JP7439270B2 - 遺伝子導入による眼色の変更 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９６２，０６３号、および２０２１年１月１５日に出願された米国仮特許出願第１７／１５０，９９９（これらの出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に基づく優先権を主張している。
分野

本技術は、一般に、眼科学に関する。

背景
自分の眼色を変えたい人々が存在する。カラーコンタクトレンズおよび虹彩上にインプラントされる着色したディスクが、この目的で使用されている。

要旨
本技術は、例えば、下記の種々の態様によって例証される。本技術の態様の種々の例は、便宜上、番号を付与した条項（１、２、３など）として記載されている。これらは、例として提供されており、本技術を限定するものではない。任意の従属する条項は、任意の組み合わせで組み合わされ得、かつ、それぞれの独立する条項中に置かれるか、または他の独立する条項中に置かれ得る。他の条項は、同様のやり方で示され得る。
１．１ 対象の虹彩の色を変更するための方法であって、
殺メラノサイト剤を、前記対象の眼の前眼房の中に導入すること；
それによって、メラノサイトの死を引き起こし、虹彩の色を変更すること
を含む、方法。
１．対象の虹彩の色を変更するための方法であって、
遺伝子ベクターを、対象の眼の前眼房内に導入することを含み；
ここで、前記遺伝子ベクターは、前記眼の虹彩のストローマにおけるメラノサイトの死を誘導し、それによって前記虹彩の色を変更することが可能である、方法。
２．前記導入することが、前記前眼房の外部から、前記眼の角膜における開口を通して、前眼房の中に行われる、条項１に記載の方法。
３．前記前眼房内の遺伝子ベクターを、前記ストローマにおけるメラノサイトの死を引き起こすのに十分な時間にわたって、前記虹彩と接触させること；および
前記十分な時間が経過した後、前記前眼房から、過剰量の前記遺伝子ベクターを取り除くことをさらに含む、条項１に記載の方法。
４．前記遺伝子ベクターが、自殺遺伝子を含む、条項１に記載の方法。
５．前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子である、条項４に記載の方法。
６．前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子である、条項４に記載の方法。
７．前記遺伝子ベクターが、前記自殺遺伝子の発現を制御するプロモーターをさらに含む、条項４～６のいずれかに記載の方法。
８．前記プロモーターが、メラノサイト特異的遺伝子プロモーターであり、必要に応じて、前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターが、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターである、条項７に記載の方法。
９．前記遺伝子ベクターが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子とチロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターを含む、条項４に記載の方法。
１０．前記自殺遺伝子と前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターが、１つのプラスミド上に保持されている、条項７～９のいずれかに記載の方法。
１１．前記自殺遺伝子と前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターが、ウイルスベクターによって運搬され、ここで、前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択される、条項７～９のいずれかに記載の方法。
１２．前記自殺遺伝子と前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターが、アデノ随伴ウイルスベクターによって運搬される、条項７～９のいずれかに記載の方法。
１３．前記アデノ随伴ウイルスベクターが、ｒＡＡＶ１カプシドまたはｒＡＡＶ６カプシドを含む、条項１２に記載の方法。
１４．ヌクレオシドアナログを前記対象に投与することをさらに含む、条項４に記載の方法。
１５．前記ヌクレオシドアナログが、ガンシクロビル、アシクロビル、およびバルガンシクロビルからなる群から選択される、条項１４に記載の方法。
１６．対象の虹彩の色を変更するための方法であって、虹彩の前面を、メラノサイトを死滅させる物質と接触させ、それによって前記虹彩の色を変更することを含む、方法。
１７．前記物質が、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターの制御下にある単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を保持するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、条項１６に記載の方法。
１８．対象の虹彩の色を変更するための組成物であって、
メラノサイトにおける自殺遺伝子の発現を誘導するメラノサイト特異的遺伝子プロモーターの制御下にある自殺遺伝子を含む遺伝子ベクターを含む滅菌点眼調製物を含む、組成物。
１９．前記遺伝子ベクターが、アデノ随伴ウイルスを含む、条項１８に記載の組成物。
２０．前記調製物が、粉末形態であり、かつ流体で再構成して滅菌点眼液または懸濁液を形成することが可能である、条項１８または１９に記載の組成物。
２１．（ｉ）人の虹彩と接触させるように構成された生体適合性の物体、および（ｉｉ）条項１８～２０のいずれか１条項に記載の組成物を含む、生物学的薬剤を送達するためのデバイス。
２２．前記生体適合性の物体が、ディスク、ストリップ、または綿撒糸を含む、条項２１のデバイス。
２３．前記自殺遺伝子が、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターの制御下にある単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子である、条項１８～２０のいずれかに記載の組成物。
２４．対象の眼の角膜における切り込みを通して挿入可能であり、かつ前記眼の虹彩の前面に位置させることが可能なフレキシブルなディスク；
ここで、前記ディスクは、それを貫通する瞳孔の開口を有し、前記開口が、前記ディスクを前記虹彩の前面に位置させた場合に、前記眼の瞳孔に位置させることが可能であり、それによって、房水を、前記瞳孔の開口を通して、前記眼の瞳孔から流出することを可能にする；
前記ディスクの後面に配置される送達材料（前記材料は、前記虹彩の前面に接触し、遺伝子ベクターを前記虹彩のストローマ内に放出するように構成されている）；および
前記遺伝子ベクター
を含む、生物学的薬剤を虹彩の前面に送達するためのデバイス。
２５．前記送達材料が、ヒドロゲルを含む、条項２４に記載のデバイス。
２６．前記遺伝子ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、条項２４または２５に記載のデバイス。
２７．前記遺伝子ベクターが、（ａ）自殺遺伝子、および（ｂ）前記自殺遺伝子の発現を制御するメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを含む、条項２４～２６のいずれかに記載のデバイス。
２８．前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子であり、前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターがチロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターである、条項２７に記載のデバイス。
２９．前記ディスクの後面から後方方向に突出し、前記瞳孔の開口に隣接して配置された中央の突出部；
ここで、前記中央の突出部は、前記ディスクが前記虹彩の前面に位置する場合、前記対象の房水が前記瞳孔の開口を通して前記眼の瞳孔から流出する間、前記虹彩の瞳孔周囲領域に接触するように構成されている、
をさらに含む、条項２４～２８のいずれかに記載のデバイス。
３０．前記中央の突出部が、前記瞳孔の開口の周囲に、円周方向に突出している、条項２９に記載のデバイス。
３１．前記ディスクの後面から後方方向に突出し、前記ディスクの周辺に隣接して配置された周辺の突出部；
ここで、前記周辺の突出部は、前記ディスクが前記虹彩の前面に位置する場合、前記対象の房水が前記瞳孔の開口を通して前記眼の瞳孔から流出する間、前記虹彩の周辺に接触するように構成されている、
をさらに含む、条項２４～２８のいずれかに記載のデバイス。
３２．前記周辺の突出部が、前記ディスクの周辺の周囲を取り囲むように突出している、条項３１に記載のデバイス。
３３．前記ディスクの後面から後方方向に突出し、前記ディスクの周辺に隣接して配置された周辺の突出部；
ここで、前記周辺の突出部は、前記ディスクが前記虹彩の前面に位置する場合、前記対象の房水が前記瞳孔の開口を通して前記眼の瞳孔から流出する間、前記虹彩の周辺に接触するように構成されている、
をさらに含む、条項２９に記載のデバイス。
３４．前記周辺の突出部が、前記ディスクの周辺の周囲を取り囲むように突出している、条項３１に記載のデバイス。
３５．前記ディスクが折りたたみ可能であり、前記ディスクの最大径よりも狭い角膜切開を通して、前記対象の眼の前眼房内への挿入を可能にする、条項２４～３４のいずれかに記載のデバイス。
３６．外科医が前記ディスクを角膜切開を通して挿入するとき、前記ディスクを前記対象の前眼房内に運ぶように構成されている道具をさらに含む、条項２４～３５のいずれかに記載のデバイス。
３７．ＡＡＶ１またはＡＡＶ６カプシド、およびメラノサイトにおける自殺遺伝子の発現を誘導するプロモーターの制御下にある自殺遺伝子を含むコンストラクトを有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
３８．前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子である、条項３７に記載のＡＡＶ。
３９．前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）自殺遺伝子である、条項３７に記載のＡＡＶ。
４０．前記プロモーターが、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターである、条項３７～３９のいずれか１条項に記載のＡＡＶ。
４１．賦形剤中に、条項３７～４０のいずれか１条項に記載のＡＡＶを含む、医薬組成物。
４２．条項３７～４０のいずれか１条項に記載のＡＡＶまたは請求条項４１の医薬組成物、およびヌクレオシドアナログを含む、眼色を変更するためのキット。
４３．前記ヌクレオシドアナログが、ガンシクロビル、アシクロビル、およびバルガンシクロビルからなる群から選択される、条項４２に記載のキット。
４４．前記ＡＡＶまたは前記医薬組成物を、ヒト対象のメラノサイト内に送達するためのデバイスをさらに含む、条項４１～４３のいずれか１条項に記載のキット。

一態様において、本開示は、（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）前記自殺遺伝子に作動可能に連結されているメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを保持する遺伝子ベクターを含む滅菌点眼調製物を含む、対象の虹彩の色を変更するための組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、前記遺伝子ベクターはプラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスを含む。

いくつかの実施形態において、前記調製物は、粉末形態であり、かつ流体で再構成して滅菌点眼液または懸濁液を形成することが可能である。いくつかの実施形態において、前記組成物は、前記調製物に接触するように構成され、かつ人の虹彩に接触して配置されるような大きさに作られた生体適合性の物体をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記生体適合性の物体は、ディスク、ストリップ、または綿撒糸を含む。

いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子は、（ｉ）単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子；（ｉｉｉ）ニトロレダクターゼ遺伝子；および（ｉｖ）カルボキシペプチダーゼＧ２遺伝子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターは、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含み、前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターは、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターを含む。

別の態様において、本開示は、殺メラノサイト剤を、対象の眼の前眼房の中に導入すること；ここで、前記薬剤は、前記眼の虹彩のストローマにおけるメラノサイトのアポトーシス死を引き起こす；それによって、前記虹彩の色を変更することを含む、対象の虹彩の色を変更するための方法を提供する。

さらに別の態様において、本開示は、遺伝子ベクターを、対象の眼の前眼房の中に導入することを含み；ここで、前記遺伝子ベクターの導入が、前記眼の虹彩のストローマにおけるメラノサイトの死を引き起こし、それによって前記虹彩の色を変更する、対象の虹彩の色を変更するための方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記導入するステップは、前記前眼房の外部から、前記眼の角膜における開口を通して、前記前眼房の中に行われる。

