JP7425903B2 - プロテアーゼインヒビターを用いる血液プロファイリング - Google Patents

プロテアーゼインヒビターを用いる血液プロファイリング Download PDF

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Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、米国を指定し、英語で公開された2017年12月18日に出願された国際出願第PC T/AU2017/000282の国内段階出願である。本出願はまた、(1)2016年12月20日に出願された「プロテアーゼインヒビターを用いる血液プロファイリング(Blood Profiling with Protease Inhibitors)」と題する米国仮出願第62/436,875号、(2)2017年4月6日に出願された
「プロテアーゼインヒビターを用いる血液プロファイリング(Blood Profiling with Protease Inhibitors)」と題する米国仮出願第62/482,582号、及び(3)2017年6月22日に出願された「プロテアーゼインヒビターを用いる血液プロファイリング(Blood Profiling with Protease Inhibitors)」と題する米国仮出願第62/523,489号からの優先権の恩典を主張する。上記の関連出願の各々は、その全体が、引用により本明細書中に組み込まれる。
さらに、以下の出願:(1)2015年10月7日に出願された「血液の調製及びプロファイリン
グ(Blood Preparation and Profiling)」と題する豪州出願第2015904075号;(2)2016年10
月6日に出願された「血液の調製及びプロファイリング(Blood Preparation and Profilin
g)」と題する国際出願PCT/AU2016/000341号、及び(3)2015年12月22日に出願された「赤血
球を用いる治療法(Therapeutic Methods Using Erythrocytes)」と題する豪州出願第2015
905309号の各々は、その全体が、引用により本明細書中に組み込まれる。さらに、本開示
において参照される他の参考文献又は刊行物もまた、その全体が、引用により本明細書中
に組み込まれる。
(技術分野)
本開示は、全体として、血液学の分野に関する。本開示は、血液中でのタンパク質プロ
ファイリング並びに例えば、サイトカイン及び/又はケモカインプロファイルを含む血液
タンパク質プロファイルを、赤血球濃縮血液試料及び/又は赤血球成分から作成及び/又は
生成する方法に関する。
(背景)
血液のタンパク質プロファイリングは、様々な目的のために使用されている。例えば、
末梢血単核細胞(PBMC)及び血清/血漿中の指標タンパク質のプロファイリングは、疾患の
診断において一般に使用されている。さらに、血液内のタンパク質プロファイルをモニタ
リングすることは、治療に対する応答性をモニタリングする手段と寛解又は退行の指標と
を提供することにより、より効果的な治療的介入を導くのを助けることができる。
サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子などの血液中に見られる生物学的マーカーは
、炎症、免疫応答、及び修復に対する洞察を提供することができる。例えば、血液中の炎
症促進性及び/又は抗炎症性サイトカイン及びケモカインレベルの検出及び定量は、免疫
状態を測定するために利用されている。これらのサイトカイン及びケモカインは、特定の
病態を診断し、疾患を発症する素因を決定し、かつ/又は予後転帰を予測するために使用
することができる。しかしながら、様々な疾患の生物学的マーカーとして役立つことにな
るタンパク質の同定は、時間がかかり、かつ多大な労力を必要とすることがある。
典型的には、血液中の様々なタンパク質の検出及び定量は、分離血清/血漿、及び/又は
PBMCを用いて実施することができる。血液の豊富な細胞成分であり、かつ典型的には、そ
の体積の40％～50％を占める赤血球(Erythrocyte)/赤血球(RBC)は、とりわけ、血液の現
在の処理及びアッセイ方法を複雑化すると考えられているので、血液タンパク質解析を実
施する前にルーチンに除去され、廃棄される。また、RBCは、血液の全体的なタンパク質
プロファイルに対して顕著な寄与をすると考えられていない。さらに、血液タンパク質を
アッセイするために血漿/血清及びPBMCのようなあまり豊富でない血液成分に依存するこ
とは、例えば、血液タンパク質プロファイルの誤りを増大させ、様々な状況下でタンパク
質及び/又はタンパク質レベルの差を検出する能力を制限する可能性がある。当業者によ
ってこれまで十分には理解されていない血液試料由来のタンパク質のタンパク質プロファ
イリング及び他の評価においてRBCを使用する利点がある。
本開示は、本明細書に開示されるこれらの及びその他の問題を解決することを対象とし
ている。本開示はまた、本明細書における考察から明らかになるように、従来技術の欠点
の少なくとも1つを克服及び/又は改善することを対象としている。本開示はまた、RBCを
使用する1以上の利点の指摘を対象としている。
(開示の概要)
本開示は、血液タンパク質プロファイルを用いて、前述の問題のいくつかを解決するこ
とを対象としており、驚くことに、RBCが実質的なレベルでいくつかの異なるタンパク質(
例えば、サイトカイン、ケモカイン、及び/又は成長因子)の供給源であることを見出した
。さらに、本発明者らは、とりわけ、赤血球試料へのプロテアーゼインヒビターの添加が
疾患又は障害を有する人に由来する試料中の様々なタンパク質のレベルを調節するが、疾
患又は障害を有さない人に由来する赤血球試料中のタンパク質のレベルを同様には調節し
ないことを見出した。したがって、本発明者らは、とりわけ、様々なプロテアーゼインヒ
ビターと接触させたRBCにおけるタンパク質の存在、レベル、又はレベルの変化を評価す
ることにより、全血、濃縮赤血球試料、及び/又は赤血球成分からタンパク質プロファイ
ルを作成するための新規のかつ有用な実験技法を作り出した。この新規のかつ有用な実験
技法は、タンパク質を検出し、かつ/又は疾患もしくは障害を有する人と健常個体を識別
する能力を高めることにより、血液からタンパク質プロファイルを作成し、かつ/又は疾
患もしくは障害を検出するために現在の技法よりも改良されたものである。本開示は、と
りわけ、プロテアーゼインヒビターを用いて、全血、赤血球濃縮試料、赤血球濃縮画分、
及び/又は赤血球成分からタンパク質プロファイルを作成するための改善された方法、キ
ット、及び/又はシステムを提供し、それにより、限定されないが、タンパク質検出の誤
りの減少並びに関連血液試料中でのタンパク質検出及び示差発現の増大を含む、1以上の
利点を提供する。
本開示のある非限定的な実施態様が本明細書に開示されている。
ある実施態様は、タンパク質プロファイルを作成する方法であって、血液試料を採取す
ること;該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;該赤血球成分由来の1種以上のタン
パク質のレベルを測定すること;該赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接
触させること;該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた赤血球成分由来の1種
以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに該1種以上のプロテアーゼインヒビター
と接触させる前及び接触させた後の赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変
化を決定することを含み、ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分
を該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後にレベルの変
化を有する1種以上のタンパク質を含む、方法に対するものである。
ある実施態様は、タンパク質プロファイルを作成する方法であって、血液試料又は血液
試料由来の赤血球成分を採取すること;該血液試料又は該赤血球成分由来の第一の部分及
び第二の部分を採取すること;該血液試料又は該赤血球成分由来の第二の部分を1種以上の
プロテアーゼインヒビターと接触させること;該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分
及び第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること(ここで、該第一の部
分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない);並びに該血液試料又は
該赤血球成分の第一の部分及び該血液試料又は該赤血球成分の第二の部分由来の1種以上
のタンパク質のレベルの変化を決定することを含み、ここで、作成されたタンパク質プロ
ファイルが、該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び該血液試料又は該赤血球成分
の第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を
含む、方法に対するものである。いくつかの実施態様において、血液試料と赤血球成分の
両方が採取される。
ある実施態様は、タンパク質プロファイルを作成する方法であって、疾患又は障害を有
さない対象に由来する血液試料を採取すること;該血液試料由来の赤血球成分を採取する
こと;該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;該赤血球成分を1
種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;該1種以上のプロテアーゼインヒビ
ターと接触させた赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の赤血球成分由
来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定することを含み、ここで、作成されたタ
ンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接
触させた後の該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を含む、方法に対
するものである。
ある実施態様は、疾患タンパク質プロファイルを作成する方法であって、疾患又は障害
を有する対象から、他の実施態様の1つ又は複数に従って作成される第一のタンパク質プ
ロファイルを得ること;該疾患又は障害を有さない対象から、他の実施態様の1つ又は複数
に従って作成される第二のタンパク質プロファイルを得ること(ここで、該第二のタンパ
ク質プロファイルは、第一のタンパク質プロファイルが得られた同じ赤血球成分から得ら
れる);及び該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該
疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差を比較する
ことを含み、ここで、作成された疾患タンパク質プロファイルが、該疾患又は障害を有す
る対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来
の1種以上のタンパク質のレベルの変化の間で差がある1種以上のタンパク質を含む、方法
に対するものである。
いくつかの実施態様において、赤血球成分は、全血又は単離赤血球から採取される。他
の実施態様において、赤血球成分は、赤血球又は赤血球膜である。他の実施態様において
、2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパ
ク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタ
ンパク質、又は10種以上のタンパク質のレベルを測定する。ある実施態様において、3種
以上のタンパク質のレベルを測定する。ある他の実施態様において、赤血球成分を、1種
以上のプロテアーゼインヒビター、2種以上のプロテアーゼインヒビター、3種以上のプロ
テアーゼインヒビター、4種以上のプロテアーゼインヒビター、5種以上のプロテアーゼイ
ンヒビター、6種以上のプロテアーゼインヒビター、7種以上のプロテアーゼインヒビター
、8種以上のプロテアーゼインヒビター、9種以上のプロテアーゼインヒビター、又は10種
以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、赤血球成分を、
少なくとも2つのプロテアーゼインヒビターを含むプロテアーゼインヒビターカクテルと
接触させる。ある実施態様において、赤血球成分を、プロテアーゼインヒビターカクテル
A8127sと接触させる。いくつかの実施態様において、1種以上のプロテアーゼインヒビタ
ーは、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタロ
プロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及びアミノペプ
チダーゼインヒビターからなる群から選択される。他の実施態様において、1種以上のタ
ンパク質のレベルの変化は、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン
・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関か
らなる群から選択される統計解析によって決定される。ある実施態様において、1種以上
のタンパク質のレベルの変化は、0倍～5倍の倍数変化である。さらに他の実施態様におい
て、該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又
は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差は、スチューデン
トのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順
位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって
決定される。さらに他の実施態様において、該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上
のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク
質のレベルの変化の差は、該レベルの変化の増加又は該レベルの変化の減少である。ある
他の実施態様において、対象はヒト又は非ヒト動物である。いくつかの実施態様において
、1種以上のタンパク質のレベルは1以上の抗体を用いて測定される。他の実施態様におい
て、1種以上のタンパク質は、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、受容体、細胞内シ
グナル伝達物質、ホルモン、核内転写因子、神経伝達物質、細胞外マトリックス成分、糖
タンパク質、炎症性タンパク質、及び酵素からなる群から選択される。ある実施態様にお
いて、1種以上のタンパク質は、表1に掲載されているタンパク質又は表2に掲載されてい
るタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、疾患又は障害は
子癇前症である。ある実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、IL-1β、IL-8
、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra
、及びHGFからなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む子癇前症タンパク質プロ
ファイルである。他の実施態様において、疾患又は障害は結腸直腸癌である。さらに他の
実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、
エオタキシン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択される1種
以上のタンパク質を含む癌タンパク質プロファイルである。
ある実施態様は、対象における疾患又は障害をモニタリングする方法であって、該疾患
又は障害を有する対象から、第一の時点における第一の血液試料及び第二の時点における
第二の血液試料を採取すること;該疾患又は障害についての他の実施態様の1つ又は複数に
従って作成される疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベ
ルを該第一の血液試料及び第二の血液試料中で測定すること;並びに該第一の血液試料及
び第二の血液試料中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差を決定することを
含み、ここで、該第一の血液試料及び第二の血液試料中の少なくとも1種のタンパク質の
レベルの変化の差が該疾患又は障害の変化を示す、方法に対するものである。
ある実施態様は、対象における治療の効果をモニタリングする方法であって、該対象か
ら、第一の時点で他の実施態様の1つ又は複数に従って作成された第一のタンパク質プロ
ファイル及び第二の時点で他の実施態様の1つ又は複数に従って作成された第二のタンパ
ク質プロファイルを得ること;並びに該第一のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1
種のタンパク質のレベルの変化を該第二のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種
のタンパク質のレベルの変化と比較することを含み、ここで、該第一のタンパク質プロフ
ァイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と該第二のタンパク質プロファ
イル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が該治療の効果を示す、方法
に対するものである。ある実施態様において、該第一の時点は治療前であり、該第二の時
点は治療後である。いくつかの実施態様において、該第一の時点は治療前であり、該第二
の時点は治療中である。他の実施態様において、該第一の時点及び該第二の時点は治療中
である。さらに他の実施態様において、該第一の時点は治療中であり、該第二の時点は治
療後である。他の実施態様において、該第一の時点及び該第二の時点は治療後である。さ
らに他の実施態様において、該対象は同じ治療を受けたことがある。他の実施態様におい
て、該対象は異なる治療を受けたことがある。ある実施態様において、該血液試料は、少
量の血液試料である。他の実施態様において、該対象は、1日に1回以上、1日に2回以上、
1日に3回以上、1日に4回以上、及び1日に5回以上からなる群から選択される回数モニタリ
ングされる。さらに他の実施態様において、該対象は、1週間に1回以上、1週間に2回以上
、1週間に3回以上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、及び1週間に7回
以上からなる群から選択される回数モニタリングされる。ある実施態様において、該対象
は毎日モニタリングされる。いくつかの実施態様において、該対象は、1週間に1回、2週
間に1回、3週間に1回、及び4週間に1回からなる群から選択される回数モニタリングされ
る。
ある実施態様は、疾患又は障害を診断する方法であって、他の実施態様の1つ又は複数
に従って作成される少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイルを得ること;対象に由来
する血液試料を採取すること;該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;該赤血球成分
の少なくとも第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;該赤血
球成分の第一の部分における疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパ
ク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球成
分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルを測定すること;該赤血球成
分の第一の部分における少なくとも1種のタンパク質と該赤血球成分の第二の部分におけ
る少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を決定すること;並びに該赤血球成分の第一
の部分及び該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの変
化を該疾患タンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比
較することを含み、ここで、該疾患タンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパ
ク質のレベルの変化と比較して同じ又は同様の該赤血球成分の第一の部分及び該赤血球成
分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化が、該対象が該疾患
又は障害を有することを示す、方法に対するものである。
ある実施態様は、対象における疾患又は障害を診断する方法であって、他の実施態様の
1つ又は複数に従って作成される対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル
を得ること;並びに少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタン
パク質のレベルの変化を他の実施態様の1つ又は複数に従って作成される疾患タンパク質
プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較することを含み、
ここで、該疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変
化と同じ又は同様の該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少
なくとも1種のタンパク質のレベルの変化が、該対象が該疾患又は障害を有することを示
す、方法に対するものである。
ある実施態様は、対象における疾患又は障害を診断する方法であって、対象についての
他の実施態様の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイル
を得ること;疾患又は障害を有さない対象についての他の実施態様の1つ又は複数に従って
作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;及び該対象についての少
なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化
を該疾患又は障害を有さない対象についての他の実施態様の1つ又は複数に従って作成さ
れる少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベル
の変化と比較することを含み、ここで、該対象についての少なくとも1つのタンパク質プ
ロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さな
い対象についての他の実施態様の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパ
ク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が、該対象が該
疾患又は障害を有することを示す、方法に対するものである。
ある実施態様は、血液試料のタンパク質プロファイルを作成するためのキットであって
、赤血球成分を得るための少なくとも1つの試薬; 1種以上のプロテアーゼインヒビター;
及び該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定するための少なくとも1つの
試薬を含む、キットに対するものである。ある実施態様において、該キットは、対象由来
の血液試料を採取するための少なくとも1つの試薬をさらに含む。他の実施態様において
、1種以上のタンパク質のレベルを測定するための試薬は1以上の抗体である。さらに他の
実施態様において、1種以上のタンパク質の存在を検出するか又はそのレベルを測定する
ための試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)装置である。他の実施態様において、1
種以上のプロテアーゼインヒビターは、プロテアーゼインヒビターカクテルを含む。さら
に他の実施態様において、プロテアーゼインヒビターカクテルはA8127sである。
ある実施態様は、タンパク質プロファイルを作成する方法であって、疾患又は障害を有
する対象由来の血液試料を採取すること;該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して
、赤血球濃縮試料を産生すること;該赤血球濃縮試料を1種以上のプロテアーゼインヒビタ
ーと接触させること;及び1種以上のタンパク質の存在を該赤血球濃縮試料中で検出するこ
とを含み、ここで、作成されるタンパク質プロファイルが該赤血球濃縮試料中で検出され
る1種以上のタンパク質を含む、方法に対するものである。
ある実施態様は、タンパク質プロファイルを作成する方法であって、疾患又は障害を有
する対象由来の血液試料を採取すること;該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して
、赤血球濃縮試料を産生すること;該赤血球濃縮試料中の赤血球及び血漿を単離すること;
該赤血球を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;該赤血球中の1種以上
のタンパク質のレベル及び該血漿中の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並び
に該血漿中の1種以上のタンパク質のレベルに対する該赤血球中の1種以上のタンパク質の
レベルを含むタンパク質比を計算することを含み、ここで、作成されるタンパク質プロフ
ァイルが少なくとも2:1のタンパク質比を有する1種以上のタンパク質を含む、方法に対す
るものである。いくつかの実施態様において、1種以上のタンパク質は、少なくとも3:1、
少なくとも4:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも15:1、及び少なくとも20:1
からなる群から選択されるタンパク質比を有する。
ある実施態様は、タンパク質プロファイルを作成する方法であって、疾患又は障害を有
する対象由来の血液試料を採取すること;該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して
、赤血球濃縮試料を産生すること;該赤血球濃縮試料中の赤血球を1種以上のプロテアーゼ
インヒビターを含有する培地中でインキュベートすること;及び1種以上のタンパク質を該
培地中で検出することを含み、ここで、作成されるタンパク質プロファイルが該培地中で
検出される1種以上のタンパク質を含む、方法に対するものである。
ある実施態様において、本方法は、赤血球濃縮試料又は培地中で検出される1種以上の
タンパク質のレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施態様において、2種以
上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6
種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク
質、もしくは10種以上のタンパク質、11種以上のタンパク質、12種以上のタンパク質、13
種以上のタンパク質、14種以上のタンパク質、もしくは15種以上のタンパク質の存在を検
出するか、又は2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種
以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質
、9種以上のタンパク質、10種以上のタンパク質、11種以上のタンパク質、12種以上のタ
ンパク質、13種以上のタンパク質、14種以上のタンパク質、もしくは15種以上のタンパク
質のレベルを測定する。いくつかの実施態様において、3種以上のタンパク質の存在を検
出するか、又は3種以上のタンパク質のレベルを測定する。他の実施態様において、赤血
球濃縮試料を、2種以上のプロテアーゼインヒビター、3種以上のプロテアーゼインヒビタ
ー、4種以上のプロテアーゼインヒビター、5種以上のプロテアーゼインヒビター、6種以
上のプロテアーゼインヒビター、7種以上のプロテアーゼインヒビター、8種以上のプロテ
アーゼインヒビター、9種以上のプロテアーゼインヒビター、又は10種以上のプロテアー
ゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、赤血球濃縮試料を3種以上のプロ
テアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、該赤血球濃縮試料を3種以
上のプロテアーゼインヒビターと接触させ、かつ2種以上のタンパク質の存在を検出する
か、又は2種以上のタンパク質のレベルを測定する。さらに他の実施態様において、赤血
球濃縮試料を2種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させ、かつ3種以上のタンパク質
の存在を検出するか、又は3種以上のタンパク質のレベルを測定する。ある実施態様にお
いて、1種以上のプロテアーゼインヒビターは、セリンプロテアーゼインヒビター、シス
テインプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、及びアスパラギン
酸プロテアーゼインヒビターからなる群から選択される。
他の実施態様において、対象はヒト又は非ヒト動物である。さらに他の実施態様におい
て、1以上の抗体を用いて、1種以上のタンパク質の存在が検出されるか又は1種以上のタ
ンパク質のレベルが測定される。ある他の実施態様において、1種以上のタンパク質は、
ケモカイン、サイトカイン、成長因子、受容体、細胞内シグナル伝達物質、ホルモン、核
内転写因子、神経伝達物質、及び細胞外マトリックス成分、並びに酵素からなる群から選
択される。他の実施態様において、1種以上のタンパク質は、表1に掲載されているタンパ
ク質又は表2に掲載されているタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施態
様において、血液試料は、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、遠心分離、セルロー
スカラム、及びデキストラン沈降からなる群から選択される1以上の方法によって白血球
除去される。いくつかの実施態様において、赤血球は、デキストラン沈降によって白血球
除去される。
ある実施態様は、対象における疾患又は障害をモニタリングする方法であって、本明細
書に開示される他の実施態様の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク
質プロファイルを第一の時点及び第二の時点における該対象から得ること;並びに該第一
の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを該第二の時点におけ
る該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較することを含み、ここで、該
第二の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較した該第一
の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルにおける1種以上のタン
パク質の存在又はレベルの差が該疾患又は障害の変化を示す、方法に対するものである。
ある実施態様は、対象における治療をモニタリングする方法であって、他の実施態様の
1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを治療前及び治
療後の対象から得ること;並びに該治療前の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイ
ルを該治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較することを含み、
ここで、該治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較した該治療前
の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルにおける1種以上のタンパク質の存在又
はレベルの差が該対象に対する該治療の効果を示す、方法に対するものである。いくつか
の実施態様において、治療を全く受けたことがない対象の少なくとも1つのタンパク質プ
ロファイルは、治療を受けた後の該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比
較される。いくつかの実施態様において、治療を実質的に全く又はほとんど受けたことが
ない対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルは、治療を受けた後の該対象の少な
くとも1つのタンパク質プロファイルと比較される。いくつかの実施態様において、ある
時点における治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルは、異なる時点で
の該治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較される。他の実施態
様において、対象は同じ治療を受けたことがある。他の実施態様において、対象は実質的
に同じ治療又は同様の治療を受けたことがある。さらに他の実施態様において、対象は異
なる治療を受けたことがある。いくつかの実施態様において、血液試料は、少量の血液試
料である。いくつかの実施態様において、対象は、1日に1回以上、1日に2回以上、1日に3
回以上、1日に4回以上、及び1日に5回以上からなる群から選択される回数モニタリングさ
れる。他の実施態様において、対象は、1週間に1回以上、1週間に2回以上、1週間に3回以
上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、及び1週間に7回以上からなる群
から選択される回数モニタリングされる。ある実施態様において、対象は毎日モニタリン
グされる。他の実施態様において、対象は、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、及び
4週間に1回からなる群から選択される回数モニタリングされる。
ある実施態様は、疾患タンパク質プロファイルを作成する方法であって、疾患又は障害
を有する対象由来の血液試料を採取すること;該血液試料の少なくとも一部を白血球除去
して、赤血球濃縮試料を産生すること;該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテ
アーゼインヒビターと接触させること;該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上
のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該
赤血球濃縮試料の第二の部分の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに該
赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルを該赤血球濃縮
試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較することを含み、こ
こで、作成される疾患タンパク質プロファイルが、該赤血球濃縮試料の該第二の部分にお
ける該1種以上のタンパク質のレベルと比較して、該赤血球濃縮試料の該第一の部分にお
ける異なるレベルを有する1種以上のタンパク質を含む、方法に対するものである。いく
つかの実施態様において、該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパ
ク質のレベルと比較した該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク
質のレベルの差は、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイッ
トニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群
から選択される統計解析によって決定される。いくつかの実施態様において、2種以上の
タンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以
上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、
又は10種以上のタンパク質のレベルが測定される。ある実施態様において、3種以上のタ
ンパク質のレベルが測定される。いくつかの実施態様において、該疾患又は障害は子癇前
症である。他の実施態様において、該疾患タンパク質プロファイルは、IL-1β、IL-8、TN
F-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra、及
びHGFからなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む子癇前症タンパク質プロファ
イルである。さらに他の実施態様において、該疾患又は障害は癌である。他の実施態様に
おいて、該疾患タンパク質プロファイルは、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、エオタキ
シン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択される1種以上のタ
ンパク質を含む癌タンパク質プロファイルである。
ある実施態様は、疾患又は障害を診断する方法であって、対象由来の血液試料を採取す
ること;該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
少なくとも該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触
させること;該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上のタンパク質のレベル及び
該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球濃縮試料の第二の部
分の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに該赤血球濃縮試料の該第一の
部分における該1種以上のタンパク質のレベルを該赤血球濃縮試料の該第二の部分におけ
る該1種以上のタンパク質のレベルと比較することを含み、ここで、該赤血球濃縮試料の
該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較した該赤血球濃縮試料の該
第一の部分における1種以上のタンパク質のレベルの差が、該対象が該疾患又は障害を有
することを示す、方法に対するものである。いくつかの実施態様において、該1種以上の
タンパク質のレベルに差がないことは、対象が疾患又は障害を有さないことを示す。
ある実施態様は、対象が疾患又は障害を有するかどうかを決定する方法であって、該対
象由来の血液試料を採取すること;該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血
球濃縮試料を産生すること;少なくとも該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテ
アーゼインヒビターと接触させること;該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上
のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該
赤血球濃縮試料の第二の部分の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに該
赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルを該赤血球濃縮
試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較することを含み、こ
こで、該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較
して該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルに差がな
いことが、該対象が該疾患又は障害を有さないことを示す、方法に対するものである。
ある実施態様は、対象における疾患又は障害を診断する方法であって、本明細書に提供
される方法に従って作成される該対象由来の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを
得ること;及び該少なくとも1つのタンパク質プロファイルを少なくとも1つの疾患タンパ
ク質プロファイルと比較することを含み、ここで、該少なくとも1つの疾患タンパク質プ
ロファイル中の該1種以上のタンパク質の存在又はレベルと同様である該少なくとも1つの
タンパク質プロファイル中の1種以上のタンパク質の存在又はレベルが、該対象が該疾患
又は障害を有することを示す、方法に対するものである。いくつかの実施態様において、
得られる少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイルは、本明細書に提供される方法の1
つ又は複数に従って作成される。
ある実施態様は、対象における疾患又は障害を診断する方法であって、本明細書に提供
される方法に従って作成される該対象由来の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを
得ること;該疾患又は障害を有さない1以上の対象由来の少なくとも1つのタンパク質プロ
ファイルを得ること;及び該対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイル
を該疾患又は障害を有さない1以上の対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロ
ファイルと比較することを含み、ここで、該疾患又は障害を有さない1以上の対象から得
られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイル中の該1種以上のタンパク質の存在又は
レベルと比較した該対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイル中の該1
種以上のタンパク質の存在又はレベルの差が、該対象が該疾患又は障害を有することを示
す、方法に対するものである。
ある実施態様は、血液試料のタンパク質プロファイルを作成するためのキットであって
、血液試料を白血球除去し、赤血球濃縮試料を産生するための少なくとも1つの試薬; 1種
以上のプロテアーゼインヒビター;並びに該赤血球濃縮試料中の1種以上のタンパク質の存
在を検出するか又はそのレベルを測定するための少なくとも1つの試薬を含む、キットに
対するものである。いくつかの実施態様において、該キットは、対象から血液試料を採取
するための少なくとも1つの試薬をさらに含む。他の実施態様において、1種以上のタンパ
ク質の存在を検出するか又はそのレベルを測定するための試薬は、1以上の抗体である。
さらに他の実施態様において、1種以上のタンパク質の存在を検出するか又はそのレベル
を測定するための試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)装置である。
概要で論じられた実施態様と同様に、他の実施態様が、本明細書、図面、及び特許請求
の範囲に開示されている。概要は、各々の及び全ての実施態様を網羅することを意図する
ものではなく;組合せ又はバリエーションが本開示とともに企図される。
(図面の簡単な説明)
本開示の実施態様は、添付の図面を参照しながら、ほんの一例として記載されている。
