１３３から供給側１３２に向かう液流を発生させることで、第２のフィルタ膜１３４の逆洗処理を行う。逆洗処理が行われている間、バルブＱ３は閉状態に制御され、逆洗に使用される液は、逆洗流路１５５を流れ、第２のフィルタ膜１３４に供給される。第２のフィルタ膜１３４に対して逆洗処理を行うことで、第２のフィルタ膜１３４の膜面及び第２のフィルタ部１３０の供給側１３２に残留する抗体を含む培養に不要な成分が、第２のフィルタ部１３０の流入口１３０ａから排出される。

回収流路１５６は、第２のフィルタ部１３０の流入口１３０ａの近傍において、第１のフィルタ部１２０の透過側１２３と第２のフィルタ部１３０の供給側１３２とを接続する流路１５３に接続されている。逆洗処理が行われている間、バルブＱ１、Ｑ２及びＱ３は閉状態に制御され、バルブＱ４は開状態に制御される。これにより、逆洗処理によって第２のフィルタ部１３０の流入口１３０ａから排出された抗体を含む培養に不要な成分は、回収流路１５６を介して回収タンク１４０に収容される。回収タンク１４０に収容された抗体を含む培養に不要な成分は、回収流路１５７を介して、次工程である抗体の精製工程に送られる。

産生物製造装置２００は、新鮮な培地を培養容器１１０に供給するための培地供給流路１５８と、培地供給流路１５８の途中に設けられたポンプＰ４を有する。また、産生物製造装置２００においては、培養容器１１０内の細胞の濃度が過度に高くなることを防止するために、培養期間内における適切なタイミングで培養容器１１０内の細胞の一部（例えば１０％程度）を抜き取るセルブリード処理が行われる。セルブリード処理において、培養容器１１０内の細胞は、流路１５９を介して培養容器１１０の外部に排出される。また、産生物製造装置２００は、ポンプＰ１～Ｐ４、バルブＱ１～Ｑ４を制御する図示しない制御部を有している。以下に、産生物製造装置２００の動作について説明する。

産生物製造装置２００において、第１のフィルタ部１２０及び第２のフィルタ部１３０において膜分離処理を行う場合、ポンプＰ１及びＰ２が駆動状態とされ、ポンプＰ３が停止状態とされる。また、バルブＱ１、Ｑ２及びＱ３が開状態に制御され、バルブＱ４が閉状態に制御される。

ポンプＰ１が駆動されることで、培養容器１１０内に収容されている細胞懸濁液が、第１のフィルタ部１２０の供給側１２２に送られる。培養容器１１０から抜き出された細胞懸濁液は、第１のフィルタ膜１２４により、タンジェンシャルフロー方式による膜分離処理が施される。第１のフィルタ膜１２４によって阻止された細胞は、流路１５２を介して培養容器１１０内に戻される。一方、抗体を含む培養に不要な成分は、第１のフィルタ膜１２４を透過する。

第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液は、流路１５３を介して第２のフィルタ部１３０の供給側１３２に送られる。第１のフィルタ膜１２４を透過した透過液は、第２のフィルタ膜１３４により、デッドエンド方式による膜分離処理が施される。第２のフィルタ膜１３４によって阻止された抗体を含む細胞培養に不要な成分は、第２のフィルタ膜１３４の膜面または第２のフィルタ部１３０の供給側１３２に残留する。一方、第２のフィルタ膜１３４を透過した、抗体等の細胞培養に不要な成分が除去された清浄な培地は、流路１５４を介して培養容器１１０に戻される。

一方、産生物製造装置２００において、逆洗処理を行う場合、ポンプＰ３が駆動状態とされ、ポンプＰ１及びＰ２が停止状態とされる。また、バルブＱ４が開状態に制御され、バルブＱ１、Ｑ２及びＱ３が閉状態に制御される。