いくつかの実施形態において、前記遺伝子ベクターは、自殺遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子は、（ｉ）単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子；（ｉｉｉ）ニトロレダクターゼ遺伝子；および（ｉｖ）カルボキシペプチダーゼＧ２遺伝子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子ベクターは、ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）自殺遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子ベクターは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子は、メラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子は、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のためのメラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子は、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のためのメラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む。

いくつかの実施形態において、遺伝子ベクタープラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスを含む。いくつかの実施形態において、前記組換えアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６カプシドタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ヌクレオシドアナログを前記対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記導入の間、前記対象の眼の前記瞳孔の縮瞳を維持することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオシドアナログは、ガンシクロビル、アシクロビル、またはバルガンシクロビルである。

一態様において、本開示は、虹彩の前面を、メラノサイトを死滅させる物質と接触させ、それによって前記虹彩の色を変更することを含む、対象の虹彩の色を変更するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記物質は、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のための遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む。

一態様において、本開示は、対象の虹彩の色を変更するための遺伝子ベクターの使用を提供し、ここで、前記遺伝子ベクターは、（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）前記自殺遺伝子に作動可能に連結されているメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを含む。

別の態様において、本開示は、対象の虹彩の色の変更に使用するための遺伝子ベクターを提供し、ここで、前記遺伝子ベクターは、（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）前記自殺遺伝子に作動可能に連結されているメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを含む。

さらに別の態様において、本開示は、眼に投与された場合に虹彩におけるメラノサイトの死を誘導することができる核酸を保持する遺伝子ベクターを含む滅菌点眼調製物を含む、対象の虹彩の色を変更するための組成物を提供する。

本技術のさらなる特徴および利点は、下記の説明に記載されているし、部分的にはその説明から明らかであるか、または本技術を実施することによって理解され得る。本技術の利点は、明細書およびその特許請求の範囲、ならびに添付の図面においして具体的に指摘されている構造によって具体化および達成される。

以上の一般的な説明と、以下の詳細な説明のどちらも、例示的および説明的であり、特許請求されている本技術のさらなる説明を提供することが意図されていることを理解すべきである。

図１Ａ～１Ｄは、遺伝子ベクター送達ディスクの種々の実施形態を示す。

図１Ａは、遺伝子ベクター送達ディスクの側方斜視図である。

図１Ｂは、瞳孔および角膜縁ガードを有する遺伝子ベクター送達ディスクの断面図である。

図１Ｃは、瞳孔ガードを有する遺伝子ベクター送達ディスクの断面図である。

図１Ｄは、眼の虹彩に接触して置かれた遺伝子ベクター送達ディスクの断面図である。

図２は、ウサギの両目の虹彩の、スリットランプ拡大図である。

図３は、フォンタナ・マッソン染色を使用した、両方の虹彩の組織学的凍結切片を示す。

図４Ａは、実施例２に記載されているように処置した、注射した日（第０日）における、ウサギのＯＤ（注射した眼）およびＯＳ（ＡＡＶ６注射をしていない対象眼）の写真である。 図４Ａは、実施例２に記載されているように処置した、注射した日（第０日）における、ウサギのＯＤ（注射した眼）およびＯＳ（ＡＡＶ６注射をしていない対象眼）の写真である。

図４Ｂは、実施例２に記載されているように処置した、注射３５日後（第３５日）の、ウサギのＯＤ（注射した眼）およびＯＳ（ＡＡＶ６注射をしていない対象眼）の写真である。 図４Ｂは、実施例２に記載されているように処置した、注射３５日後（第３５日）の、ウサギのＯＤ（注射した眼）およびＯＳ（ＡＡＶ６注射をしていない対象眼）の写真である。

詳細な説明
以下の詳細な説明において、本技術の十分な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が説明されている。しかしながら、当業者には、本技術が、これらの具体的な詳細のいくつかを欠いても実施され得ることが明らかであろう。他の例において、本技術が不明瞭にならないように、よく知られている構造および技術は、詳細に示されていない。

「態様」などの語句は、そのような態様が本技術に必須であること、またはそのような態様が本技術の全ての構成にあてはまることを意味するものではない。ある態様に関連する開示は、全ての構成、または１つもしくはそれを超える態様にはあてはまらないことがあり得る。ある態様は、本開示の１つまたはそれを超える例を提供し得る。「態様（ａｎ ａｓｐｅｃｔ）」などの語句は、１つまたはそれを超える態様（ａｓｐｅｃｔｓ）を指し得、その逆も同様である。「実施形態」などの語句は、そのような実施形態が本技術に必須であること、またはそのような実施形態が本技術の全ての構成にあてはまることを意味するものではない。ある実施形態に関連する開示は、全ての実施形態、または１つもしくはそれを超える実施形態にはあてはまらないことがあり得る。ある実施形態は、本開示の１つまたはそれを超える例を提供し得る。「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」などの語句は、１つまたはそれを超える実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）を指し得、その逆も同様である。「構成」などの語句は、そのような構成が本技術に必須であること、またはそのような構成が本技術の全ての構成にあてはまることを意味するものではない。ある構成に関連する開示は、全ての構成、または１つもしくはそれを超える構成にはあてはまらないことがあり得る。ある構成は、本開示の１つまたはそれを超える例を提供し得る。「構成（ａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）」などの語句は、１つまたはそれを超える構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ）を指し得、その逆も同様である。法律で許される範囲で、本開示（図面と文字を含む）の内容は、米国著作権法（著作権２０１９）によって保護される。

眼色の変更

虹彩の色は、美的な属性として、重要な社会的機能を果たす。虹彩の色のある種の変更は、カラーコンタクトレンズを使用することによって可能になった。これらのレンズは、所定の屈折力を有し得、または美容的機能のみをもたらし得る。

美容目的のカラーコンタクトレンズに関連するいくつかの不利益が存在する。このレンズは、所定の屈折力を有するコンタクトレンズと同じ使用上の潜在的な問題（レンズ材料に対するアレルギー反応、および不適切な取扱いによる感染を含む）を有する。さらに、コンタクトレンズは、潜在的ユーザーの中には、不快感ゆえに、受け入れることができない者が存在する。その上、カラーコンタクトレンズは、挿入および除去するために、全ての潜在的ユーザーが有するわけではない、ある程度の器用さが要求される。さらに、虹彩の色の永続的な変更は、カラーコンタクトレンズの使用によって実現することはできない。なおその上に、カラーコンタクトレンズは、自然に見える、美容的に許容され得る効果をもたらすことができないことが多い。自然なブラウンの虹彩は不透明であるのに対し、自然なブルー、グレー、バイオレット、およびグリーンの虹彩は不透明ではない。しかしながら、ブルーまたはグリーンのコンタクトレンズをブラウンの虹彩の上に置いた場合、不透明なブルーまたは／およびグリーンの虹彩が生じる。この状態は自然には存在しないため、その虹彩は、作り物に見え、美容的に魅力的ではない。

虹彩の色を変えるための他の方法は、虹彩の前面に移植した着色したディスク、または虹彩内に注入した色素の使用を含む。これらの侵襲的な眼科的手順および眼の中に異物を置いておくことの潜在的な問題のために、およびこれらの介入後の虹彩の不自然に不透明な外観のために、カラー虹彩インプラントの移植、および虹彩内への色素の挿入は、幅広く採用されてはいない。

虹彩の色を変えるためのさらに別の方法は、眼にレーザーエネルギーを印加することであり、これによって、虹彩の前面から着色した組織の一部が除去される。この方法に伴う潜在的な問題は、過剰な熱伝達による虹彩の瘢痕、眼色に寄与する虹彩タンパク質および虹彩の微細構造（例えば、ストローマクリプトおよび溝）の破壊、および眼の線維柱帯（前眼房から房水を排出し、正常な眼内圧を維持するために重要である）を詰まらせる除去した虹彩フラグメントによる術後緑内障を含む。さらに、レーザー光は、レーザーのエネルギーが眼の後面に伝達され、網膜または視神経を損傷するリスクのため、瞳孔の近くに安全に照射することが潜在的に難しい。

よって、カラーコンタクトレンズ、眼内レンズ、虹彩内への色素沈着、または虹彩のレーザー照射を必要としない、安全かつ永続的なヒトの虹彩色の変更方法の必要性が残っている。

虹彩および色

虹彩は、５つの細胞層、すなわち前境界層、ストローマ、散大および括約筋 線維、ならびに後極部色素上皮からなり、これらのうちで眼色の外観のために最も重要なのは、前層と、その下にあるストローマである。眼形成の発生学的研究によって、虹彩の２つの着色した層は、異なる起源に由来することが実証された。後層は、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）として知られており、密接に融合した立方色素細胞の二重層からなる。これらは神経外胚葉起源であり、眼杯の前端から生じる。ＩＰＥとは対照的に、ストローマメラノサイトは、神経冠における、真皮メラノサイトと発生学的起源が同じであり、発生の間に、ぶどう膜路を通って移動する。ＩＰＥは、全ての眼色における虹彩の検査において、白皮症の人の場合を除き、常に着色しており、眼色の印象に対する寄与は小さい。上に横たわるストローマが薄い場合、この層は、パターン形成にいくらかの影響を及ぼし得る。例えば、濃色のＩＰＥは、ストローマが非常に薄い眼において、透過する光を吸収し得、それによって、ストローマのより深い細胞層の白色コラーゲン線維に対して、グレーの色彩が与えられるであろう。

ＩＰＥは、瞳孔を通って入射し得るだけであり、反射して後方から射出され得ない過剰な光を吸収することによって、網膜を保護する役割を果たし得る。ストローマ－ＩＰＥジャンクションにおける非着色平滑筋分化組織は、虹彩散大筋として機能する。虹彩における上側の２つの細胞層は、虹彩の主要な構成要素にあたる。外側の前境界層は、特に、着色しておらず、変化したストローマ細胞（すなわち、線維芽細胞、メラノサイト、および放射状に配向したコラーゲン線維の密集した集まり）からなる場合、極めて薄い。

下にあるストローマは、線維芽細胞、メラノサイト、コラーゲン原線維タンパク質（タイプＩ、ＩＩＩ；ＶＩおよびＸＶＩＩＩ）、グリコサミノグリカン、および免疫細胞（マクロファージおよびマスト細胞など）でできた、緩い結合組織からなる。ストローマメラノサイトの樹状突起は、一般に、虹彩表面に対して並行に配向しており、前境界層にクラスターを形成する傾向を有し、眼色にかかわらず、虹彩ストローマ細胞のおよそ６６％にあたることが示されている。