図1A～1TTは、少量の全血中の様々なタンパク質のレベルを示す一連のグラフである。 図2A～2AAは、指穿刺(FT)又は静脈穿刺(V)によって健常対象から採取された全血試料から単離赤血球中の様々なタンパク質のレベルを示す一連のグラフである。 図3A～3Gは、塩化リチウムと接触させた赤血球中の様々なタンパク質のレベルを示す一連のグラフである。 図4A～4VVは、健常個体、健常妊婦、子癇前症妊婦、及び腫瘍患者からの単離赤血球中の様々なタンパク質のレベルの差を示す一連のグラフである。 図5A～5Cは、腫瘍患者から単離された血漿中のレベルに対する赤血球中の様々なタンパク質のレベルの比を示すチャートである。 図6A～6RRは、健常個体、健常妊婦、子癇前症妊婦、及び腫瘍患者からの単離赤血球由来の様々なタンパク質のレベルを示す一連のグラフである。 図7A～7Zは、RBCから放出されたタンパク質の濃度(黒色のカラム)及びインキュベーション後に細胞に残存しているタンパク質の濃度(灰色のカラム)に対するプロテアーゼインヒビター(PI)の効果を示す一連のグラフである。 図8A～8ZZは、健常個体、健常妊婦、子癇前症妊婦、及び腫瘍患者からの単離赤血球由来のタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビター(PI)の効果を示す一連のグラフである。 図9A～9FFは、健常個体、健常妊婦、子癇前症妊婦、及び腫瘍患者からの単離赤血球由来のタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビター(PI)の効果を示す一連のグラフである。 図10A～10Dは、健常個体、健常妊婦、子癇前症妊婦、及び腫瘍患者由来の赤血球から放出されたサイトカインの累積データに対するプロテアーゼインヒビター(PI)の効果を示す一連のグラフである。 図11A～11Dは、プロテアーゼインヒビター(PI)の存在下又は非存在下で健常個体、健常妊婦、子癇前症妊婦、及び腫瘍患者由来の赤血球から放出されたサイトカインの累積データの差を示す一連のグラフである。 図12A～12VVは、健常個体由来の赤血球から放出されたサイトカインに対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図13A～13VVは、健常個体由来の赤血球から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図14A～14AAは、健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図15A～15AAは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたサイトカインに対する個々のプロテアーゼインヒビター及びプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図16A～16AAは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図17A～17AAは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたサイトカインと比較した健常個体由来の赤血球から放出されたサイトカインに対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図18A～18AAは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたサイトカインと比較した健常個体由来の赤血球から放出されたサイトカインの倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図19A～19VVは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインと比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインの倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図20A～20LLは、健常個体由来の赤血球から放出された他のタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビター及びプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図21A～21LLは、健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインと比較した健常個体由来の赤血球から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図22A～22VVは、リンパ腫を有する個体と比較した健常個体由来の全血溶解物から得られる赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図23A～23VVは、リンパ腫を有する個体と比較した健常個体由来の単離赤血球から得られる赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図24A～24VVは、変形性関節症を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図25A～25VVは、子癇前症を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図26A～26VVは、子宮内発育不全を伴う子癇前症を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図27A～27VVは、潰瘍性大腸炎を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図28A～28VVは、十二指腸潰瘍を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたサイトカインに対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図29A～29LLは、リンパ腫を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球から放出された他のタンパク質に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図30A～30NNは、変形性関節症を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球から放出された他のタンパク質に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図31A～31NNは、潰瘍性大腸炎を有する個体と比較した健常個体由来の赤血球から放出された他のタンパク質に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図32は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図33は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図34は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図35は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図36は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図37は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図38は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図39は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図40は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図41は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図42は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図43は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図44は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図45は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を示す一連のグラフである。 図46は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図47は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図48は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図49は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図50は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図51は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図52は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図53は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図54は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図55は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図56は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図57は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図58は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図59は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の濃度に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図60は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図61は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図62は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図63は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図64は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図65は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図66は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図67は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図68は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図69は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図70は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図71は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図72は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図73は、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図74は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図75は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図76は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図77は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図78は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図79は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図80は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図81は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図82は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図83は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図84は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図85は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図86は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。 図87は、結腸直腸癌を有する健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質と比較した健常個体由来の赤血球膜から放出されたタンパク質の倍数変化に対するプロテアーゼインヒビターカクテルの効果を示す一連のグラフである。
(定義)
本出願で使用される場合、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、別途文脈によって
明確に指示されない限り、複数の指示物を含む。例えば、「細胞溶解物(a cell lysate)
」という用語は、複数の細胞溶解物(cell lysates)を含む。
本明細書で使用される場合、「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)
」を意味する。「含む(comprising)」という単語のバリエーション、例えば、「含む(com
prise)」及び「含む(comprises)」は、それに応じて変化した意味を有する。したがって
、例えば、工程「A」及び「B」を「含む」方法は、もっぱら工程「A」及び「B」からなり
得るか、又は1以上のさらなる工程(例えば、工程「A」、「B」、及び「C」)を含み得る。
詳細な説明において使用される主題の見出しは、参照の容易さ又は読者のために含まれ
ており、本開示又は特許請求の範囲の全体を通して見られる主題を制限するために使用さ
れるべきではない。主題の見出しは、請求項の範囲又は請求項の限定を解釈する際に使用
されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥
類、及び齧歯類種を含む経済的に、社会的に、又は研究に重要な動物を含む。それゆえ、
「対象」は、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物などの哺乳動物であり得る。
本明細書で使用される場合、「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」という用語
は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む)、IgA(IgA1及びIgA2を含む)、IgD、IgE、又
はIgM、並びにIgY、単鎖全抗体を含む全抗体、並びにこれらの抗原結合断片を含む。抗原
結合抗体断片には、Fab、Fab'及びF(ab')2、Fd、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド
結合Fv(sdFv)、及びVL又はVHドメインのいずれかを含む断片が含まれるが、これらに限定
されない。抗体は、動物起源に由来し得る。単鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変領
域を、単独で又は以下のもの:ヒンジ領域、CH1、CH2、及びCH3ドメインの全体もしくは部
分と組み合わせて含み得る。また、可変領域とヒンジ領域とCH1、CH2、及びCH3ドメイン
の組合せも含まれる。抗体は、生体分子と特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、並びにヒトモノクローナル抗
体及びポリクローナル抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって一緒
に連結されたアミノ酸から構成されるポリマーを指す。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」、又は「プロテイナ
ーゼ」という用語は、タンパク質のペプチド結合を加水分解によって破壊し、切断し、又
はタンパク質分解する酵素を指す。プロテアーゼには、特定のタンパク質基質(例えば、
特定のタンパク質)に特異的であり、かつ/又はそれを特異的に切断するもの、1種類のタ
ンパク質基質に特異的であるもの(例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアー
ゼ、メタロプロテアーゼ、もしくはアスパラギン酸プロテアーゼ)、又は複数の種類のタ
ンパク質基質に特異的であるもの(例えば、システイン及びセリンプロテアーゼ)が含まれ
得る。プロテアーゼには、タンパク質基質に非特異的であるか、又はそれを非特異的に切
断するもの(例えば、ペプシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、エキソプロテアーゼ、
エンドプロテアーゼなど)も含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼインヒビター」という用語は、プロテアー
ゼ酵素の触媒(例えば、タンパク質分解)活性を遮断し又は低下させる物質(例えば、タン
パク質又は化学物質)を指す。プロテアーゼインヒビターは、プロテアーゼが、所与のタ
ンパク質のペプチド結合を切断する能力を、典型的には、プロテアーゼの活性部位を遮断
して、それが基質に接近するのを妨げることにより遮断し得る。非限定的な例として、プ
ロテアーゼインヒビターには、非特異的プロテアーゼインヒビター(例えば、EDTA)、特異
的プロテアーゼインヒビター(セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアー
ゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒ
ビター、及びアミノペプチダーゼインヒビターを含む)、又は二重特異性、多特異性、も
しくは汎特異性プロテアーゼインヒビター(セリン及びシステインプロテアーゼインヒビ
ターを含む)が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質プロファイル」という用語は、試料中に存在
するタンパク質及び/又はタンパク質断片を指す。試料は、細胞を含んでいても、含んで
いなくてもよい。試料が細胞を含む場合、タンパク質又はタンパク質断片は、細胞内に及
び/又は部分的にもしくは完全に細胞表面に存在し得る。必要条件ではないが、タンパク
質プロファイルは、試料中のタンパク質及び/又はタンパク質断片についての定量的情報
も提供し得る。
本明細書で使用される場合、「血液試料」という用語は、血液及び/又は血液成分を少
なくとも一部含む試料を指す。血液試料は、1以上の対象から直接的に又は1以上の対象由
来の血液の既存のコレクションから得ることができる。血液試料は、いくつかの方法によ
って、例えば、身体部分(例えば、腕、脚、耳)の静脈穿刺(例えば、翼状針及びバキュテ
ナー、直針及びバキュテナー、並びに翼状針及びシリンジ)、又は穿刺(例えば、指穿刺、
踵穿刺、もしくは耳穿刺)によって、ヒト対象から採取することができる。血液試料は、
いくつかの方法によって、例えば、身体部分(例えば、尾部、腕、脚(例えば、大腿部)、
鼻、顔、耳、胸部、首/喉、舌、心臓)の静脈穿刺(例えば、針及びシリンジ)又は穿刺(例
えば、指穿刺、踵穿刺、耳穿刺、もしくは尾部穿刺)によって、非ヒト哺乳動物対象から
採取することができる。血液試料は、いくつかの方法によって、例えば、身体部分(例え
ば、翼、喉、又は心臓)の静脈穿刺(例えば、針及びシリンジ)によって、他の非ヒト動物(
例えば、ニワトリ又は鳥)から採取することができる。
本明細書で使用される場合、「血液細胞」又は「血液試料中に存在する細胞」という用
語は、赤血球及び白血球を含む、試料中の細胞を指すが、血小板を除外する又は実質的に
除外する。
本明細書で使用される場合、「赤血球濃縮試料」、「赤血球試料」、又は「RBC濃縮画
分」という用語は、RBCの割合が濃縮前の血液試料のものと比較して増加している試料又
は試料の成分を指す。RBCの割合は、例えば、別々の試料を提供するために、試料からRBC
ではない細胞型を除去すること(例えば、白血球の除去(白血球除去)及び/もしくは血小板
の除去)により、並びに/又は試料中の他の細胞型からRBCを取り出すことにより増加させ
ることができる。赤血球濃縮試料は、培地、血漿/血清、上清、及び/又は細胞洗浄液から
も構成され得る。RBC濃縮画分は、全血液細胞数の99.5％超、99.6％超、99.7％超、99.75
％超、99.8％超、99.85％超、99.9％超、99.5％超、約100％の赤血球、又は100％の赤血
球を含み得る。
本明細書で使用される場合、「赤血球成分」という用語は、全/無傷赤血球及び赤血球
の成分又は要素を指す。例えば、ある実施態様において、赤血球成分は赤血球である。他
の実施態様において、赤血球成分は赤血球膜である。赤血球は、例えば、全血又は赤血球
濃縮試料から採取することができる。赤血球膜は、全血、赤血球濃縮試料、及び/又は単
離赤血球から採取及び/又は産生することができる。
本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、一般的に、急速期間内で(例
えば、数ミリ秒、1～2秒、1～5秒、1～10秒、1～15秒、1～20秒、10～20秒、10～30秒、3
0～60秒、1分未満、又は2分未満の期間で)、その凝固点未満の温度まで血液細胞(例えば
、RBC)及び/又は血漿/血清を凍結させることを指す。
本明細書で使用される場合、「白血球除去」は、別々の白血球除去試料を提供するため
に、例えば、血液試料もしくは血液試料成分から白血球を除去することによるか、又は血
液試料もしくは血液試料成分から他の血液成分を取り出すことにより、血液試料又は血液
試料成分中の白血球の割合を低下させることを指す。いくつかの実施態様において、白血
球除去には、血小板除去が含まれる。
本明細書で使用される場合、「血小板除去」は、別々の血小板除去試料を提供するため
に、例えば、血液試料もしくは血液試料成分から血小板を除去することによるか、又は血
液試料もしくは血液試料成分から他の血液成分を単離することにより、血液試料又は血液
試料成分中の血小板の割合を低下させることを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞上清」は、細胞の集団が、所定の温度又は所定の温
度範囲で、所定の期間、例えば: 30分、1時間、2時間、3時間、6時間、12時間、24時間、
48時間、72時間、96時間、又は120時間よりも長い間、インキュベート又は培養される細
胞培養培地を意味するものと理解される。
本明細書で使用される場合、「細胞洗浄液」は、細胞洗浄液が一般に細胞培養用の培地
として使用されない限り、細胞の集団をすすぐために使用されており、かつ上で定義され
ている細胞上清とは異なる液体を意味するものと理解される。したがって、「細胞洗浄液
」を作製するために使用される流体は、30分、20分、15分、10分、5分、4分、3分、2分、
1分、又は30秒:未満の期間、細胞集団と混合することができる。
本明細書で使用される場合、「培地(media)」又は「培地(medium)」は、血液試料内の
細胞、血液試料から単離された細胞、又は血液試料から単離された細胞から産生された細
胞成分の生存能力を維持する能力を有する組成物を指す。培地(media)は、細胞の成長及
び増殖を刺激するか、又は細胞を特定の及び/もしくは既存の成長状態に維持することが
できる。培地(media)の非限定的な例としては、等張塩溶液、平衡化塩溶液、生理食塩水
、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ハンクス平衡化塩溶液(HBSS)、アール平衡化塩溶液(EBSS
)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)、最小必須培地(MEM)、改良型最小必須培地(I
MEM)、イーグル最小必須培地(EMEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、及びイスコフ
改変ダルベッコ培地(IMDM)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「少量」という用語は、1ミリリットル以下である血液の
量を指す。少量は、1μL～100μL、100μL～200μL、200μL～300μL、300μL～400μL、
400μL～500μL、500μL～600μL、600μL～700μL、700μL～800μL、800μL～900μL、
及び900μL～1000μLであり得る。いくつかの実施態様において、少量は、50μL～100μL
、100μL～150μL、150μL～200μL、200μL～250μL、250μL～300μL、300μL～350μL
、350μL～400μL、400μL～450μL、450μL～500μL、500μL～550μL、550μL～600μL
、600μL～650μL、650μL～700μL、700μL～750μL、750μL～800μL、800μL,～850μ
L、850μL～900μL、900μL～950μL、950μL～1000μLである。いくつかの実施態様にお
いて、少量は、1μL～10μL、10μL～20μL、20μL～30μL、30μL～40μL、40μL～50μ
L、50μL～60μL、60μL～70μL、70μL～80μL、80μL～90μL、又は90μL～100μLであ
る。他の実施態様において、少量は、0.1μL～0.5μL、0.5μL～1μL、1μL～5μL、5μL
～10μL、10μL～15μL、15μL～20μL、20μL～25μL、25μL～30μL、30μL～35μL、3
5μL～40μL、40μL～45μL、45μL～50μL、50μL～55μL、55μL～60μL、60μL～65μ
L、65μL～70μL、70μL～75μL、75μL～80μL、80μL～85μL、85μL～90μL、90μL～
95μL、又は95μL～100μLである。いくつかの実施態様において、少量は、5μL～10μL
、5μL～15μL、5μL～20μL、5μL～25μL、5μL～30μL、5μL～35μL、5μL～40μL、
5μL～45μL、5μL～50μL、5μL～55μL、5μL～60μL、5μL～65μL、5μL～70μL、5
μL～75μL、5μL～80μL、5μL～85μL、5μL～90μL、5μL～95μL、又は5μL～100μL
である。他の実施態様において、少量は、0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5
μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17
μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL、26μL、27μL、28μL
、29μL、30μL、31μL、32μL、33μL、34μL、35μL、36μL、37μL、38μL、39μL、4
0μL、41μL、42μL、43μL、44μL、45μL、46μL、47μL、48μL、49μL、又は50μLで
ある。
本明細書で使用される場合、「検出可能なレベル」又は「検出のレベル」という用語は
、試料(例えば、血液試料)中の所望の分子、例えば、タンパク質の存在を示す及び/又は
示唆する組成物又は薬剤の能力を指す。赤血球濃縮試料において、例えば、タンパク質の
検出可能なレベルは、検出に利用可能なタンパク質の増加のために増加し得る。この増加
は、例えば、タンパク質の検出を妨害する及び/又は減少させるタンパク質-分子相互作用
(例えば、タンパク質-タンパク質、タンパク質-膜、タンパク質-核酸)の破壊を介する1以
上の理由によるものであり得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質の「レベルの変化(change in level)」又は「
レベルの変化(change in the level)」という用語は、当業者であれば、同じ、実質的に
同じ、同様の、又は実質的に同様のタンパク質レベルであると考えない検出可能なタンパ
ク質のレベルの増加又は減少を指す。したがって、当業者であれば、検出可能なタンパク
質のレベルの増加又は減少を、例えば、観測(例えば、クロマトグラフィー)、統計検定(
例えば、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定
、ウィルコクソンの順位和、もしくはスペルマン(Spermans)の順位相関)、又は測定され
るタンパク質レベルの関連性のある倍数変化(例えば、統計的に有意な倍数変化(例えば、
0を上回る倍数変化、0.5を上回る倍数変化、1を上回る倍数変化、もしくは1.5を上回る倍
数変化))の計算の結果によって、統計的に有意であると認識するであろう。
本明細書で使用される場合、タンパク質のレベルに「変化がない」又は「差がない」と
いう用語は、タンパク質レベルが増加も減少もしていない(例えば、タンパク質レベルが
同じである)こと、又は当業者であれば、タンパク質レベルが同じもしくは実質的に同様
であると考えるほどにわずかなタンパク質レベルの増加もしくは減少を指す。したがって
、当業者であれば、検出可能なタンパク質のレベルの増加又は減少を、観測(例えば、ク
ロマトグラフィー)、統計検定(例えば、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モ
デル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、もしくはスペルマン(Sperman
s)の順位相関)、又は測定されるタンパク質レベルの関連性のある倍数変化(例えば、統計
的に有意な倍数変化(例えば、0.5を下回る倍数変化、1.0を下回る倍数変化、もしくは1.5
を下回る倍数変化))の計算の結果によって、統計的に有意でないと認識するであろう。
本明細書で使用される場合、「異なるレベルの変化」又は「レベルの変化の差」は、別
の試料又は対象における1種以上のタンパク質のレベルの変化と同じでない、実質的に同
じでない、同様でない、又は実質的に同様でない1つの試料又は対象(例えば、疾患又は障
害を有さない対象と比較した疾患又は障害を有する対象)における1種以上のタンパク質の
レベルの変化を指す。例えば、1種以上のタンパク質のレベルの変化の差には:別の対象に
おける同じタンパク質レベルの減少と比較したある対象におけるタンパク質レベルの増加
;別の対象における1種以上のタンパク質のレベルの変化と比較したある対象におけるより
大きいもしくはより小さい程度の1種以上のタンパク質のレベルの変化(例えば、異なる対
象におけるタンパク質レベルの増加もしくは減少よりも大きいもしくは小さいある対象に
おけるタンパク質レベルの増加もしくは減少);又は別の対象におけるレベルの変化がない
ことと比較したある対象におけるレベルの変化(例えば、他の対象におけるタンパク質レ
ベルの有意な増加もしくは減少がないことと比較したある対象におけるタンパク質レベル
の増加もしくは減少)が含まれ得る。レベルの変化の差は、データ可視化(例えば、チャー
トもしくはグラフ)又は統計解析(例えば、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果
モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、もしくはスペルマン(Sperm
ans)の順位相関)を含む、解析法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、RBCからのタンパク質の「放出」は、活性のある又は不活
性な機構によって、(i)RBCの細胞内領域又は内部からRBCの表面及び/又は細胞外もしくは
外部領域(例えば、血漿、血清、及び/又は培地)に移動したか、或いは(ii)RBCの細胞外又
は外部領域から(例えば、血漿、血清、及び/又は培地から)RBCの表面並びに/又は細胞外
領域もしくは外部に移動したタンパク質を指す。いくつかの実施態様において、該タンパ
ク質は、細胞表面タンパク質結合相互作用(例えば、受容体、共有結合、非共有結合、及
び/又は接着)によって、RBCの表面に結合し得る。他の実施態様において、該表面結合タ
ンパク質は、RBCの細胞外又は外部領域に(例えば、血漿、血清、及び/又は培地に)もう一
度放出され得る。
本明細書で使用される場合、「治療」は、疾患、障害、もしくは疾病、及び/又はこれ
らに関連する症状の1以上の症状の予防、軽減、又は改善を含む、疾患、障害、もしくは
疾病の予防、管理、軽減、又は改善において使用し得る1以上の療法、プロトコル、方法
、及び/又は薬剤を指す。ある実施態様において、「治療(treatment)」及び「治療(treat
ments)」という用語は、疾患、障害、又は疾病の予防、管理、軽減、及び/又は改善にお
いて有用な生物療法、支持療法、及び/又は他の療法を指す。
本明細書で使用される場合、「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という語句は、当
業者であれば、2つの値(例えば、タンパク質濃度/レベル又はレベルの変化(例えば、倍数
変化))の差が、該値によって測定される生物学的特徴との関連において、ほとんど又は全
く生物学的に及び/又は統計的に有意でないと考えるような、2つの数値間の十分に高い類
似度を意味する。例えば、2つの値の差は、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20
％未満、約10％未満、又は約5％未満であり得る。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、本明細書に記載される実施態様
の1つ又は複数を実施するのに有用な構成要素を有する送達系を指す。非限定的な例とし
て、該キットは:血液を収集する方法、プロテアーゼを阻害する方法、タンパク質検出を
増大させる方法、凝固を防止する方法、血液を安定化する方法、赤血球成分を採取する方
法、RBCの濃縮方法、非RBC血液成分の除去/分離方法、血液もしくはその成分を瞬間凍結
させる方法、細胞を溶解させる方法、細胞を洗浄する方法、細胞を培養する方法、特定の
標的タンパク質を細胞内及び/もしくは細胞外で検出する方法、又はこれらの組合せを含
み得る。いくつかの実施態様において、キットは、以下のもの:対象から血液試料を採取
するための装置(例えば、シリンジ、針、翼状針、チューブ、針ホルダー、採血セット、
輸送装置、バキュテナー、hemaPEN(商標));対象から乾燥血液試料を採取するための装置(
例えば、濾紙、カード、HemaSpot(商標));液体血液試料から赤血球画分、白血球画分、及
び/又は血小板画分を採取するための装置(例えば、抗体がコーティングされた磁気ビーズ
);プロテアーゼインヒビター;カチオン塩;抗凝固剤;プロテアーゼインヒビター;タンパク
質変性剤;などうちの1つ又は複数を含み得る。そのような送達系は、ある場所から別の場
所への反応試薬の貯蔵、輸送、もしくは送達を可能にするシステム(例えば、適切な容器
中のラベル、参照試料、補助材料など)及び/又は補助材料(例えば、バッファー、アッセ
イを実施するための説明文書など)を含み得る。例えば、キットは、関連する反応試薬及
び/又は補助材料を含有する1以上の筐体、例えば、箱を含み得る。「キット」という用語
は、小分けされたキットと組み合わされたキットの両方を含む。
本明細書で使用される場合、「小分けされたキット」という用語は、全キット構成要素
のサブ部分を含有する2以上の別々の容器を含む送達系を指す。容器は、意図されたレシ
ピエントに、一緒に又は別々に送達され得る。全キット構成要素のサブ部分を含有する2
以上の別々の容器を含む送達系は、「小分けされたキット」という用語の意味に含まれる
。
本明細書で使用される場合、「組み合わされたキット」は、単一の容器中(例えば、所
望の構成要素の各々を収納する単一の箱の中)に反応アッセイの構成要素を含有する送達
系を指す。
本明細書における従来技術の文書、又はその文書から派生したもしくはその文書に基づ
いた本明細書における意見の記載はいずれも、該文書又は派生意見が関連分野の共通した
一般知識の一部であるという承認ではない。
(詳細な説明)
血液中のタンパク質レベルをプロファイリングするための現在使用されている技法は、
通常、分析を血清/血漿及び/又はPBMCに制限している。RBCは血液処理及び/又は血液タン
パク質測定を妨害すると考えられているので、RBCは、タンパク質プロファイルの作成前
の血液処理の間に、ルーチンに除去され、廃棄される。
本発明者らは、RBCがタンパク質マーカーの重要な供給源を提供するという予期しない
発見及び赤血球濃縮試料とプロテアーゼインヒビターとの接触が疾患又は障害を有する対
象におけるタンパク質マーカーの検出可能なレベルを調節する一方で、該疾患又は障害を
有さない対象由来の赤血球試料におけるタンパク質レベルを変化させないままにするか又
は示差調節するという予期しない発見をした。したがって、現在の技術の欠点は、RBCが
本明細書に記載される様々なタンパク質マーカーの供給源を提供するとこれまで認識され
ておらず、したがって、タンパク質プロファイリングからのRBCの排除が不十分かつ/又は
不正確な評価を提供するという点で確認されている(2015年10月7日に出願された「血液の
調製及びプロファイリング(Blood Preparation and Profiling)」と題する豪州出願AU201
5904075号及び2016年10月6日に出願された「血液の調製及びプロファイリング(Blood Pre
paration and Profiling)」と題する国際出願PCT/AU2016/000341号も参照)。さらに、現
在の技術は、血液試料中のプロテアーゼインヒビターの存在に応答した赤血球タンパク質
マーカーのレベルの非特異的及び/又は特異的変化に基づく疾患又は障害を有する対象と
疾患又は障害を有さない対象の簡単な及び/又は迅速な描写に適していない。本開示は、
血液タンパク質プロファイリングの欠点を是正し、疾患又は障害を有する対象におけるタ
ンパク質レベル/検出を調節するためにプロテアーゼインヒビターと接触させたRBCの解析
を組み込んでいる血液からタンパク質プロファイルを作成するための新規のかつ有用な実
験技法を提供する。本明細書に提供される新規のかつ有用な実験技法は、診断、予後予測
、及び/又は治療用途を有する。
以下の説明は、当業者がそれを実施することができる程度に十分詳細に、本開示の例示
的な実施態様を示している。記載されている様々な実施態様の特徴又は限定は、本開示の
他の実施態様又は本開示全体を必ずしも限定するものではない。したがって、以下の詳細
な説明は、特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定するものではない。
(赤血球(RBC)におけるタンパク質プロファイリング)
本開示は、RBCを含む血液試料、赤血球濃縮試料、赤血球成分、及び/又は血液試料成分
からタンパク質プロファイルを生成する方法であって、プロテアーゼインヒビターを使用
することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、RBCの数は、血液試料又は
血液試料成分中に存在する血液細胞の総数の0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％
、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.75％、99.9
％、又は99.95％超を占める。
(血液試料)
提供されている方法において対象から採取される血液試料は、本明細書に定義されてい
る通りであり(例えば、「血液試料」を参照)、対象又は既存の血液コレクション(例えば
、1以上の対象から以前に得られた血液及び/又は保存された血液)から採取することがで
きる。該血液試料は、当業者に利用可能な例示的な手段を用いて、対象から採取すること
ができる(例えば、世界保健機関、「血液、血液成分、及び血漿派生物の採取、処理、及
び品質管理のための要件(Requirements for the collection, processing and quality c
ontrol of blood, blood components and plasma derivatives)」、世界保健機関の技術
レポートシリーズ、第840号、1994年、付録2を参照)。非限定的な例として、該血液試料
は、静脈血、毛細管血、動脈血、又はこれらの組合せを用いて、対象から採取することが
できる。
ある実施態様において、少量の血液試料は、対象又は既存の血液コレクションから採取
される。少量は、例えば、穿刺(例えば、指穿刺、踵穿刺、耳穿刺、又は尾部穿刺)による
ものを含む、様々な方法によって、対象から採取することができる。いくつかの実施態様
において、少量の血液試料は、指穿刺、踵穿刺、もしくは耳穿刺、又は乾燥血液スポット
によって(例えば、ヒトから)採取される。他の実施態様において、少量の血液試料は、尾
部穿刺によって(例えば、マウス又はラットから)採取される。他の実施態様において、少
量の血液試料は、指穿刺によって採取される。他の実施態様において、少量の血液試料は
、踵穿刺によって(例えば、乳児から)採取される。さらに他の実施態様において、少量の
血液試料は、耳穿刺によって採取される。さらなる実施態様において、少量の血液試料は
、尾部穿刺によって採取される。
いくつかの実施態様において、少量は、本明細書に定義されている通りである(例えば
、「少量」を参照)。他の実施態様において、少量は、1μL～10μL、5μL～100μL、又は
5μL～50μLである。他の実施態様において、少量は、5μL～20μL又は5μL～10μLであ
る。さらに他の実施態様において、少量は、5μLである。他の実施態様において、少量は
、1μLである。
少量の血液試料の採取は、対象への害(例えば、疼痛、失血、血中濃度の遅い回復)を減
少させるので、少量の血液試料の採取は、より多い量の血液試料と比較して、例えば、対
象のより頻繁なサンプリングを可能にする。例えば、包括的な血液分析は、動物を屠殺し
なければならないほど多くの血液を必要とするので、典型的な現在の方法を用いて、小動
物(例えば、ラット、マウス)からの頻繁な採血は達成可能ではない。同様に、失血による
害を防ぐために、乳児からは、穿刺(例えば、踵穿刺)によってしか頻繁に安全にサンプリ
ングすることができない。本明細書に提供されるある実施態様において、少量の血液試料
が採取される。ある実施態様において、少量の血液試料は、1日に1回以上、1日に2回以上
、1日に3回以上、1日に4回以上、又は1日に5回以上の頻度で採取される。他の実施態様に
おいて、少量の血液試料は、1週間に1回以上、1週間に2回以上、1週間に3回以上、1週間
に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、又は1週間に7回以上採取される。他の実
施態様において、少量の血液試料は、毎日採取される。さらに他の実施態様において、少
量の血液試料は、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、又は4週間に1回採取される。あ
る実施態様において、少量の血液試料は、1カ月に1回採取される。
(濃縮赤血球試料又は画分)
いくつかの実施態様において、本方法は、赤血球濃縮試料、赤血球濃縮画分、又は赤血
球からタンパク質プロファイルを作成又は生成すること、及び赤血球濃縮試料、赤血球濃
縮画分、又は赤血球中の1種以上のタンパク質のレベルを決定することを含む。赤血球濃
縮試料及び赤血球濃縮画分は、例えば、白血球除去及び/又は血小板除去によって、血液
試料から産生することができる。それに加えて又はその代わりに、RBCを試料から取り出
して、赤血球濃縮試料又は赤血球濃縮画分を産生することができる。
白血球除去及び血小板除去のための様々な方法が利用可能である(例えば、Wenz, B.の
文献、「白血球除去の方法(Methods for leukodepletion)」、「白血球除去した血液製剤
の臨床的利益(Clinical Benefits of Leukodepleted Blood Products)」、pp 5-16, 1995
, Springer Berlin Heidelberg所収; Novotny V.及びBrand, A.の文献、「白血球除去血
及び血小板輸血(Leukocyte-Poor Blood and Platelet Transfusions)」、「現代の輸血医
学(Modern Transfusion Medicine)」、pp 117-121, 1995, CRC Press社所収; White及びJ
enningsの文献、「血小板プロトコル:研究及び臨床実験手順(Platelet Protocols: Resea
rch and Clinical Laboratory Procedures)」、1999, Academic Pressを参照)。白血球除
去のための好適な技法の非限定的な例としては、フローサイトメトリー、デキストラン沈
降、フィコール/パーコール密度勾配遠心分離などが挙げられる。
本開示は、赤血球濃縮試料を産生すること及び該赤血球濃縮試料中の1種以上のタンパ
ク質の存在を検出するか又は該タンパク質のレベルを測定することにより、血液試料中の
1種以上のタンパク質の検出又は測定の感度を増大させる方法も提供する。ある実施態様
において、血液とデキストランの比は、1:1～2:1、1:1～3:1、1:1～4:1、1:1～5:1、1:1
～6:1、1:1～7:1、1:1～8:1、1:1～9:1、又は1:1～10:1である。他の実施態様において、
血液とデキストランの比は、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、又は10:1
である。さらに他の実施態様において、血液とデキストランの比は、2:1である。さらな
る実施態様において、血液とデキストランの比は、4:1である。
非限定的な例として、赤血球濃縮試料又は赤血球濃縮画分は、血液試料中に存在してい
た白血球数の90％、92.5％、95％、97.5％、99％、99.5％、99.75％、又は99.9％超の白
血球除去によって生成される。この文脈における「白血球除去」は、別々の白血球除去(R
BC濃縮)画分を提供するために、該血液試料から白血球を直接除去することにより、及び/
又は該試料からRBCを取り出すことにより達成することができる。いくつかの実施態様に
おいて、白血球除去には血小板除去が含まれる。
それに加えて又はその代わりに、赤血球濃縮試料又は赤血球濃縮画分は、血液試料中に
存在していた血小板数の90％、92.5％、95％、97.5％、99％、99.5％、99.75％、又は99.
9％超の血小板除去によって生成される。この文脈における「血小板除去」は、別々の血
小板除去(RBC濃縮)画分を提供するために、該血液試料から血小板を直接除去することに
より、及び/又は該試料からRBCを取り出すことにより達成することができる。
いくつかの実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球濃縮画分は、99.75％超、99.