ポンプＰ３が駆動されることで、通常の膜分離処理の際に発生する液流とは逆向きの、第２のフィルタ部１３０の透過側から供給側に向かう液流が発生し、これにより、第２のフィルタ膜１３４の逆洗処理が行われる。第２のフィルタ膜１３４に対して逆洗処理を行うことで、第２のフィルタ膜１３４の膜面及び第２のフィルタ部１３０の供給側１３２に残留する抗体を含む細胞培養に不要な成分が第２のフィルタ部１３０の流入口１３０ａから排出される。逆洗処理によって第２のフィルタ部１３０から排出された抗体を含む細胞培養に不要な成分は、回収流路１５６を介して回収タンク１４０に収容される。回収タンク１４０に収容された抗体を含む培養に不要な成分は、回収流路１５７を介して、次工程である抗体の精製工程に送られる。培養期間中、ポンプＰ３は、間欠的に駆動され、逆洗処理が間欠的に実施される。従って、抗体を含む細胞培養に不要な成分の回収流路１５６への送液は、間欠的に行われる。本実施形態に係る産生物製造装置２００においては、培養期間中、膜分離処理と逆洗処理とが交互に繰り返し実施される。

ポンプＰ２は、膜分離処理及び逆洗処理が行われている間、連続的または所定のタイミングで駆動され、回収流路１５６を介して回収タンク１４０に送られた培地の分量と略同じ分量の新鮮な培地が、培地供給流路１５８を介して培養容器１１０に供給される。これにより、培養容器１１０内における培地の分量は、培養期間中、略一定に保たれる。

本実施形態に係る産生物製造装置２００が、上記のように動作することで、第１～第３の実施形態に係る製造方法によって製造された生体由来物（すなわち、生体活性物質が導入された生体由来物）を培養する工程と、培養された生体由来物によって産生される産生物を抽出する工程と、を含む産生物の製造方法が実現される。

本実施形態に係る産生物の製造方法によれば、生体由来物への生体活性物質の導入効率を高めることができるので、産生物の製造効率を高めることが可能となる。

［実施例］
細胞数を示す上で「Ｍ」は１００００００を意味するものとする。例えば、１Ｍは１００００００、０．１Ｍは、１０００００、１０Ｍは１０００００００を意味する。
生体由来物への生体活性物質の導入を以下の手順で行った。初めに、細胞濃度が０．５Ｍ ｃｅｌｌｓ/ｍＬとなるように、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）をExpi293 Expression Medium（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中にと播種した。この細胞懸濁液をＣＯ_２濃度が８％、雰囲気温度が３７℃のインキュベーター内に収容し、１２０ｒｐｍで攪拌しながら１日培養を行った。

翌日、細胞懸濁液の細胞濃度が１Ｍｃｅｌｌｓ/ｍＬになっていることを確認した後、２００×ｇ、５分間の遠心分離処理を行った。遠心分離処理後の細胞懸濁液の上澄みを除去し、新たなExpi293 Expression Medium（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）で再懸濁し、細胞濃度を３０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液に濃度が５μｇ／ｍＬとなるようにｐｍａｘＧＦＰ（Ｌｏｎｚａ社）を添加し、混合し、細胞－プラスミド混合液を得た。

細胞－プラスミド混合液を５０ｍＬシリンジに充填し、一対の電極対を備えた流路に流速８ｍＬ／ｍｉｎで９ｍＬ送液した。細胞－プラスミド混合液が流路内に滞留する１５０ｍｓの期間内において、電極対に１３０Ｖ、５ｍｓの電圧パルスを印加した。すなわち、流路を通過する全ての細胞に対して５ｍｓに亘り電圧が印加され、１４５ｍｓが休止期間となる。流路を通過した細胞－プラスミド混合液を回収瓶に回収した。回収瓶に回収した９ｍＬの細胞－プラスミド混合液のうち、６ｍＬを回収し、残りの３ｍＬをサンプル１とした。サンプル１は電圧印加が１回のみであるので開示の技術を適用しない比較例となる。