より明るい虹彩色の存在が一般的に見られるのは、他の集団においても散発的に報告されてはいるが、ほとんど独占的に、ヨーロッパ人、およびヨーロッパ系混血の個体においてである。メラノサイトの数は、異なる眼色の間で異なるとは思われないが、メラノサイトの総数は、アフリカ系またはヨーロッパ系の系統と比較して、虹彩面積がより小さいか、またはメラノサイト密度がわずかに低いため、アジア人の虹彩においてより少ないであろうと報告されている。虹彩ストローマメラノサイトの超微細構造的研究によって、知覚される眼色の相異は、メラニン色素が細胞内にパッケージングされているメラノソーム粒子の量および質の違いによるものであることが明らかになっている。

眼色に影響するメラニン色素には２種類あり、それらは、ユーメラニン（黒みがかったブラウンを有する）と、フェオメラニン／リポクローム（赤みがかった黄色を有する）である。白皮症の個体（皮膚もしくは眼の色素がわずかであるか、または色素がない）を除き、誰もが虹彩の後ろ側にユーメラニンを有する。虹彩の前面のメラニンの種類および量が、種々の色の反射光による眼色に重要である。

メラニンが持続的に産生および分泌される皮膚や毛髪とは異なり、虹彩においては、メラノソームは保持され、かつ虹彩ストローマ内のメラノサイトの細胞質に集まる。眼色間のメラニンの質もまた、化学的に研究されており、ブルーの虹彩が有する色素は最小であるのに対し、他の眼色において、ユーメラニン形態およびフェオメラニン形態が検出されることが報告されている。注目すべきことに、メラニンの質と量もまた、虹彩の色と相関があり、ユーメラニン：フェオメラニン比は、より暗い眼について大幅に大きいのに対し、より明るい眼は、フェオメラニンの量がわずかに多いことが示されている。よって、メラニン色素量、パッケージング、および質は、全て変動し、眼の濃淡のスペクトルを生じさせる。

研究によって、メラノサイトの数、虹彩ストローマにおける全ての細胞（線維芽細胞を含む）の中のメラノサイトの割合、および虹彩ストローマ細胞充実性は、虹彩の色に寄与する主要な因子ではない。

むしろ、虹彩の色の相異は、核周辺細胞質領域（ＡＭＡＣ）あたりの平均メラノソーム領域の変動、および表層虹彩メラノサイト内の核周辺領域（ＡＭＮＣ）あたりの平均メラノソーム数に、少なくとも部分的に起因し得る。この結果は、一様にブルーの眼と、他の全ての色のグループとの間の大きな違いを反映している。具体的には、一様なブルー、一様なヘーゼル、一様なブラウン、またはより暗い瞳孔周囲環を示すいずれかに分類されるオートプシー眼の間で、核周辺細胞質領域内のみ、または表層ストローマメラノサイトの核周辺および周辺細胞質領域内を合わせた成熟メラノソームの電子顕微鏡イメージ、およびコンピューター処理したイメージ解析、面積、数、およびサイズを測定し、上記の発見に至った。

眼色の遺伝学

虹彩内のメラニンの存在は、ヒトの眼の色合いのために重要であり、同時に、虹彩組織（フックス窩、母斑、Ｗｏｌｆｆｌｉｎ結節、および収縮溝を含む）における複雑な構造も明らかである。ブルー－ブラウンの眼色の分離は、単純なメンデルの優勢劣勢遺伝子モデルを使用して説明されてきたが、現代の分子生物学的な見方は、このプロセスの生物学的複雑性を、ポリジーン形質として考慮に入れている。ヒトの眼色の相異のおよそ７４％は、ＯＣＡ２遺伝子を含む１５番染色体の１インターバルによって説明されると考えられている。この領域の微細マッピングによって、このブルーブラウンの眼色に関連するほぼ全てを説明する上流のＨＥＲＣ２のイントロン８６内に、一塩基置換ｒｓ１２９１３８３２Ｔ／Ｃが同定されている。このＳＮＰ（ＳＷＩ／ＳＮＦファミリーメンバーＨＬＴＦの標的部位を提供する）は、クロマチンリモデリングによるＯＣＡ２遺伝子活性化に必要とされる、進化的に高度に保存された調節エレメントの一部として機能する。虹彩パターンに影響を与え得る主要な候補遺伝子としては、ＭＩＴＦおよびＰＡＸ６もあげられる。

メラノサイトを死滅させるための自殺遺伝子の導入

本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」は、典型的には、アポトーシス（すなわち、プログラム化された細胞死）によって、または任意の他の細胞傷害メカニズムによって、細胞が自分自身を殺す結果を引き起こすタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。これらの遺伝子の活性化は、多くのプロセスに起因し得るが、アポトーシスを誘発する主要な細胞の「スイッチ」は、ｐ５３タンパク質である。自殺遺伝子は、非毒性のプロドラッグ基質を、毒性の薬物にトランスフォームさせ得る酵素をコードするため、プロドラッグトランスフォーミング遺伝子とも呼ばれる。例えば、非毒性の５Ｆ－シトシン（５Ｆｃ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）によって、癌毒性５Ｆ－ウラシル（５Ｆｕ）にトランスフォームされ得る。

細胞を殺すための不活性化された薬物を用いる自殺遺伝子治療は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ治療（ＧＤＥＰＴ）または遺伝子プロドラッグ活性化治療（ＧＰＡＴ）と呼ばれる。

ＧＤＥＰＴは、腫瘍に送達される異種タンパク質をコードする遺伝子を利用し、その後、プロドラッグを投与し、それが腫瘍内で発現されている細胞傷害性薬剤を活性化する。最も有望な自殺遺伝子／プロドラッグ（例えば、ヌクレオシドアナログ）コンビネーションの３つは、（１）単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）とガンシクロビル（ＧＣＶ）、（２）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）と５－フルオロシチジン（ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｄｉｎｅ）（５－ＦＣ）、および（３）細菌ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）と５－（アジリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）－１－イル）－２，４－ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）である。

ＧＤＥＰＴの別の例は、ＣＰＧ２－ＣＭＤＡ系、すなわち細菌酵素カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）に基づく自殺遺伝子治療である。ＣＰＧ２は、よく研究された自殺遺伝子であるＨＳＶ－ＴＫおよびＣＤに対して、分裂している細胞だけでなく、静止状態の細胞を殺すことができるプロドラッグを活性化するという点で利点を有する。ＣＰＧ２は、プロドラッグであるＣＭＤＡを、細胞傷害性薬剤が直接放出されるように切断し、薬剤の活性化のためにさらなる酵素的処理を必要としないという利点を有する。

ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）自殺遺伝子が、チロシナーゼプロモーター（Ｔｙｒ－ＨＳＶｔｋ）によってメラノサイトを転写的に標的化するプラスミドの皮内注射は、ヌクレオシドアナログプロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）が投与されると、最小限の炎症で、組織特異的なメラノサイトの死滅を引き起こす。Ｔｙｒ－ＨＳＶｔｋプラスミドとマウスヒートショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）遺伝子（ＣＭＶ－ｈｓｐ７０）を発現するプラスミドの複数回の経皮注射の組み合わせは、非常に炎症性の環境において、正常なメラノサイトの局所的な死滅を生じさせる。幸運なことに、メラノサイトの単純な死滅は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗メラノサイト／メラノーマＴ細胞応答の発生に対して非常に影響が小さく、自己免疫応答（白斑など）のリスクは低い。

ＤＮＡの注入は、毛包の毛球マトリックス内の色素産生メラノサイトに対する、標的化された発現を促進する。チロシナーゼ遺伝子の転写は、細胞が増殖し毛髪線維の形成が起きている場合、毛周期の成長期の間、毛球におけるメラニン形成細胞に特異的に起こる。チロシナーゼ遺伝子のプロモーターは、（例えば、メラノーマの処置のための）治療的な導入遺伝子のメラノサイト特異的およびメラノーマ特異的遺伝子発現を指示し得る。毛包は免疫特権（すなわち、免疫応答が制限または阻止されている）領域を構成する。この免疫特権の喪失は、病状、例えば、円形脱毛症（これは、パッチ状の毛髪脱落によって特徴付けられ、成長期における毛包に対する自己免疫応答によって引き起こされると考えられている）に関係し得る。

腫瘍細胞の免疫原性的に殺すことは、ｈｓｐ（これは、樹状細胞（ＤＣｓ）による自己抗原の免疫寛容原性的な提示を、免疫寛容の破壊に十分なほど高い免疫賦活性の提示に切り替える、効果的なスイッチとして機能し得る）の誘導に関連する。転写的に標的化された細胞傷害性遺伝子を送達するためのプラスミドＤＮＡ（ヒートショックタンパク質（ｈｓｐ）と一緒に）の皮内注射は、マウスにおいて、正常なメラノサイトのｉｎ ｖｉｖｏにおける直接的な炎症性の死滅を誘導するために使用され得る。プラスミドによるｈｓｐ投与と組み合わされた場合、通常細胞を高度に特異的に殺すことが、自己抗原に対する免疫寛容を破壊するために使用され得、確立した全身的に分散した腫瘍の拒絶をもたらす。しかしながら、抗自己Ｔ細胞応答もまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、おそらく正常細胞の病理学的死滅が起こる環境における自己免疫疾患の発生に対する保護として、速やかに抑制される。

Ｔｙｒ－ＨＳＶｔｋ ＤＮＡの皮内注射は、メラノサイトを標的にする。細胞傷害性遺伝子発現をメラノサイトに標的化するために、チロシナーゼプロモーター（Ｔｙｒ－ＨＳＶｔｋ）によって転写的に制御されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を保持するプラスミドまたは他のベクターが構築され得る。チロシナーゼプロモーター－ｌａｃＺプラスミドの注入は、メラノサイトが位置する毛幹の基部において特異的な発現をもたらす。チロシナーゼの発現は、メラノサイトに特異的であり、その発現の喪失は、メラノサイトの破壊の代替マーカーとして使用され得る。プロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）（または他の適切なヌクレオシドアナログ）が提供されると、ＨＳＶｔｋを発現している細胞は、ＧＣＶを毒性の三リン酸形態に変換し、それが、合成の間にＤＮＡ内に組み込まれた場合、細胞死をもたらす。チロシナーゼｍＲＮＡ量とジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）オキシダーゼ酵素活性は、両方とも、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）処置動物と比較して、ＧＣＶ－処置動物において、注射部位において一貫して減少し（ｐ＜０．０１）、これは、局所的な注射部位におけるメラノサイトの破壊を示す。