8％超、99.9％超、99.95％超、約100％、又は100％の赤血球を(RBC濃縮画分内に存在する
血液細胞の総数の成分として)含むことができる。
所与の濃縮試料又は赤血球濃縮画分におけるRBCのパーセンテージは、例えば、フロー
サイトメトリー、蛍光顕微鏡法、他の抗体ベースの技法などを含む、当業者に利用可能な
方法を用いて評価することができる。
(赤血球膜)
ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、赤血球膜及び/又は赤血球ゴー
ストからタンパク質プロファイルを作成又は生成することを含む。赤血球膜は、細胞質タ
ンパク質の一部(例えば: 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95
％、又は99％超)が除去されているRBCを指す。細胞質タンパク質を、例えば、赤血球(単
離されたものと全血中で発見されるものの両方)の溶解、洗浄、及び遠心分離によって除
去することができる。赤血球細胞を、例えば、低張性溶血(例えば、Bramley TA、Coleman
R、Finean JB.の文献、様々なオスモル濃度の培地中での低張性溶解によって調製された
ヒト赤血球ゴーストの化学的、酵素学的、及び透過性特性(Chemical, enzymological and
permeability properties of human erythrocyte ghosts prepared by hypotonic lysis
in media of different osmolarities). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembran
es, 241(3) 1971を参照)、凍結解凍サイクルなどを含む、いくつかの方法によって溶解さ
せて、赤血球膜を採取することができる。凍結解凍サイクルを適当な回数(例えば、少な
くとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、又は少なくとも5回)繰り返して、赤血球膜
と関連する所望のレベルの(例えば、細胞質タンパク質を95％含まない)細胞質材料を獲得
することができる。赤血球膜を、溶解赤血球の遠心分離(例えば、16,000g)によって採取
することができるので、赤血球が該試料のわずかな又は最小の成分であるとしても、該膜
を赤血球を含む試料から単離することができる。
(少量の赤血球濃縮試料)
本開示は、少量の赤血球濃縮血液試料からタンパク質プロファイルを作成する方法も提
供する。少量は、当技術分野で利用可能であり、かつ当業者によってその後の赤血球濃縮
試料におけるタンパク質検出又はタンパク質測定の方法に適しているとみなされるような
方法(例えば、下のタンパク質プロファイリングを参照)によって赤血球濃縮血液試料から
採取することができる。少量は、本明細書に定義されている通りである(例えば、「少量
」を参照)。非限定的な例として、他の実施態様において、少量は、0.1μL～0.5μL、0.5
μL～1μL、1μL～5μL、5μL～10μL、5μL～20μL、5μL～30μL、5μL～40μL、5μL
～50μL、5μL～60μL、5μL～70μL、5μL～80μL、5μL～90μL、又は5μL～100μLで
あり得る。いくつかの実施態様において、少量は、5μL～100μLである。他の実施態様に
おいて、少量は、5μL～50μL又は5μL～20μLである。さらに他の実施態様において、少
量は、5μL～10μLである。ある実施態様において、少量は、5μLである。
(RBCを含む全血)
他の実施態様は、RBCを含む全血試料の解析を含む。これらの実施態様において、該全
血試料は、試料内の血液細胞型の相対比率を変更することなく、又は実質的に変更するこ
となく、かつ血漿/血清を分離することなく、タンパク質プロファイルについて解析され
る。
全血試料は、当業者に利用可能な例示的な手段を用いて採取することができる(例えば
、世界保健機関、「血液、血液成分、及び血漿派生物の採取、処理、及び品質管理のため
の要件(Requirements for the collection, processing and quality control of blood,
blood components and plasma derivatives)」、世界保健機関の技術レポートシリーズ
、第840号、1994年、付録2を参照)。方法は、本明細書の実施例にも提示されている。
非限定的な例として、全血試料は、静脈血、毛細管血、動脈血、又はこれらの組合せを
用いて採取することができる。
いくつかの実施態様において、全血の解析を含む本開示の方法は、乾燥血液スポット(D
BS)サンプリングを用いて実施することができる。DBSサンプリングの非限定的な利点とし
ては、以下のもの:試料の安定性、最少量の要求(例えば、スポット当たり30～100μL)、
試料収集(例えば、指、つま先、又は踵の穿刺)及び輸送の容易さのうちの1つ又は複数が
挙げられる。本開示で使用するために得られたDBS試料は、例えば、冷蔵下及び/又は周囲
温度で数カ月から数年間、安定性を維持することができる。
DBSの好適な方法は、当業者に十分に利用可能である(例えば、McDadeらの文献; Demogr
aphy 2007, 44: 899-925; De Jesusらの文献、Clin Chem 2009, 55:1; 158-164; Sharma
らの文献、Drug Testing and Analysis, 2014, 6(5), 399-414を参照)。
ここでもほんの非限定的な例として、簡潔に述べると、全血は、適切な器具(例えば、
滅菌された外科用ブレード又は使い捨てランセット)を用いて、関心のある対象(例えば、
指、踵、又はつま先の穿刺)から採取し、例えば、メンブレン又は紙(例えば、濾紙カード
)上にスポットすることができる。定量的解析については、測定された血液量を適用する
ことができる。その後、血液を、例えば、室温及び/又は窒素流及び/又は制御された湿度
下で乾燥させることができる。乾燥時間は、通常、少なくとも一部は、試料量によって決
まる。DBSメンブレン又は紙は、周囲温度で保存するか又は冷蔵保存することができ、か
つ湿気を避けるために適切に包装することができる。その後、DBSは、好適な時点で(例え
ば、抽出溶媒又は同様のものを用いて)、解析用に抽出することができる。
(さらなる血液コンパートメントの解析)
濃縮RBC試料、RBC画分、又はRBCを含む全血試料のタンパク質プロファイリングに加え
て、本開示の方法は、1以上のさらなる血液コンパートメントのタンパク質プロファイル
解析を実施することをさらに含むことができる。
例えば、タンパク質プロファイル解析は、血漿、血清、血小板、白血球、濃縮血小板画
分、濃縮白血球画分、血小板濃縮血漿、白血球濃縮血漿、血小板と白血球の混合物、特定
の白血球(例えば、Tリンパ球(例えば、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球)、Bリンパ球、N
K細胞、単球、好中球、好酸球、好塩基球などのうちの1つ又は複数)、及びこれらの組合
せから選択される1以上のさらなる血液コンパートメントに対して実施することができる
。
解析用のさらなる血液コンパートメントは、利用可能な技法を用いて調製することがで
きる。例えば、細胞成分は、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、遠心分離などによ
って単離することができる。血漿/血清分離技法も当技術分野で利用可能である。多くの
標準的な教科書及びプロトコルが入手可能であり、かつこれらの目的のために広く使用さ
れており、非限定的な例として:世界保健機関、「血液、血液成分、及び血漿派生物の採
取、処理、及び品質管理のための要件(Requirements for the collection, processing a
nd quality control of blood, blood components and plasma derivatives)」、世界保
健機関の技術レポートシリーズ、第840号、1994年、付録2; Wenz, B.の文献、「白血球除
去の方法(Methods for leukodepletion)」、「白血球除去した血液製剤の臨床的利益(Cli
nical Benefits of Leukodepleted Blood Products)」、pp 5-16, 1995, Springer Berli
n Heidelberg所収; Novotny V.及びBrand, A.の文献、「白血球除去血及び血小板輸血(Le
ukocyte-Poor Blood and Platelet Transfusions)」、「現代の輸血医学(Modern Transfu
sion Medicine)」、pp 117-121, 1995, CRC Press社所収; White及びJenningsの文献、「
血小板プロトコル:研究及び臨床実験手順(Platelet Protocols: Research and Clinical
Laboratory Procedures)」、1999, Academic Pressを参照されたい。
(溶解物解析)
いくつかの実施態様において、本開示の方法は、細胞溶解物からタンパク質プロファイ
ルを生成することを含む。
ほんの非限定的な例として、本開示の方法のうちの1つ又は複数に従って調製される濃
縮RBC試料又はRBC画分を処理して、1種以上のタンパク質のレベルが決定される溶解物を
提供することができる。該溶解物は、全血、血漿、血清、血小板、白血球、濃縮血小板画
分、濃縮白血球画分、血小板濃縮血漿、白血球濃縮血漿、血小板と白血球の混合物、特定
の白血球(例えば、Tリンパ球(例えば、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球)、Bリンパ球、N
K細胞、単球、好中球、好酸球、好塩基球などのうちの1つ又は複数)、及びこれらの組合
せから選択される1以上の他の血液コンパートメントから産生することもできる。
それに加えて又はその代わりに、RBCではない、又は最小量のRBC(例えば、10％、5％、
4％、3％、2％、1％、もしくは0.5％未満のRBC)を含有する、血液の他の細胞成分を処理
して、1種以上のタンパク質のレベルが決定される溶解物を提供することができる。
本開示の方法における使用のための細胞溶解物は、例えば、液体ホモジナイゼーション
、機械的破壊、凍結/解凍サイクル、高周波音波、手動研磨、化学的透過処理、酵素的透
過処理、及びストレプトリシンを用いる透過処理などを含む好適な手段を用いて産生する
ことができる。
いくつかの実施態様において、細胞溶解物は、1回、2回、3回、4回、5回、又は5回より
多くの凍結/解凍サイクルによって調製される。この技法は、凝固点で血液試料又はその
成分を安定化し、タンパク質内容物の溶解及び解析前の保存を可能にする手段を提供する
という潜在的な利点を提供する。典型的には、瞬間凍結は、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃
、-50℃、-60℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90℃、-100℃、-120℃、-140℃、-160℃、-180
℃、-190℃、-195℃、もしくは-196℃又はそれ未満の温度で実施することができる。さら
に他の実施態様において、瞬間凍結は、-5℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60
℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90、-100℃、-120℃、-104℃、-160℃、-180℃、-190℃、-2
00℃未満の温度で実施される。さらに他の実施態様において、瞬間凍結は、-190℃、-191
℃、-192℃、-193℃、-194℃、-195℃、-196℃、-197℃、-198℃、又は-199℃未満の温度
で実施される。全血試料、RBC濃縮試料、RBC濃縮画分、及び/又は他の異なる細胞成分を
瞬間凍結させて、細胞を安定化することができる。これは、例えば、処理中に存在するRB
C及び/又は他の細胞型からのタンパク質の隔離及び/又は放出を低下させるか又は防止す
ることができる。
(細胞洗浄液及び上清の解析)
いくつかの実施態様において、本開示の方法は、細胞洗浄液及び/又は細胞上清からタ
ンパク質プロファイルを生成することを含む。
細胞洗浄液及び/又は細胞上清は、RBCを含む血液試料又は血液試料成分から産生するこ
とができる。いくつかの実施態様において、RBCの数は、該血液試料又は該血液試料成分
中に存在する血液細胞の総数の0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％
、70％、80％、90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.75％、99.9％、又は99.95
％超を占める。
いくつかの実施態様において、細胞洗浄液は、RBC濃縮細胞を洗浄することにより、及
び/もしくは全血、血小板、白血球、濃縮血小板画分、濃縮白血球画分、血小板濃縮血漿
、白血球濃縮血漿、血小板と白血球の混合物、特定の白血球(例えば、Tリンパ球(例えば
、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球)、Bリンパ球、NK細胞、単球、好中球、好酸球、好塩
基球などのうちの1つもしくは複数)、又はこれらの組合せから選択される1以上の細胞血
液コンパートメントを別々に洗浄することにより産生することができる。
いくつかの実施態様において、細胞上清は、RBC濃縮細胞をインキュベート又は培養す
ることにより、及び/或いは血小板、白血球、濃縮血小板画分、濃縮白血球画分、血小板
濃縮血漿、白血球濃縮血漿、血小板と白血球の混合物、特定の白血球(例えば、Tリンパ球
(例えば、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球)、Bリンパ球、NK細胞、単球、好中球、好酸
球、好塩基球などのうちの1つもしくは複数)、又はこれらの組合せから選択される1以上
の細胞血液コンパートメントを別々にインキュベート又は培養することにより産生するこ
とができる。細胞上清は、その後、細胞から分離し、インキュベート又は培養された細胞
によって(細胞内に及び/又は細胞表面から)放出されるタンパク質について解析すること
ができる。任意に、該上清の除去後に残りの細胞を洗浄し、タンパク質プロファイルを生
成するために使用することができる。細胞洗浄液を細胞上清と組み合わせて、タンパク質
プロファイルを生成することができ、又はその代わりに、個々のタンパク質プロファイル
を細胞洗浄液及び細胞上清から別々に生成することができる。これにより、望ましい場合
、2つの個々のプロファイルの比較が可能になる。
一連の細胞上清は、上記のような細胞を一定期間培養し、一連の上清を様々な時点で収
集することにより産生することができる。該上清をタンパク質内容物について解析して、
複数の時点にわたるタンパク質プロファイル解析を提供することができる。任意に、イン
キュベーション又は培養条件(例えば、培地の内容物、温度など)は、上清のサンプリング
の時点間で変化させることができる。任意に、1以上の時点で上清を除去した後に残りの
細胞を洗浄し、タンパク質プロファイルを生成するために使用することができる。細胞洗
浄液を、所定の時点(例えば、同一の時点)の細胞上清と組み合わせて、タンパク質プロフ
ァイルを生成することができる。或いは、個々のタンパク質プロファイルを個々の細胞洗
浄液及び個々の細胞上清から生成することができる。或いは、複数の時点からの細胞洗浄
液をプールし、解析して、タンパク質プロファイルを生成することができる。同様に、複
数の時点からの細胞上清をプールし、解析して、タンパク質プロファイルを生成すること
ができる。
RBC濃縮細胞をインキュベートもしくは培養するのに及び/又は他の細胞性血液コンパー
トメントを別々にインキュベートもしくは培養するのに好適な例示的なプロトコル及び/
又は培地は、当業者に利用可能である(例えば、Koller、Palsson、Masters(編)、「ヒト
細胞培養:第IV巻、初代造血細胞(Human Cell Culture: Vol IV. Primary Hematopoietic
cells)」、2006、Springer Science and Business Media; Mirty及びHughes(編)、2001、
「ヒト細胞培養プロトコル、第3版(Human Cell Culture Protocols,Third edition)」、2
011、Humana Pressを参照)。方法は、本明細書の実施例にも提示されている。
細胞洗浄は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、等張塩溶液、成長培地、培養培地
、又はこれらの組合せなどの好適な培地を用いて実施することができる。
本開示の方法における細胞洗浄液、細胞培養培地、又は細胞インキュベーション培地と
して使用するための好適な培地の非限定的な例としては、等張塩溶液、平衡化塩溶液、生
理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ハンクス平衡化塩溶液(HBSS)、アール平衡化塩
溶液(EBSS)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)、最小必須培地(MEM)、改良された
最小必須培地(IMEM)、イーグル最小必須培地(EMEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
、及びイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、又はこれらの組合せが挙げられる。いくつか
の実施態様において、該培地は、RBCを成長又は増殖しない状態で維持するためのPBS又は
HBSSである。他の実施態様において、該培地は、RBCの成長又は増殖を刺激するためのRPM
Iである。
(血液安定化剤及び抗凝固剤)
特定の機械的特徴に限定されるものではないが、RBCは、様々なタンパク質(例えば、サ
イトカイン及びケモカイン)を隔離及び放出する能力を有し得ると仮定され、かつRBCによ
るタンパク質放出(或いは、隔離)の程度は、血液の収集及び処理中に起こる様々な要因に
よって影響されると考えられる。
いくつかの実施態様において、ある実施態様において使用される血液試料又はその成分
は、血液安定化剤と混合することができる。RBCを安定化する能力を有する薬剤は、処理
中のRBCからのタンパク質の隔離及び/又は放出を低下させるか又は防止するために有用で
ある。
血液細胞安定化剤は、対象から血液試料を収集する時に及び/又はその後の血液試料も
しくはその成分の処理中に、血液試料と混合することができる。非限定的な例として、血
液安定化剤は、血液試料が対象から採取されてから、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、10秒、2
0秒、30秒、1分、2分、3分、4分、5分、10分、15分、30分、45分、1時間、2時間、3時間
、4時間、5時間、7.5時間、又は10時間以内に、血液試料又はその成分と混合することが
できる。
好適な血液安定化剤の非限定的な例としては、プロテアーゼインヒビター、抗凝固剤、
RNA安定化剤(例えば、RNALater - Thermo Fisher Scientific)、タンパク質変性剤、又は
これらの組合せが挙げられる。ある実施態様において、血液安定化剤は、プロテアーゼイ
ンヒビターではない。
例示的な実施態様において、血液安定化剤は、抗凝固剤である。抗凝固剤は、対象から
血液試料を収集する時に(例えば、血液試料が収集される器もしくは容器は、抗凝固剤を
含有し得る)、及び/又はその後の血液試料もしくはその成分の処理中に、抗凝固剤と混合
することができる。
好適な抗凝固剤の非限定的な例としては、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、
EDTA二ナトリウム塩、EDTA四ナトリウム塩、EDTA二カリウム塩、EDTA二アンモニウム塩、
エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸(EGTA)、EDTA三ナトリウム塩、EDTA三カリ
ウム塩、エチレングリコール-O,O-ビス(2-アミノエチル)-N,N,N,N-四酢酸、N-(2-ヒドロ
キシエチル)エチレンジアミン-N,N,N-三酢酸三ナトリウム塩、クエン酸塩、酸-クエン酸
塩-デキストロース、クエン酸水素二アンモニウム、酒石酸二アンモニウム、ワルファリ
ン、N-(2-ビス(カルボキシメチル)アミノエチル)-N-(2-ヒドロキシエチル)グリシン塩二
水和物、クエン酸、クエン酸一ナトリウム塩、クエン酸二ナトリウム塩、クエン酸三ナト
リウム塩、クエン酸一カリウム塩、クエン酸三カリウム塩、プロテインC/プロテインS、
ニトリロ三酢酸、酒石酸カリウムナトリウム、D-酒石酸水素カリウム、L-酒石酸一ナトリ
ウム塩、L-酒石酸二ナトリウム塩、L-酒石酸二カリウム塩、ストレプトキナーゼ、硫酸プ
ロタミン、トリス(カルボキシメチル)アミン、抗トロンビンIII、フェンプロクモン、ヒ
ルジン、ニクマロン、クマディン、グリコサミノグリカン、イブプロフェン、アセチルサ
リチル酸、インドメタシン、プロスタグランジン、スルフィンピラゾン、ウロキナーゼ、
ヒルログ、組織プラスミノーゲン活性化因子、クマリン、又はこれらの組合せが挙げられ
る。
抗凝固剤は、例えば、RBC濃縮画分の解析に加えて、白血球(leukocyte)(白血球(white
blood cell))、血小板、及び/又は血漿のうちの1つ又は複数のタンパク質プロファイリン
グが望ましい場合の使用に有益であり得る。抗凝固剤は、血液の全タンパク質成分(すな
わち、血漿成分を除く血液細胞の混合集団)のタンパク質プロファイリングを実施するこ
とが望ましい場合の使用にも有益であり得る。
他の実施態様において、本開示の方法において使用される血液試料は、例えば、タンパ
ク質プロファイリングが、RBC、濃縮RBC、又は全血試料に対して実施されることになって
いる場合、抗凝固剤と混合しなくてもよい。そのような場合、抗凝固活性を有さない又は
わずかな量の抗凝固活性しか有さない他の安定化剤を血液試料又はその成分と混合しても
よい。
他の実施態様において、本開示の方法において使用される血液試料又はその成分は、凍
結(例えば、瞬間凍結)によるか又は乾燥(例えば、乾燥血液スポット)によって安定化する
ことができる。
(プロテアーゼインヒビターの使用)
ある実施態様において、本方法は、全血試料、赤血球濃縮試料、又は赤血球成分(例え
ば、赤血球もしくは赤血球膜)を、該試料又は成分中の1種以上のタンパク質のレベルを調
節する1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させることを含む。赤血球濃縮試料又
は赤血球成分は、例えば、該赤血球濃縮試料又は赤血球成分を、1種以上のプロテアーゼ
インヒビターを含有する培地(例えば、PBS、HBSS、EBSS、RPMI、MEM、IMEM、EMEM、DMEM
、IMDM)中でインキュベートすることにより、1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触
させることができる。該血液試料又は成分は、疾患もしくは障害を有する対象及び/又は
疾患もしくは障害を有さない対象(例えば、健常対象)から採取することができる。例えば
、該血液試料又は成分は、疾患又は障害を有さない対象由来の血液試料又は成分中の1種
以上のタンパク質のレベルの調節と比較して、疾患又は障害を有する対象由来の試料又は
成分中の1種以上のタンパク質のレベルを示差調節する1種以上のプロテアーゼインヒビタ
ーに接触させることができる。
多くのプロテアーゼインヒビターは、本明細書に提供される方法において、個々に、又
は当業者によって決定される方法での使用のための好適なプロテアーゼインヒビターと組
み合わせて使用することができる。例えば、赤血球成分由来のタンパク質のレベルに対す
る個々のプロテアーゼインヒビターの効果(例えば、増加もしくは減少の程度、又は顕著
な増加もしくは減少の欠如)を決定することにより、当業者は、タンパク質レベルの望ま
しい調節に基づいて、特定のプロテアーゼインヒビターを使用することを選択することが
できる。本方法での使用に好適なプロテアーゼインヒビターには、いくつかの実施態様に
おいて、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタ
ロプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及びアミノペ
プチダーゼインヒビターを含む、様々なプロテアーゼファミリー由来のプロテアーゼを阻
害するものが含まれ得る。プロテアーゼインヒビターは、特定のプロテアーゼ、もしくは
特定のプロテアーゼファミリーの阻害に特異的であるか、又は一般的な/共通のタンパク
質分解機構を阻害する非特異的なもの(例えば、EDTA)であり得る。プロテアーゼインヒビ
ターには、複数のプロテアーゼファミリー由来のプロテアーゼを阻害するもの、例えば、
セリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼの両方を阻害するプロテアーゼインヒビタ
ー(例えば、ロイペプチン、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、扁平上皮細胞癌抗
原-1(SCCA-1))も含まれ得る。プロテアーゼインヒビターには、内在性であるもの(例えば
、内在性タンパク質)又は合成されたもの(例えば、化学合成されたもの)が含まれ得る。
提供される方法での使用に好適なセリンプロテアーゼインヒビターには、例えば、α-1
-アンチキモトリプシン、C1インヒビター(C1INH)、α-1-アンチトリプシン、アンチトロ
ンビンIII、α-1-アンチプラスミン、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター-1(PAI-1
)、膵臓トリプシンインヒビター、SCCA-1、セリンプロテアーゼ活性を阻害するセルピン
スーパーファミリーの他のメンバー、アプロチニン、キモスタチン、ロイペプチン、アン
チパイン二塩酸塩、PMSF(Thermo Fisher Scientific)、ジイソプロピルフルオロホスフェ
ート(DSF)、E-64(N-(N-L-3-trans-カルボニル)-L-ロイシル)-アグマチン)、Pefabloc(登
録商標) SC(Roche/Sigma-Aldrich)、TLCK(CAS 131918-97-3)、カテスピン(cathespin)(例
えば、カテプシンA及びG)インヒビター、トリプシンインヒビターなどが含まれ得る。
本明細書に提供される方法での使用に好適なシステイン(チオール)プロテアーゼインヒ
ビターには、例えば、カスパーゼインヒビター、カルパインインヒビター(例えば、カル
パインインヒビターI、カルパインインヒビターII、カルパスタチン)、カテプシン(例え
ば、カテプシンB、C、F、H、K、S、L、O、S、V、X、及びW)(例えば、パパイン)インヒビ
ター(例えば、シスタチン(例えば、ステフィン、シスタチン、キニノーゲン)、サイロピ
ン、セルピン、E-64(N-(N-L-3-trans-カルボニル)-L-ロイシル)-アグマチン))、SCCA-1、
キモスタチン、アンチパイン二塩酸塩、N-エチルマレイミド、ロイペプチン、α2-マクロ
グロブリン、PMSFなどが含まれ得る。
本明細書に提供される方法での使用に好適なメタロプロテアーゼ(メタロプロテイナー
ゼ)インヒビターには、例えば、ベスタチン、ホスホラミドン、α2-マクログロブリン、
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(例えば、TIMP1～TIMP4)、EDTA、2,2'-ビピリ
ジルReagentPlus(登録商標)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩脱水和物、1,10-フ
ェナントロリン一水和物、ホスホラミドン二ナトリウム塩、並びに他の合成インヒビター
(例えば、ヒドロキサメート系、チオール系、ピリミジン系、ヒドロキシプロン(hydroxyp
rone)系、リン系、及びテトラサイクリン系、並びにメタロエンドペプチダーゼインヒビ
ター(例えば、ホスホラミドン、SCH 39370)などが含まれ得る。
本明細書に提供される方法での使用に好適なアスパラギン酸/アスパルチルプロテアー
ゼインヒビターには、例えば、α2-マクログロブリン、ペプスタチン、ペプスタチンA、
カテプシン(例えば、カテプシンD及びE)インヒビターなどが含まれ得る。
本明細書に提供される方法での使用に好適なアミノペプチダーゼインヒビターには、例
えば、ベスタチン塩酸塩、アクチノニン、アルファメニンA、アスプスタチン、アマスタ
チン塩酸塩、アルファメニンB、エベラクトンA、エピアマスタチン塩酸塩、アミノペプチ
ダーゼNインヒビター、ベスタチンメチルエステル、l-グルタミン酸γ-(7-アミド-4-メチ
ルクマリン)、CHR 2797、カプトプリル、フマギリン、HFI 142、SC 57461Aなどが含まれ
得る。
また、本明細書に提供される方法での使用に好適なものは、プロテアーゼインヒビター
カクテル(PIC)である。ある実施態様において、プロテアーゼインヒビターカクテルはA81
27sであり、これは、アンチパイン二塩酸塩、ベスタチン、E-64、ロイペプチン、ペプス
タチン、ホスホラミドン、Pefabloc SC、EDTA-Na2、及びアプロチニンを含む。他の実施
態様において、PIC、例えば、cOmplete(登録商標)プロテアーゼインヒビターカクテル錠(
Roche)、プロテアーゼインヒビターカクテル粉末(Sigma Aldrich、カタログ番号SRE0055)
、SIGMAFASTプロテアーゼインヒビター錠(Sigma Aldrich、カタログ番号S8820)、プロテ
アーゼインヒビターカクテル(Sigma Aldrich、カタログ番号P8340)、動物成分不含プロテ
アーゼインヒビターカクテル(Sigma Aldrich、カタログ番号13786)、Haltプロテアーゼ及
びホスフェートインヒビターカクテル(Thermo Fisher)、Abcamのプロテアーゼインヒビタ
ー(Abcam)、プロテアーゼインヒビターカクテル(Promega)などを本明細書に提供される方
法で使用することができる。さらに、プロテアーゼインヒビターカクテルをカスタマイズ
して、対象となるタンパク質(例えば、タンパク質プロファイル中のタンパク質)のレベル
の変化に対する個々のプロテアーゼインヒビターの効果を決定することにより、対象とな
るタンパク質のレベルの変化を増強することができる。プロテアーゼインヒビターを、例
えば、特定の疾患タンパク質プロファイルについて、測定されているタンパク質の発現に
対するその効果に基づいて、特定のプロテアーゼインヒビターカクテルに含めることも、
そこから除くこともできる。
いくつかの実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1
種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤
血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、上記のプロテアーゼインヒビターの組合せ(例え
ば、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタロプ
ロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及び/又はアミノ
ペプチダーゼインヒビターの組合せ)と接触させる。いくつかの実施態様において、全血
試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のセリンプロテアーゼインヒビ
ター、1種以上のシステインプロテアーゼインヒビター、1種以上のメタロプロテアーゼイ
ンヒビター、1種以上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及び/又は1種以上の
アミノペプチダーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤血
球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のセリンプロテアーゼインヒビター及び1
種以上のシステインプロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、全
血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のセリンプロテアーゼインヒ
ビター及び1種以上のメタロプロテアーゼインヒビターと接触させる。いくつかの実施態
様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のセリンプロ
テアーゼインヒビター及び1種以上のアスパルチルプロテアーゼインヒビターと接触させ
る。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を
、1種以上のセリンプロテアーゼインヒビター及び1種以上のアミノペプチダーゼインヒビ
ターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又
は赤血球成分を、1種以上のセリンプロテアーゼインヒビター、1種以上のシステインプロ
テアーゼインヒビター、及び1種以上のメタロプロテアーゼインヒビターと接触させる。
他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上の
セリンプロテアーゼインヒビター、1種以上のシステインプロテアーゼインヒビター、及
び1種以上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様にお
いて、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のセリンプロテアー
ゼインヒビター、1種以上のシステインプロテアーゼインヒビター、及び1種以上のアミノ
ペプチダーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血
球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のシステインプロテアーゼインヒビター及
び1種以上のメタロプロテアーゼインヒビターと接触させる。いくつかの他の実施態様に
おいて、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のシステインプロ
テアーゼインヒビター及び1種以上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビターと接触さ
せる。ある実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種
以上のシステインプロテアーゼインヒビター及び1種以上のアミノペプチダーゼインヒビ
ターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又
は赤血球成分を、1種以上のシステインプロテアーゼインヒビター、1種以上のメタロプロ
テアーゼインヒビター、及び/又は1種以上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビターと
接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血
球成分を、1種以上のシステインプロテアーゼインヒビター、1種以上のメタロプロテアー
ゼインヒビター、及び/又は1種以上のアミノペプチダーゼインヒビターと接触させる。他
の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のシ
ステインプロテアーゼインヒビター、1種以上のメタロプロテアーゼインヒビター、1種以
上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及び/又は1種以上のアミノペプチダーゼ
インヒビターと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/
又は赤血球成分を、1種以上のメタロプロテアーゼインヒビター及び1種以上のアスパラギ
ン酸プロテアーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、
赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のメタロプロテアーゼインヒビター及
び1種以上のアミノペプチダーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様におい
て、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のメタロプロテアーゼ
インヒビター、1種以上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及び1種以上のアミ
ノペプチダーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤
血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のアスパラギン酸プロテアーゼインヒビ
ター及び1種以上のアミノペプチダーゼインヒビターと接触させる。
さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、
セリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼの両方を阻害する1種以上のプロテアーゼ
インヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、
及び/又は赤血球成分を、セリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼの両方及び1以上
のメタロプロテアーゼを阻害する1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。他
の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、セリンプロ
テアーゼとシステインプロテアーゼの両方及び1以上のアスパラギン酸プロテアーゼを阻
害する1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において
、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、セリンプロテアーゼとシステイ
ンプロテアーゼの両方及び1以上のアミノペプチダーゼを阻害する1種以上のプロテアーゼ
インヒビターと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/
又は赤血球成分を、セリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼの両方を阻害する1種
以上のプロテアーゼインヒビター、1以上のメタロプロテアーゼ、及び1以上のアスパラギ
ン酸プロテアーゼと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及
び/又は赤血球成分を、セリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼの両方、1以上のメ
タロプロテアーゼ、1以上のアスパラギン酸プロテアーゼ、及び1以上のアミノペプチダー
ゼを阻害する1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。ある実施態様において
、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、1以上の特定のプロテアーゼイン
ヒビター(例えば、セリン、システイン、メタロプロテアーゼ、アスパルチルプロテアー
ゼ、又はアミノペプチダーゼインヒビター)及び1以上の非特異的プロテアーゼインヒビタ
ー(例えば、EDTA)と接触させる。いくつかの実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試
料、及び/又は赤血球成分を、プロテアーゼインヒビターカクテルを含む上記のプロテア
ーゼインヒビターの1つ又は複数と接触させる。ある実施態様において、全血試料、赤血
球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、プロテアーゼインヒビターカクテルA8127sと接触
させる。
いくつかの上記のプロテアーゼインヒビターを、ある実施態様において、組み合わせて
使用することができる。例えば、いくつかの実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試
料、及び/又は赤血球成分を、1種以上のプロテアーゼインヒビター、2種以上のプロテア
ーゼインヒビター、3種以上のプロテアーゼインヒビター、4種以上のプロテアーゼインヒ
ビター、5種以上のプロテアーゼインヒビター、6種以上のプロテアーゼインヒビター、7
種以上のプロテアーゼインヒビター、8種以上のプロテアーゼインヒビター、9種以上のプ
ロテアーゼインヒビター、10種以上のプロテアーゼインヒビター、11種以上のプロテアー
ゼインヒビター、12種以上のプロテアーゼインヒビター、13種以上のプロテアーゼインヒ
ビター、14種以上のプロテアーゼインヒビター、15種以上のプロテアーゼインヒビター、
16種以上のプロテアーゼインヒビター、17以上のインヒビター、18種以上のプロテアーゼ
インヒビター、19種以上のプロテアーゼインヒビター、又は20種以上のプロテアーゼイン
ヒビターと接触させることができる。他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料
、及び/又は赤血球成分を、2種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施
態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、3種以上のプロテア
ーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試
料、及び/又は赤血球成分を、4種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。いくつ
かの他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、5種以
上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤血球
濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、6種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。
いくつかの他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を
、7種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様において、全
血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、8種以上のプロテアーゼインヒビター
と接触させる。さらに他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤
血球成分を、9種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。他の実施態様において
、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、10種以上のプロテアーゼインヒ
ビターと接触させる。他の実施態様において、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤
血球成分を、15種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる。さらに他の実施態様に
おいて、全血試料、赤血球濃縮試料、及び/又は赤血球成分を、20種以上のプロテアーゼ
インヒビターと接触させる。
(カチオン塩の使用)
ある実施態様は、赤血球濃縮試料を、該試料中の1種以上のタンパク質の検出可能なレ
ベルを増大させる及び/又は増強する少なくとも1つのカチオン塩と接触させることをさら
に含む。カチオン塩は、当業者によって決定される、本方法での使用に好適である1つ又
は複数であり得る。カチオン塩は、いくつかの実施態様において、一価又は多価(例えば
、二価、三価)金属イオン塩である。他の実施態様において、カチオン塩は、アンモニウ
ム塩である。
本方法での使用に好適な一価の金属カチオン塩には、例えば、ナトリウム塩、カリウム
塩、リチウム塩など、又はこれらの組合せが含まれ得る。好適なナトリウム塩には、例え
ば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、酢酸ナト
リウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、アスコルビン酸
ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸
ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、メタケイ
酸ナトリウム、及びプロピオン酸ナトリウムなど、又はこれらの組合せが含まれ得る。好
適なカリウム塩には、例えば、塩化カリウム、クエン酸カリウム、臭化カリウム、ヨウ化
カリウム、重炭酸カリウム、亜硝酸カリウム、過硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、硫酸カ
リウム、重亜硫酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、グルタ
ミン酸カリウム、グアニル酸二カリウム、グルコン酸カリウム、リンゴ酸カリウム、アス
コルビン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、コハク酸カリウム、酒石酸カリウム、及びこ
れらの組合せが含まれ得る。好適なリチウム塩には、例えば、塩化リチウム、臭化リチウ
ム、炭酸リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸リチウム、乳酸リチウム、クエン
酸リチウム、アスパラギン酸リチウム、グルコン酸リチウム、リンゴ酸リチウム、アスコ
ルビン酸リチウム、オロト酸リチウム、コハク酸リチウム、又はこれらの組合せが含まれ
る。
本方法での使用に好適な二価金属カチオン塩には、例えば、カルシウム塩、カリウム塩
、ベリリウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、ラジウム塩、鉄(第一鉄)塩など、又は
これらの組合せが含まれ得る。好適なカルシウム塩には、例えば、塩化カルシウム、硫酸
カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、
リン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム(calcium alginite)、ステアリン酸カルシウム
、ソルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムなど、又はこれらの組合せが含まれる。
好適なマグネシウム塩には、例えば、フッ化マグネシウム、塩化マグネシウム、臭化マグ
ネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、亜硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、硝酸マグネシウム、
ホウ酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウ
ム、マレイン酸マグネシウム、コハク酸マグネシウム、リンゴ酸マグネシウム、タウリン
酸マグネシウム、オロト酸マグネシウム、グリシン酸マグネシウム、ナフテン酸マグネシ
ウム、アセチルアセトン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、ステ
アリン酸マグネシウム、ヘキサフルオロケイ酸マグネシウム、サリチル酸マグネシウム、
又はこれらの組合せが含まれ得る。好適なベリリウム塩には、例えば、リン酸ベリリウム
、酢酸ベリリウム、酒石酸ベリリウム、クエン酸ベリリウム、グルコン酸ベリリウム、マ
レイン酸ベリリウム、コハク酸ベリリウム、リンゴ酸ナトリウムベリリウム、アルファブ
ロモカンファースルホン酸ベリリウム、アセチルアセトン酸ベリリウム、ギ酸ベリリウム
、又はこれらの組合せが含まれ得る。好適なストロンチウム塩には、例えば、塩化ストロ
ンチウム、リン酸ストロンチウム、硫酸ストロンチウム、炭酸ストロンチウム、酸化スト
ロンチウム、硝酸ストロンチウム、酢酸ストロンチウム、酒石酸ストロンチウム、クエン
酸ストロンチウム、グルコン酸ストロンチウム、マレイン酸ストロンチウム、コハク酸ス
トロンチウム、リンゴ酸ストロンチウム、L型及び/もしくはD型アスパラギン酸ストロン
チウム、フマル酸ストロンチウム、L型及び/もしくはD型グルタミン酸ストロンチウム、
グルタル酸ストロンチウム、乳酸ストロンチウム、L-トレオン酸ストロンチウム、マロン
酸ストロンチウム、ラネリン酸ストロンチウム(有機金属キレート)、アスコルビン酸スト
ロンチウム、酪酸ストロンチウム、クロドロン酸ストロンチウム、イバンドロン酸ストロ
ンチウム、サリチル酸ストロンチウム、アセチルサリチル酸ストロンチウム、又はこれら
の組合せが含まれ得る。好適なバリウム塩には、例えば、水酸化バリウム、フッ化バリウ
ム、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硫酸バリウム、硫化バリウム(S)、
炭酸バリウム、過酸化バリウム、酸化バリウム、硝酸バリウム、酢酸バリウム、酒石酸バ
リウム、クエン酸バリウム、グルコン酸バリウム、マレイン酸バリウム、コハク酸バリウ
ム、リンゴ酸バリウム、グルタミン酸バリウム、シュウ酸バリウム、マロン酸バリウム、
ナフテン酸バリウム、アセチルアセトン酸バリウム、ギ酸バリウム、安息香酸バリウム、
p-t-ブチル安息香酸バリウム、アジピン酸バリウム、ピメリン酸バリウム、スベリン酸バ
リウム、アゼル酸バリウム、セバシン酸バリウム、フタル酸バリウム、イソフタル酸バリ
ウム、テレフタル酸バリウム、アントラニル酸バリウム、マンデル酸バリウム、サリチル
酸バリウム、チタン酸バリウム、又はこれらの組合せが含まれ得る。好適なラジウム塩に
は、例えば、フッ化ラジウム、塩化ラジウム、臭化ラジウム、ヨウ化ラジウム、酸化ラジ
ウム、窒化ラジウム、又はこれらの組合せが含まれ得る。好適なラジウム塩には、例えば
、フッ化ラジウム、塩化ラジウム、臭化ラジウム、ヨウ化ラジウム、酸化ラジウム、窒化
ラジウムなどが含まれた。好適な鉄(第一鉄)塩には、例えば、硫酸第一鉄、酸化第一鉄、
酢酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸アンモニウム第一鉄、グルコン酸第一鉄、シュウ
酸第一鉄、フマル酸第一鉄、マレイン酸第一鉄、リンゴ酸第一鉄、乳酸第一鉄、アスコル
ビン酸第一鉄、エリスロビン酸第一鉄(ferrous erythrobate)、グリセリン酸第一鉄、及
びピルビン酸第一鉄など、又はこれらの組合せが含まれ得る。
ある実施態様において、カチオン塩は、赤血球濃縮試料中のpH変化を防止及び/又は最
小化することができるものである(例えば、塩化物又は炭酸塩)。したがって、ある実施態
様において、カチオン塩は、炭酸塩である。さらなる実施態様において、カチオン塩は、
細胞膜(例えば、RBC膜)への損傷を防止又は最小化することもできる。ある実施態様にお
いて、カチオン塩は、塩化物塩である。他の実施態様において、カチオン塩は、塩化カル
シウム、塩化カリウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウム、塩化ラジウム、又はこれら
の組合せである。さらに他の実施態様において、カチオン塩は、塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、塩化ルビジウム、塩化セシウム、塩化リチウム、又はこれらの組合せである。他
の実施態様において、カチオン塩は、塩化リチウムである。他の実施態様において、カチ
オン塩は、塩化ナトリウムであり得る。ある実施態様において、カチオン塩は、炭酸カル
シウム、炭酸カリウム、炭酸ストロンチウム、炭酸バリウム、又は炭酸ラジウムであり得
る。さらに他の実施態様において、カチオン塩は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸
ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸リチウム、又はこれらの組合せである。さらに他の実施
態様において、カチオン塩は、炭酸リチウムである。他の実施態様において、カチオン塩
は、炭酸ナトリウムである。
一価又は二価金属カチオン塩以外の塩を本方法で使用することができ、これには、三価
塩又は他の多価塩、例えば、アルミニウム、シリコン、スカンジウム、チタン、バナジウ
ム、クロム、コバルト、ニッケル、銅、マンガン、亜鉛、錫、及び銀など、又はこれらの
組合せなどが含まれる。
アンモニウム塩は、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウム、ホウ酸アンモニウム、臭化アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、硫酸
アンモニウムセリウム(IV)、クロム酸アンモニウム、二クロム酸アンモニウム、リン酸二
水素アンモニウム、フッ化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、二塩
基性リン酸アンモニウムナトリウム四水和物、チオ硫酸アンモニウム、及びアンモニウム
ジルコニウムなど、又はこれらの組合せを含む好適なアンモニウム塩とともに本方法で使
用することもできる。
ある実施態様において、カチオン塩は、塩化アンモニウムである。他の実施態様におい
て、カチオン塩は、炭酸アンモニウムである。
ある実施態様において、赤血球濃縮試料を上記のカチオン塩の1以上の組合せと接触さ
せて、該試料中の1種以上のタンパク質の検出可能なレベルを増大させる及び/又は増強す
る。いくつかの実施態様において、赤血球濃縮試料を少なくとも1つのカチオン塩と接触
させる。他の実施態様において、赤血球濃縮試料を少なくとも2つのカチオン塩と接触さ
せる。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料を少なくとも3つのカチオン塩と接
触させる。
ある実施態様において、血液試料を上記のカチオン塩の1以上の組合せと接触させて、
該血液試料の赤血球濃縮前に、該試料中の1種以上のタンパク質の検出可能なレベルを増
加させる及び/又は増強する。いくつかの実施態様において、血液試料を少なくとも1つの
カチオン塩と接触させる。他の実施態様において、血液試料を少なくとも2つのカチオン
塩と接触させる。さらに他の実施態様において、血液試料を少なくとも3つのカチオン塩
と接触させる。
本明細書における塩(例えば、ナトリウム含有塩)への言及は、該塩の無水形態及び水和
形態を含む。
ある実施態様において、全血試料を上記のカチオン塩の少なくとも1つと接触させて、
タンパク質プロファイルを作成する。全血試料は、当業者に利用可能な方法を用いて、静
脈血、毛細管血、動脈血、又はこれらの組合せから採取することができる。
他の実施態様において、血漿、血清、血小板、白血球、濃縮血小板画分、濃縮白血球画
分、血小板濃縮血漿、白血球濃縮血漿、血小板と白血球の混合物、特定の白血球(例えば
、Tリンパ球(例えば、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球)、Bリンパ球、NK細胞、単球、好
中球、好酸球、好塩基球などのうちの1つ又は複数)、及びこれらの組合せから選択される
1以上のさらなる血液コンパートメントを上記のカチオン塩の少なくとも1つに接触させて
、タンパク質プロファイルを作成する。解析用のさらなる血液コンパートメントは、利用
可能な技法(例えば、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、遠心分離など)を用いて調
製することができる。
(タンパク質の検出及びプロファイリング)
本開示は、RBC成分を含む血液試料(例えば、RBC濃縮試料、RBC濃縮画分、又は全血試料
)からタンパク質プロファイルを作成する方法を提供する。そのようなプロファイルの作
成は、限定されないが、炎症、免疫応答、及び/もしくは細胞修復を含む生物学的プロセ
ス、並びに/又は病態についての洞察を提供することができる。
本開示の方法によるタンパク質プロファイルの生成において検出又は測定し得るタンパ
ク質の種類に特定の制限を付与するものではないが、非限定的な例としては、シグナル伝
達分子、例えば、ケモカイン、サイトカイン、他の炎症性タンパク質、糖タンパク質、成
長因子、受容体、細胞内シグナル伝達物質、ホルモン、核内転写因子、神経伝達物質、及
び細胞外マトリックス成分、並びに酵素が挙げられる。例えば、成長因子には、例えば、
皮膚細胞の成長、増殖、治癒、又は分化を刺激するもの(例えば、上皮成長因子(EGF)、ケ
ラチノサイト成長因子(KGF)、遊走刺激因子(MSF))、神経細胞/神経系の成長、増殖、治癒
、又は分化を刺激するもの(例えば、ニューレグリン(例えば、ニューレグリン1～4)及び
ニューロトロフィン(例えば、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロ
トロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン4(NT-4)))、結合組織及び間葉細胞の成長、増
殖、治癒、又は分化を刺激するもの(例えば、線維芽細胞成長因子(FGF))、血管細胞の成
長、増殖、治癒、又は分化を刺激するもの(例えば、血小板由来成長因子(PDGF)、胎盤成
長因子(PGF)、血管内皮成長因子(VEGF))、血液細胞の成長、増殖、治癒、又は分化を刺激
するもの(例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子(GM-CSF))、並びに細胞増殖を刺激するもの(例えば、インスリン
様成長因子(IGF-1)、インスリン様成長因子-2(IGF-2))が、多面的成長因子(例えば、形質
転換成長因子-ベータ(TGF-β)、形質転換成長因子-ベータ(TGF-α)、腫瘍壊死因子(TNF))
とともに含まれ得る。
受容体には、細胞内受容体(例えば、核内受容体(例えば、転写因子)、細胞質内受容体(
例えば、ステロイド)、及び小胞体(例えば、IP3)受容体、細胞表面受容体(例えば、イオ
ンチャネル結合型、G-タンパク質結合型、酵素結合型、トール(toll)開口型、及びリガン
ド開口型受容体、インテグリン)、可溶性受容体(例えば、可溶性サイトカイン受容体)、
並びにスカベンジャー受容体(例えば、SR-A1、SR-A2、SCARA1-SCARA5、SCARB1-SCARB3、C
D68、dSR-C1、LOX-1、sPD-1、sCTLA-4)が含まれ得る。ホルモンには、脂質由来のもの(例
えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタシリン(prostacylin)、トロンボ
キサン);アミノ酸由来のもの(例えば、エピネフリン、メラトニン、チロキシン);ペプチ
ド(例えば、アミリン、アディポネンクチン(adiponenctin)、アンジオテンシノーゲン、
カルシトニン、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモ
ン(FSH)、グレリン、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)
、インスリン、インスリン様成長因子(IGF)など);並びにステロイド(例えば、アンドロゲ
ン、エストロゲン、グルココルチコイド、プロゲストゲン、及びセコステロイドなど)が
含まれ得る。細胞内シグナル伝達物質又は変換物質には、タンパク質及びタンパク質キナ
ーゼのファミリー(例えば、Ras及びSrcファミリー)、並びにWntシグナル伝達ファミリー
タンパク質が含まれ得る。神経伝達物質には、アミノ酸、ペプチド(例えば、β-エンドル
フィン、オピオイド)、モノアミン、微量アミン、プリン、及びガス状伝達物質が含まれ
得る。核内転写因子には、DNA転写のモジュレーター(例えば、fos、myc、N-myc)、及びmR
NA転写のモジュレーター、及び細胞分裂の抑制因子(例えば、p53、pRb)が含まれ得る。酵
素には、オキシドレダクターゼ(例えば、アルコール、アルデヒド、アミノ酸、硫黄、ジ
フェノール、及びペルオキシダーゼなど)、NADH、NADPH、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、
キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼ
が含まれ得る。数多くあるケモカイン及びサイトカインには、例えば、下の表1及び表2に
掲載されているものが含まれ得る。
ある実施態様において、本方法は、下の表1及び2に掲載されている単一のタンパク質も
しくはタンパク質の組合せからなるか又はそれらを含むタンパク質プロファイルを作成す
ることを含む。該プロファイルは、RBC成分を含む血液試料(例えば、赤血球濃縮試料、RB
C濃縮画分、又は全血試料)から生成することができる。さらなるプロファイルは、限定さ
れないが、血漿、血清、血小板、白血球、濃縮血小板画分、濃縮白血球画分、血小板濃縮
血漿、白血球濃縮血漿、血小板と白血球の混合物、特定の白血球(例えば、Tリンパ球(例
えば、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球)、Bリンパ球、NK細胞、単球、好中球、好酸球、
好塩基球などのうちの1つ又は複数)、及びこれらの組合せを含む、他の細胞コンパートメ
ントから生成することができる。
表1:本開示の方法によって生成されるタンパク質プロファイルに含まれ得る個々のタンパ
ク質の非限定的な例。該タンパク質プロファイルは、掲載されているタンパク質の1つも
しくは複数を含むか又はそれらからなり得る。
Figure 0007425903000001
Figure 0007425903000002
表2:本開示の方法によって生成されるタンパク質プロファイルに含まれ得るタンパク質ペ
アの非限定的な例。該タンパク質プロファイルは、掲載されているタンパク質の1つもし
くは複数を含むか又はそれらからなり得る。
Figure 0007425903000003
Figure 0007425903000004
Figure 0007425903000005
Figure 0007425903000006
Figure 0007425903000007
ある実施態様において、1種以上、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7
種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種
以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、21種以上、22種以上、23種
以上、24種以上、25種以上、26種以上、27種以上、28種以上、29種以上、もしくは30種以
上のタンパク質の存在、レベル、又はレベルの変化が、赤血球濃縮試料及び/又は赤血球
成分中で検出又は測定される。
ある他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、1種以上のタンパク
質の存在が検出されるか、又は1種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は1種以
上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様において、赤血球濃縮試料又
は赤血球成分から、2種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は2種以上のタンパク
質のレベルが測定されるか、又は2種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他
の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、3種以上のタンパク質の存在
が検出されるか、又は3種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は3種以上のタン
パク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球
成分から、4種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は4種以上のタンパク質のレベ
ルが測定されるか、又は4種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。さらに他の
実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、5種以上のタンパク質の存在が
検出されるか、又は5種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は5種以上のタンパ
ク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成
分から、6種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は6種以上のタンパク質のレベル
が測定されるか、又は6種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様
において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、7種以上のタンパク質の存在が検出され
るか、又は7種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は7種以上のタンパク質のレ
ベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分
から、8種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は8種以上のタンパク質のレベルが
測定されるか、又は8種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様に
おいて、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、9種以上のタンパク質の存在が検出される
か、又は9種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は9種以上のタンパク質のレベ
ルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分か
ら、10種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は10種以上のタンパク質のレベルが
測定されるか、又は10種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。さらに他の実施
態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、11種以上のタンパク質の存在が検出
されるか、又は11種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は11種以上のタンパク
質のレベルの変化が測定される。いくつかの実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血
球成分から、12種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は12種以上のタンパク質の
レベルが測定されるか、又は12種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実
施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、13種以上のタンパク質の存在が検
出されるか、又は13種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は13種以上のタンパ
ク質のレベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤
血球成分から、14種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は14種以上のタンパク質
のレベルが測定されるか、又は14種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。さら
なる実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、15種以上のタンパク質の存
在が検出されるか、又は15種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は15種以上の
タンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤
血球成分から、16種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は16種以上のタンパク質
のレベルが測定されるか、又は16種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。さら
に他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、17種以上のタンパク質の
存在が検出されるか、又は17種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は17種以上
のタンパク質のレベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試
料又は赤血球成分から、18種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は18種以上のタ
ンパク質のレベルが測定されるか、又は18種以上のタンパク質のレベルの変化が測定され
る。他の実施態様において、赤血球濃縮試料中で、19種以上のタンパク質の存在が検出さ
れるか、又は19種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は19種以上のタンパク質
のレベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球
成分から、20種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は20種以上のタンパク質のレ
ベルが測定されるか、又は20種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。さらに他
の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、21種以上のタンパク質の存在
が検出されるか、又は21種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は21種以上のタ
ンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血
球成分から、22種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は22種以上のタンパク質の
レベルが測定されるか、又は22種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実
施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、23種以上のタンパク質の存在が検
出されるか、又は23種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は23種以上のタンパ
ク質のレベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤
血球成分から、24種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は24種以上のタンパク質
のレベルが測定されるか、又は24種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。さら
に他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、25種以上のタンパク質の
存在が検出されるか、又は25種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は25種以上
のタンパク質のレベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試
料又は赤血球成分から、26種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は26種以上のタ
ンパク質のレベルが測定されるか、又は26種以上のタンパク質のレベルの変化が測定され
る。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、27種以上のタン
パク質の存在が検出されるか、又は27種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は
27種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態様において、赤血球濃縮
試料又は赤血球成分から、28種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は28種以上の
タンパク質のレベルもしくはレベルの変化が測定されるか、28種以上のタンパク質のレベ
ルが測定されるか、又は28種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。他の実施態
様において、赤血球濃縮試料又は赤血球成分から、29種以上のタンパク質の存在が検出さ
れるか、又は29種以上のタンパク質のレベルが測定されるか、又は29種以上のタンパク質
のレベルの変化が測定される。さらに他の実施態様において、赤血球濃縮試料又は赤血球
成分から、30種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は30種以上のタンパク質のレ
ベルが測定されるか、又は30種以上のタンパク質のレベルの変化が測定される。
タンパク質プロファイルは、例えば、本開示の方法の1つ又は複数に従って調製される
溶解物、細胞洗浄液、細胞上清、又はこれらの組合せにおける1種以上のタンパク質の存
在を検出することにより、作成又は生成することができる。検出されたタンパク質を定量
(例えば、レベルを測定)して、タンパク質プロファイルを作成又は生成することができる
。他の実施態様において、タンパク質プロファイルは、1種以上のタンパク質のレベルの
変化を測定することにより、本明細書に提供される方法に従って作成することができ、こ
の場合、該タンパク質プロファイルは、レベルの変化を有する1種以上のタンパク質及び/
又は1種以上のタンパク質のレベルの変化の測定値を含み得る。
単一の又は混合された血液細胞集団及び血漿/血清中のタンパク質の検出及び/又は定量
の方法は、当業者に利用可能である。好適な方法の非限定的な例としては、抗体ベースの
方法、一般的に、フローサイトメトリー、ELISA、ラテラルフロー、免疫染色、免疫蛍光
、免疫電気泳動(例えば、ウエスタンブロットを含む)などが挙げられる。或いは、タンパ
ク質は、質量分析、分光法、クロマトグラフィー、電気泳動、ビシンコニン酸アッセイ(B
CA)、酵素アッセイなどを用いて検出及び/又は定量することができる。ここでもほんの一
例として、タンパク質定量法は、米国特許第7,501,286号、第8,530,182号、及び米国特許
公開第2013028838号に記載されている。方法は、本明細書の実施例にも提示されている。
本開示は、血漿中の同じ1種以上のタンパク質のレベルに対する赤血球中の1種以上のタ
ンパク質のレベルを含むタンパク質比を計算することにより、赤血球濃縮試料又は赤血球
成分からタンパク質プロファイルを作成する方法も提供する。該タンパク質比は、RBC及
び血漿中の測定されたタンパク質濃度を標準化し、その後、RBC中のタンパク質の濃度を
血漿中のタンパク質の濃度で割ることにより計算することができる。RBC及び血漿中のタ
ンパク質の濃度は、全血中の1ミリリットル当たりのそれらの相対濃度(例えば、全血中の
％)を計算することにより標準化される。
ある実施態様において、血漿中の1種以上のタンパク質のレベルに対する赤血球中の1種
以上のタンパク質のレベルを含むタンパク質比は、少なくとも2:1、少なくとも10:1、少
なくとも20:1、少なくとも30:1、少なくとも40:1、少なくとも50:1、少なくとも60:1、少
なくとも70:1、少なくとも80:1、少なくとも90:1、少なくとも100:1、少なくとも110:1、
少なくとも120:1、少なくとも130:1、少なくとも140:1、少なくとも150:1、少なくとも16
0:1、少なくとも170:1、少なくとも180:1、少なくとも190:1、又は少なくとも200:1であ
る。他の実施態様において、該タンパク質比は、少なくとも3:1、少なくとも4:1、少なく
とも5:1、少なくとも6:1、少なくとも7:1、少なくとも8:1、少なくとも9:1、少なくとも1
0:1、少なくとも11:1、少なくとも12:1、少なくとも13:1、少なくとも14:1、少なくとも1
5:1、少なくとも16:1、少なくとも17:1、少なくとも18:1、少なくとも19:1、少なくとも2
0:1、少なくとも21:1、少なくとも22:1、少なくとも23:1、少なくとも24:1、少なくとも2
5:1、少なくとも26:1、少なくとも27:1、少なくとも28:1、少なくとも29:1、少なくとも3
0:1、少なくとも31:1、少なくとも32:1、少なくとも33:1、少なくとも34:1、少なくとも3
5:1、少なくとも36:1、少なくとも37:1、少なくとも38:1、少なくとも39:1、又は少なく
とも40:1である。
(疾患のプロファイリング及び評価)
本開示は、血液試料(例えば、全血試料又は赤血球濃縮血液試料又は赤血球濃縮画分)の
疾患タンパク質プロファイルを作成するための本明細書における方法を提供する。ある実
施態様において、疾患プロファイルは、プロテアーゼインヒビターと接触させていない試
料と比較した、プロテアーゼインヒビターと接触させた赤血球濃縮試料又は赤血球成分と
関連する1種以上のタンパク質の存在及び/又はレベルに差がある疾患又は障害について作
成することができる。その代わりに又はそれに加えて、疾患タンパク質プロファイルは、
疾患又は障害を有さない対象由来の赤血球濃縮試料又は赤血球成分(例えば、プロテアー
ゼインヒビターと接触させた試料)と比較した、疾患又は障害を有する対象由来のプロテ
アーゼインヒビターと接触させた赤血球濃縮試料又は赤血球成分と関連する1種以上のタ
ンパク質の存在及び/又はレベルに差がある疾患又は障害について作成することができる
。さらに他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有する
対象のタンパク質プロファイル由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と疾患又は障
害を有さない対象のタンパク質プロファイル由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化
に差がある疾患又は障害について作成することができる。非限定的な例として、疾患プロ
ファイルは、表1に記載されているタンパク質の1つもしくは複数、又は表2に記載されて
いるタンパク質の1以上の組合せの存在又はレベルに差がある疾患又は障害について作成
することができる。
ある実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有する1以上
の対象から本明細書に提供される方法に従って少なくとも1つのタンパク質プロファイル
を得ること並びにプロテアーゼインヒビターと接触させた赤血球濃縮試料中の1種以上の
タンパク質の存在、レベル、又はレベルの変化とプロテアーゼインヒビターと接触させて
いない赤血球濃縮試料中の1種以上のタンパク質の存在、レベル、又はレベルの変化を比
較することにより作成される。他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、
本方法に従って疾患又は障害を有さない1以上の対象から少なくとも1つのタンパク質プロ
ファイルを得ること及び疾患又は障害を有する1以上の対象から本方法に従って得られる
少なくとも1つのタンパク質プロファイル中の1種以上のタンパク質の存在又はレベルを比
較することにより作成される。ある実施態様において、少なくとも1つのタンパク質プロ
ファイルは、疾患又は障害を有する対象から得られる。他の実施態様において、少なくと
も1つのプロファイルは、疾患又は障害を有さない対象から得られる。さらなる実施態様
において、少なくとも1つのタンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有する対象から
得られ、少なくとも1つのタンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有さない対象から
得られる。他の実施態様において、血液試料は、疾患又は障害を有する1以上の対象から
採取され、プールされる。他の実施態様において、血液試料は、疾患又は障害を有さない
1以上の対象から採取され、プールされる。タンパク質プロファイルは、疾患もしくは障
害を有する1以上の対象、及び/又は疾患もしくは障害を有さない1以上の対象のプール血
液試料から本方法に従って得ることができる。タンパク質プロファイルは、疾患タンパク
質プロファイルを含むタンパク質を決定する前の時点で、該タンパク質プロファイル中の
1種以上のタンパク質の存在又はレベルを比較することにより得ることができる。
いくつかの実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、プロテアーゼインヒビ
ターと接触させていない対象由来の赤血球濃縮試料又は赤血球成分と比較して、プロテア
ーゼインヒビターと接触させた疾患又は障害を有する対象由来の赤血球濃縮試料又は赤血
球成分中で異なる存在、レベル、又はレベルの変化を有する1種以上のタンパク質から構
成される。他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、本方法に従って作成
され、かつ疾患又は障害を有さない対象由来の赤血球濃縮試料又は赤血球成分と比較して
、疾患又は障害を有する対象由来の赤血球濃縮試料又は赤血球成分中で異なる存在、レベ
ル、又はレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む。当業者は、タンパク質の存
在及び/又はレベルの統計的に関連性のある差を決定する解析を用いて、タンパク質が異
なる(例えば、変化した(changed)もしくは変化した(altered))存在及び/もしくはレベル(
例えば、より高いもしくはより低いレベル)、又は異なるレベルの変化(例えば、倍数変化
)を有するかどうかを決定することができる。
ある実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、プロテアーゼインヒビターと
接触させていない対象由来の血液試料中に存在しない、1種以上のプロテアーゼインヒビ
ターと接触させた疾患又は障害を有する対象由来の血液試料(例えば、全血試料もしくは
赤血球濃縮試料)又は赤血球成分中に存在する1種以上のタンパク質を含む。他の実施態様