回収した６ｍＬの細胞－プラスミド混合液のうち３ｍＬを、上記の流路に流速８ｍＬ／ｍｉｎで再び送液した。細胞－プラスミド混合液が流路内に滞留する１５０ｍｓの期間内において、電極対に２０Ｖ、７５ｍｓの電圧パルスを印加した。すなわち、流路を通過する全ての細胞に対して７５ｍｓに亘り電圧が印加され、７５ｍｓが休止期間となる。流路を通過した細胞－プラスミド混合液を回収瓶に回収した。この回収した細胞－プラスミド混合液をサンプル２とした。すなわち、サンプル２は、１３０Ｖ、５ｍｓの電圧パルスによる１回目の電圧印加が行われた後、２０Ｖ、７５ｍｓの電圧パルスによる２回目の電圧印加が行われたものである。このとき、１回目のパルス及び２回目のパルスの印加時における電極間距離は１ｍｍであった。Ｔ１／Ｔ２＝１／１５であり、Ｅ２/Ｅ１＝１/６．５、 Ｔ１/Ｔ０＝１/２４０００、せん断速度４００[ｓ^－１］、Ｌ１/Ｌ２＝１である。

サンプル１を除く６ｍＬの細胞－プラスミド混合液のうち残りの３ｍＬを、上記の流路に流速８ｍＬ／ｍｉｎで再び送液した。細胞－プラスミド混合液が流路内に滞留する１５０ｍｓの期間内において、電極対に４０Ｖ、７５ｍｓの電圧パルスを印加した。すなわち、流路を通過する全ての細胞に対して７５ｍｓに亘り電圧が印加され、７５ｍｓが休止期間となる。流路を通過した細胞－プラスミド混合液を回収瓶に回収した。この回収した細胞－プラスミド混合液をサンプル３とした。すなわち、サンプル３は、１３０Ｖ、５ｍｓの電圧パルスによる１回目の電圧印加が行われた後、４０Ｖ、７５ｍｓの電圧パルスによる２回目の電圧印加が行われたものである。Ｔ１／Ｔ２＝１／１５であり、Ｅ２/Ｅ１＝１/３．２５、Ｔ１/Ｔ０＝１/２４０００、せん断速度４００ ［ｓ^－１］、 Ｌ１/Ｌ２＝１である。

下記の表１は、サンプル１～３について、印加された電圧パルス及び総エネルギーをまとめたものである。総エネルギーは（２）式を用いて算出した。（２）式におけるＶ１及びＴ１として、１回目の送液における印加電圧及びパルス幅をそれぞれ適用した。（２）式におけるＶ２及びＴ２として、２回目の送液における印加電圧及びパルス幅をそれぞれ適用した。（２）式におけるＩ１及びＩ２は、印加電圧を電極間の抵抗値（８３Ω）で除算することで算出した。電極間の抵抗値を以下の手順で事前に取得した。ＨＥＫ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）の懸濁液を５０ｍＬシリンジに充填し、上記の流路に流速８ｍＬ／ｍｉｎで送液し、上記の流路を細胞懸濁液で満たした。その後、流路に設けられた電極間の抵抗値を測定した。抵抗値は８３Ωであった。なお、電極間距離は１ｍｍである。

別々の回収瓶に回収したサンプル１～３を１０分間静置した後、２００×ｇ、５分間の遠心分離処理を行った。遠心分離処理後の各サンプルの上澄みを除去し、新たなＥｘｐｉ２９３培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）で再懸濁した。

細胞濃度が１Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ウェルプレートに収容された予め温めておいた２ｍＬのExpi293 Expression Medium（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）に各サンプルを滴下した。各サンプルをＣＯ_２濃度が８％、雰囲気温度が３７℃のインキュベーター内に収容し、２４時間静置培養した。