ヌクレオシドアナログ

本技術による投与のために有用であり得るヌクレオシドアナログとしては、以下のものがあげられる。

デオキシアデノシンアナログ：ジダノシン（ｄｄＩ）、ビダラビン

アデノシンアナログ：ＢＣＸ４４３０

デオキシシチジンアナログ：シタラビン、ゲムシタビン、エムトリシタビン、ラミブジン、ザルシタビン

グアノシンアナログおよびデオキシグアノシンアナログ：アバカビル、アシクロビル、エンテカビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル（プロドラッグであるグアノシンアナログ）

チミジンアナログおよびデオキシチミジンアナログ：スタブジン（ｄ４Ｔ）、テルビブジン、ジドブジン（アジドチミジン、またはＡＺＴ）

デオキシウリジンアナログ：イドクスウリジン、トリフルリジン。

ガンシクロビル

ガンシクロビル（９－［（１，３，－ジヒドロキシ－２－プロポキシ）メチル］グアニン、またはＤＨＰＧ）は、合成の、ヌクレオシドグアノシンの非環式プリンアナログである。構造的および薬理学的にアシクロビルに類似し、ヘルペスウイルスに対して活性である。この薬物は、プロドラッグであり、感染の間に、ウイルスキナーゼ（例えば、その１つはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子ＵＬ９７にコードされている）によって、細胞内でガンシクロビル５’－一リン酸に変換される。その後、細胞キナーゼ（これは、非感染細胞と比較して、ＣＭＶまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染細胞には１０倍高濃度で存在する）は、ガンシクロビル二リン酸とガンシクロビル三リン酸の形成を触媒する。アシクロビルと比較して、ガンシクロビルはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対する抗ウイルス活性が著しく増大し、ウイルスＤＮＡに対する選択性がより小さくなるように、構造的に異なる。

ガンシクロビル三リン酸は、デオキシグアノシン三リン酸のＤＮＡ内組み込みの競合的阻害剤であり、細胞ＤＮＡポリメラーゼよりも、ウイルスＤＮＡポリメラーゼを優先的に阻害する。さらに、ガンシクロビル三リン酸は、鎖伸長のための劣った基質として働き、それによって第２の経路によるウイルスＤＮＡ合成を途絶させる。

活性なリン酸化形態のガンシクロビルは、ウイルスＤＮＡ内へのデオキシグアノシンの組み込みと競合することで組み込み点においてＤＮＡ合成を停止させることにより、ＤＮＡ合成を妨害することによって、ＣＭＶおよび他のヒトヘルペスウイルスの複製を阻害する。ガンシクロビルは、細胞のポリメラーゼに対する阻害よりも、ウイルスＤＮＡポリメラーゼをより効果的に阻害する。鎖伸長は、ガンシクロビルが除去されると再開する。ＣＭＶ感染細胞において、ガンシクロビルは、非感染細胞におけるよりも、著しく速やかにリン酸化されると考えられている。しかしながら、非感染細胞も低レベルのガンシクロビル三リン酸を生成し得る。ガンシクロビル三リン酸の濃度は、非感染細胞と比較して、ＣＭＶ感染細胞において、１００倍も大きいことがあり得、また、ＣＭＶ感染細胞において数日間持続し得る。

バルガンシクロビルは、速やかにガンシクロビルに変換され、免疫無防備状態の宿主におけるＣＭＶ感染の処置および予防において主要な役割を果たす経口プロドラッグである。

遺伝子治療ベクター

ウイルスベクター

アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、およびレンチウイルスなどのウイルスは、角膜の中に効率的に遺伝子を輸送することが見いだされている。アデノウイルスとレトロウイルスは、（例えば、短時間に、中程度～激しい炎症反応を伴って）角膜の中に遺伝子をうまく運搬し得る。しかしながら、これらのベクターは、両方とも、低／非分裂細胞（角膜内皮およびケラトサイトなど）に形質導入する能力を欠くこと、および免疫反応を誘発することから、遺伝子治療のための用途に制限がある。ＡＡＶベクターと無能化レンチウイルスベクターは、低速／非分裂細胞に形質導入する能力および長期間の導入遺伝子発現をもたらす能力のために、眼組織の中への遺伝子送達のためのより優れた代替法を提供する。レンチウイルスベクターの起源（ウマ伝染性貧血ウイルスおよびＨＩＶ）は、懸念であり、ヒト患者における使用に対する熱意は著しく弱められる。ウイルスベクターの中で、ＡＡＶは、その潜在能力および安全性プロファイルのゆえに、遺伝子治療のためのよい選択である。組換えＡＡＶベクターは、重大な副作用を伴わない、患者の眼の遺伝子治療および視力回復のための大きな期待が示されている。

アデノ随伴ウイルス

１１０の同定されたＡＡＶセロタイプの中で、セロタイプ１－１０は、今日までに遺伝子治療のために使用されている。ＡＡＶベクターは、高い形質導入効率、および網膜、角膜、多くの他の眼組織において、ｉｎ ｖｉｖｏで長期間の導入遺伝子発現が示されている。各セロタイプにおいて、種々の細胞／組織についてユニークな形質導入パターンが示されているが、ＡＡＶ２は、他のＡＡＶセロタイプと比較して、遺伝子治療について、より徹底的に試験されている。ＡＡＶ６、８、および９は、特に、全身的な遺伝子導入を効率的に媒介する能力を有している。異なるＡＡＶセロタイプによる遺伝子導入の差異は、宿主細胞の受容体とウイルスカプシドの相互作用のためである可能性がある。異なるＡＡＶセロタイプのカプシド領域における構造的な差異は、各セロタイプが、異なる細胞表面受容体に結合することを可能にする。例えば、細胞に入るために、ＡＡＶセロタイプ４、５、および６はシアル酸を利用するが、ＡＡＶ８および９はラミニン受容体を使用する。ＡＡＶ２ゲノムのＡＡＶ１－９のカプシド中へのトランスカプシド化を使用して多様な偽パッケージングベクターが作成されたため、このことが、ハイブリッドＡＡＶベクターの開発に繋がった。これらの次世代型ハイブリッドベクターＡＡＶ２／１－９は、種々の動物モデルの眼組織において、ＡＡＶ２／２と比較して、より高い形質導入効率を示した。

硝子体内および網膜下注射による眼内へのベクター導入後、ＡＡＶ２／７および２／８は、網膜組織と前眼房組織（虹彩、線維柱帯、および角膜を含む）の両方において、より優れた長期形質導入能（最大６か月）を示した。ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、およびＡＡＶ２／９ベクターによるその後の研究により、これらの知見は、網膜組織についてさらに補強された。同様のやり方で、ＡＡＶ２／８および２／９は、非眼組織（例えば、心臓、脳、骨格筋、肺、および肝臓など）において、５～１００倍優れた形質導入効率を示す。

アルカリホスファターゼ（ＡＰ）をコードするＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、およびＡＡＶ２／９ベクターは、ヒト角膜線維芽細胞に効率的に形質導入するが、形質導入効率は異なる。ＡＡＶ２／６は、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９と比較して、３０～５０倍高い形質導入効率を示す。試験されたＡＡＶセロタイプの中で著しい細胞死または細胞生存率の低下を引き起こしたものはなく、ＡＡＶベクターが角膜に対して安全であることが再確認された。これらのベクターによる、マウスの角膜を使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験およびヒト角膜を使用したｅｘ ｖｉｖｏは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と比較して、非常に異なる形質導入プロファイルを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏによる知見と異なり、試験された３つのベクターの形質導入効率の順番は、ＡＡＶ２／９≧ＡＡＶ２／８＞ＡＡＶ２／６であった。文献の報告によってｉｎ ｖｉｔｒｏの遺伝子送達は、ｉｎ ｖｉｖｏの形質導入とは異なり得ることが示されているため、これらの知見は驚くべきことではない。試験されたこれら３つのセロタイプのいずれも、細胞死、細胞生存率の低下、炎症、ならびに／またはＴＵＮＥＬおよびＣＤ１１ｂもしくはＦ４／８０免疫染色で測定した場合の角膜における顕著な免疫反応などの、いかなる重大な副作用も引き起こさなかった。角膜上皮における導入遺伝子の発現は、マウスの眼において、ＡＡＶ２によって最大８か月間検出され、これは、ｒＡＡＶ送達導入遺伝子が、ｉｎ ｖｉｖｏで、数か月間、可能性としては数年間、存続し得ることを示唆している。

８つの異なる野生型の天然ウイルスのシャッフリングから作成されたＡＡＶ－ＤＪ（タイプ２／タイプ８／タイプ９キメラ）は、幅広い範囲の細胞タイプの中への高い遺伝子導入効率のため、遺伝子導入のために使用されている。例えば、ＡＡＶ－ＤＪベクターは、他の天然型のセロタイプと比較して、高い標的化頻度で、ブタ線維芽細胞における遺伝子をノックアウトするために使用されている。ＡＡＶ－ＤＪは、ヒトケラチノサイトにおける液質導入効率において、全ての他のセロタイプをしのぐ。

前述のいずれか、または他の適切なＡＡＶベクターが、用量および組織に対する曝露の持続時間などの因子に応じて、本発明の原理に従って使用し得る。

非ウイルスベクター

ウイルスを使用しない、プラスミドＤＮＡ発現治療遺伝子の標的細胞の中への導入は、非ウイルス遺伝子導入方法の幅広いカテゴリーに入る。非ウイルス遺伝子治療は、低い毒性、免疫原性、および病原性のために、ウイルス遺伝子治療よりも安全であると考えられる。さらに、プラスミドベクターの作成は、直接的であり、かつ費用対効果が高い。にもかかわらず、低いトランスフェクション効率が大きな問題である。これらの技術の簡単な説明を以下に示す。

マイクロインジェクション

角膜を例として使用すると、マイクロインジェクションによって、プラスミドは、ＧＦＰ、インターロイキン（ＩＬ）１８、Ｆｌｔ２３ｋ、エンドスタチン、ＭＭＰ１４、およびバソヒビンを含む遺伝子を、角膜の種々の細胞の中に、うまく送達させた。角膜の異なる層を標的とするマイクロインジェクションが、種々の解剖学的部位に行われ、ストローマ内、結膜下、および直接的な前眼房の中へのものがあげられる。顕微手術の技術もまた、角膜障害における遺伝子機能を探索する実行可能な方法を提供する。角膜内へのｉｎ ｖｉｖｏの導入遺伝子送達は、レポーターまたはＦＧＦ２遺伝子をコードするＳＡＩＮＴ－１８およびプラスミドベクターで構成された半乾燥ｐ－ｂＦＧＦ－ＳＡＩＮＴ－１８複合体のストローマ内層状移植を使用して成功している。この角膜遺伝子移植技術は、角膜における局所的導入遺伝子送達を可能にした。