において、疾患タンパク質プロファイルは、プロテアーゼインヒビターと接触させていな
い対象由来の血液試料又は赤血球成分中に存在する、1種以上のプロテアーゼインヒビタ
ーと接触させた疾患又は障害を有する対象由来の血液試料又は赤血球成分中に存在しない
1種以上のタンパク質を含む。他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、
プロテアーゼインヒビターと接触させていない対象由来の血液試料又は赤血球成分と比較
して、プロテアーゼインヒビターと接触させた疾患又は障害を有する対象由来の血液試料
又は赤血球成分中でより高いレベルを有する1種以上のタンパク質を含む。さらに他の実
施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、プロテアーゼインヒビターと接触させ
ていない対象由来の血液試料と比較して、プロテアーゼインヒビターと接触させた疾患又
は障害を有する対象由来の血液試料又は赤血球成分中でより低いレベルを有する1種以上
のタンパク質を含む。
さらに他の実施態様において、本方法に従って作成される疾患タンパク質プロファイル
は、疾患又は障害を有さない対象と比較して、疾患又は障害を有する対象において異なる
レベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む。他の実施態様において、疾患又は障
害を有する対象における1種以上のタンパク質のレベルの変化は、疾患又は障害を有さな
い対象における1種以上のタンパク質のレベルの減少と比較したレベルの増加である。さ
らに他の実施態様において、疾患又は障害を有する対象における1種以上のタンパク質の
レベルの変化は、疾患又は障害を有さない対象における1種以上のタンパク質のレベルの
増加と比較したレベルの減少である。他の実施態様において、1種以上のタンパク質のレ
ベルの変化の増加又は減少の度合いは、疾患又は障害を有さない対象における1種以上の
タンパク質のレベルの変化の増加又は減少の度合いと比較して、疾患又は障害を有する対
象においてより大きい。他の実施態様において、1種以上のタンパク質のレベルの変化の
増加又は減少の度合いは、疾患又は障害を有さない対象における1種以上のタンパク質の
レベルの変化の増加の度合いと比較して、疾患又は障害を有する対象においてより小さい
。他の実施態様において、疾患又は障害を有さない対象における1種以上のタンパク質の
レベルの変化と比較して、疾患又は障害を有する対象における1種以上のタンパク質のレ
ベルの有意な変化はない。さらに他の実施態様において、疾患又は障害を有する対象にお
ける1種以上のタンパク質のレベルの変化と比較して、疾患又は障害を有さない対象にお
ける1種以上のタンパク質のレベルの有意な変化はない。
他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、上記の組合せを含み－例えば
、それは、プロテアーゼインヒビターと接触させていない対象由来の血液試料又は赤血球
成分中の1種以上のタンパク質のレベルと比較して、プロテアーゼインヒビターと接触さ
せた疾患又は障害を有する対象由来の血液試料又は赤血球成分中でより高いレベルを有す
る1種以上のタンパク質及びより低いレベルを有する1種以上のタンパク質を含む。ある実
施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、プロテアーゼインヒビターと接触させ
ていない対象由来の血液試料又は赤血球成分中の1種以上のタンパク質のレベルと比較し
て、プロテアーゼインヒビターと接触させた疾患又は障害を有する対象由来の血液試料又
は赤血球成分中で異なるレベルを有する1種以上のタンパク質を含む。
他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有する対象に
存在するが、該疾患又は障害を有さない対象に存在しない1種以上のタンパク質を含む。
他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有する対象に存
在しないが、該疾患又は障害を有さない対象に存在する1種以上のタンパク質を含む。い
くつかの他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有さな
い対象における1種以上のタンパク質と比較して、疾患又は障害を有する対象においてよ
り高いレベルを有する1種以上のタンパク質を含む。さらに他の実施態様において、疾患
タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有さない対象における1種以上のタンパク質
と比較して、疾患又は障害を有する対象においてより低いレベルを有する1種以上のタン
パク質を含む。さらに他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、上記の組
合せ－例えば、疾患又は障害を有さない対象における1種以上のタンパク質と比較して、
疾患又は障害を有する対象においてより高いレベルを有する1種以上のタンパク質及びよ
り低いレベルを有する1種以上のタンパク質を含む。ある実施態様において、疾患タンパ
ク質プロファイルは、疾患又は障害を有さない対象における1種以上のタンパク質と比較
して、疾患又は障害を有する対象において異なるレベルを有する1種以上のタンパク質を
含む。さらに他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、疾患又は障害を有
さない対象における1種以上のタンパク質のレベルの変化と比較して、疾患又は障害を有
する対象において異なるレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む。
ある実施態様において、疾患タンパク質プロファイルは、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13
、MIF、エオタキシン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択さ
れる1種以上のタンパク質を含む癌タンパク質プロファイルである。他の実施態様におい
て、疾患タンパク質プロファイルは、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM
-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra、及びHGFからなる群から選択される1
種以上のタンパク質を含む子癇前症タンパク質プロファイルである。
本開示は、本明細書に提供される方法によって作成される疾患タンパク質プロファイル
を用いて、対象が疾患又は障害を有するかどうかを決定する方法も提供する。本明細書に
提供される方法のうちの1つによって作成された少なくとも1つのタンパク質プロファイル
を対象から得ることができる。対象のタンパク質プロファイルは、2種のタンパク質プロ
ファイル(例えば、タンパク質の存在、タンパク質レベル、又はタンパク質レベルの変化)
の類似性について、本明細書に提供される方法によって作成される疾患タンパク質プロフ
ァイルと比較することができる。対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロフ
ァイルの類似性は、該対象が該疾患又は障害を有することを示し得る。ある実施態様にお
いて、疾患タンパク質プロファイルと比較して、対象のタンパク質プロファイル中の少な
くとも1種のタンパク質、少なくとも2種のタンパク質、少なくとも3種のタンパク質、少
なくとも4種のタンパク質、少なくとも5種のタンパク質、少なくとも6種のタンパク質、
少なくとも7種のタンパク質、少なくとも8種のタンパク質、少なくとも9種のタンパク質
、少なくとも10種のタンパク質、少なくとも11種のタンパク質、少なくとも12種のタンパ
ク質、少なくとも13種のタンパク質、少なくとも14種のタンパク質、少なくとも15種のタ
ンパク質、少なくとも16種のタンパク質、少なくとも17種のタンパク質、少なくとも18種
のタンパク質、少なくとも19種のタンパク質、少なくとも20種のタンパク質、少なくとも
21種のタンパク質、少なくとも22種のタンパク質、少なくとも23種のタンパク質、少なく
とも24種のタンパク質、少なくとも25種のタンパク質、少なくとも26種のタンパク質、少
なくとも27種のタンパク質、少なくとも28種のタンパク質、少なくとも29種のタンパク質
、又は少なくとも30種のタンパク質に類似性がある。他の実施態様において、疾患タンパ
ク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質と比較して、対象のタンパク質プロフ
ァイル中の少なくとも1種のタンパク質に類似性がある。さらに他の実施態様において、
疾患タンパク質プロファイルと比較して、対象のタンパク質のプロファイル中の少なくと
も3種のタンパク質に類似性がある。さらに他の実施態様において、疾患タンパク質プロ
ファイルと比較して、対象のタンパク質のプロファイル中の少なくとも5種のタンパク質
に類似性がある。さらに他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルと比較して
、対象のタンパク質のプロファイル中の少なくとも10種のタンパク質に類似性がある。さ
らに他の実施態様において、疾患タンパク質プロファイルと比較して、対象のタンパク質
のプロファイル中の少なくとも15種のタンパク質に類似性がある。他の実施態様において
、疾患タンパク質プロファイルと比較して、対象のタンパク質のプロファイル中の少なく
とも20種のタンパク質に類似性がある。他の実施態様において、疾患タンパク質プロファ
イルと比較して、対象のタンパク質のプロファイル中の少なくとも30種のタンパク質に類
似性がある。
ある実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイル
は、同じ又は同様の存在、レベル、又はレベルの変化を有しており、対象が疾患又は障害
を有し得ることを示している。1種以上のタンパク質の同じ又は実質的に同じレベル又は
レベルの変化は、例えば、同じである(例えば、当業者によって決定されたとき、関連性
のある統計解析の範囲内にある)タンパク質レベルから、例えば、統計解析又は閾値倍差
により、当業者によって異なるものと決定されるよりも少ないタンパク質レベル(例えば
、2倍未満異なるタンパク質レベル)の範囲に及び得る。いくつかの実施態様において、対
象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレ
ベル又はレベルの変化は同じである。さらに他の実施態様において、対象のタンパク質プ
ロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの
変化は実質的に同様である。他の実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾
患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化の差は、当
業者に利用可能な統計法(例えば、0.05以下のp-値を伴うスチューデントのT-検定)によっ
て決定されたとき、実質的に同様である。さらに他の実施態様において、対象のタンパク
質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、
当業者に利用可能であるか又は当業者によって決定される所定の参照範囲(例えば、健常
な又は通常のタンパク質濃度範囲)との比較によって決定される。他の実施態様において
、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質
のレベルは、0.5倍未満異なる。ある他の実施態様において、対象のタンパク質プロファ
イルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルは、1倍未満異なる。
さらに他の実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファ
イルの1種以上のタンパク質のレベルは、1.5倍未満異なる。さらに他の実施態様において
、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質
のレベルは、2倍未満異なる。
他の実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイル
は、タンパク質の異なる存在、レベル、又はレベルの変化を有しており、対象が疾患又は
障害を有さないことを示す。ある実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾
患タンパク質プロファイルは、1種以上の異なるタンパク質を含む。他の実施態様におい
て、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルは、1種以上のタンパ
ク質の異なる又は実質的に異なるレベルを有する。1種以上のタンパク質の異なる又は実
質的に異なるレベル又はレベルの変化は、例えば、異なる(例えば、当業者によって決定
されたとき、関連性のある統計解析の範囲内にない)タンパク質レベルから、例えば、統
計解析又は閾値倍差により、当業者によって同様であると決定されるよりも大きいタンパ
ク質レベル(例えば、2倍よりも大きく異なるタンパク質レベル)の範囲に及び得る。いく
つかの実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイル
の1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は異なる。さらに他の実施態様におい
て、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク
質のレベル又はレベルの変化は実質的に異なる。他の実施態様において、対象のタンパク
質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベ
ルの変化の差は、当業者に利用可能な統計法(例えば、0.05以上のp-値を伴うスチューデ
ントのT-検定)によって決定されたとき、実質的に異なる。さらに他の実施態様において
、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質
のレベル又はレベルの変化の差は、当業者に利用可能であるか又は当業者によって決定さ
れる所定の参照範囲(例えば、健常な又は通常のタンパク質濃度範囲)との比較によって決
定される。ある実施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロ
ファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は、0倍～5倍異なる。他の実
施態様において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以
上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は、0.5倍よりも大きく異なる。他の実施態様
において、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタ
ンパク質のレベル又はレベルの変化は、1.0倍よりも大きく異なる。ある他の実施態様に
おいて、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタン
パク質のレベル又はレベルの変化は、1.5倍よりも大きく異なる。さらに他の実施態様に
おいて、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタン
パク質のレベル又はレベルの変化は、2.0倍よりも大きく異なる。さらに他の実施態様に
おいて、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタン
パク質のレベル又はレベルの変化は、2.5倍よりも大きく異なる。他の実施態様において
、対象のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質
のレベル又はレベルの変化は、3.0倍よりも大きく異なる。他の実施態様において、対象
のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベ
ル又はレベルの変化は、3.5倍よりも大きく異なる。さらに他の実施態様において、対象
のタンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベ
ル又はレベルの変化は、4.0倍よりも大きく異なる。さらなる実施態様において、対象の
タンパク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル
又はレベルの変化は、4.5倍よりも大きく異なる。他の実施態様において、対象のタンパ
ク質プロファイルと疾患タンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレ
ベルの変化は、5.0倍よりも大きく異なる。
(治療評価)
本開示は、本明細書に提供される方法によって作成されるタンパク質プロファイルを用
いて、対象における治療をモニタリングする方法も提供する。ある実施態様において、本
明細書に提供される方法に従って作成されるタンパク質プロファイルは、治療前及び治療
後の対象から得られ、該タンパク質プロファイルは、この2つの間の(例えば、タンパク質
の存在、レベル、又はレベルの変化の)差について比較される。他の実施態様において、
本明細書に提供される方法によって作成されるタンパク質プロファイルは、治療前及び治
療中の対象から得られ、該タンパク質プロファイルは、この2つの間の差について比較さ
れる。さらに他の実施態様において、本明細書に提供される方法によって作成されるタン
パク質プロファイルは、治療中及び治療後の対象から得られ、該タンパク質プロファイル
は、この2つの間の差について比較される。他の実施態様において、本明細書に提供され
る方法によって作成されるタンパク質プロファイルは、治療終了後及び後続の治療終了後
の時点の対象から得られ、該タンパク質プロファイルは、この2つの間の差について比較
される。
ある実施態様において、治療を受けている対象は、1以上の治療又はいくつかの治療を
受けていてもよい。他の実施態様において、該対象は、特定の治療を受けたことがあり、
かつ/又は特定の治療を受けている。ある実施態様において、治療前に得られるタンパク
質プロファイルは、治療を全く受けたことがない対象から得られてもよく、治療後の対象
のタンパク質プロファイルと比較される。他の実施態様において、タンパク質プロファイ
ルは、治療の過程で得られ、その場合、治療中のある時点で得られた対象の少なくとも1
つのタンパク質プロファイルは、治療中の異なる時点で得られた対象の少なくとも1つの
タンパク質プロファイルと比較される。ある実施態様において、治療前及び治療後のタン
パク質プロファイルは、治療の過程で同じ治療を受けている対象から得られる。他の実施
態様において、治療前及び治療後のタンパク質プロファイルは、治療の過程で異なる治療
を受けている対象(例えば、治療を切り替えた対象)から得られる。治療後の対象のタンパ
ク質プロファイルと比較した治療前に得られる対象のタンパク質プロファイル(例えば、
タンパク質の存在、レベル、又はレベルの変化)の差は、治療が対象に対する効果を有し
たことを示し得る。治療中の異なる時点で得られる対象のタンパク質プロファイルの差は
、治療が対象に対する効果を有したことを示し得る。治療中及び治療後に得られる対象の
タンパク質プロファイルの差は、治療が対象に対する効果を有したことを示し得る。
ある実施態様において、治療前及び治療後のタンパク質プロファイル中の少なくとも1
種のタンパク質、少なくとも2種のタンパク質、少なくとも3種のタンパク質、少なくとも
4種のタンパク質、少なくとも5種のタンパク質、少なくとも6種のタンパク質、少なくと
も7種のタンパク質、少なくとも8種のタンパク質、少なくとも9種のタンパク質、少なく
とも10種のタンパク質、少なくとも11種のタンパク質、少なくとも12種のタンパク質、少
なくとも13種のタンパク質、少なくとも14種のタンパク質、少なくとも15種のタンパク質
、少なくとも16種のタンパク質、少なくとも17種のタンパク質、少なくとも18種のタンパ
ク質、少なくとも19種のタンパク質、少なくとも20種のタンパク質、少なくとも21種のタ
ンパク質、少なくとも22種のタンパク質、少なくとも23種のタンパク質、少なくとも24種
のタンパク質、少なくとも25種のタンパク質、少なくとも26種のタンパク質、少なくとも
27種のタンパク質、少なくとも28種のタンパク質、少なくとも29種のタンパク質、又は少
なくとも30種のタンパク質に差がある。
ある実施態様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較した治療前のタンパク
質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質に差がある。さらに他の実施態様におい
て、治療後のタンパク質プロファイルと比較した治療前のタンパク質プロファイル中の少
なくとも3種のタンパク質に差がある。さらに他の実施態様において、治療後のタンパク
質プロファイルと比較した治療前のタンパク質プロファイル中の少なくとも5種のタンパ
ク質に差がある。さらに他の実施態様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較
した治療前のタンパク質プロファイル中の少なくとも10種のタンパク質に差がある。さら
に他の実施態様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較した治療前のタンパク
質プロファイル中の少なくとも15種のタンパク質に差がある。他の実施態様において、治
療後のタンパク質プロファイルと比較した治療前のタンパク質プロファイル中の少なくと
も20種のタンパク質に差がある。他の実施態様において、治療後のタンパク質プロファイ
ルと比較した治療前のタンパク質プロファイル中の少なくとも30種のタンパク質に差があ
る。ある実施態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療
中のある時点のタンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質に差がある。さ
らに他の実施態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療
中のある時点のタンパク質プロファイル中の少なくとも3種のタンパク質に差がある。さ
らに他の実施態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療
中のある時点のタンパク質プロファイル中の少なくとも5種のタンパク質に差がある。さ
らに他の実施態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療
中のある時点のタンパク質プロファイル中の少なくとも10種のタンパク質に差がある。さ
らに他の実施態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療
中のある時点のタンパク質プロファイル中の少なくとも15種のタンパク質に差がある。他
の実施態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療中のあ
る時点のタンパク質プロファイル中の少なくとも20種のタンパク質に差がある。他の実施
態様において、治療中の別の時点のタンパク質プロファイルと比較した治療中のある時点
のタンパク質プロファイル中の少なくとも30種のタンパク質に差がある。ある他の実施態
様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較した治療中のタンパク質プロファイ
ル中の少なくとも1種のタンパク質に差がある。さらに他の実施態様において、治療後の
タンパク質プロファイルと比較した治療中のタンパク質プロファイル中の少なくとも3種
のタンパク質に差がある。さらに他の実施態様において、治療後のタンパク質プロファイ
ルと比較した治療中のタンパク質プロファイル中の少なくとも5種のタンパク質に差があ
る。さらに他の実施態様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較した治療中の
タンパク質プロファイル中の少なくとも10種のタンパク質に差がある。さらに他の実施態
様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較した治療中のタンパク質プロファイ
ル中の少なくとも15種のタンパク質に差がある。他の実施態様において、治療後のタンパ
ク質プロファイルと比較した治療中のタンパク質プロファイル中の少なくとも20種のタン
パク質に差がある。他の実施態様において、治療後のタンパク質プロファイルと比較した
治療中のタンパク質プロファイル中の少なくとも30種のタンパク質に差がある。
ある実施態様において、治療前に得られる対象のタンパク質プロファイルは、治療後に
得られるタンパク質プロファイルと異なるタンパク質を含み、治療が対象に対する効果を
有した可能性があることを示す。他の実施態様において、治療前に得られる対象のタンパ
ク質プロファイルは、治療後に得られるタンパク質プロファイルと比較して、1種以上の
タンパク質の異なるレベルを有し、治療が対象に対する効果を有した可能性があることを
示す。1種以上のタンパク質のレベルの差は、先に記載されているように、当業者によっ
て適切に決定されることができる(例えば、統計解析を用いて、又はタンパク質レベルを
測定及び比較して、タンパク質の存在又はレベルの統計的に有意な差を決定する)。1種以
上のタンパク質の異なるレベルは、例えば、1倍差よりも大きいレベルを含み得る。ある
実施態様において、治療前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタン
パク質のレベルの差は、1倍超、1.5倍超、2倍超、2.5倍超、3倍超、3.5倍超、4倍超、4.5
倍超、5倍超、5.5倍超、6倍超、6.5倍超、7倍超、7.5倍超、8倍超、8.5倍超、9倍超、9.5
倍超、又は10倍超である。いくつかの実施態様において、治療前及び治療後の対象のタン
パク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、1.5倍超である。他の実施態
様において、治療前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質
のレベルの差は、2倍超である。他の実施態様において、治療前及び治療後の対象のタン
パク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、2.5倍超である。さらに他の
実施態様において、治療前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタン
パク質のレベルの差は、3倍超である。さらに他の実施態様において、治療前及び治療後
の対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、4倍超である。
他の実施態様において、治療前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1種以上の
タンパク質のレベルの差は、5倍超である。他の実施態様において、治療前及び治療後の
対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、6倍超である。さ
らに他の実施態様において、治療前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1種以
上のタンパク質のレベルの差は、7倍超である。他の実施態様において、治療前及び治療
後の対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、8倍超である
。さらに他の実施態様において、治療前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1
種以上のタンパク質のレベルの差は、9倍超である。さらに他の実施態様において、治療
前及び治療後の対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベルの差は、1
0倍超である。
ある実施態様において、対象の治療をモニタリングするために、少量の血液試料を採取
して、治療前及び治療後のタンパク質プロファイルを作成する。少量の血液試料は、対象
から頻繁にサンプリングすることを可能にし、結果的に、これまで達成できなかった頻度
での治療モニタリングを可能にする。いくつかの実施態様において、少量の血液試料は、
1日に1回以上、1日に2回以上、1日に3回以上、1日に4回以上、又は1日に5回以上の頻度で
採取することができる。他の実施態様において、少量の血液試料は、1週間に1回以上、1
週間に2回以上、1週間に3回以上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、
又は1週間に7回以上採取される。他の実施態様において、少量の血液試料は、毎日採取さ
れる。さらに他の実施態様において、少量の血液試料は、1週間に1回、2週間に1回、3週
間に1回、又は4週間に1回採取される。ある実施態様において、少量の血液試料は、1カ月
に1回採取される。
本開示は、本明細書に提供される方法によって作成されるタンパク質プロファイルを用
いて、対象における治療の有効性を決定する方法も提供する。ある実施態様において、少
なくとも1つのタンパク質プロファイルは、治療を受けた対象から得られる。他の実施態
様において、少なくとも1つのタンパク質プロファイルは、治療を受けていない対象から
得られ、治療を受けた対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルは、治療を受けて
いない対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較される。他の実施態様にお
いて、該タンパク質プロファイルは、治療を受けていない1以上の対象から採取される血
液試料を用いて作成され、該血液試料はプールされる。他の実施態様において、タンパク
質プロファイルは、治療を受けた対象から採取される1以上の血液試料を用いて作成され
、血液試料はプールされる。タンパク質プロファイルは、治療を受けていない1以上の対
象のプール血液試料及び/又は治療を受けていない対象由来の1以上の血液試料から作成す
ることができる。他の実施態様において、1以上のタンパク質プロファイルは、治療を受
けていない1以上の対象から得られ、かつ/又は1種以上のタンパク質プロファイルは、治
療を受けた対象から得られ、かつ統計解析は、当技術分野で利用可能な手段によって実施
されて、(存在及び/もしくはレベルの統計的に有意な差によって)治療を受けていない対
象のタンパク質プロファイルを含むタンパク質を決定し、かつ/又は健常個体由来の参照
範囲は、治療を受けた対象のタンパク質プロファイルと比較される。治療を受けた対象の
タンパク質プロファイルと治療を受けていない対象のタンパク質プロファイルは、これら
2つのタンパク質プロファイルを比較する前の時点で作成することができる。
治療を受けていない対象のタンパク質プロファイルと比較した、治療を受けた対象のタ
ンパク質プロファイル間の1種以上のタンパク質の存在、レベル、又はレベルの変化の類
似性は、治療の有効性を示し得る。ある実施態様において、少なくとも1種のタンパク質
、少なくとも2種のタンパク質、少なくとも3種のタンパク質、少なくとも4種のタンパク
質、少なくとも5種のタンパク質、少なくとも6種のタンパク質、少なくとも7種のタンパ
ク質、少なくとも8種のタンパク質、少なくとも9種のタンパク質、少なくとも10種のタン
パク質、少なくとも11種のタンパク質、少なくとも12種のタンパク質、少なくとも13種の
タンパク質、少なくとも14種のタンパク質、少なくとも15種のタンパク質、少なくとも16
種のタンパク質、少なくとも17種のタンパク質、少なくとも18種のタンパク質、少なくと
も19種のタンパク質、少なくとも20種のタンパク質、少なくとも21種のタンパク質、少な
くとも22種のタンパク質、少なくとも23種のタンパク質、少なくとも24種のタンパク質、
少なくとも25種のタンパク質、少なくとも26種のタンパク質、少なくとも27種のタンパク
質、少なくとも28種のタンパク質、少なくとも29種のタンパク質、又は少なくとも30種の
タンパク質に類似性がある。他の実施態様において、少なくとも1種のタンパク質に類似
性がある。さらに他の実施態様において、少なくとも3種のタンパク質に類似性がある。
さらに他の実施態様において、少なくとも5種のタンパク質に類似性がある。さらに他の
実施態様において、少なくとも10種のタンパク質に類似性がある。さらに他の実施態様に
おいて、少なくとも15種のタンパク質に類似性がある。他の実施態様において、少なくと
も20種のタンパク質に類似性がある。他の実施態様において、少なくとも30種のタンパク
質に類似性がある。
ある実施態様において、治療を受けた対象のタンパク質プロファイルと治療を受けてい
ない対象のタンパク質プロファイルは、存在する同じ1種以上のタンパク質を有し、治療
が有効であった可能性があることを示す。他の実施態様において、治療を受けた対象のタ
ンパク質プロファイルと治療を受けていない対象のタンパク質プロファイルは、1種以上
のタンパク質の同じ又は実質的に同様のレベル又はレベルの変化を有し、治療が有効であ
った可能性があることを示す。1種以上のタンパク質の同じ又は実質的に同様のレベル又
はレベルの変化には、例えば、同じである(例えば、当業者によって決定されたとき、関
連性のある統計解析の範囲内にある)タンパク質のレベル又はレベルの変化から、当業者
によって、例えば、統計解析又は所定の閾値倍差(例えば、2倍未満の差)により、十分に
異なると決定されるタンパク質レベルが含まれ得る。いくつかの実施態様において、治療
を受けた対象のタンパク質プロファイルと治療を受けていない対象のタンパク質プロファ
イルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は同じである。さらに他の実施態
様において、治療を受けた対象のタンパク質プロファイルと治療を受けていない対象のタ
ンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は実質的に同様
である。他の実施態様において、治療を受けた対象のタンパク質プロファイルと治療を受
けていない対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質レベル又はレベルの変
化の差は、当業者に利用可能な統計法(例えば、0.05以下のp-値を伴うスチューデントのT
-検定)によって決定される。さらに他の実施態様において、治療を受けた対象のタンパク
質プロファイルと治療を受けていない対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパ
ク質のレベル又はレベルの変化の差は、当業者に利用可能であるか又は当業者によって決
定される所定の参照範囲(例えば、健常な又は通常の濃度範囲)との比較によって決定され
る。他の実施態様において、治療を受けた対象のタンパク質プロファイルと治療を受けて
いない対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化
は、0.5倍未満異なる。他の実施態様において、治療を受けた対象のタンパク質プロファ
イルと治療を受けていない対象のタンパク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベ
ル又はレベルの変化は、1倍未満異なる。さらに他の実施態様において、治療を受けた対
象のタンパク質プロファイルと治療を受けていない対象のタンパク質プロファイルの1種
以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は、1.5倍未満異なる。さらに他の実施態様
において、治療を受けた対象のタンパク質プロファイルと治療を受けていない対象のタン
パク質プロファイルの1種以上のタンパク質のレベル又はレベルの変化は、2倍未満異なる
。
(対象)
ある実施態様は、対象由来の血液試料又はその成分のタンパク質プロファイルを決定す
ることに関する。
対象は、血液が赤血球を含む動物(例えば、哺乳動物、鳥、魚、爬虫類、又は両生類)で
あり得る。好適な対象の非限定的な例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類、及
び齧歯類種が挙げられる。それゆえ、いくつかの実施態様において、対象は、ヒト又は非
ヒト動物であり得る。他の実施態様において、対象は、マウス、ラット、ハムスター、フ
ェレット、アレチネズミ、ウサギ、サル、チンパンジー、ウマ、ポニー、ロバ、ヒツジ、
ブタ、ニワトリ、ヤギ、ネコ、又はイヌであり得る。
(キット)
本開示は、本明細書に記載される方法を実施するために必要な構成要素を含むキットも
提供する。
非限定的な例として、該キットは:血液の収集、プロテアーゼの阻害、血液凝固の防止
、血液の安定化、RBCの濃縮、赤血球成分の採取、非RBC血液成分の除去/分離、血液又は
その成分の瞬間凍結、細胞の溶解、細胞の洗浄、細胞の培養、細胞内及び/もしくは細胞
外での特定の標的タンパク質の検出、特定のタンパク質のレベルの測定、並びに/又はこ
れらの組合せのための手段を含み得る。ある実施態様において、該キットは、血液試料を
白血球除去し、赤血球濃縮試料を産生するための少なくとも1つの試薬及び少量の赤血球
濃縮試料中の1種以上のタンパク質の存在を検出するか又はそのレベルを測定するための
少なくとも1つの試薬を含む。ある実施態様において、1種以上のタンパク質の存在を検出
するか又はそのレベルを測定するための試薬は、ELISA装置である。他の実施態様におい
て、該キットは、対象から血液試料を採取するための少なくとも1つの試薬をさらに含む
。
いくつかの実施態様において、本開示によるキットは、以下のもの:対象から血液試料
を採取するための装置(例えば、シリンジ、針、翼状針、チューブ、針ホルダー、採血セ
ット、輸送装置、バキュテナー、hemaPEN(商標))、対象から乾燥血液試料を採取するため
の装置(例えば、濾紙、カード、HemaSpot(商標));液体血液試料から赤血球画分、白血球
画分、及び/又は血小板画分を採取するための装置(例えば、抗体がコーティングされた磁
気ビーズ);プロテアーゼインヒビター;抗凝固剤;タンパク質変性剤;など並びにこれらの
組合せのうちの1つ又は複数を含み得る。
(実施例)
これから、本開示を、限定するものと決してみなされるべきではない、具体的な実施例
を参照しながら説明することにする。
(実施例1.わずかな血液量でのタンパク質レベルの測定)
血漿中の相当量でのそのレベルと比較した赤血球中の高レベルの様々なタンパク質の発
見により、例えば、少量の全血及び/又はRBCを用いて、タンパク質マーカーを同定するこ
とができることが示唆された。数多くのタンパク質のレベルを少量の全血及びRBCで解析
した。
全血を、指穿刺により、健常ボランティア(n＝1)から、EDTA溶液(3mg/mL)中に直接収集
した。マルチプレックス解析(BioPlex解析)のために、試料を-80℃で保存し、-80℃で3回
の凍結解凍サイクルに供して、解析前の完全な細胞溶解を確実にもたらした。赤血球を3
回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。溶解後、全血を、
5μLの全血(45μLのPBS中)、10μLの全血(40μLのPBS中)、15μLの全血(35μLのPBS中)、
20μLの全血(30μLのPBS中)、又は25μLの全血(25μLのPBS中)でのマルチプレックスサイ
トカインアッセイで解析した。2つのマルチプレックスアッセイを利用した。第一のもの
は、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、
IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP
-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、及びVEGFについてアッセイする27-プ
レックスヒトサイトカインパネルであり、第二のものは、IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12
、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF
、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAILについてアッセイする21-プレックスヒトサイ
トカインパネルであった(Bio-Plex Pro 27-プレックス及び21-プレックス、Bio-Rad)。該
アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用い
て、製造元の指示に従って実施した。該アッセイをLuminex(登録商標) 200(商標)システ
ム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較正曲線を、BioPlexマ
ネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメータロジスティック
曲線回帰によって解析した。
様々な希釈(1:10、1:5、1:3.3、1:2.5、1:2)の全血中の表示されたタンパク質の濃度が
図1A～1TTに示されている(未希釈の濃度に計算し直されている)。全血の解析により、い
くつかのタンパク質が存在すること、及びこれらのタンパク質が様々な希釈でも存在する
ことが明らかになった。しかしながら、解析されたタンパク質の多くについて、希釈線形
性はなかった。これは、全血に特有のものではなく; BioPlexなどのLuminexプラットフォ
ームでの血漿の解析においても観察される(希釈によって、より多くのタンパク質が通常
検出される)。これらの結果は、タンパク質を(5μLに至るまでの)少量の全血でモニタリ