各サンプルの遺伝子導入効率（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｒａｔｅ）をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン）を用いて取得し、生細胞率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をＶｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ（ベックマン・コールター）を用いて取得した。図１０は、サンプル１～３について取得した遺伝子導入効率及び生細胞率を示すグラフである。図１０に示すように、電圧パルスの印加回数が２回であるサンプル２、３においては、電圧パルスの印加回数が１回であるサンプル１と比較して、遺伝子導入効率及び生細胞率が向上した。更に、サンプル２はサンプル３と比較して、細胞生存率が高かった。また、サンプル３はサンプル２と比較して、遺伝子導入効率が高かった。具体的には、導入効率は、サンプル１は平均８．６４％、サンプル２は１２．３６％、サンプル３は１４．５１％であった。生細胞率は、サンプル１は平均８２．０３％、サンプル２は平均９２．７３％、サンプル３は８５．９７％であった。

なお、２０１９年７月１２日に出願された日本国特許出願２０１９－１３０７１２の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (12)

1. 生体活性物質が導入された生体由来物の製造方法であって、
   前記生体活性物質の導入前の生体由来物と、前記生体活性物質とを含む懸濁液が、第１の電界強度を有する第１の電界領域を通過する工程と、
   前記懸濁液が、前記第１の電界領域を通過した後に、前記第１の電界強度よりも低い第２の電界強度を有する第２の電界領域を通過する工程と、を含み、
   前記生体由来物がヒト由来細胞であり、
   前記懸濁液が前記第１の電界領域を通過する第１の期間は、前記懸濁液が前記第２の電界領域を通過する第２の期間よりも短く、
   前記生体活性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質のいずれかである
   製造方法。
2. 前記第１の期間Ｔ１と前記第２の期間Ｔ２との比Ｔ１／Ｔ２が１／１０００以上１未満である
   請求項１に記載の製造方法。
3. 前記第２の電界強度Ｅ２と前記第１の電界強度Ｅ１との比Ｅ２／Ｅ１が１／１０００以上１未満である
   請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
4. 前記生体活性物質及び前記生体由来物を含む懸濁液が、前記第１の電界領域を通過した後であり且つ前記第２の電界領域を通過する前に、無電界領域を通過する
   請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 前記懸濁液が前記第１の電界領域を通過する第１の期間Ｔ１と、前記懸濁液が前記無電界領域を通過する第３の期間Ｔ０との比Ｔ１／Ｔ０が、１／２５０００以上１未満である
   請求項４に記載の製造方法。
6. 前記生体活性物質を含む懸濁液及び前記生体活性物質の導入前の生体由来物を含む懸濁液が、互いに異なる流路を流れ、それぞれの流路の合流点において混合された後、前記第
   １の電界領域及び前記第２の電界領域を通過する
   請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 前記懸濁液は、流路内を流通することにより前記第１の電界領域及び前記第２の電界領域を通過し、
   前記流路の、前記懸濁液の流通方向と直交する断面の面積をＳ［ｍ^２］、前記流路の前記断面の周長をＣ［ｍ］、前記懸濁液が前記第１の電界領域及び前記第２の電界領域を通過する平均速度をｕ［ｍ／ｓ］としたとき、下記の（１）式によって定義されるせん断速度Ｄ［ｓ^－１］が、１［ｓ^－１］以上５０００［ｓ^－１］以下である
   請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の製造方法。
   Ｄ＝２ｕ・Ｃ／Ｓ ・・・（１）
8. 前記懸濁液が、前記第１の電界領域及び前記第２の電界領域とは別の少なくとも１つの電界領域を通過する工程を更に含む
   請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 前記生体活性物質がＤＮＡである
   請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の製造方法によって生体由来物を製造する工程と、
    製造された前記生体由来物を培養する工程と、
    前記生体由来物によって産生される産生物を抽出する工程と、
    を含む産生物の製造方法。
11. 前記産生物がウイルスである
    請求項１０に記載の製造方法。
12. 前記生体由来物はＨＥＫ２９３細胞である
    請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法。