プラスミドまたはネイキッドＤＮＡ挿入のためのこれらの同じ技術が、マイクロインジェクションまたはその他の方法で、本技術の原理に従って、虹彩に適用され得る。

エレクトロポレーション

エレクトロポレーション（電気遺伝子治療または電気透過処理とも呼ばれる）は、高強度の電気的パルスを使用して、細胞膜中に一過性の細孔を形成し、これは、培養した眼細胞、およびｉｎ ｖｉｖｏの眼表面組織の両方における遺伝子送達に有用である。有利な点は、大きいＤＮＡコンストラクトが、特別な装置が必要ではあるが、細胞の中に輸送できることである。再び角膜を例として使用すると、エレクトロポレーションは、外来遺伝子を、角膜上皮ならびにケラトサイトの中に送達する能力を有する。２００Ｖ／ｃｍの電流は、外傷、角膜浮腫、または炎症を引き起こさなかったが、導入遺伝子の導入は低レベルであった。より高い電流は、遺伝子導入を増大させたが、大きな角膜損傷も引き起こした。電流は、加熱、または細胞膜の破壊によるＣａ２＋流入の結果として、不可逆的な組織損傷を引き起こし得る。電気を補助としたｅｘ ｖｉｖｏのヒト角膜の内皮への遺伝子送達が記述されている。特別に設計された電極を使用して、２つのレポーター遺伝子（ＥＧＦＰおよびβガラクトシダーゼ（βｇａｌ））を、１２５ｍＡの矩形波による、８回の１Ｈｚ、１００ｍｓのパルスを使用して、組織培養におけるヒト角膜の中に輸送することに成功した。効率はウイルスベクターよりも大幅に低いにもかかわらず、低い細胞死、および内皮細胞のタイトジャンクションの完全性に顕著な変化がないことは、臨床適用の可能性を示す。イオントフォレーシスとエレクトロポレーションを、個別に、または組み合わせて使用した、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびデキストラン巨大分子の、マウス角膜上皮の中へのｉｎ ｖｉｖｏの電気的輸送が報告されている。イオントフォレーシスとエレクトロポレーションは、両方とも、個別に巨大分子を角膜の中に輸送したが、イオントフォレーシスは、より効率的であることが見いだされ、また、イオントフォレーシスにエレクトロポレーションを続ける組み合わせは、これら両方の方法を単独で行うよりも有効であった。

ソノポレーション

ソノポレーションは、ＤＮＡを核に送達するために、形質膜に細孔を生じさせるために超音波を利用する。超音波は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの細胞のトランスフェクションのために有効である。このアプローチのトランスフェクション効率は、マイクロバブルなどのコントラスト剤の使用に加えて、トランスデューサーの周波数、音圧、出力強度、および超音波処理のパルス持続時間に依存する。マイクロバブルは、コントラスト剤として、イメージングの向上のためだけではなく、細胞膜透過性を増大させることによって、遺伝子送達も改善するために生成される。超音波標的化マイクロバブル破壊は、部位特異的遺伝子導入アプローチとして大きな可能性を有し得、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏのヒトＲＰＥ細胞、およびｉｎ ｖｉｖｏのラット網膜のＡＡＶ媒介遺伝子トランスフェクションにおいて使用され、成功している。

遺伝子銃

遺伝子銃は、弾道的な（生物弾道的とも呼ばれる）遺伝子導入法である。ミクロンサイズの生物学的に不活性な重金属（金、銀、またはタングステン）粒子と、機械的またはマクロ噴出（求心、磁気、または静電）力を利用する。細胞／組織に対するＤＮＡ被覆粒子の高速度での砲撃の結果、遺伝子導入が起こる。遺伝子銃による遺伝子送達は、粒子にコーティングされたＤＮＡの量、温度、細胞の数、力の大きさ、ＤＮＡ被覆粒子の数などの多くの因子に依存する。この方法の数多くの制限のいくつかは、粒子の侵入深度が浅いこと、細胞の損傷が大きいこと、遺伝子導入が制御できないこと、コストが高いこと、内部器官へのアクセスなどである。

プラスミドまたはネイキッドＤＮＡ挿入のためのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イオントフォレーシス、ソノポレーション、および遺伝子銃技術は本技術の原理に従って、また、当業者によって理解され、状況に適合されるであろうように、虹彩に適用することができる。

メラノサイトのためのＡＡＶベクター

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、いかなる既知の病理にも関連がない、ヘルパー依存性のパルボウイルスである。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ウイルスタンパク質を一切発現せず、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入することができ、また、持続的な導入遺伝子発現に関連する。臨床試験においてｒＡＡＶを投与された何百もの患者が、いかなる重要なベクター関連合併症も生じない、遺伝子治療ベクターとして大規模に評価されている。ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターとは異なり、ｒＡＡＶの組み込みは一般的ではなく、ベクターゲノムは、エピソーム状態を維持する。ｒＡＡＶには、少なくとも１２のセロタイプおよび多くのカプシド変異体が存在し、異なる受容体および共受容体の利用によって、異なる細胞タイプに対する異なる指向性が生じる。

ＡＡＶ２／２、２／１、および２／４は、主に網膜色素上皮を冒す異なる網膜疾患モデルの表現型を戻すために使用され、成功しているにもかかわらず、１つの試験において、セロタイプ２ ｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ２）によって、プライマリーヒトメラノサイトの形質導入は観察されなかった。眼内注射後のｒＡＡＶセロタイプ１によるマウス脈絡膜および虹彩メラノサイトの形質導入が報告されており、これは、少なくともいくつかのｒＡＡＶセロタイプは、ヒトメラノサイトに形質導入することが可能であり得ることを示唆している。

ｒＡＡＶのバリアントのプライマリーヒトメラノサイトに形質導入する能力による選別によって、ｒＡＡＶ６が最適なセロタイプとして同定され、細胞の７～７８％に形質導入した。ｒＡＡＶ６チロシンカプシドミュータントによって、形質導入の増大は観察されなかった。導入遺伝子を発現する細胞の数は、感染後６～１２日にピークになり、形質導入細胞は、第２８日においても、依然として検出可能であった。したがって、ｒＡＡＶ６は、プライマリーヒトメラノサイトの形質導入のための非組み込み型ベクターと考えられ得る。

ｒＡＡＶ１とｒＡＡＶ６のほかに、任意の適切なアデノ随伴ウイルスベクターが、本技術の原理に従って使用され得る。

遺伝子ベクターキャリアー

本明細書で使用される場合、「遺伝子ベクター（ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ）」または「遺伝子ベクター（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つもしくはそれを超えるポリヌクレオチドまたは１つもしくはそれを超えるポリヌクレオチドのキャリアー、例えば、目的の核酸配列（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、遺伝子、プロモーター、およびエンハンサー）を保持するウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルスのカプシド）を指し得るか、または前記ポリヌクレオチドを含むキャリアーと、同様に保持されている任意の他のタンパク質もしくは他の分子の全体の組み合わせを指し得る。

本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、標準的な定義を有し、また、特定のタンパク質をコードするための十分な情報を有する配列を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）も指す。

本明細書で使用される場合、用語「チミジンキナーゼ遺伝子」は、ある生物においてチミジンキナーゼをコードする、既知の標準的なＤＮＡ配列、またはその改変物を含むポリヌクレオチドを指す。チミジンキナーゼをコードする既知の標準的なＤＮＡ配列の改変物としては、（１）チミジンキナーゼをコードする既知のＤＮＡコード配列の改変物またはフラグメント（例えば、コドン最適化配列）；または（２）チミジンキナーゼまたはチミジンキナーゼと同じ機能を有するタンパク質の転写および／または翻訳をもたらすための十分な情報を含む、前記標準的なＤＮＡコード配列に対して相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（メッセンジャーＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む）があげられる。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、発現のためのエレメントが、ベクター内で、コード配列の発現を指示または制御するような様式で、コード配列に対して配置されていることを意味する。

本技術による遺伝子ベクター（例えば、ＤＮＡ配列、プラスミド、またはＡＡＶなどのウイルスベクター）は、外科医によって、種々のキャリアー（「遺伝子ベクターキャリアー」）（流体の溶液または懸濁液、プラズマ、ゲルまたはペーストを含む）のいずれかによって、虹彩表面に運ばれてもよく（例えば、スパチュラ、綿撒糸、または他のアプリケーターによって虹彩表面に塗布される）、または（例えば、薬剤付き絆創膏のように、遺伝子ベクターが片面に塗布された）薬剤付きの生体適合性材料のディスク、ストリップ、または綿撒糸によって、虹彩表面に運ばれてもよい。例えば、外科医は、このような材料の１つまたはそれを超えるディスク、ストリップ、または綿撒糸を、ベクター粒子を含んだ接着性の材料の面を（例えば、毛細管現象の力によって、または生分解性接着剤（例えば、フィブリンもしくはアルブミンペーストもしくは接着剤、または速やかに溶解する他の適切な材料）によって）虹彩に接着させた状態で、ある期間にわたって（例えば、１、３、５、１０、１２、もしくは１５分間、またはそれより長く）、虹彩表面に付与し得る。

ヒドロゲルおよび遺伝子ベクターを送達するための他の材料

ヒドロゲルは、水または水性溶媒系中で膨潤し、送達のために、その溶媒（意図した薬物）を膨潤した架橋ゲル相中に保持する能力を有するポリマーである。浸透および拡散特性を操作することによって、ヒドロゲルは、疎水性薬剤および親水性薬剤、小分子、および巨大分子を保持することができる。特定の構造に応じて、適用において、非分解性でも、分解性でもあり得る。ヒドロゲルは、疎水性、親水性、小分子、および巨大分子を保持する能力を有する。温度およびｐＨ感受性に設計され得る。

ヒドロゲルは、親水性ポリマーの架橋または自己組織化によって形成され、天然材料（例えば、フィブリン、キトサン、およびヒアルロナン）、または合成材料（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリビニルアルコール）から形成され得る。さらに、ヒドロゲルは、多くの適用のためにカスタマイズされ得る。例えば、注射可能または環境応答性であるように、特定の細胞タイプの浸透を促進するように、および種々の幾何学的構造を持たせるように、設計され得る。遺伝子ベクターの送達に対する制御は、ヒドロゲルキャリアーの物理的性質（例えば、ポアサイズおよび分解速度など）を変化させることによって実現され得る。重要なことに、導入遺伝子の発現は、前記足場の内在的な生物活性を増強させるか、またはそれと相乗作用を示し、それによって再生医療のための組織形成を促進する環境を形成するように設計され得る。