ングすることができることを示している。全血中の数多くのタンパク質の検出の容易さは
、(例えば、指先から採取される)非常にわずかな血液量をタンパク質レベルの解析用に収
集し、使用することができることを示している。
(実施例2.指先血試料と静脈血試料中のタンパク質の存在)
わずかな血液量でのタンパク質の検出をさらに調べるために、指穿刺での数多くのタン
パク質のレベルを、利用可能な方法によって収集された静脈血でのそのレベルと比較した
。
全血を、健常ボランティアから、静脈穿刺によるか又は指穿刺によって(n＞12)、EDTA
バキュテナー(k2EDTAバキュテナー、BD Biosciences)又はEDTA溶液(3mg/mL)中に直接収集
した。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温で処理した。マルチプレックス解
析(BioPlex解析)のために、試料を-80℃で保存し、-80℃での3回の凍結解凍サイクルに供
して、解析前の完全な細胞溶解を確実にもたらした。血漿及び赤血球を、次のように、デ
キストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離し(1500g、10分)、上部の血漿層を収
集した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)に再懸濁させた。その後、
デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細胞懸濁液に1:4比(デキストラン:
細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降のために、この溶液を室温で30分
間放置した。この後、上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の赤血球画分を単離した。赤
血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で2回洗浄し、残りの赤血球ペレッ
トを計数し(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)、その後、解析まで凍結させた(-80℃)
。
赤血球を3回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。溶解
後、赤血球溶解物を4億細胞/mL相当までPBSに希釈した。その後、これらの溶解物をマル
チプレックスサイトカインアッセイで解析した。1つのマルチプレックスアッセイを利用
した。これは、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL
-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、
IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、及びVEGFについてアッセ
イする27-プレックスヒトサイトカインパネル(Bio-Plex Pro 27-プレックス、Bio-Rad)で
あった。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄
工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセイをLuminex(登録商標) 200(商
標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較正曲線を、
BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメータロジス
ティック曲線回帰によって解析した。
静脈血及び指先血から単離された血漿、又は静脈血及び指先血から単離された赤血球の
溶解物中の表示されたタンパク質の濃度は、図2A～2AAに示されている。有意差(p＜0.05)
は、スチューデントのT-検定を用いて決定された。指先血と静脈血を比較したとき、血漿
中のタンパク質のレベルと赤血球中のタンパク質のレベルの間に一貫した傾向があった。
例えば、IL-6の濃度は、静脈血漿中の濃度とは対照的に、指先から単離された血漿中で有
意により高い濃度であった。この同じ傾向は、赤血球で観察され、有意により高いレベル
のタンパク質が指先血から単離された細胞で観察された。この傾向は、例えば、IL-2、RA
NTES、及びIP-10を含む、いくつかのタンパク質について観察された。例えば、IL-1β、I
L-8、及びTNF-αを含む、いくつかのタンパク質について、より高い濃度が、指先血から
単離された血漿及び赤血球中で観察された。
赤血球について、生物学的変動(標準偏差)は、静脈試料よりも指先試料で小さかった(
例えば、MIP-1β、G-CSF)。これは、指先から収集された赤血球の解析が静脈血の解析よ
りも再現性が高いことを示唆した。正反対のことが、血漿中のいくつかのタンパク質につ
いて観察され、この場合、静脈血漿は指先血よりも変動が小さかった(例えば、IL-7、PDG
F-bb)。これらの結果は、頻繁な血液収集を使用し得る、指先由来の赤血球の単離及び解
析の正当性を裏付けた。
(実施例3.カチオン塩を用いるRBCにおけるタンパク質プロファイル)
赤血球を、次のように、デキストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離し(1500g
、10分)、上部の血漿層を廃棄した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)
に再懸濁させた。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細胞懸
濁液に1:4比(デキストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降のため
に、この溶液を室温で30分間放置した。この後、上部の白血球に富む層及び下部の赤血球
画分を分離し、白血球を廃棄した。下部の赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g
、5分)中で2回洗浄した。上清を廃棄し、赤血球ペレットをPBS又は100mM LiClを含有する
PBSのいずれかに再懸濁させた。
赤血球を3回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。溶解
後、赤血球溶解物を4億細胞/mL相当までPBSに希釈した。赤血球溶解物を、IL-1α、IL-2R
a、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MI
F、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAILについてアッセイする21-プレ
ックスヒトサイトカインパネル(Bio-Plex Pro 27-プレックス及び21-プレックス、Bio-Ra
d)で解析した。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioPlex Pro II, Bio-Rad)
を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセイをLuminex(登録商標)
200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較正曲
線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメータ
ロジスティック曲線回帰によって解析した。
図3A～図3Gに見られるように、塩化リチウムは、該アッセイで該タンパク質のうちのい
くつかのレベルを増大させ、かつ/又は増強した。
(実施例4.子癇前症又は癌を有する個体と比べた健常個体由来のRBCにおけるタンパク質プ
ロファイル)
疾患又は障害を有する個体と比較した健常個体の血液中のタンパク質のレベルの差を測
定した。全血を: 1)健常ボランティア、2)健常妊婦、3)子癇前症妊婦、及び4)癌患者を含
む、4群の人々から収集した(表1参照)。健常妊娠対照を、妊娠期間に応じて、子癇前症試
料とマッチさせた。血液を、各々のボランティアから、静脈穿刺(n≧3)によって、EDTAバ
キュテナー(k2EDTAバキュテナー、BD Biosciences)中に直接収集した。
(表1.参加者の概要)
Figure 0007425903000008
血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温で処理した。マルチプレックス解析(Bi
oPlex解析)のために、試料を-80℃で保存し、-80℃での3回の凍結解凍サイクルに供して
、解析前の完全な細胞溶解を確実にもたらした。
血漿及び赤血球を、次のように、デキストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離
し(1500g、10分)、上部の血漿層を収集した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウ
ム(0.15M)に再懸濁させた。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこ
の細胞懸濁液に1:4比(デキストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈
降のために、この溶液を室温で30分間放置した。この後、上部の白血球に富む層を廃棄し
、下部の赤血球画分を単離した。赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中
で2回洗浄し、残りの赤血球ペレットを計数し(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)、そ
の後、解析まで凍結させた(-80℃)。
赤血球を3回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。溶解
後、赤血球溶解物を4億細胞/mL相当までPBSに希釈した。その後、これらの溶解物及び血
漿試料(未希釈)をマルチプレックスサイトカインアッセイで解析した。2つのマルチプレ
ックスアッセイを利用した。第一のものは、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF、
IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p
70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-
α、及びVEGFについてアッセイする27-プレックスヒトサイトカインパネルであり、第二
のものは、IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2
、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAILにつ
いてアッセイする21-プレックスヒトサイトカインパネルであった(Bio-Plex Pro 27-プレ
ックス及び21-プレックス、Bio-Rad)。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioP
lex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセイ
をLuminex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々の
サイトカインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA
)を用いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解析した。
図4A～図4VVは、全血(約5×109細胞/mL) 1mL当たりの相対濃度に計算し直した参加者の
群由来の血漿及び赤血球(4億細胞/mL)の溶解物中の表示されたタンパク質の濃度を示して
いる。有意差(p＜0.05)は、スチューデントのT-検定を用いて決定された。健常(非妊娠)
個体の血液中のタンパク質レベルを癌患者と比較し、健常妊娠個体の血液中のタンパク質
レベルを子癇前症の妊娠個体の血液中のタンパク質レベルと比較した。図5A～図5Cは、血
漿と対比した赤血球中のタンパク質の濃度の倍数差を示している。
タンパク質の収集物において、健常対照個体におけるタンパク質レベルと疾患又は障害
を有する個体におけるタンパク質レベルの間に有意差があった。例えば、IL-2は、健常群
中よりも癌群から収集された赤血球中で有意に少なく(約10倍少なく)、ケモカインCTACK
は、健常妊娠群よりも子癇前症群から収集された赤血球中で有意に多かった。さらに、48
種のサイトカインのうちの28種は、血漿レベルを実質的に超える(2:1よりも大きい)RBC中
のタンパク質のレベルを有し、倍数変化は2:1から～280:1(RBC:血漿比)の範囲に及んだ。
中央値RBC-血漿比は5.9:1であった。試験の結果は、赤血球が、疾患のバイオマーカーを
同定するための有用なツールであり得ることを示している。さらに、血漿と併せた赤血球
の解析は、例えば、血漿単独でのタンパク質レベルには明らかな差がないが、赤血球(例
えば、bFGF)で、又は赤血球と血漿の間で同定可能な差がある場合、現在取得不可能であ
る病態に関するより多くの情報を提供し得る。
(実施例5.子癇前症又は癌を有する個体と比べた健常個体由来のRBCにおけるタンパク質プ
ロファイル及びRBCタンパク質放出)
赤血球によって放出されるタンパク質のレベルを、健常個体及び疾患又は障害を有する
個体で評価した。全血を: 1)健常ボランティア、2)健常妊婦、3)子癇前症妊婦、及び4)癌
患者を含む、4群の人々から収集した(表2)。
(表2.参加者の概要)
Figure 0007425903000009
健常な妊娠対照試料を、妊娠期間に応じて、子癇前症試料とマッチさせた。血液を、各
々のボランティアから、静脈穿刺(n≧3)によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナ
ー、BD Biosciences)中に直接収集した。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温
で処理した。マルチプレックス解析(BioPlex解析)のために、試料を-80℃で保存し、-80
℃での3回の凍結解凍サイクルに供して、解析前の完全な細胞溶解を確実にもたらした。
赤血球を、次のように、デキストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離し(1500g
、10分)、上部の血漿層を廃棄した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)
に再懸濁させた。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細胞懸
濁液に1:4比(デキストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降のため
に、この溶液を室温で30分間放置した。この後、上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の
赤血球画分を単離した。赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で2回洗
浄し、残りの赤血球ペレットを計数した(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)。その後
、赤血球を4億細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(500g、5分)により単離した。試料を
-80℃で保存し、解析前に3回の凍結/解凍サイクルを受けさせた。その後、馴化PBS試料を
マルチプレックスサイトカインアッセイで解析した。2つのマルチプレックスアッセイを
利用した。第一のものは、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、
IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1
5、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、及びVEGFにつ
いてアッセイする27-プレックスヒトサイトカインパネルであり、第二のものは、IL-1α
、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-
CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAILについてアッセイする2
1-プレックスヒトサイトカインパネルであった(Bio-Plex Pro 27-プレックス及び21-プレ
ックス、Bio-Rad)。該アッセイを、製造元の指示に従って、自動化磁気洗浄ステーション
(BioPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて実施した。該アッセイをLuminex(登録商
標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較
正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメ
ータロジスティック曲線回帰によって解析した。
図6A～図6RRは、参加者群由来の赤血球馴化PBS中の表示されたタンパク質の濃度を示し
ている。馴化PBSは、37℃で24時間の赤血球インキュベーションの後に産生された。有意
差(p＜0.05)は、スチューデントのT-検定を用いて決定された。健常対照個体と疾患群の
個体のタンパク質レベルに有意差があった。例えば、健常対照と比較したとき、健常個体
よりも有意に少ないIL-1α及びGCS-Fが、癌を有する人々から単離された赤血球から放出
され、健常個体よりも有意に多いIL-12(p40)及びエオタキシンが、癌患者から単離された
赤血球から放出された。同様に、少数のサイトカイン、例えば、MIFは、健常妊娠群と子
癇前症を有する群の間で有意に異なっていた。
これらの結果は、赤血球のセクレトームの解析が疾患のバイオマーカーを同定及び追跡
するための有用な診断ツールであり得ることを示唆した。赤血球の分泌(赤血球タンパク
質放出)の解析は、病態に関するさらなる情報を提供し得る。
(実施例6. RBC中に存在するタンパク質に対するプロテアーゼインヒビターの効果)
全血を静脈収集によってEDTAバキュテナー中に収集した。血漿を遠心分離後に収集し、
上記のようにFACS又はデキストラン沈降のどちらかを用いて、細胞を単離した。単離され
た細胞及び全血を遠心分離(2000g、10分)によってペレット化し、規定の濃度にまで再懸
濁させた。試料を-80℃で凍結させ、凍結/解凍サイクルに3回供して、細胞を溶解させた
。試料をHu 27-プレックスBioPlexで解析した。さらに、RBCによって放出又は分泌された
タンパク質を解析した。先に記載されているように、全血を静脈収集によってEDTAバキュ
テナー中に収集し、RBCをデキストラン沈降によって単離した。単離されたRBCを分注して
、100uLのPBS又はPBS＋プロテアーゼインヒビター(PI)(1×)中、2000万細胞にし、細胞を
、37℃、5％CO2で、24時間インキュベートした。インキュベーション後、上清と細胞を遠
心分離によって分離し、試料を-80℃で凍結させ、3回の凍結/解凍サイクルに供して、細
胞を溶解させた。試料をHu 27-プレックスBioPlexで解析した。
RBC培養中のプロテアーゼインヒビターの添加により、タンパク質の放出又は分泌が変
化した(37℃で24時間)。
インキュベーション条件は、次の通りであった:
1.RBC＋PBS(100uLのPBS中、2000万個のRBC)
2.RBC＋PBS＋プロテアーゼインヒビター(PI)(100uLのPBS＋PI中、2000万個のRBC)
図7A～7Zに示された一連のグラフは、RBCから放出又は分泌されたタンパク質の濃度(黒
色のカラム)及び放出又は分泌後に細胞に残存するタンパク質の濃度(灰色のカラム)に対
するプロテアーゼインヒビター(PI)の効果を示している。培養溶液中のプロテアーゼイン
ヒビターの包含の結果として、典型的には、放出又は分泌と細胞溶解物の両方について、
検出濃度がより低くなったが、例外もあった(すなわち、MIP-1b)。データは、平均±標準
偏差(SD)として提示されている。
(実施例7.子癇前症又は癌を有する個体と比べた健常個体由来のRBC中のタンパク質レベル
に対するプロテアーゼインヒビターの効果)
赤血球によって放出されるタンパク質のレベルを健常個体由来の赤血球及び疾患又は障
害を有する個体由来の赤血球で評価した。全血を: 1)健常ボランティア、2)健常妊婦、3)
子癇前症妊婦、及び4)癌患者を含む、4群の人々から収集した(表3)。
(表3.参加者の概要)
Figure 0007425903000010
健常な妊娠対照試料を、妊娠期間に応じて、子癇前症試料とマッチさせた。血液を、各
々のボランティアから、静脈穿刺(n≧3)によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナ
ー、BD Biosciences)中に直接収集した。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温
で処理した。マルチプレックス解析(BioPlex解析)のために、試料を-80℃で保存し、-80
℃での3回の凍結解凍サイクルに供して、解析前の完全な細胞溶解を確実にもたらした。
全血を遠心分離し(1500g、10分)、上部の血漿層を廃棄した。その後、赤血球を、次の
ように、デキストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離し(1500g、10分)、上部の
血漿層を廃棄した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)に再懸濁させた
。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細胞懸濁液に1:4比(デ
キストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降のために、この溶液を
室温で30分間放置した。この後、上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の赤血球画分を単
離した。赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で2回洗浄し、残りの赤
血球ペレットを計数した(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)。その後、赤血球を4億細
胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。
1つの例において、全血試料を2つのアリコートに分け、1つのアリコートを、表4に示さ
れる各々の群(健常ボランティア、健常妊娠、子癇前症、癌)について、一晩のインキュベ
ーションの間、プロテアーゼインヒビターカクテル(1×)のミニcOmpleteプロテアーゼイ
ンヒビターカクテル錠、Roche)で処理した。その後、赤血球を、デキストラン沈降を用い
て、全血から単離した。別の例において、赤血球をデキストラン沈降によって全血からま
ず単離し、赤血球画分を2つのアリコートに分け、表4に示される各々の群(健常ボランテ
ィア、健常妊娠、子癇前症、癌)について、一晩のインキュベーションの間、プロテアー
ゼインヒビターカクテル(1×、ミニcOmpleteプロテアーゼインヒビターカクテル錠、Roch
e)で処理した。
(表4.実験条件)
Figure 0007425903000011
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(500g、5分)により単離した。試料
を-80℃で保存し、解析前に3回の凍結/解凍サイクルを受けさせた。その後、馴化PBS試料
をマルチプレックスサイトカインアッセイで解析した。2つのマルチプレックスアッセイ
を利用した。第一のものは、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β
、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL
-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、及びVEGFに
ついてアッセイする27-プレックスヒトサイトカインパネルであり、第二のものは、IL-1
α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、
M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAILについてアッセイす
る21-プレックスヒトサイトカインパネルであった(Bio-Plex Pro 27-プレックス及び21-
プレックス、Bio-Rad)。該アッセイを、製造元の指示に従って、自動化磁気洗浄ステーシ
ョン(BioPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて実施した。該アッセイをLuminex(登
録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイトカイン
の較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パ
ラメータロジスティック曲線回帰によって解析した。
図8A～図8ZZ及び図9A～図9FFは、参加者群由来のプロテアーゼインヒビターの存在下又
は非存在下のいずれかの赤血球馴化PBSにおける表示されたタンパク質の濃度を示してい
る。馴化PBSは、37℃で24時間の赤血球インキュベーションの後に産生された。有意差(p
＜0.05)は、スチューデントのT-検定を用いて決定された。タンパク質レベルがプロテア
ーゼインヒビターの存在下で一般に減少する健常対象由来の血液試料(図7A～7Zを参照)と
は対照的に、子癇前症又は癌を有する対象の血液試料をプロテアーゼインヒビターととも
にインキュベートしたとき、タンパク質のレベルは同様であるか又は増大する傾向があっ
た。これらの結果は、どちらかの血液試料をプロテアーゼインヒビターと接触させ、かつ
タンパク質レベルの変化を検出/測定することにより、健常血液試料と罹患血液試料を識
別し得ることを示唆している。
図10A～図10D及び図11A～図11Dは、参加者群由来のプロテアーゼインヒビターの存在下
又は非存在下のいずれかの赤血球馴化PBSにおけるサイトカイン解析の累積蛍光データ(lo
g2)を示している。馴化PBSは、37℃で24時間の赤血球インキュベーションの後に産生され
た。有意差(p＜0.05)は、スチューデントのT-検定を用いて決定された。これらのデータ
は、子癇前症の女性から単離された赤血球が、プロテアーゼインヒビターで処理したとき
、それが存在しないときと比較して、有意により多いサイトカインを放出したことを示し
ている(図10Cを参照)。比較すると、健常な妊娠していない参加者について(図10Aを参照)
又は健常な妊娠している参加者について(図10Bを参照)、プロテアーゼインヒビターあり
の場合とプロテアーゼインヒビターなしの場合で、有意差は観察されなかった。同様に、
健常な非妊娠個体と健常な妊娠個体の間で、プロテアーゼインヒビター処理によるサイト
カインのレベルに有意差があり(図10B)、健常な参加者と癌患者の間で有意性の傾向があ
った(図11D)。これらの結果は、血液試料を処理するためのプロテアーゼインヒビターの
使用が健常群と罹患群の識別に役立ち得るということを示唆している。
(実施例8.健常個体由来の赤血球由来のタンパク質に対する特定のプロテアーゼインヒビ
ターの効果)
健常ボランティア由来の血液試料を用いて、赤血球由来のタンパク質に対する特定のプ
ロテアーゼインヒビターの効果を評価した。全血を、健常ボランティアから、静脈穿刺(n
≧3)によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナー、BD Biosciences)中に直接収集し
た。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温で処理した。マルチプレックス解析(
BioPlex解析)のために、試料を-80℃で保存した。
赤血球を、次のように、デキストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離し(1500g
、10分)、上部の血漿層を廃棄した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)
に再懸濁させた。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細胞懸
濁液に1:4比(デキストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降のため
に、この溶液を室温で30分間放置した。その後、上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の
赤血球画分を単離した。赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で1回洗
浄し、残りの赤血球ペレットを計数した(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)。その後
、赤血球を4億細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。
また、一部の試料を、PBSインキュベーション中、表5に示されたプロテアーゼインヒビタ
ーとともにインキュベートした。
(表5.プロテアーゼインヒビター)
Figure 0007425903000012
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(500g、5分)によって単離し、その
後、-80℃で保存した。その後、馴化PBS試料をマルチプレックスサイトカインアッセイで
解析した。2つのマルチプレックスアッセイを利用した。第一のものは、塩基性FGF、エオ
タキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、I
L-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1
β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、及びVEGFについてアッセイする27-プレックスヒトサイト
カインパネルであり、第二のものは、IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTA
CK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF
-1α、TNF-β、TRAILについてアッセイする21-プレックスヒトサイトカインパネルであっ
た(Bio-Plex Pro 27-プレックス及び21-プレックス、Bio-Rad)。該アッセイを、自動化磁
気洗浄ステーション(BioPlex Pro II、Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従
って実施した。該アッセイをLuminex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、
蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェ
ア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解析
した。
健常参加者由来のプロテアーゼインヒビターカクテル又は個々のプロテアーゼインヒビ
ターとともに37℃で24時間インキュベートした後の4億細胞/mLの赤血球馴化PBS中のタン
パク質について、倍数変化を決定した。p＜0.05の場合、値は、未処理の対照と有意に異
なる(*は、p＝0.05～0.01の場合; **は、p＝0.01～0.001の場合; ***は、p＜0.001の場合
)。1よりも大きい倍数変化を有する値は、タンパク質が、プロテアーゼインヒビターとと
もにインキュベートされていないもの(対照)と比較して、プロテアーゼインヒビターとと
もにインキュベートされた試料においてより高い濃度を有することを示し、1未満の倍数
変化を有する値は、タンパク質が、プロテアーゼインヒビターとともにインキュベートさ
れた試料において、そうでないもの(対照)と比較してより低い濃度を有することを示した
。有意差(p＜0.05)は、スチューデントのT-検定を用いて決定された。
(表6.プロテアーゼインヒビターによる赤血球中のタンパク質の倍数変化)
Figure 0007425903000013
個々のプロテアーゼインヒビターの使用は、対照細胞(プロテアーゼインヒビターなし)
と比較したとき、赤血球から放出される種々のサイトカインの濃度を変化させた(表6を参
照)。複数のプロテアーゼインヒビターが同じサイトカインの濃度を変化させたが、この
変化の方向は変動した。例えば、ベスタチン及びペプスタチンは、赤血球からのタンパク
質の放出に対する様々なプロテアーゼインヒビターの複雑な効果の最高の例である。赤血
球をアミノペプチダーゼインヒビターであるベスタチンとともにインキュベートすると、
放出されるIFN-a2、IL-18、MIF、TRAIL、HGF、及びIL12-p40の濃度が変化する。アスパラ
ギン酸プロテアーゼのペプスタチンも、IFN-a2、MIF、及びHGFの濃度に影響を及ぼす。し
かしながら、これらの例の各々において、ペプスタチンは、ベスタチンの正反対の効果を
もたらした。同様に、HGFの濃度は、赤血球をベスタチンとともにインキュベートした後
、劇的に増加したが、HGF濃度は、赤血球をペプスタチンとともにインキュベートした後
、顕著に減少した(表6)。特定のプロテアーゼインヒビターと複数のサイトカインの濃度
との間のこの相互作用の複雑な性質から、サイトカインの非特異的タンパク質分解の阻害
を上回るものが、プロテアーゼインヒビターを媒介するタンパク質濃度効果を生じさせて
いるという有力な証拠がもたらされた。
赤血球からのタンパク質の放出に対するプロテアーゼインヒビターの組合せの効果を決
定するために、タンパク質プロファイルをプロテアーゼインヒビターカクテルとともにイ
ンキュベートされた健常赤血球から得た。プロテアーゼインヒビターカクテルA8127sは、
表5の個々のプロテアーゼインヒビター(アンチパイン二塩酸塩50μg/mL;ベスタチン40μg
/mL; E-64 10μg/mL;ロイペプチン5μg/mL;ペプスタチン0.7μg/mL;ホスホラミドン330μ
g/mL; Pefabloc SC 1mg/mL; EDTA-Na2 0.5mg/mL;アプロチニン2μg/mL)を組み合わせるこ
とにより作製され、該プロテアーゼインヒビターの各々は、健常赤血球からのサイトカイ
ン放出に対して個々に顕著な効果を有していた(表6及び図12A～図12VV)。健常赤血球をA8
127s及びcOmpleteプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)とともにインキュベートし
た。A8127sは、IL-17、エオタキシン、GM-CSF、PDGF-bb、INF-a2、IL-2ra、CTACK、MCP-3
、MIG、及びIL-3の統計的に有意な変化をもたらしたが(図13A～図13VV)、cOmpleteプロテ
アーゼインヒビターカクテルは、本実験ではサイトカイン濃度に対する有意な変化をもた
らさなかった。
全体として、このデータは、プロテアーゼインヒビターが健常個体から単離される赤血
球から放出されるサイトカインの濃度の有意な変化をもたらすことを示した。個々のプロ
テアーゼとサイトカイン濃度の変化との間の複雑な関係性から、そのような効果がサイト
カインの非特異的タンパク質分解の阻害にのみ関連する可能性が低いことが示された。さ
らに、市販のインヒビターカクテル(Roche cOmplete)とA8127sプロテアーゼインヒビター
カクテルの比較から、A8127sが健常参加者から単離される赤血球から放出されるサイトカ
インの濃度/プロファイルの有意な変化をもたらす能力がより高いことが示された。
(実施例9.赤血球膜由来のタンパク質に対するプロテアーゼインヒビターの効果)
プロテアーゼインヒビターが赤血球膜からのタンパク質の放出に対する効果を有するか
どうかを決定するために、赤血球膜を単離赤血球及び全血から採取し、その後、プロテア
ーゼインヒビターとともにインキュベートした。全血を、健常ボランティアから、静脈穿
刺によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナー、BD Biosciences)中に直接収集した
。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温で処理した。マルチプレックス解析(Bi
oPlex解析)のために、試料を解析前に-80℃で保存した。
全血のアリコートを収集し、-80℃で凍結させた。赤血球を、次のように、デキストラ
ン沈降を用いて、残りの新鮮全血から単離した。全血を遠心分離し(1500g、10分)、上部
の血漿層を廃棄した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)に再懸濁させ
た。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)を細胞懸濁液に1:4比(デキ
ストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降のために、この溶液を室
温で30分間放置した。その後、上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の赤血球画分を単離
した。赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で1回洗浄し、残りの赤血
球ペレットを計数し(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)、細胞のアリコートを-80℃で
凍結させた。
赤血球膜の単離のために、全血と単離赤血球の両方の凍結アリコートを3回の凍結解凍
サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。溶解物のアリコート(100μL当
たり4000万個の赤血球に相当する容量)を1:20比(溶解物:PBS)でPBSに添加した。その後、
赤血球膜を溶液からの遠心分離(16,000g、20分、4℃)によって単離した。その後、上部の
画分を廃棄し、その後、得られた膜をPBS中で4億細胞/mLまで希釈し、37℃及び5％CO2で2
4時間インキュベートした。また、一部の試料を表5のプロテアーゼインヒビターとともに
インキュベートした。
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(16,000g、20分、4℃)により単離
した。試料を解析まで-80℃で保存した。その後、馴化PBS試料をマルチプレックスサイト
カインアッセイで解析した。27-プレックスヒトサイトカインパネルは、塩基性FGF、エオ
タキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、I
L-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1
β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、及びVEGFについてアッセイする。該アッセイを、自動化
磁気洗浄ステーション(BioPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に
従って実施した。該アッセイをLuminex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し
、蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウ
ェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解
析した。
図14A～図14AAは、プロテアーゼインヒビターカクテル(A8127s及びcOmplete(Roche))の
存在下又は非存在下のいずれかで、馴化PBS中でインキュベートされる赤血球膜中のいく
つかのタンパク質の濃度を示している。このデータは、より少ない赤血球数でさえ、顕著
な数のサイトカインが、(全血と濃縮赤血球溶解物の両方に由来する)赤血球膜馴化PBS中
に容易に検出可能なレベルでなおも存在することを示した。1mL当たり4億個という赤血球
の濃度は、1mL当たりわずか80μLの全血に相当した(新鮮全血1mL当たり5×109個の赤血球
という規定濃度を仮定する)。実験をわずか200μLの4億細胞/mL溶液で実施したので、上
で観察されたサイトカイン濃度を検出するためにわずか16μLの全血の出発試料で十分で
あるということになる。
(実施例10.癌コホート由来の赤血球タンパク質に対するプロテアーゼインヒビターの効果
)
多くのタンパク質の存在又はレベルの変化によって、種々の疾患が特徴付けられる。特
に、癌は、特に、タンパク質、炎症性タンパク質(例えば、サイトカイン)の示差レベルを
伴う疾患である。したがって、結腸直腸癌及びリンパ腫を有する人に由来する赤血球由来
のタンパク質の濃度を調べた。
全血を、ボランティアから、静脈穿刺によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナ
ー、BD Biosciences)中に直接収集した。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温
で処理した。マルチプレックス解析(BioPlex解析)のために、試料を解析前に-80℃で保存
した。赤血球を、次のように、デキストラン沈降を用いて単離した。全血を遠心分離し(1
500g、10分)、上部の血漿層を廃棄した。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.