ヒドロゲルは、侵襲性が最小限の手順によって身体内に導入することができるため、遺伝子カーゴの臨床適用のための、特に魅力的なクラスの送達材料である。フィブリンＰＥＧおよび自己組織化ペプチドヒドロゲルは、ＡＡＶとＬＶの両方をうまく被包および放出することが示されている。アルギン酸（マイナスに荷電した生体材料である）は、低い免疫原性、調節可能な生分解性、および穏やかなゲル化順のために、ウイルスベクターの送達のために同様に試験された魅力的で多用途のビヒクルである。ウイルス送達のために使用される他のヒドロゲルと異なり、アルギン酸は、組織相互作用を伴わずに、組織標的の細胞微小環境内で、直接的にｉｎ ｓｉｔｕで、ポリマーネットワークの外側で形質導入が行われることが意図された用途のために、特に魅力的である。アルギン酸ヒドロゲルは、化学的修飾なしで、細胞浸潤および接着を補助しないことでよく知られている。

典型的には、アルギン酸ヒドロゲルからのペイロードの放出は、アルギン酸ヒドロゲル系の３つの鍵となる側面、すなわち、ヒドロゲル内におけるペイロードの拡散性；ヒドロゲルの分解性；およびアルギン酸とペイロードの間の親和性、を制御することによって調節され得る。上記の３つの側面は、小分子、タンパク質、および、さらに最近では、ウイルスベクターなどのより大きな粒子の放出を制御するために使用されている。ＡＡＶおよびＬＶは、異なる固有の物理的特性（異なる細部および表面特性）を示す。これらの相異から、アルギン酸ヒドロゲルベクターからの放出メカニズムは、これら２つのベクター間で異なるであろうことが予期される。例えば、メッシュサイズは、アルギン酸ヒドロゲルの拡散性に影響する鍵となる特性である。実際に、報告されているアルギン酸ヒドロゲルポアサイズは、約５～１７０ｎｍの範囲であり、したがって、類似のサイズを示すカーゴについて、存在するポリマーネットワークの破壊（すなわち、分解）は、カーゴの放出を調節するために必要である。アルギン酸ヒドロゲルは、アルギン酸分子量組成、架橋ジャンクションのサイズにおけるミスマッチ、およびポリマー鎖の酸化の程度を変化させることによって、数日から数か月の範囲のスケールで分解するように設計され得る。したがって、分解性のアルギン酸ヒドロゲルは、ＬＶおよびＡＡＶなどのウイルスベクターの所望の放出速度に適合するように作られ得る、望ましい送達材料である。

水溶性が高いペイロードについては、親水性ポリマーマトリックスからの溶解は、主に、ヒドロゲル層を通したベクターの拡散によって制御され；ゲル層内の高いベクター濃度勾配は、ベクターの送達を促進する。しかしながら、水溶性が低い薬物候補については、ベクター放出速度は、主に、ポリマーマトリックスの侵食に依存する。その結果、親水性ポリマーの膨潤特性は、ベクター放出プロファイルに著しい影響を及ぼし得る。さらに、ポリマーマトリックスの水和および侵食は、水のさらなる取り込みおよび浸透を引き起こし；このことが、次に、ベクターの拡散に影響を与えるであろう。

ヒドロゲルとベクター粒子をロードした虹彩送達ディスク

遺伝子ベクター（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルス粒子）を運搬するための、本技術によるベクター送達デバイスの１つのタイプは、ヒドロゲルを保持するフレキシブルストリップもしくは「ディスク」［１］（図１Ａ～１Ｄ）、またはベクター粒子が埋め込まれた、カプセル化された、またはその他の方法で壁、チャンバー、ポケット、カラム、または類似の機能の構造に含められた送達材料［２］（例えば、フィブリンまたはアルブミンマトリックスまたは「接着剤」）である。前記粒子を放出するための媒体またはマトリックスは、様々な材料およびそれらの組み合わせから構成され得る。以下の議論は、本技術の原理によって同じベクター放出目的のために使用され得る材料を限定するものではないが、例としてヒドロゲルに焦点があてられるであろう。

遺伝子ベクターの送達のためのヒドロゲルは、好ましくは、ディスク［１］の後面に、ディスク［１］が上記手順の間に配置された場合に、虹彩［７ｂ］の前面に向け、かつ接触させて置かれる（図１Ｄ）。ディスク上のヒドロゲル（例えば送達材料）のための凹部［６］は、図１Ｄに示されている。ヒドロゲルは、水（例えば、患者の前眼房中の房水）と接触した後、または体温（３７℃）もしくは身体のｐＨ（７．４）に達した後に溶解し始める。０秒～２分、またはそれより長い初期期間の後、ヒドロゲルは、ベクター粒子を放出し始める。溶解および粒子の放出速度は、ヒドロゲルの成分の選択、ならびにその濃度および化学的性質に応じて設計され得る。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、患者の眼内の房水と接触すると溶解または分解を開始し、外科医に（例えば、ディスクの折りたたみをほどき、位置を調節することによって）ディスクを患者の虹彩上に置く時間を与えるための初期期間（例えば、３０、４５、６０、７５、または９０秒、またはそれより長い期間）の後、ヒドロゲルは、ヒドロゲルからの遺伝子ベクターの放出を開始するであろう。いくつかの実施形態におけるヒドロゲルは、好ましくは、初期期間経過後、ベクターを速やかに（例えば、１～３分以内、またはそれより短時間に）放出するであろう。これによって、ベクターが虹彩に速やかに、かつ高濃度または力価で接触することが可能になり、虹彩ストローマメラノサイトの速やかな形質導入の成功を確実にすることを助け、手順の持続時間が相対的に短くなる。

いくつかの実施形態において、ディスクは、形状が円形であり、患者の虹彩に適合するようなサイズと形状にされる。別の形状（例えば、多角形のストリップ）もまた使用され得る。ディスクは、様々な虹彩サイズに適合するように様々なサイズで入手し得るか、または（例えば、虹彩サイズの統計的平均に基づいて）１つまたはいくつかのサイズに標準化され得る。ディスクの中央部にある瞳孔の開口は、手術の間、ディスクが虹彩上に置かれ、ベクターを放出している間、そこを通して房水が流出することを可能にする。

本明細書に記載されているディスクの非限定的な例を図１Ａ～１Ｄに示す。いくつかの実施形態において、ディスク［１］は、「瞳孔ガード」［４］（これは、ディスク［１］の瞳孔の開口［３］の周囲を取り囲むように配置された、中央部の筒状の突出部である）を有する（図１Ｂ～１Ｄ）。図１Ｄは、患者の眼の虹彩［７ａ－７ｂ］に適合するディスクの概略図を示す。ディスク［１］の中央部にある瞳孔の開口［３］は、手術の間、ディスク［１］が虹彩［７ａ］上に置かれ、ベクターを放出している間、そこを通して房水が流出することを可能にする。瞳孔ガード［４］は、好ましくは、ディスク［１］から虹彩表面［７ｂ］に向けて伸び、ヒドロゲルと瞳孔の開口［３］の間のバリアーを形成する。瞳孔ガード［４］は、ベクター粒子が、手術の間に、瞳孔［９］を通して、前眼房［８］から後眼房に向かって（房水の流れに対して）逆方向に移動するリスクを低減させ得る。

いくつかの実施形態において、ディスク［１］は、ディスク［１］の周辺の周囲を取り囲むように配置された、中央部の筒状の突出部である「角膜縁ガード」［５］を有する（図１Ｂおよび１Ｄ）。角膜縁ガード［５］は、好ましくは、ディスク［１］から虹彩表面［７ｂ］に向けて伸び、角膜［１０］の虹彩角膜角で、眼の角膜縁の近くに、ヒドロゲルと線維柱帯の間のバリアーを形成する。瞳孔ガード［４］は、ベクター粒子が、手術の間に、前眼房から線維柱帯の中に（房水の流れに対して）順方向に移動するリスクを低減させ得る。

いくつかの実施形態において、ディスクは、瞳孔ガードも、角膜縁ガードも有していない（図１Ａ）。他の実施形態において、ディスクは、瞳孔ガード［４］と角膜縁ガード［５］を両方とも有している（図１Ｂおよび１Ｄ）。いくつかの実施形態において、ディスクは、瞳孔ガード［４］を有しており、角膜縁ガードを有していない（図１Ｃ）。また、いくつかの実施形態において、ディスクは、角膜縁ガード［５］を有しており、瞳孔ガードを有していない（図示せず）。

手術

以下の手術の説明は、単に例示的なものであり、本技術を限定することを意味するものではない。眼科医の技能、経験、および好みにより、本技術による遺伝子治療を施すための任意の適切な手順に従い得る。

ピロカルピンおよび／または前房内縮瞳剤などの手術前縮瞳薬を、前記手順の間の遺伝子ベクターとの接触のために利用可能な前面面積を最大化するために、患者に使用し得る。さらに、縮瞳は、線維柱帯を開き、それによって、房水流出速度を増大させ、より大きい瞳孔に対して、より小さい瞳孔を通した前眼房の中への房水流の速度を増大させるために有用であり得る。房水の、このより高い流速および流出量の増大は、そうでなければ、この手順の間および後に、前眼房から瞳孔を通して虹彩の後面に流れ得るフリーなベクター粒子にＩＰＥが曝露されるリスクを低減させ得る。

患者に適切な局所または全身麻酔を施した後、角膜穿刺を形成してもよく、前眼房および角度が、粘弾性または気泡によって深められる。あるいは、前記手順は、事前の穿刺を行うことなく、前眼房の中に直接挿入したニードルを使用して、シリンジからベクター粒子を注射することによって行ってもよい。リドカインまたは他の局所麻酔薬を、さらなる麻酔のために、前房内に注入してもよい。

外科医は、遺伝子ベクターキャリアーを、粘弾性または気泡の体積まで、前眼房の中に、房全体または後眼房のいずれかの中に導入する。気泡の後に流体を投与することによって、例えば、臨床的結果を生じさせるために必要とされる遺伝子ベクターキャリアーの注入量を減少させ、ＤＮＡベクター粒子と虹彩前側の間の接触の可能性を増大させ、角膜内皮または角膜ストローマ（この場所では、チロシナーゼプロモーターを保持するベクターは、機能しないであろう）の中への粒子の損失を低減させ得る。