15M)に再懸濁させた。その後、デキストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細
胞懸濁液に1:4比(デキストラン:細胞懸濁液)で添加した。チューブの底への赤血球沈降の
ために、この溶液を室温で30分間放置した。上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の赤血
球画分を単離した。該赤血球画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で1回洗浄
し、残りの赤血球ペレットを計数した(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)。その後、
赤血球を4億細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。ま
た、一部の試料を、PBSインキュベーション中、表5の個々のプロテアーゼインヒビター、
市販のプロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche)、又はA8127sプロテアーゼ
インヒビターカクテルとともにインキュベートした。A8127sプロテアーゼインヒビターカ
クテルは、アンチパイン二塩酸塩(50μg/mL);ベスタチン(40μg/mL); E-64(10μg/mL);ロ
イペプチン(5μg/mL);ペプスタチン(0.7μg/mL);ホスホラミドン(330μg/mL); Pefabloc
SC(1mg/mL); EDTA-Na2(0.5mg/mL);及びアプロチニン(2μg/mL)を含んでいた。
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(500g、5分)により単離した。試料
を-80℃で保存した。その後、馴化PBS試料を、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF
、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12
(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF
-α、及びVEGFについてアッセイする27-プレックスヒトサイトカインパネル(Bio-Plex Pr
o 27-プレックス、Bio-Rad)で解析した。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(Bi
oPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセ
イをLuminex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々
のサイトカインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, U
SA)を用いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解析した。
(10.1 結腸直腸癌)
図15A～図15AAは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から放出された表示されたタ
ンパク質の濃度を示しており、ここで、該赤血球は、個々のプロテアーゼインヒビター又
は市販のプロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche)とともにインキュベート
されたものであった。有意差(p＜0.05)は、スチューデントのT-検定を用いて決定された
。個々のプロテアーゼインヒビターは、対照(プロテアーゼインヒビターなし)と比較した
とき、結腸直腸癌参加者由来の赤血球から放出される種々のサイトカインの濃度を変化さ
せた。個々のプロテアーゼインヒビターは、放出されるサイトカインのプロファイルを非
常に様々な様式で変化させた。例えば、赤血球をアンチパイン二塩酸塩(パパイン、トリ
プシン、及びカテプシンのインヒビター)で処理すると、放出されるIFN-γ、IL-12(p70)
、IL-15、IL-17、IL-13、IL-7、IP-10、PDGF-bb、及びIL-2の濃度が増大し、一方、IL-1
β、IL-8、TNF-α、MIP-1α、G-CSF、及びIL-6の濃度が減少した。対照的に、Pefabloc S
C(セリンプロテアーゼインヒビター)は、IL-13及びIL-7のみの放出濃度を増大させ、一方
、IL-1β、IL-8、IL-9、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、MIP-1α、G-CSF、及びIL-6の濃度を減
少させた。特定のプロテアーゼインヒビターと複数のサイトカインの放出との間の相互作
用の複雑な性質から、サイトカインの非特異的タンパク質分解の阻害を上回るものが、タ
ンパク質レベルに対するプロテアーゼインヒビター媒介性効果を生じさせているという有
力な証拠がもたらされた。図16A～図16AAは、結腸直腸癌を有する個体由来の赤血球から
市販のプロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche)又はA8127sのいずれかを含
有する馴化PBS中に放出されたタンパク質の濃度を示している。cOmpleteプロテアーゼイ
ンヒビターカクテルは、対照試料と比較したとき、IL-2の濃度を有意に変化させただけで
あった。対照的に、A8127sプロテアーゼインヒビターカクテルによる赤血球の阻害は、対
照試料と比較したとき、IL-1β、IL-15、及びGM-CSFの濃度を有意に変化させた。このデ
ータは、結腸直腸癌患者から単離された赤血球をプロテアーゼインヒビターに曝露させる
と、馴化PBS中に放出されるサイトカインの濃度に対する有意な変化がもたされることを
示した。さらに、cOmpleteプロテアーゼインヒビターカクテルとA8127sプロテアーゼイン
ヒビターカクテルの比較により、A8127sカクテルは、結腸直腸癌参加者から単離される赤
血球由来の放出されるサイトカインのプロファイルの有意な変化をもたらす能力がより高
いことが示された。
次に、結腸直腸癌を有する人の赤血球から放出されたタンパク質に対するその効果と比
較した、健常個体由来の赤血球から放出されたタンパク質に対するプロテアーゼインヒビ
ターの効果の差を評価した。表5の個々のプロテアーゼインヒビターとともにインキュベ
ートされた赤血球由来のタンパク質の濃度が図17A～図17AAに示されている。このデータ
は、プロテアーゼインヒビターカクテルを特定の病態に対して最適化することができる方
法を提供する。サイトカインIL-8、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、及びIL-6は、結
腸直腸癌参加者由来のA8127sとともにインキュベートされた赤血球で統計的に有意な変化
を有すると確認された。個々のプロテアーゼインヒビターのデータは、Pefabloc SCが、I
L-8、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、及びIL-6について同じ様式で、健常参加者及び
結腸直腸癌参加者に影響を及ぼすことを示した。それゆえ、A8127sプロテアーゼカクテル
からのPefabloc SCの除去は、健常者のサイトカインプロファイルと結腸直腸癌のサイト
カインプロファイルの間で観察される差を増大させることができる。
図18A～図18AAは、赤血球をプロテアーゼインヒビターカクテル(A8127s及びcOmplete(R
oche))とともにインキュベートしたときの結腸直腸癌参加者と比べた健常個体由来の赤血
球におけるタンパク質濃度の倍数変化を示している。この結果は、赤血球とプロテアーゼ
インヒビターとのインキュベーションが、健常参加者と結腸直腸癌参加者の両群由来の赤
血球馴化PBSのサイトカインプロファイルに有意な変化をもたらすことを示した。A8127s
プロテアーゼインヒビターカクテルは、未処理の試料と比較したとき、健常参加者と結腸
直腸癌参加者の両方について、サイトカインレベルの最大数の統計的に有意な変化をもた
らした。この結果は、A8127sプロテアーゼインヒビターカクテルがcOmpleteプロテアーゼ
インヒビターカクテルよりも有意なサイトカインプロファイルの変化をもたらすことを示
した先の健常個体でのデータと一致していた。
健常コホート及び結腸直腸癌コホートから単離された試料は、プロテアーゼインヒビタ
ーに対するそれらの応答の仕方が異なっていた。結腸直腸癌患者由来の無傷赤血球をA812
7sプロテアーゼインヒビターカクテルとともにインキュベートしたとき、有意に変化する
いくつかのサイトカイン－IL-8、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、及びIL-6があった
。対照的に、無傷赤血球を健常参加者から単離し、A8127sとともにインキュベートしたと
き、有意な変化は検出されなかった。これは、A8127sプロテアーゼインヒビターカクテル
とともに又は該カクテルなしでインキュベートされた無傷赤血球が結腸直腸癌に特有であ
るサイトカインプロファイルを同定するのに有益であり得るということを示した。表7は
、各々のプロテアーゼインヒビターカクテルを用いて健常参加者及び結腸直腸癌参加者で
有意に変化したサイトカインの数をまとめたものである。
(表7.赤血球をプロテアーゼインヒビターカクテルとともにインキュベートした後に濃度
が有意に変化したタンパク質の数)
Figure 0007425903000014
健常コホート及び結腸直腸癌コホート由来の赤血球膜から放出されたタンパク質も、プ
ロテアーゼインヒビターの存在下及び非存在下で濃度差を示した。赤血球膜の単離のため
に、全血の凍結アリコートを3回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実に
もたらした。この後、溶解物のアリコート(100μL当たり1億2000万個の赤血球に相当する
容量)をPBSに1:20比(溶解物:PBS)で添加した。その後、赤血球膜を溶液からの遠心分離(1
6,000g、20分、4℃)によって単離した。その後、上部の画分を廃棄し、その後、得られた
膜を12億細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。プロテ
アーゼインヒビターとインキュベートしていない健常参加者又は結腸直腸癌を有する参加
者由来の赤血球膜と比較した、プロテアーゼインヒビターとともに37℃で24時間インキュ
ベートした後の12億細胞/mLの(全血溶解物から単離された)赤血球膜馴化PBS中のタンパク
質の倍数変化。p＜0.05の場合、値に有意差がある(*)。データは、平均±標準偏差である
。図19A～19VVは、8つのサイトカインが、健常個体由来の赤血球膜と比較した結腸直腸癌
を有する個体由来の赤血球膜でプロテアーゼインヒビターカクテルA8127sに対する示差応
答を有することを示した。
さらなるタンパク質の濃度を、健常個体及び結腸直腸癌を有する人由来のプロテアーゼ
インヒビターとともにインキュベートされた赤血球で解析した。sEGFR、FGF-塩基性、G-C
SF、HGF、sHER-2/neu、sIL-6Ra、レプチン、オステオポンチン、PECAM-1、PDGF-AB/BB、
プロラクチン、SCF、sTIE-2、sVEGFR-1、及びsVEGFR-2についてアッセイする16-プレック
スヒト癌バイオマーカーパネル1、並びにAPRIL/TNFSF13、BAFF/TNFSF13B、sCD30/TNFRF8
、sCD163、キチナーゼ-3様1、gp130/sIL-6Rβ、IFN-α2、IFN-γ、IL-2、sIL-6Rα、IL-8
、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-27(p28)、
IL-28A/IFN-λ2、IL-29/IFN-λ1、IL-32、IL-34、IL-35、LIGHT/TNFSF14、MMP-1、MMP-2
、MMP-3、オステオカルシン、オステオポンチン、ペントラキシン-3、sTNF-R1、sTNF-R2
、TSLP、及びTWEAK/TNFSF12についてアッセイする37-プレックスヒト炎症性サイトカイン
パネル(Bio-Plex癌バイオマーカー16-プレックスパネル及び炎症37-プレックスパネル、B
io-Rad)を使用した。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioPlex Pro II、Bio-
Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセイをLuminex(登録商
標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較
正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメ
ータロジスティック曲線回帰によって解析した。
図20A～20LLは、健常参加者(n＝3)又は結腸直腸癌を有する参加者(n＝2)についてのプ
ロテアーゼインヒビターもプロテアーゼインヒビターカクテルもなしで37℃で24時間イン
キュベートした後の4億細胞/mLの赤血球馴化PBS中のタンパク質の濃度を示している。p＜
0.05の場合、値に有意差があった(*)。データは、平均±標準偏差として提示されている
。このデータは、プロテアーゼインヒビターが、赤血球から放出される様々なホルモン、
可溶性受容体、タンパク質、及びサイトカインの濃度に対する効果を有することを示した
。高濃度の分子、例えば、オステオポンチン、キチナーゼ3-様1、及びMMP-1が、PBS中、3
7℃で24時間インキュベートされた健常個体から単離された赤血球から放出された(図20A
～20LL)。赤血球へのプロテアーゼインヒビターカクテルの添加は、タンパク質濃度の変
化をもたらした。例えば、sCD30/TNFRSF8、IL-19、及びLIGHT/TNFSF14は、対照(プロテア
ーゼインヒビターなし)と比較して、A8127sインキュベーションの場合に有意に多かった(
図20A～20LL)。プロテアーゼインヒビターインキュベーション後の観察された変化は、健
常参加者から単離された赤血球と結腸直腸癌を有する参加者から単離された赤血球で異な
っていた。例えば、オステオポンチンの濃度は、健常群由来の赤血球のA8127sインキュベ
ーションの場合に有意に増大したが、結腸直腸癌群では、同じ条件下で変化しなかった。
逆に、IL-27(p28)の濃度は、A8127sの場合に結腸直腸癌群で有意に減少したが、健常群で
は変化しなかった。1つのコホートがプロテアーゼインヒビターの存在下で有意に変化し
たタンパク質濃度を有する一方、もう1つのコホートでは、タンパク質濃度が反対の方向
に動くか、又は変化しないという傾向が10個のタンパク質で生じた。
次に、赤血球膜から放出されるタンパク質が、プロテアーゼインヒビターカクテルとと
もにインキュベートされた赤血球膜と比較して、赤血球で濃度差を示すかどうかを健常個
体について評価した。赤血球膜を採取するために、全血の凍結アリコートを3回の凍結解
凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。この後、溶解物のアリコート
(100μL当たり1億2000万個の赤血球に相当する容量)をPBSに1:20比(溶解物:PBS)で添加し
た。その後、赤血球膜を溶液からの遠心分離(16,000g、20分、4℃)によって単離した。そ
の後、上部の画分を廃棄し、その後、得られた膜を12億細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及
び5％CO2で24時間インキュベートした。一部の試料を、PBSインキュベーション期間中、
プロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete又はA8127s)で処理した。健常参加者(n＝3)
又は結腸直腸癌を有する参加者(n＝2)由来のプロテアーゼインヒビターもプロテアーゼイ
ンヒビターカクテルもなしで37℃で24時間インキュベートした後の4億細胞/mLの赤血球馴
化PBS(無傷赤血球)又は12億細胞/mLの赤血球膜馴化PBS(赤血球膜)中のタンパク質の濃度
。p＜0.05の場合、値に有意差があった(*)。データは、平均±標準偏差として提示されて
いる。
図21A～21LLに見られるように、健常参加者由来の無傷赤血球と赤血球膜のタンパク質
プロファイルにはっきりとした違いがあった。対照(プロテアーゼインヒビターなし)にお
いて、赤血球膜によって放出されるタンパク質の濃度は、無傷赤血球によって放出される
タンパク質の濃度よりも、16個のタンパク質については有意に高く、6個のタンパク質に
ついて有意に低かった。プロテアーゼインヒビターが無傷細胞と赤血球膜の両方で馴化PB
Sのタンパク質プロファイルをどのように変化させるのかにも違いがあった。例えば、PDG
F-AB/BBは、対照と比較して、A8127sとともにインキュベートされた赤血球膜で有意に低
かったが、無傷細胞群では変化しなかった。同様の傾向は、とりわけ、プロラクチン、gp
130/sIL-6Rb、BAFF/TNFSF13B、MMP-2、及びTWEAK/TNFSF12について観察された(図21A～21
LLを参照)。他の例において、プロテアーゼインヒビターカクテルの包含は、無傷赤血球
の馴化PBS中のタンパク質の濃度を有意に変化させたが、赤血球膜からのタンパク質の放
出には影響を及ぼさなかった。この例には、オステオポンチン、sVEGR-1、IL-19、MMP-1
、及びペントラキシン-3が含まれる。この結果は、プロテアーゼインヒビターに対する応
答及び馴化PBS中のタンパク質の濃度を調節する機構が無傷赤血球と比較して赤血球膜で
実質的に変化することを示した。
(10.2 リンパ腫)
癌を有する人由来の赤血球成分から放出されるタンパク質の濃度に対するプロテアーゼ
インヒビターの効果をさらに調べるために、健常個体及びリンパ腫を有する個体の赤血球
膜由来のタンパク質の濃度の変化を評価した。赤血球膜の単離のために、全血及び赤血球
の凍結アリコートを3回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらし
た。この後、溶解物のアリコート(100μL当たり1億2000万個の赤血球に相当する容量)をP
BSに1:20比(溶解物:PBS)で添加した。その後、赤血球膜を溶液からの遠心分離(16,000g、
20分、4℃)によって単離した。その後、上部の画分を廃棄し、その後、得られた膜を12億
細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。一部の試料を、
PBSインキュベーション期間中、プロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete又はA8127s
)で処理した。
図22A～22VVは、全血溶解物から単離された赤血球膜由来のタンパク質のレベルの変化
を示しており、一方、図23A～23VVは、プロテアーゼインヒビターカクテルの存在下で単
離赤血球から採取された赤血球膜由来のタンパク質のレベルの変化を示している。12億細
胞/mLの全血溶解物又は濃縮赤血球溶解物から単離された赤血球膜馴化PBSを、プロテアー
ゼインヒビターとともに又はプロテアーゼインヒビターなしで、健常参加者又はリンパ腫
を有する参加者由来の赤血球とともに37℃で24時間インキュベートした。p＜0.05の場合
、値に有意差があった(*)。データは、平均±標準偏差である。このデータから、(無傷赤
血球で示されたような)サイトカインの放出に対するプロテアーゼインヒビターの効果が
単離された赤血球膜でも有効であると結論付けることができる。A8127sは、健常参加者由
来の濃縮赤血球膜を除く全ての群において最大数のサイトカイン変化をもたらした。これ
は、A8127sが市販のプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche cOmplete)よりも有意なサ
イトカインプロファイルの変化をもたらすことを示す以前のデータと一致していた。
とりわけ、健常群及びリンパ腫群から単離された試料は、プロテアーゼインヒビターイ
ンキュベーションに対するそれらの応答の仕方が異なっていた。リンパ腫患者由来の赤血
球膜をA8127sとともにインキュベートしたときに有意に変化したいくつかのサイトカイン
もあった。対照的に、赤血球膜を健常参加者から単離し、同じ方法で処理したとき、有意
な変化は検出されなかった。全血から単離された赤血球膜について、サイトカインIL-8、
IL-6、IP-10、IL-3、及びSCFは、このように挙動した。同様に、濃縮赤血球から単離され
た赤血球膜中のサイトカインIL-12p70、IL-17、IL-4、MCP-1、GM-CSF、IFN-a2、IL-1a、I
L-18、M-CSF、SCGF-B、IL-12p40は、同じパターンに従った。これは、濃縮赤血球溶解物
から単離された赤血球膜がリンパ腫に特有であるサイトカインプロファイルを同定するの
に有益であり得ることを示している。
このデータは、IL-4、IFN-a2、IL-18、SCGF-b、及びLIFを健常試料とリンパ腫試料の識
別のためのパネルとして一緒に使用し得ることも示した。サイトカインは、A8127sととも
にインキュベートした後のリンパ腫試料で統計的に変化しているだけでなく、(インキュ
ベートされていない対照からA8127sとのインキュベーションへの)倍数変化の傾向も、健
常個体由来の試料と比較して、リンパ腫試料で異なっている。表8は、使用されたプロテ
アーゼインヒビターカクテルによって健常参加者とリンパ腫参加者の両方由来の赤血球膜
で有意に変化したサイトカインの数をまとめたものである。
(表8.各々の試料群についてのインキュベートしていない対照と比較した各々のプロテア
ーゼインヒビター(PI)カクテルとともにインキュベートした後の統計的に有意に(p＜0.05
)変化したサイトカインの数)
Figure 0007425903000015
(実施例11.炎症性疾患コホート由来の赤血球成分に対するプロテアーゼインヒビターの効
果)
プロテアーゼインヒビターが様々な炎症性疾患を有する個体に由来する赤血球成分由来
のタンパク質に対する示差効果を有するかどうかをさらに調べるために、様々な炎症性疾
患を有する個体から採取された赤血球又は赤血球膜をプロテアーゼインヒビターカクテル
とともにインキュベートし、タンパク質レベルの変化を評価した。
全血を、ボランティアから、静脈穿刺によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナ
ー、BD Biosciences)中に直接収集した。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温
で処理した。マルチプレックス解析(BioPlex解析)のために、試料を-80℃で保存し、-80
℃での3回の凍結解凍サイクルに供して、解析前の完全な細胞溶解を確実にもたらした。
収集後、全血を分注し、-80℃で凍結させた。赤血球膜の単離のために、全血の凍結ア
リコートを3回の凍結解凍サイクルに供して、完全な細胞溶解を確実にもたらした。この
後、溶解物のアリコート(100μL当たり1億2000万個の赤血球に相当する容量)をPBSに1:20
比(溶解物:PBS)で添加した。その後、赤血球膜を溶液からの遠心分離(16,000g、20分、4
℃)によって単離した。その後、上部の画分を廃棄し、その後、得られた膜を12億細胞/mL
までPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートした。一部の試料をプロテア
ーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche; A8127s)とともにインキュベートした。A81
27sプロテアーゼインヒビターカクテルは、アンチパイン二塩酸塩(50μg/mL);ベスタチン
(40μg/mL); E-64(10μg/mL);ロイペプチン(5μg/mL);ペプスタチン(0.7μg/mL);ホスホ
ラミドン(330μg/mL); Pefabloc SC(1mg/mL); EDTA-Na2(0.5mg/mL);及びアプロチニン(2
μg/mL)から構成されている。
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(16,000g、20分、4℃)により単離
した。試料を-80℃で保存し、解析前に3回の凍結/解凍サイクルを受けさせた。その後、
馴化PBS試料をマルチプレックスサイトカインアッセイで解析した。2つのマルチプレック
スアッセイを利用した。第一のものは、塩基性FGF、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF、IFN-
γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)
、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α、
及びVEGFについてアッセイする27-プレックスヒトサイトカインパネルであり、第二のも
のは、IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LI
F、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAILについて
アッセイする21-プレックスヒトサイトカインパネルであった(Bio-Plex Pro 27-プレック
ス及び21-プレックス、Bio-Rad)。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioPlex
Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセイをLu
minex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイ
トカインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を
用いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解析した。
健常個体の赤血球膜に対するプロテアーゼインヒビターの効果を、変形性関節症を有す
る個体(図24A～24VV);子癇前症を有する個体(図25A～25VV);子宮内発育不全を伴う子癇前
症を有する個体(図26A～26VV);潰瘍性大腸炎を有する個体(図27A～27VV);及び十二指腸潰
瘍と感染症を有する個体(図28A～28VV)由来の赤血球膜に対する効果と比較した。プロテ
アーゼインヒビターなしの健常参加者又は変形性関節症(OA)、子癇前症(PE)、子癇前症と
子宮内発育不全(PE＋IUGR)、潰瘍性大腸炎(UC)、及び十二指腸潰瘍と感染症(DU)を有する
参加者由来の赤血球膜と比較したプロテアーゼインヒビターとともに37℃で24時間インキ
ュベートした後の12億細胞/mLの(全血溶解物から単離された)赤血球膜馴化PBS中のタンパ
ク質の倍数変化。p＜0.05の場合、値に有意差があった(*)。データは、平均±標準偏差で
ある。
このデータは、赤血球膜とプロテアーゼインヒビターとのインキュベーションが、健常
参加者及び疾患参加者由来の赤血球膜馴化PBSのサイトカインプロファイルの際立った変
化をもたらすことを示した。このデータは、A8127sが対照及びcOmpleteプロテアーゼイン
ヒビターカクテルと比較してより大きいサイトカインレベルの変化をもたらすことも示し
た(図24A～図28VV)。
健常群及び疾患群から単離された試料は、プロテアーゼインヒビターインキュベーショ
ンに対するそれらの応答の仕方が異なっていた。図24A～図28VVは、A8127sが、健常試料
と比較した疾患試料でサイトカイン濃度に影響を及ぼした様式に明白な差を示すいくつか
のサイトカインの例を特定している。例えば、IFN-a2濃度は、プロテアーゼインヒビター
で処理した健常群由来の赤血球膜で低下したが、変形性関節症群で大幅に増大した。同様
に、IP-10は、プロテアーゼインヒビターインキュベーションありの健常妊娠コホート由
来の赤血球膜で増大したが、子癇前症コホートで減少した。検討された疾患の各々は、プ
ロテアーゼインヒビターインキュベーション後に健常コホート由来の赤血球膜と疾患コホ
ート由来の赤血球膜との間で示差応答を示すいくつかのサイトカインを示した。表9は、
有意な示差効果を示した各々の病態についてのサイトカインの総数をまとめたものである
。
(表9.健常参加者群と疾患参加者群との間でプロテアーゼインヒビターインキュベーショ
ンに関連する示差濃度変化を示す各々の病態についてのサイトカインの総数)
Figure 0007425903000016
プロテアーゼインヒビターとともにインキュベートされた様々な疾患を有する個体由来
の赤血球膜を、病態に関与するさらなるタンパク質についてアッセイした。赤血球膜を、
健常個体、並びにリンパ腫、変形性関節症、及び潰瘍性大腸炎を有する個体から採取した
。2つのマルチプレックスアッセイを利用した。第一のものは、sEGFR、FGF-塩基性、G-CS
F、HGF、sHER-2/neu、sIL-6Ra、レプチン、オステオポンチン、PECAM-1、PDGF-AB/BB、プ
ロラクチン、SCF、sTIE-2、sVEGFR-1、及びsVEGFR-2についてアッセイする16-プレックス
ヒト癌バイオマーカーパネル1であり、第二のものは、APRIL/TNFSF13、BAFF/TNFSF13B、s
CD30/TNFRF8、sCD163、キチナーゼ-3様1、gp130/sIL-6Rβ、IFN-α2、IFN-γ、IL-2、sIL
-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、I
L-27(p28)、IL-28A/IFN-λ2、IL-29/IFN-λ1、IL-32、IL-34、IL-35、LIGHT/TNFSF14、MM
P-1、MMP-2、MMP-3、オステオカルシン、オステオポンチン、ペントラキシン-3、sTNF-R1
、sTNF-R2、TSLP、及びTWEAK/TNFSF12についてアッセイする37-プレックスヒト炎症性サ
イトカインパネルであった(Bio-Plex癌バイオマーカー16-プレックスパネル及び炎症37-
プレックスパネル、Bio-Rad)。該アッセイを、自動化磁気洗浄ステーション(BioPlex Pro
II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従って実施した。該アッセイをLumin
ex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、蛍光値を収集した。各々のサイト
カインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用
いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解析した。プロテアーゼインヒビター
なしの健常参加者又はリンパ腫、変形性関節症(OA)、及び潰瘍性大腸炎(UC)を有する参加
者由来のものと比較した、プロテアーゼインヒビターとともに37℃で24時間インキュベー
トした後の12億細胞/mLの(全血溶解物から単離された)赤血球膜馴化PBS中のタンパク質の
倍数変化。p＜0.05の場合、値に有意差があった(*)。データは、平均±標準偏差である。
このデータは、プロテアーゼインヒビターが、健常参加者群(図29A～図31NN)において
、かつリンパ腫(図29A～図29LL)、変形性関節症(図30A～図30NN)、及び潰瘍性大腸炎(図3
1A～図31NN)参加者群においても同様に、いくつかのタンパク質の放出を変化させること
を示した。プロテアーゼインヒビターの効果は、タンパク質間と疾患群間の両方で変動し
た。例えば、リンパ腫参加者群では、A8127sとともにインキュベートされた赤血球膜中の
PECAM-1について、有意な減少が観察されたが、健常群では有意な変化が検出されなかっ
た。同様に、プロラクチンは、プロテアーゼインヒビターとともにインキュベートした後
、有意に減少したが、健常群では有意に変化しなかった。統計的に有意でないものの、キ
チナーゼ3様1、IL-26、及びIL-35については、健常群とリンパ腫群との間で、A8127sイン
キュベーション後の倍数変化の示差傾向が観察され、その場合、それぞれのタンパク質の
濃度は健常群で増大し、リンパ腫群で減少し、そしてその逆も同様であった。
検討された疾患の各々は、プロテアーゼインヒビターインキュベーション後に健常コホ
ートと疾患コホートとの間で示差応答を示すいくつかのタンパク質を有した。変形性関節
症を有する参加者では、ペントラキシン-3及びキチナーゼ3様1を含む、12種のサイトカイ
ンが示差応答を示した。同様に、潰瘍性大腸炎を有する参加者では、IL-20、IL-27(p28)
、及びBAFF/TNFSF13Bを含む、26種のサイトカインが示差応答を示した。上記の情報を用
いて、健常コホートと罹患コホートを識別するために、診断パネルを開発することができ
る。
(実施例12.癌コホート由来の赤血球成分由来の細胞チェックポイントレギュレータータン
パク質に対するプロテアーゼインヒビターの効果)
発癌のような病態に特に関係があるとされるタンパク質の濃度及び濃度の変化を、プロ
テアーゼインヒビターの存在下及び非存在下において、赤血球及び赤血球膜で検討する。
全血を健常ボランティア又は癌を有するボランティアから収集する。血液を、各々のボラ
ンティアから、静脈穿刺によって、EDTAバキュテナー(k2EDTAバキュテナー、BD Bioscien
ces)中に直接収集する。血液の画分を収集し、収集から4時間以内に室温で処理する。マ
ルチプレックス解析(BioPlex解析)のために、試料を解析前に-80℃で保存する。収集後、
全血のアリコートを-80℃で凍結させる。赤血球を、次のように、デキストラン沈降を用
いて、残りの全血から単離する。全血を遠心分離し(1500g、10分)、上部の血漿層を廃棄
する。残りの細胞ペレットを等量の塩化ナトリウム(0.15M)に再懸濁させる。その後、デ
キストラン(0.15M塩化ナトリウム中、6％w/v)をこの細胞懸濁液に1:4比(デキストラン:細
胞懸濁液)で添加する。チューブの底への赤血球沈降のために、この溶液を室温で30分間
放置する。上部の白血球に富む層を廃棄し、下部の赤血球画分を単離する。赤血球画分を
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、500g、5分)中で1回洗浄し、残りの赤血球ペレットを計数す
る(Coulter Act Diff, Beckman Coulter)。その後、赤血球を4億細胞/mLまでPBSに希釈し
、37℃及び5％CO2で24時間インキュベートする。一部の試料を、PBSインキュベーション
中、表5の個々のプロテアーゼインヒビター、市販のプロテアーゼインヒビターカクテル(
cOmplete、Roche)、又はA8127sプロテアーゼインヒビターカクテルでも処理する。A8127s
プロテアーゼインヒビターカクテルは、アンチパイン二塩酸塩(50μg/mL);ベスタチン(40
μg/mL); E-64(10μg/mL);ロイペプチン(5μg/mL);ペプスタチン(0.7μg/mL);ホスホラミ
ドン(330μg/mL); Pefabloc SC(1mg/mL); EDTA-Na2(0.5mg/mL);及びアプロチニン(2μg/m
L)を含む。
赤血球膜の単離のために、全血の凍結アリコートを3回の凍結解凍サイクルに供して、
完全な細胞溶解を確実にもたらす。この後、溶解物のアリコート(100μL当たり1億2000万
個の赤血球に相当する容量)をPBSに1:20比(溶解物:PBS)で添加した。その後、赤血球膜を
遠心分離によって溶液から単離する(16,000g、20分、4℃)。その後、上部の画分を廃棄し
、その後、得られた膜を12億細胞/mLまでPBSに希釈し、37℃及び5％CO2で24時間インキュ
ベートする。一部の赤血球膜試料をプロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche
; A8127s)で処理する。
インキュベーション後、得られた馴化PBSを遠心分離(16,000g、20分、4℃)によって単
離する。試料を-80℃で保存する。その後、馴化PBS試料をマルチプレックスアッセイで解
析する。CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、CD223(Lag-3)、CD27、CD270(HVEM)、CD272(BTLA
)、CD279(PD-1)、CD28、CD357(GITR)、CD80(B7-1)、TIM3をアッセイする14-プレックスヒ
ト免疫-腫瘍学チェックポイントパネル(ProcartaPlex 14-プレックスヒト免疫-腫瘍学チ
ェックポイントパネル、Affymetrix eBioscience)を使用する。該アッセイを、自動化磁
気洗浄ステーション(BioPlex Pro II, Bio-Rad)を洗浄工程に用いて、製造元の指示に従
って実施する。該アッセイをLuminex(登録商標) 200(商標)システム(Bio-Rad)で実行し、
蛍光値を収集した。各々のサイトカインの較正曲線を、BioPlexマネージャーソフトウェ
ア(ver. 5.0, Bio-Rad, USA)を用いる5パラメータロジスティック曲線回帰によって解析
する。
個々のプロテアーゼインヒビターとともに37℃で24時間インキュベートした後の4億細
胞/mLの赤血球馴化PBS中のタンパク質の濃度を、健常参加者又は癌を有する参加者由来の
赤血球で測定する。このデータは、健常個体由来のものと比較した、癌を有する個体由来
の赤血球中のタンパク質濃度の変化を示している(図32～45)。さらに、個々のプロテアー
ゼインヒビターは、タンパク質濃度に対する様々な効果を有する。そのような情報を用い
て、癌を有する個体由来の赤血球成分中のタンパク質濃度に対してより大きい度合いの効
果があるようにプロテアーゼインヒビターカクテルをカスタマイズすることができる。例
えば、タンパク質濃度に対するプロテアーゼインヒビターの効果を示すデータに基づいて
、特定の個々のプロテアーゼインヒビターをプロテアーゼインヒビターカクテルに添加す
るか又はプロテアーゼインヒビターカクテルから除去することができる。プロテアーゼイ
ンヒビターカクテルを最適化して、健常プロファイルと癌プロファイルの間の統計的に有
意な差を強調/最大化することができる。
プロテアーゼインヒビターもプロテアーゼインヒビターカクテルもなしで37℃で24時間
インキュベートした後の4億細胞/mLの赤血球馴化PBS(無傷赤血球)及び12億細胞/mLの赤血
球膜馴化PBS(赤血球膜)中のタンパク質の濃度を、健常参加者又は癌を有する参加者由来
の赤血球成分中で測定する。p＜0.05の場合、値は有意に異なる(*)。データは、平均±標
準偏差として提示されている。様々な癌チェックポイントタンパク質が赤血球及び赤血球
膜から放出される(図46～59)。このデータは、プロテアーゼインヒビターが、健常個体及
び癌を有する個体の赤血球及び赤血球膜から放出された様々な癌チェックポイントタンパ
ク質の濃度に対する効果を有することをさらに示している(図46～59)。さらに、プロテア
ーゼインヒビターインキュベーション後の観察された変化は、健常参加者から単離された
赤血球成分と結腸直腸癌を有する参加者から単離された赤血球成分の間で異なる。
プロテアーゼインヒビターとともに37℃で24時間インキュベートした後の4億細胞/mLの
赤血球馴化PBS及び12億細胞/mLの(全血溶解物から単離された)赤血球膜馴化PBS中のタン
パク質の倍数変化を、健常参加者又は癌を有する参加者由来の赤血球成分におけるプロテ
アーゼインヒビターインキュベーションなしと比較する。p＜0.05の場合、値は有意に異
なる(*)。データは、平均±標準偏差である。このデータは、赤血球及び赤血球膜とプロ
テアーゼインヒビターとのインキュベーションが、健常参加者群と癌参加者群の両方由来
の赤血球馴化及び赤血球膜馴化PBS由来の癌チェックポイントタンパク質のプロファイル
に対する有意な変化をもたらすことを示している(図60～73及び図74～87)。健常群から単
離された試料と癌群から単離された試料は、プロテアーゼインヒビターインキュベーショ
ンに対するそれらの応答の仕方が異なる。癌患者由来の赤血球又は赤血球膜を、例えば、
A8127sプロテアーゼインヒビターカクテルとともにインキュベートしたとき、有意に変化
するいくつかのチェックポイントタンパク質がある(図60～73及び図74～87)。対照的に、
該プロテアーゼインヒビターは、健常個体由来の赤血球及び赤血球膜における同じチェッ
クポイントタンパク質の発現に対して異なる効果を有する(図60～73及び図74～87)。
上記のデータを用いて、健常コホートと癌コホートを識別するために、診断パネルを開
発することができる。
(実施例13.他の例示的で非限定的な実施態様)
特許請求された主題のさらなる利点は、特許請求された主題の特定の実施態様を記載している以下の例から明白である。
1.タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)血液試料を採取すること;
b.)該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
d.)該赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
f.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定することを含み、
ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分を該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後にレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む、方法。
2.タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)血液試料又は血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
b.)該血液試料又は該赤血球成分由来の第一の部分及び第二の部分を採取すること;
c.)該血液試料又は該赤血球成分由来の第二の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
d.)該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること(ここで、該第一の部分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない);並びに
e.)該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び該血液試料又は該赤血球成分の第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定すること
を含み、
ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び該血液試料又は該赤血球成分の第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む、方法。
3.血液試料と赤血球成分の両方が採取される、例2記載の方法。
4.タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有さない対象に由来する血液試料を採取すること;
b.)該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
d.)該赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
f.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定すること
を含み、
ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を含む、方法。
5.疾患タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有する対象から、例1～3の1つ又は複数に従って作成される第一のタンパク質プロファイルを得ること;
b.)該疾患又は障害を有さない対象から、例4に従って作成される第二のタンパク質プロファイルを得ること(ここで、該第二のタンパク質プロファイルは、該第一のタンパク質プロファイルが得られた同じ赤血球成分から得られる);及び
c.)該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差を比較すること
を含み、
ここで、作成される疾患タンパク質プロファイルが、該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の間で差がある1種以上のタンパク質を含む、方法。
6.該赤血球成分が全血又は単離赤血球から採取される、例1～5の1つ又は複数記載の方法。
7.該赤血球成分が赤血球又は赤血球膜である、例6記載の方法。
8. 2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、又は10種以上のタンパク質のレベルが測定される、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
9. 3種以上のタンパク質のレベルが測定される、例8記載の方法。
10.該赤血球成分を、1種以上のプロテアーゼインヒビター、2種以上のプロテアーゼインヒビター、3種以上のプロテアーゼインヒビター、4種以上のプロテアーゼインヒビター、5種以上のプロテアーゼインヒビター、6種以上のプロテアーゼインヒビター、7種以上のプロテアーゼインヒビター、8種以上のプロテアーゼインヒビター、9種以上のプロテアーゼインヒビター、又は10種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
11.該赤血球成分を、少なくとも2つのプロテアーゼインヒビターを含むプロテアーゼインヒビターカクテルと接触させる、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
12.該赤血球成分をプロテアーゼインヒビターカクテルA8127sと接触させる、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
13.該1種以上のプロテアーゼインヒビターが、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及びアミノペプチダーゼインヒビターからなる群から選択される、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
14.該1種以上のタンパク質のレベルの変化が、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって決定される、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
15.該1種以上のタンパク質のレベルの変化が0倍～5倍の倍数変化である、例1～7の1つ又は複数記載の方法。
16.該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差が、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって決定される、例5～7の1つ又は複数記載の方法。
17.該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差が該レベルの変化の増加又は該レベルの変化の減少である、例5～7の1つ又は複数記載の方法。
18.該対象がヒト又は非ヒト動物である、例1～17の1つ又は複数記載の方法。
19.該1種以上のタンパク質のレベルが1以上の抗体を用いて測定される、例1～17の1つ又は複数記載の方法。
20.該1種以上のタンパク質が、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、受容体、細胞内シグナル伝達物質、ホルモン、核内転写因子、神経伝達物質、細胞外マトリックス成分、糖タンパク質、炎症性タンパク質、及び酵素からなる群から選択される、例1～17の1つ又は複数記載の方法。
21.該1種以上のタンパク質が、表1に掲載されているタンパク質又は表2に掲載されているタンパク質からなる群から選択される、例1～17の1つ又は複数記載の方法。
22.該疾患又は障害が子癇前症である、例1～17の1つ又は複数記載の方法。
23.該疾患タンパク質プロファイルが、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra、及びHGFからなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む子癇前症タンパク質プロファイルである、例22記載の方法。
24.該疾患又は障害が結腸直腸癌である、例1～17の1つ又は複数記載の方法。
25.該疾患タンパク質プロファイルが、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、エオタキシン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む癌タンパク質プロファイルである、例24記載の方法。
26.対象における疾患又は障害をモニタリングする方法であって:
a.)該疾患又は障害を有する対象から、第一の時点における第一の血液試料及び第二の時点における第二の血液試料を採取すること;
b.)該疾患又は障害についての例5に従って作成される疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルを該第一の血液試料及び第二の血液試料中で測定すること;並びに
c.)該第一の血液試料及び第二の血液試料中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差を決定すること
を含み、
ここで、該第一の血液試料及び第二の血液試料中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が該疾患又は障害の変化を示す、方法。
27.対象における治療の効果をモニタリングする方法であって:
a.)該対象から、第一の時点で例1～3の1つ又は複数に従って作成される第一のタンパク質プロファイルを得ること及び第二の時点で例1～4の1つ又は複数に従って作成される第二のタンパク質プロファイルを得ること;並びに
b.)該第一のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を該第二のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較すること
を含み、
ここで、該第一のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質レベルの変化と該第二のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が該治療の効果を示す、方法。
28.該第一の時点が治療前であり、該第二の時点が治療後である、例27記載の方法。
29.該第一の時点が治療前であり、該第二の時点が治療中である、例27記載の方法。
30.該第一の時点及び該第二の時点が治療中である、例27記載の方法。
31.該第一の時点が治療中であり、該第二の時点が治療後である、例27記載の方法。
32.該第一の時点及び該第二の時点が治療後である、例27記載の方法。
33.該対象が同じ治療を受けたことがある、例27記載の方法。
34.該対象が異なる治療を受けたことがある、例27記載の方法。
35.該血液試料が少量の血液試料である、例27～34の1つ又は複数記載の方法。
36.該対象が、1日に1回以上、1日に2回以上、1日に3回以上、1日に4回以上、及び1日に5回以上からなる群から選択される回数モニタリングされる、例34記載の方法。
37.該対象が、1週間に1回以上、1週間に2回以上、1週間に3回以上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、及び1週間に7回以上からなる群から選択される回数モニタリングされる、例35記載の方法。
38.該対象が毎日モニタリングされる、例35記載の方法。
39.該対象が、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、及び4週間に1回からなる群から選択される回数モニタリングされる、例35記載の方法。
40.疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)請求項3に従って作成される少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイルを得ること;
b.)対象に由来する血液試料を採取すること;
c.)該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
d.)該赤血球成分の少なくとも第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該赤血球成分の第一の部分における疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルを測定すること;
f.)該赤血球成分の第一の部分における少なくとも1種のタンパク質と該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を決定すること;並びに