ベクター粒子の遺伝子ベクターキャリアー（例えば、溶液、懸濁液、または薬用ストリップもしくはディスク）を前眼房の中への注射が行われた後、外科医は、粒子と虹彩前側の間の適切な表面相互作用を確実にするために、適切な時間の経過を待ってもよい。この時間は、例えば、投与した流体中の粒子の力価（濃度）、注射した流体の体積、および投与した流体がその中に置かれた前眼房内の空間の体積（例えば、前眼房全体（成人における平均体積は、約１７０μＬである）、または後眼房）から粘弾性もしくは気泡までに応じて変わり得る。

ベクター粒子と虹彩前側の間の適切な表面相互作用を確実にするために適切な時間を待った後、外科医は、投与した遺伝子ベクターキャリアーの過剰量（もしあれば）または残量を、前眼房から、任意の適切な手段（例えば、吸引、平衡塩類溶液（ＢＳＳ）などの適切な流体によるフラッシング、および／またはリンスなど）によって取り除いてもよい。適切な曝露時間の後の遺伝子ベクターキャリアーのこの除去は、遺伝子ベクターに対する遠方のメラノサイト（例えば、ＩＰＥ、脈絡膜、およびＲＰＥにおける）の曝露を制限または阻止するために、このプロセスを「クエンチすること」と考えることができる。

適切な用量のベクター（例えば、５～５０μＬの１Ｅ１０～１Ｅ１３ ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ粒子溶液）が、その後の前眼房からの除去を必要としないように、前眼房の中にニードルによって注射されるケースにおいて、虹彩メラノサイトまたは他の細胞によって取り込まれなかったベクターは、線維柱帯を通した通常の房水の流出（約１％／分で）、およびぶどう膜強膜流出系によって、前眼房を離れ、体循環に入るであろう。

粘弾性または気泡が付与された場合には、前眼房から除去または潅注してもよく、また、カルバコール眼内溶液（または他の縮瞳薬）を、瞳孔の縮瞳を起こさせるために前房内に注射してもよい。全ての創傷に水を注入し、水を通さない縫合を保証するためにチェックし、例えば、必要であれば、１０－０ナイロン縫合糸を主要な創傷に使用する。その他の場合は、角膜の創傷は、自己閉鎖するであろう。

手術後、ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシドアナログ（または、使用された前記自殺遺伝子コンストラクトに応じて選択される、上記に列挙したような他の適切なプロドラッグ）適切な期間（例えば、数日から数週間）にわたって投与すべきである。この薬物は、医師が選択すれば、患者の手術前に開始してもよい。投与の期間は、患者の反応（例えば、患者の眼が経時的に次第に明るくなる場合）に応じて、または決まったプロトコル（例えば、１～７日または１～４週間のどこでも）に基づいて変わり得る。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドアナログの投与は、手術後、少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または５週間後に開始される。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドアナログは、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、または９日間投与される。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドアナログは、手術後、第５～１０日、第１０～１５日、第１５～２０日、第２０～２５日、第２５～３０日、第３０～３５日、第３５～４０日、または第４０～４５日に投与される。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドアナログは、手術後、第１３～１７日、第１８～２２日、第２３～２７日、第２８～３２日、第３３～３７日、第３８～４２日、第４３～４７日、または第４８～５２日に投与される。

患者は、手術後、虹彩炎（これは、メラノサイトが死滅した場合に起こり得る）、または他の眼の炎症の症状および徴候についてモニターすべきである。このような炎症は、軽度かつ一過性であると予期され、毛様体筋麻痺薬（例えば、シクロペントレート）および局所または全身コルチコステロイド薬（例えば、プレドニゾロン点眼薬または経口プレドニゾンまたはメチルプレドニゾロン投与パック）によって対処し得る。痛みは、アセトアミノフェン、イブプロフェンのような非ステロイド性抗炎症ＮＳＡＩＤ薬、または、まれなケースにおいて、オキシコドンなどのオピオイドによって対処し得る。

実験例
実施例１：Ｉｎ ｖｉｖｏ試験－ウサギにおける虹彩前側のストローマメラノサイトの選択的除去

ダッチベルテッド（ＤＢ）ウサギは、１４日間馴化および検疫され、次いで、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物による全身麻酔を受けた後、３０Ｇニードルの付いた５００μＬインスリンシリンジを使用して、前眼房の中に、２Ｅ＋１３ ｖｇ／ｍｌの力価で、５０μＬのＡＡＶ６リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液の片側ＯＤ（右眼）注射を受けた。瞳孔は、手術中、および手術後１日間、１日４回まで、２％ピロカルピン局所点眼薬で縮瞳状態を維持した。第３８～４２日に、ウサギは、腹腔内に、５０ｍｇ／ｋｇのガンシクロビル注射を受けた。眼は、第１、３、５、７、１４、２１、２８、３８、４５、５２、５９、６６、および８３日に、スリットランプで検査された。ベースラインにおいて、フラッシュ網膜電図検査を行い、正常であった。

このケースにおいて、ＡＡＶ６ベクターは、マウスチロシナーゼプロモーター配列（ｐＤＲＩＶＥ５Ｌｕｃｉａ－ｍＴｙｒ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって駆動される、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ）チミジンキナーゼをコードする自己相補的（二本鎖）ＤＮＡカセット（ｐＡＬ１２０－ＴＫプラスミド配列、Ｍａｒｉａ Ｃａｓｔｒｏ，ＰｈＤから提供を受けた：Ｋｉｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００８ Ｍａｙ ８２（９）：４６８０－４；Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡに開示されている）を保持していた。アポトーシスによる細胞死を誘発することができる任意の他のメラノサイト特異的遺伝子コンストラクト、および／または本技術の原理に従って送達される任意の他のベクター（異なるＡＡＶセロタイプなど）は、本明細書で議論されているように、適切であろう。

８３日の試験全体を通して、眼科検査の間に変化は認められず、試験の間、対象ウサギの体重は安定していた。角膜と虹彩は健康に見えた。前眼房に炎症細胞または発赤は認められなかった。レンズは透明であった。全期間にわたり、結膜、強膜、および後眼部検査は正常のままであり、硝子体、網膜、脈絡膜、および視神経の外観は正常であった。前眼房における最初の炎症徴候の時に、局所０．１％デキサメタゾン（デキサメタゾン、ＷＺＦ ＰＯＬＦＡ ＳＡ、Ｐｏｌａｎｄ）で注射した眼を処置する準備をしていたが、このような事態は生じなかった。

凍結包埋の前に、虹彩と網膜は、１×ＴＢＳで洗浄し、１×ＰＢＳで作成した１０％、２０％、および３０％勾配ショ糖溶液に置いた。その後、組織は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（凍結包埋溶液（ｃｒｙｏ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））中に埋めることによって凍結され、さらなる処理まで、液体窒素中で凍結し、－２０℃で保存された。Ｌｅｉｃａ ｃｒｙｏｔｏｍｅ ＣＭ１８６０を使用して、厚さ１０μｍの切片を切り出した。

虹彩と網膜の切片は、ヘマトキシリン・エオシン（Ｆｏｎｔａｎａ Ｍａｓｓｏｎ染色キット）、およびマクロファージの同定のために抗ＣＤ６８抗体で染色した。

結果

毛：ウサギの黒い毛には、試験の間、色素脱失の徴候はなく、これは、毛包において、メラノサイトの著しい喪失がなかったことを示す。

スリットランプ検査：第４５日（ガンシクロビル注射の第３８日の１週間後）に、全体的および斑点状の両方の形で、虹彩の表面全体にわたって均一な分布で、虹彩前側の色素沈着の喪失が観察された。この色素沈着の喪失は、第２週（第５２日）および第３週（第５９日）に増大し、その後安定した。第５９日と８３日の間、拡大率２５倍でのスリットランプ検査によって、さらなる色素脱失は観察されなかった。図２を参照のこと。

組織学：フォンタナ・マッソン染色によって、対照眼（ＯＳ）と比較して、処置眼（ＯＤ）において、虹彩前側のストローマメラノサイトの喪失が（特に虹彩の前面において）明らかにされた。図３を参照のこと。虹彩色素上皮（虹彩の後面において）は変化がなく、この領域において観察可能なメラノサイトの喪失はなかった。網膜と脈絡膜においても、同様に、メラノサイトの喪失が見られなかった。

実施例２：Ｉｎ ｖｉｖｏ試験－ウサギにおける眼色変化

ダッチベルテッド（ＤＢ）ウサギは、１４日間馴化および検疫され、次いで、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物による全身麻酔を受けた後、３０Ｇニードルの付いた５００μＬインスリンシリンジを使用して、前眼房の中に、２Ｅ＋１３ ｖｇ／ｍｌの力価で、５０μＬのＡＡＶ６リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）溶液の片側ＯＤ（右眼）注射を受けた。実施例１に記載されているように、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ）チミジンキナーゼのコード配列を含むＡＡＶ６ベクターを使用した。

瞳孔は、手術中、および手術後１日間、１日４回まで、２％ピロカルピン局所点眼薬で縮瞳状態を維持した。１羽のウサギは、第７～１１日に、腹腔内に、５０ｍｇ／ｋｇのガンシクロビル注射を受け、その他のウサギは、第１４～１８日に、腹腔内に、５０ｍｇ／ｋｇのガンシクロビル注射を受けた。

眼は、第０、１、３、７、１４、２１、２８、および３５日に、スリットランプで検査され、それぞれの日に、ＯＤ（注射した眼）とＯＳ（ＡＡＶ６注射をしていない対照眼）の両方について、写真を撮影した。第０日および第３５日の画像を図４Ａ（第０日）および４Ｂ（第３５日）に示す。図４Ｂは、ウイルス注射の３５日後、ＯＤ（注射した眼）において眼色が変化し、ＯＳ（対照眼）において変化がないことを明確に示す。

以上の説明は、本明細書に記載された種々の構成を、当業者が実施できるように提供されている。本技術は、種々の図面および構成を参照して具体的に説明されているが、これらは単に例証を目的とするものであることを理解すべきであり、本技術の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

本技術を実行するための多くの他のやり方が存在し得る。本明細書に記載されている種々の機能およびエレメントは、本技術の範囲を逸脱することなく、示されているものとは別のやり方で区分され得る。これらの構成に対する種々の改変は、当業者には容易に明らかになるであろうし、本明細書に規定された一般的原理は、他の構成に適用され得る。よって、当業者によって、本技術の範囲を逸脱することなく、本技術に対して、多くの変更および改変が行われ得る。

本明細書で使用される場合、特定の時間の「少なくとも～の期間」（例えば、「少なくとも１日の期間」）は、少なくともその時間持続する期間（例えば、持続期間が１日またはそれを超えて続く期間）を指す。

本明細書に記載されている自殺遺伝子およびメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを有する遺伝子ベクターキャリアーを投与する方法またはシステムのいずれも、当業者には明らかであろうように、本技術の本説明に列挙された任意の条件のために使用され得る。遺伝子ベクターキャリアーに対する曝露、および薬物投与の量およびタイミングは、患者の反応に応じて変更または設定され得る。

開示されているプロセスにおけるステップの特定の順序または序列は、例示的なアプローチの例証であることが理解される。設計上の選択により、プロセスにおけるステップの特定の順序または序列は、再配列され得ることが理解される。いくつかのステップは、同時に実施され得る。添付の方法クレームは、例示的な順序で種々のステップのエレメントを示し、示されている特定の順序または序列に限定されることを意味するものではない。

本明細書で使用される場合、一連のアイテム（それらの任意のアイテムを区切るための用語「および」または「または」を含む）の前に記載される用語「の少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ）」は、リストの各要素（すなわち、各アイテム）ではなくて、リストを全体として修飾する。用語「の少なくとも１つ」は、必要ではないが、その一連の各アイテムの少なくとも１つの選択を含み得る。むしろ、この用語は、アイテムのいずれか１つの少なくとも１つ、および／またはアイテムの任意の組み合わせの少なくとも１つ、および／またはアイテムのそれぞれの少なくとも１つを含む意味を許容する。例として、語句「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つ」は、Ａだけの、Ｂだけの、Ｃだけの、Ａ、Ｂ、およびＣの任意の組み合わせの；および／またはＡ、Ｂ、およびＣのそれぞれの少なくとも１つを含む。

「上方」、「底部」、「前方」、「後方」などの用語は、本開示で使用される場合、基準に対する通常の重力的な枠組みではなく、基準に対して任意の枠組みを指すものと理解すべきである。よって、上方の表面、底部の表面、前方の表面、および後方の表面は、基準の重力的な枠組みにおいて、上向きに、下向きに、斜めに、または水平に伸び得る。

さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などが本説明または特許請求の範囲で使用される限度で、このような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が特許請求の範囲の移行句として使用される場合に解釈されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と同様の様式で、包含的であることが意図されている。

用語「例示的な」は、本明細書において、「例、実例、または例証として役立つ」を意味するために使用される。「例示的な」として本明細書に記載されている任意の実施形態は、他の実施形態に対して、好ましい、または有利であるものとして解釈されるべき必要はない。

単数形の要素に対する言及は、具体的な記述がない限り、「１つであってただ１つ」を意味することを意図するものではなく、むしろ「１つまたはそれを超える」を意味することを意図している。男性の代名詞（例えば、彼の）は、女性および中性（例えば、彼女のおよびその）を含み、その逆も同様である。用語「いくつかの」は、１つまたはそれを超えるを指す。下線を付した、太字にした、および／またはイタリック体にした見出しおよび小見出しは、便宜上使用されているだけであり、本技術を限定するものではなく、本技術の説明の解釈と関連して示されたものではない。当業者に知られている、または後に知られることになる、本開示の全体を通して記載されている種々の構成のエレメントに対する、全ての構造的および機能的同等物は、参照により本明細書に明示的に援用され、本技術によって包含されることが意図されている。さらに、本明細書に開示されているものは、そのような開示が上記の説明に明示的に列挙されているか否かにかかわらず、どれも公共に提供することは意図されていない。

本発明の特定の態様および実施形態を説明してきたが、これらは例として示されているに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際に、本明細書に記載されている新たな方法およびシステムは、本発明の趣旨を逸脱することなく、他の様々な形態で実現され得る。添付の特許請求の範囲およびその均等物は、本発明の範囲および趣旨に入るであろうように、そのような形態または変形物を包含することを意図している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
対象の虹彩の色を変更するための組成物であって、
（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）前記自殺遺伝子に作動可能に連結されているメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを保持する遺伝子ベクターを含む滅菌点眼調製物を含む、組成物。
(項目２)
前記遺伝子ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
(項目３)
前記遺伝子ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスを含む、項目１に記載の組成物。
(項目４)
前記調製物が、粉末形態であり、かつ流体で再構成して滅菌点眼液または懸濁液を形成することが可能である、項目１に記載の組成物。
(項目５)
前記調製物に接触するように構成され、かつ人の虹彩に接触して配置されるような大きさに作られた生体適合性の物体をさらに含む、項目１～４のいずれかに記載の組成物。
(項目６)
前記生体適合性の物体が、ディスク、ストリップ、または綿撒糸を含む、項目４に記載の組成物。
(項目７)
前記自殺遺伝子が、（ｉ）単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子；（ｉｉｉ）ニトロレダクターゼ遺伝子；および（ｉｖ）カルボキシペプチダーゼＧ２遺伝子からなる群から選択される、項目１～６のいずれかに記載の組成物。
(項目８)
前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターが、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターを含む、項目１～７のいずれかに記載の組成物。
(項目９)
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含み、前記メラノサイト特異的遺伝子プロモーターが、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターを含む、項目１～６のいずれかに記載の組成物。
(項目１０)
対象の虹彩の色を変更するための方法であって、
殺メラノサイト剤を、対象の眼の前眼房の中に導入すること；
ここで、前記薬剤は、前記眼の虹彩のストローマにおけるメラノサイトのアポトーシス死を引き起こすことによって、前記虹彩の色を変更することを含む、方法。
(項目１１)
対象の虹彩の色を変更するための方法であって、
遺伝子ベクターを、対象の眼の前眼房の中に導入することを含み；
ここで、前記遺伝子ベクターの導入が、前記眼の虹彩のストローマにおけるメラノサイトの死を引き起こすことによって前記虹彩の色を変更する、方法。
(項目１２)
前記導入することが、前記前眼房の外部から、前記眼の角膜における開口を通して、前記前眼房の中に行われる、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記遺伝子ベクターが、自殺遺伝子を含む、項目１１に記載の方法。
(項目１４)
前記自殺遺伝子が、（ｉ）単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；（ｉｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子；（ｉｉｉ）ニトロレダクターゼ遺伝子；および（ｉｖ）カルボキシペプチダーゼＧ２遺伝子からなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
前記遺伝子ベクターが、ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）自殺遺伝子を含む、項目１１に記載の方法。
(項目１６)
前記遺伝子ベクターが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む、項目１１に記載の方法。
(項目１７)
前記自殺遺伝子が、メラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている、項目１１に記載の方法。
(項目１８)
前記自殺遺伝子が、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のためのメラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている、項目１１に記載の方法。
(項目１９)
前記自殺遺伝子が、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のためのメラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む、項目１１に記載の方法。
(項目２０)
前記遺伝子ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択される、項目１１～１９のいずれかに記載の方法。
(項目２１)
前記遺伝子ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスを含む、項目１１～１９のいずれかに記載の方法。
(項目２２)
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６カプシドタンパク質を含む、項目２１に記載の方法。
(項目２３)
ヌクレオシドアナログを前記対象に投与することをさらに含む、項目１１～２２のいずれかに記載の方法。
(項目２４)
前記導入することの間に、前記対象の眼の前記瞳孔の縮瞳を維持することをさらに含む、項目１１～２２のいずれかに記載の方法。
(項目２５)
前記ヌクレオシドアナログが、ガンシクロビル、アシクロビル、またはバルガンシクロビルである、項目２３に記載の方法。
(項目２６)
対象の虹彩の色を変更するための方法であって、虹彩の前面を、メラノサイトを死滅させる物質と接触させることによって前記虹彩の色を変更することを含む、方法。
(項目２７)
前記物質が、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のための遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む、項目２６に記載の方法。
(項目２８)
対象の虹彩の色を変更するための遺伝子ベクターの使用であって、前記遺伝子ベクターが、（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）前記自殺遺伝子に作動可能に連結されているメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを含む、使用。
(項目２９)
対象の虹彩の色の変更に使用するための遺伝子ベクターであって、前記遺伝子ベクターは、（ａ）自殺遺伝子；および（ｂ）前記自殺遺伝子に作動可能に連結されているメラノサイト特異的遺伝子プロモーターを含む、遺伝子ベクター。
(項目３０)
対象の虹彩の色を変更するための組成物であって、眼に投与された場合に虹彩におけるメラノサイトの死を誘導することができる核酸を保持する遺伝子ベクターを含む滅菌点眼調製物を含む、組成物。

Claims (10)

1. 対象の虹彩の色を変更するための方法における使用のための組成物であって、有効量の遺伝子ベクターを含み、前記方法は、
   前記組成物を、前記対象の眼の前眼房の中に直接導入することであって、前記遺伝子ベクターが、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）のためのメラノサイト特異的遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスである、こと
   を含み；
   前記対象の虹彩は健康であり、
   ここで、前記組成物の導入が、前記前眼房における炎症の兆候を誘導することなく、前記眼の健康な虹彩のストローマにおけるメラノサイトを死滅させることによって前記虹彩の色を変更するのに十分である、組成物。
2. 前記導入することが、前記前眼房の外部から、前記眼の角膜における開口を通して、前記前眼房の中に行われる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組換えアデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６カプシドタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記方法が、ガンシクロビル、アシクロビル、またはバルガンシクロビルからなる群から選択されるヌクレオシドアナログを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記方法が、前記導入することの間および前記導入の後の手術後１日間の間に、前記対象の前記眼の瞳孔の縮瞳を維持することをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記遺伝子ベクターの前記有効量が５～５０μＬの１Ｅ１０～１Ｅ１３ ベクター ゲノム（ｖｇ）／ｍｌである、請求項１に記載の組成物。
7. 前記組成物が、粉末形態であり、かつ流体で再構成して滅菌点眼液または懸濁液を形成することが可能である、請求項１に記載の組成物。
8. 前記組成物が、前記対象のメラノサイト内に前記組成物を送達するためのデバイスを含むキット中にある、請求項１に記載の組成物。
9. 前記組成物が、前記組成物に接触するように構成され、かつ前記対象の虹彩に接触して配置されるような大きさに作られた生体適合性の物体を含むキット中にある、請求項１に記載の組成物。
10. 前記生体適合性の物体が、ディスク、ストリップ、または綿撒糸を含む、請求項９に記載の組成物。