g.)該赤血球成分の第一の部分及び該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を該疾患タンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較すること
を含み、
ここで、該疾患タンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較した該赤血球成分の第一の部分及び該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの同じ又は同様の変化が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、方法。
41.対象における疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)例1～3の1つ又は複数に従って作成される該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;及び
b.)該少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を例5に従って作成される疾患タンパク質プロファイル由来の該少なくとも1種のタンパク質のレベル変化と比較すること
を含み、
ここで、該疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化に対する該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの同じ又は同様の変化が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、方法。
42.対象における疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)該対象についての例1～3の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;
b.)例4に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;及び
c.)該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を例4に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較すること
を含み、
ここで、該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と例4に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、方法。
43.血液試料のタンパク質プロファイルを作成するためのキットであって:
a.)赤血球成分を採取するための少なくとも1つの試薬;
b.)1種以上のプロテアーゼインヒビター;及び
c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定するための少なくとも1つの試薬
を含む、キット。
44.該キットが対象由来の血液試料を採取するための少なくとも1つの試薬をさらに含む、例43記載の方法。
45. 1種以上のタンパク質のレベルを測定するための試薬が1以上の抗体である、例43記載の方法。
46. 1種以上のタンパク質を検出するか又はそのレベルを測定するための試薬が酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)装置である、例45記載の方法。
47.該1種以上のプロテアーゼインヒビターがプロテアーゼインヒビターカクテルを含む、例43記載の方法。
48.該プロテアーゼインヒビターカクテルがA8127sである、例47記載の方法。
49.タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有する対象由来の血液試料を採取すること;
b.)該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
c.)該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;及び
d.)該赤血球濃縮試料中の1種以上のタンパク質の存在を検出すること
を含み、
ここで、作成される該タンパク質プロファイルが該赤血球濃縮試料中で検出される1種以上のタンパク質を含む、方法。
50.タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有する対象由来の血液試料を採取すること;
b.)該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
c.)該赤血球濃縮試料中の赤血球及び血漿を単離すること;
d.)該赤血球を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該赤血球中の1種以上のタンパク質のレベル及び該血漿中の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
e.)該赤血球中の1種以上のタンパク質のレベル対該血漿中の1種以上のタンパク質のレベルを含むタンパク質比を計算すること,
を含み、
ここで、作成される該タンパク質プロファイルが少なくとも2:1のタンパク質比を有する1種以上のタンパク質を含む、方法。
51.該1種以上のタンパク質が、少なくとも3:1、少なくとも4:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも15:1、及び少なくとも20:1からなる群から選択されるタンパク質比を有する、例49記載の方法。
52.タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有する対象由来の血液試料を採取すること;
b.)該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
c.)該赤血球濃縮試料中の赤血球を1種以上のプロテアーゼインヒビターを含有する培地中でインキュベートすること;及び
d.)1種以上のタンパク質を該培地中で検出すること,
を含み、
ここで、作成されるタンパク質プロファイルが該培地中で検出される1種以上のタンパク質を含む、方法。
53.該赤血球濃縮試料中で検出される該1種以上のタンパク質のレベルを測定することをさらに含む、例48又は例51記載の方法。
54. 2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、もしくは10種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、又は10種以上のタンパク質のレベル、11種以上のタンパク質、12種以上のタンパク質、13種以上のタンパク質、14種以上のタンパク質、もしくは15種以上のタンパク質のレベルが測定される、例48～52の1つ又は複数記載の方法。
55. 3種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は3種以上のタンパク質のレベルが測定される、例53記載の方法。
56.該赤血球濃縮試料を、2種以上のプロテアーゼインヒビター、3種以上のプロテアーゼインヒビター、4種以上のプロテアーゼインヒビター、5種以上のプロテアーゼインヒビター、6種以上のプロテアーゼインヒビター、7種以上のプロテアーゼインヒビター、8種以上のプロテアーゼインヒビター、9種以上のプロテアーゼインヒビター、又は10種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる、例48～54の1つ又は複数記載の方法。
57.該赤血球濃縮試料を3種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる、例55記載の方法。
58.該赤血球濃縮試料を3種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させ、かつ2種以上のタンパク質の存在を検出するか、又は2種以上のタンパク質のレベルを測定する、例55記載の方法。
59.該赤血球を2種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させ、かつ3種以上のタンパク質の存在を検出するか、又は3種以上のタンパク質のレベルを測定する、例55記載の方法。
60.該1種以上のプロテアーゼインヒビターが、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、及びアスパラギン酸プロテアーゼインヒビターからなる群から選択される、例48～58の1つ又は複数記載の方法。
61.該対象がヒト又は非ヒト動物である、例48～59の1つ又は複数記載の方法。
62.該1種以上のタンパク質の存在が検出されるか、又は1種以上のタンパク質のレベルが1以上の抗体を用いて測定される、例48～60の1つ又は複数記載の方法。
63.該1種以上のタンパク質が、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、受容体、細胞内シグナル伝達物質、ホルモン、核内転写因子、神経伝達物質、及び細胞外マトリックス成分、並びに酵素からなる群から選択される、例48～60の1つ又は複数記載の方法。
64.該1種以上のタンパク質が、表1に掲載されているタンパク質又は表2に掲載されているタンパク質からなる群から選択される、例48～60の1つ又は複数記載の方法。
65.該血液試料が、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、遠心分離、セルロースカラム、及びデキストラン沈降からなる群から選択される1以上の方法によって白血球除去される、例48～60の1つ又は複数記載の方法。
66.該血液試料がデキストラン沈降によって白血球除去される、例64記載の方法。
67.対象における疾患又は障害をモニタリングする方法であって:
a.)例48～60の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを第一の時点及び第二の時点における該対象から得ること;並びに
b.)該第一の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを該第二の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較すること
を含み、
ここで、該第二の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較した該第一の時点における該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルにおける1種以上のタンパク質の存在又はレベルの差が該疾患又は障害の変化を示す。
68.対象における治療をモニタリングする方法であって:
a.)例48～60の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを治療前及び治療後の対象から得ること;並びに
b.)該治療前の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを該治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較すること,
を含み、
ここで、該治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較した該治療前の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルにおける1種以上のタンパク質の存在又はレベルの差が該対象に対する該治療の効果を示す、方法。
69.治療を全く受けたことがない対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルが治療を受けた該対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較される、例67記載の方法。
70.ある時点での治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルが異なる時点での該治療後の対象の少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較される、例67記載の方法。
71.該対象が同じ治療を受けたことがある、例69記載の方法。
72.該対象が異なる治療を受けたことがある、例69記載の方法。
73.該血液試料が少量の血液試料である、例66～71の1つ又は複数記載の方法。
74.該対象が、1日に1回以上、1日に2回以上、1日に3回以上、1日に4回以上、及び1日に5回以上からなる群から選択される回数モニタリングされる、例66～72の1つ又は複数記載の方法。
75.該対象が、1週間に1回以上、1週間に2回以上、1週間に3回以上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、及び1週間に7回以上からなる群から選択される回数モニタリングされる、例66～72の1つ又は複数記載の方法。
76.該対象が毎日モニタリングされる、例66～72の1つ又は複数記載の方法。
77.該対象が、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、及び4週間に1回からなる群から選択される回数モニタリングされる、例66～72の1つ又は複数記載の方法。
78.疾患又は障害タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有する1以上の対象由来の血液試料を採取すること;
b.)該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
c.)該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
d.)該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球濃縮試料の第二の部分の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;及び
e.)該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルを該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較すること
を含み、
ここで、作成される疾患タンパク質プロファイルが、該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較して、該赤血球濃縮試料の該第一の部分における異なるレベルを有する1種以上のタンパク質を含む、方法。
79.該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較した該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルの差のレベルが、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって決定される、例77記載の方法。
80. 2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、又は10種以上のタンパク質のレベルが測定される、例77又は例78記載の方法。
81. 3種以上のタンパク質のレベルが測定される、例79記載の方法。
82.該疾患又は障害が子癇前症である、例80記載の方法。
83.該疾患タンパク質プロファイルが、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra、及びHGFからなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む子癇前症タンパク質プロファイルである、例81記載の方法。
84.該疾患又は障害が癌である、例80記載の方法。
85.該疾患タンパク質プロファイルが、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、エオタキシン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む癌タンパク質プロファイルである、例83記載の方法。
86.疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)対象由来の血液試料を採取すること;
b.)該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
c.)少なくとも該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
d.)該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球濃縮試料の第二の部分の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;及び
e.)該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルを該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較すること,
を含み、
ここで、該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較した該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上のタンパク質のレベルの差が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、方法。
87.該1種以上のタンパク質のレベルに差がないこと、該対象が該疾患又は障害を有さないことを示すを示す、例85記載の方法。
88.対象が疾患又は障害を有するかどうかを決定する方法であって:
a.)該対象由来の血液試料を採取すること;
b.)該血液試料の少なくとも一部を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生すること;
c.)少なくとも該赤血球濃縮試料の第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
c.)該赤血球濃縮試料の該第一の部分における1種以上のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球濃縮試料の第二の部分の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
d.)該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルを該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較すること
を含み、
ここで、該赤血球濃縮試料の該第二の部分における該1種以上のタンパク質のレベルと比較して該赤血球濃縮試料の該第一の部分における該1種以上のタンパク質のレベルに差がないことが、該対象が該疾患又は障害を有さないことを示す、方法。
89.対象における疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)例48～60の1つ又は複数に従って作成される該対象由来の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;及び
b.)該少なくとも1つのタンパク質プロファイルを少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイルと比較すること
を含み、
ここで、該少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイル中の該1種以上のタンパク質の存在又はレベルと同様である該少なくとも1つのタンパク質プロファイル中の1種以上のタンパク質の存在又はレベルが、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、方法。
90.得られる該少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイルが例30～33の1つ又は複数に従って作成される、例88記載の方法。
91.対象における疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)例48～60の1つ又は複数に従って作成される該対象由来の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;
b.)該疾患又は障害を有さない1以上の対象由来の少なくとも1つのタンパク質プロファイルを採取すること;及び
c.)該対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイルを該疾患又は障害を有さない1以上の対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較すること
を含み、
ここで、該疾患又は障害を有さない1以上の対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイル中の該1種以上のタンパク質の存在又はレベルと比較した該対象から得られる該少なくとも1つのタンパク質プロファイル中の該1種以上のタンパク質の存在又はレベルの差が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、方法。
92.血液試料のタンパク質プロファイルを作成するためのキットであって:
a.)血液試料を白血球除去して、赤血球濃縮試料を産生するための少なくとも1つの試薬;
b.)1種以上のプロテアーゼインヒビター;及び
c.)該赤血球濃縮試料中の1種以上のタンパク質の存在を検出するか又はそのレベルを測定するための少なくとも1つの試薬
を含む、キット。
93.該キットが対象由来の血液試料を採取するための少なくとも1つの試薬をさらに含む、例91記載の方法。
94. 1種以上のタンパク質の存在を検出するか又はそのレベルを測定するための試薬が1以上の抗体である、例91記載の方法。
95. 1種以上のタンパク質の存在を検出するか又はそのレベルを測定するための試薬が酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)装置である、例93記載の方法。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)血液試料を採取すること;
b.)該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
d.)該赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
f.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定すること
を含み、
ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分を該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後にレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む、前記方法。
（態様２）
タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)血液試料又は血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
b.)該血液試料又は該赤血球成分由来の第一の部分及び第二の部分を採取すること;
c.)該血液試料又は該赤血球成分由来の第二の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
d.)該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること(ここで、該第一の部分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない);並びに
e.)該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び該血液試料又は該赤血球成分の第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定すること
を含み、
ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該血液試料又は該赤血球成分の第一の部分及び該血液試料又は該赤血球成分の第二の部分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を有する1種以上のタンパク質を含む、前記方法。
（態様３）
血液試料と赤血球成分の両方が採取される、態様2記載の方法。
（態様４）
タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有さない対象に由来する血液試料を採取すること;
b.)該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
d.)該赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに
f.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を決定すること
を含み、
ここで、作成されたタンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化を含む、前記方法。
（態様５）
疾患タンパク質プロファイルを作成する方法であって:
a.)疾患又は障害を有する対象から、態様1～3の1つ又は複数に従って作成される第一のタンパク質プロファイルを得ること;
b.)該疾患又は障害を有さない対象から、態様4に従って作成される第二のタンパク質プロファイルを得ること(ここで、該第二のタンパク質プロファイルは、該第一のタンパク質プロファイルが得られた同じ赤血球成分から得られる);及び
c.)該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差を比較すること
を含み、
ここで、作成された疾患タンパク質プロファイルが、該疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と該疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の間で差がある1種以上のタンパク質を含む、前記方法。
（態様６）
前記赤血球成分が全血又は単離赤血球から採取される、態様1～5の1つ又は複数記載の方法。
（態様７）
前記赤血球成分が赤血球又は赤血球膜である、態様6記載の方法。
（態様８）
2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、又は10種以上のタンパク質のレベルが測定される、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様９）
3種以上のタンパク質のレベルが測定される、態様8記載の方法。
（態様１０）
前記赤血球成分を、1種以上のプロテアーゼインヒビター、2種以上のプロテアーゼインヒビター、3種以上のプロテアーゼインヒビター、4種以上のプロテアーゼインヒビター、5種以上のプロテアーゼインヒビター、6種以上のプロテアーゼインヒビター、7種以上のプロテアーゼインヒビター、8種以上のプロテアーゼインヒビター、9種以上のプロテアーゼインヒビター、又は10種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１１）
前記赤血球成分を、少なくとも2つのプロテアーゼインヒビターを含むプロテアーゼインヒビターカクテルと接触させる、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１２）
前記赤血球成分をプロテアーゼインヒビターカクテルA8127sと接触させる、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１３）
前記1種以上のプロテアーゼインヒビターが、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及びアミノペプチダーゼインヒビターからなる群から選択される、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１４）
前記1種以上のタンパク質のレベルの変化が、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって決定される、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１５）
前記1種以上のタンパク質のレベルの変化が0倍～5倍の倍数変化である、態様1～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１６）
前記疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と前記疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差が、スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって決定される、態様5～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１７）
前記疾患又は障害を有する対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化と前記疾患又は障害を有さない対象由来の1種以上のタンパク質のレベルの変化の差が該レベルの変化の増加又は該レベルの変化の減少である、態様5～7の1つ又は複数記載の方法。
（態様１８）
前記対象がヒト又は非ヒト動物である、態様1～17の1つ又は複数記載の方法。
（態様１９）
前記1種以上のタンパク質のレベルが1以上の抗体を用いて測定される、態様1～17の1つ又は複数記載の方法。
（態様２０）
前記1種以上のタンパク質が、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、受容体、細胞内シグナル伝達物質、ホルモン、核内転写因子、神経伝達物質、細胞外マトリックス成分、糖タンパク質、炎症性タンパク質、及び酵素からなる群から選択される、態様1～17の1つ又は複数記載の方法。
（態様２１）
前記1種以上のタンパク質が、表1に掲載されているタンパク質又は表2に掲載されているタンパク質からなる群から選択される、態様1～17の1つ又は複数記載の方法。
（態様２２）
前記疾患又は障害が子癇前症である、態様1～17の1つ又は複数記載の方法。
（態様２３）
前記疾患タンパク質プロファイルが、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra、及びHGFからなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む子癇前症タンパク質プロファイルである、態様22記載の方法。
（態様２４）
前記疾患又は障害が結腸直腸癌である、態様1～17の1つ又は複数記載の方法。
（態様２５）
前記疾患タンパク質プロファイルが、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、エオタキシン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む癌タンパク質プロファイルである、態様24記載の方法。
（態様２６）
対象における疾患又は障害をモニタリングする方法であって:
a.)該疾患又は障害を有する対象から、第一の時点における第一の血液試料及び第二の時点における第二の血液試料を採取すること;
b.)該疾患又は障害についての態様5に従って作成される疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルを該第一の血液試料及び第二の血液試料中で測定すること;並びに
c.)該第一の血液試料及び第二の血液試料中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差を決定すること
を含み、
ここで、該第一の血液試料及び第二の血液試料中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が該疾患又は障害の変化を示す、前記方法。
（態様２７）
対象における治療の効果をモニタリングする方法であって:
a.)該対象から、第一の時点で態様1～3の1つ又は複数に従って作成される第一のタンパク質プロファイルを得ること及び第二の時点で態様1～4の1つ又は複数に従って作成される第二のタンパク質プロファイルを得ること;並びに
b.)該第一のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を該第二のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較すること
を含み、
ここで、該第一のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質レベルの変化と該第二のタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が該治療の効果を示す、前記方法。
（態様２８）
前記第一の時点が治療前であり、前記第二の時点が治療後である、態様27記載の方法。
（態様２９）
前記第一の時点が治療前であり、前記第二の時点が治療中である、態様27記載の方法。
（態様３０）
前記第一の時点及び前記第二の時点が治療中である、態様27記載の方法。
（態様３１）
前記第一の時点が治療中であり、前記第二の時点が治療後である、態様27記載の方法。
（態様３２）
前記第一の時点及び前記第二の時点が治療後である、態様27記載の方法。
（態様３３）
前記対象が同じ治療を受けたことがある、態様27記載の方法。
（態様３４）
前記対象が異なる治療を受けたことがある、態様27記載の方法。
（態様３５）
前記血液試料が少量の血液試料である、態様27～34の1つ又は複数記載の方法。
（態様３６）
前記対象が、1日に1回以上、1日に2回以上、1日に3回以上、1日に4回以上、及び1日に5回以上からなる群から選択される回数モニタリングされる、態様35記載の方法。
（態様３７）
前記対象が、1週間に1回以上、1週間に2回以上、1週間に3回以上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、及び1週間に7回以上からなる群から選択される回数モニタリングされる、態様35記載の方法。
（態様３８）
前記対象が毎日モニタリングされる、態様35記載の方法。
（態様３９）
前記対象が、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、及び4週間に1回からなる群から選択される回数モニタリングされる、態様35記載の方法。
（態様４０）
疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)態様3に従って作成される少なくとも1つの疾患タンパク質プロファイルを得ること;
b.)対象に由来する血液試料を採取すること;
c.)該血液試料由来の赤血球成分を採取すること;
d.)該赤血球成分の少なくとも第一の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
e.)該赤血球成分の第一の部分における疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベル及び該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルを測定すること;
f.)該赤血球成分の第一の部分における少なくとも1種のタンパク質と該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を決定すること;並びに
g.)該赤血球成分の第一の部分及び該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を該疾患タンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較すること
を含み、
ここで、該疾患タンパク質プロファイル中の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較した該赤血球成分の第一の部分及び該赤血球成分の第二の部分における少なくとも1種のタンパク質のレベルの同じ又は同様の変化が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、前記方法。
（態様４１）
対象における疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)態様1～3の1つ又は複数に従って作成される該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;及び
b.)該少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を態様5に従って作成される疾患タンパク質プロファイル由来の該少なくとも1種のタンパク質のレベル変化と比較すること
を含み、
ここで、該疾患タンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と同じ又は同様の該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、前記方法。
（態様４２）
対象における疾患又は障害を診断する方法であって:
a.)該対象についての態様1～3の1つ又は複数に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;
b.)態様4に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること;及び
c.)該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化を態様4に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と比較すること
を含み、
ここで、該対象についての少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化と態様4に従って作成される少なくとも1つのタンパク質プロファイル由来の少なくとも1種のタンパク質のレベルの変化の差が、該対象が該疾患又は障害を有することを示す、前記方法。
（態様４３）
血液試料のタンパク質プロファイルを作成するためのキットであって:
a.)赤血球成分を採取するための少なくとも1つの試薬;
b.)1種以上のプロテアーゼインヒビター;及び
c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定するための少なくとも1つの試薬
を含む、前記キット。
（態様４４）
前記キットが対象由来の血液試料を採取するための少なくとも1つの試薬をさらに含む、態様43記載の方法。
（態様４５）
前記1種以上のタンパク質のレベルを測定するための試薬が1以上の抗体である、態様43記載の方法。
（態様４６）
前記1種以上のタンパク質を検出するか又はそのレベルを測定するための試薬が酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)装置である、態様45記載の方法。
（態様４７）
前記1種以上のプロテアーゼインヒビターがプロテアーゼインヒビターカクテルを含む、態様43記載の方法。
（態様４８）
前記プロテアーゼインヒビターカクテルがA8127sである、態様47記載の方法。

Claims (19)

  1. 疾患タンパク質プロファイルを作成する方法であって、
    (a.)疾患又は障害を有する対象について第一のタンパク質プロファイルを得ること、
    (b.)疾患又は障害を有さない対象について第二のタンパク質プロファイルを得ることであって、
    ここで、該第一のタンパク質プロファイル及び該第二のタンパク質プロファイルは:
    (A)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該分離された赤血球成分から第一の部分及び第二の部分を採取すること;
    (iii.)該赤血球成分の該第二の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該赤血球成分の該第一の部分及び該接触させた赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定することであって、該第一の部分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない、前記測定すること;並びに、
    (v.)該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を有する該1種以上のタンパク質を含む、前記方法;又は、
    (B)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
    (iii.)該分離された赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに、
    (v.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を含む、前記方法、
    により得られ、作成された該第二のタンパク質プロファイルが、該第一のタンパク質プロファイルが得られたものと同じ赤血球成分から得られる、前記得ること、並びに、
    (c.)該第一のタンパク質プロファイル及び該第二のタンパク質プロファイルの間の差を比較することにより、疾患タンパク質プロファイルを作成すること、を含む、前記方法。
  2. (a)前記赤血球成分が、全血もしくは単離赤血球から採取され、かつ、
    (b)前記赤血球成分を:
    (i)1種以上のプロテアーゼインヒビター、2種以上のプロテアーゼインヒビター、3種以上のプロテアーゼインヒビター、4種以上のプロテアーゼインヒビター、5種以上のプロテアーゼインヒビター、6種以上のプロテアーゼインヒビター、7種以上のプロテアーゼインヒビター、8種以上のプロテアーゼインヒビター、9種以上のプロテアーゼインヒビター、もしくは10種以上のプロテアーゼインヒビター;
    (ii)少なくとも2つのプロテアーゼインヒビターを含むプロテアーゼインヒビターカクテル;又は、
    (iii)アンチパイン二塩酸塩、ベスタチン、E-64、ロイペプチン、ペプスタチン、ホスホラミドン、Pefabloc SC、EDTA-Na2、及びアプロチニンを含むプロテアーゼインヒビターカクテルA8127s、と接触させる、請求項1記載の方法。
  3. 2種以上のタンパク質、3種以上のタンパク質、4種以上のタンパク質、5種以上のタンパク質、6種以上のタンパク質、7種以上のタンパク質、8種以上のタンパク質、9種以上のタンパク質、又は10種以上のタンパク質のレベルが測定される、請求項1記載の方法。
  4. 前記1種以上のプロテアーゼインヒビターが、セリンプロテアーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、及びアミノペプチダーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
  5. 前記第一のタンパク質プロファイル及び前記第二のタンパク質プロファイルの間の差が、
    a)スチューデントのT検定、ANOVA検定、混合効果モデル、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソンの順位和、及びスペルマン(Spermans)の順位相関からなる群から選択される統計解析によって決定される;又は、
    b)該第一のタンパク質プロファイルにおける1種以上のタンパク質のレベルの増加及び/もしくは減少であって、該第二のタンパク質プロファイルにおける1種以上のタンパク質のレベルの増加及び/もしくは減少より大きいか、又は小さい、前記増加及び/もしくは減少である、請求項1記載の方法。
  6. 前記1種以上のタンパク質が、
    (a)ケモカイン、サイトカイン、成長因子、受容体、細胞内シグナル伝達物質、ホルモン、核内転写因子、神経伝達物質、細胞外マトリックス成分、糖タンパク質、炎症性タンパク質、及び酵素;
    (b)表1に掲載されているタンパク質;又は、
    (c)表2に掲載されているタンパク質、からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
  7. 前記疾患又は障害が：
    a)子癇前症である;又は、
    b)結腸直腸癌である、請求項1記載の方法。
  8. 対象における治療の効果をモニタリングする方法であって、
    (a.)該対象について、第一の時点で作成された第一のタンパク質プロファイルを得ること、
    (b.)該対象について、第二の時点で作成された第二のタンパク質プロファイルを得ることであって、
    ここで、該第一のタンパク質プロファイル及び該第二のタンパク質プロファイルは:
    (A)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該分離された赤血球成分から第一の部分及び第二の部分を採取すること;
    (iii.)該赤血球成分の該第二の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該赤血球成分の該第一の部分及び該接触させた赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定することであって、該第一の部分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない、前記測定すること;並びに、
    (v.)該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を有する該1種以上のタンパク質を含む、前記方法;又は、
    (B)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
    (iii.)該分離された赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに、
    (v.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を含む、前記方法、
    により得られる、前記得ること、並びに、
    (c.)該第一のタンパク質プロファイル及び該第二のタンパク質プロファイルの間の差を比較することにより、該治療の効果を決定すること、を含む、前記方法。
  9. (i)前記第一の時点が治療前であり、かつ前記第二の時点が治療後である;
    (ii)該第一の時点が治療前であり、かつ該第二の時点が治療中である;
    (iii)該第一の時点及び該第二の時点が治療中である;
    (iv)該第一の時点が治療中であり、かつ該第二の時点が治療後である;又は、
    (v)該第一の時点及び該第二の時点が治療後である、請求項8記載の方法。
  10. 前記血液試料が、1ミリリットル以下の量の血液試料である、請求項8記載の方法。
  11. 対象における疾患又は障害を決定するためのデータを得る方法であって:
    (a.)該対象について少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ることであって、ここで、該少なくとも1つのタンパク質プロファイルは:
    (A)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該分離された赤血球成分から第一の部分及び第二の部分を採取すること;
    (iii.)該赤血球成分の該第二の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該赤血球成分の該第一の部分及び該接触させた赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定することであって、該第一の部分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない、前記測定すること;並びに、
    (v.)該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を有する該1種以上のタンパク質を含む、前記方法;又は、
    (B)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
    (iii.)該分離された赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに、
    (v.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を含む、前記方法、
    により得られる、前記得ること、並びに、
    (b.)該対象の該少なくとも1つのタンパク質プロファイルを、請求項1記載の方法に従って作成される疾患タンパク質プロファイルと比較すること、を含み、
    ここで、該対象についての該少なくとも1つのタンパク質プロファイルの少なくとも1種以上のタンパク質のレベルの差が該疾患タンパク質プロファイルの該少なくとも1種以上のタンパク質のレベルの差の50%以下である場合に、該対象が該疾患又は障害を有する、前記方法。
  12. 対象における疾患又は障害を決定するためのデータを得る方法であって、
    (a.)該対象について少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ること、
    (b.)疾患又は障害を有さない対象について少なくとも1つのタンパク質プロファイルを得ることであって、
    ここで、該対象についての、及び、該疾患又は障害を有さない対象についての、該少なくとも1つのタンパク質プロファイルは:
    (A)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該分離された赤血球成分から第一の部分及び第二の部分を採取すること;
    (iii.)該赤血球成分の該第二の部分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該赤血球成分の該第一の部分及び該接触させた赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定することであって、該第一の部分は該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させていない、前記測定すること;並びに、
    (v.)該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該赤血球成分の該第一の部分及び該赤血球成分の該第二の部分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を有する該1種以上のタンパク質を含む、前記方法;又は、
    (B)
    (i.)対象から採取した血液試料由来の赤血球成分を分離することであって、該赤血球成分が赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記分離すること;
    (ii.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;
    (iii.)該分離された赤血球成分を1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させること;
    (iv.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させた該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルを測定すること;並びに、
    (v.)該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を決定すること、を含む方法であって、
    作成されたタンパク質プロファイルが、該1種以上のプロテアーゼインヒビターと接触させる前及び接触させた後の該赤血球成分由来の該1種以上のタンパク質のレベルの差を含む、前記方法、
    により得られる、前記得ること、並びに、
    (c.)該対象についての該少なくとも1つのタンパク質プロファイルを、該疾患又は障害を有さない対象について得られた該少なくとも1つのタンパク質プロファイルと比較することにより、該対象が該疾患又は障害を有するかどうかを決定すること、を含む、前記方法。
  13. 請求項1～12のいずれか1項記載の方法で使用するためのキットであって:
    (a.)対象から採取された血液試料から赤血球成分を採取するための少なくとも1つの試薬であって、該赤血球成分が、赤血球もしくは赤血球膜を含む、前記試薬;
    (b.)1種以上のプロテアーゼインヒビター;及び
    (c.)該赤血球成分由来の1種以上のタンパク質のレベルを測定するための少なくとも1つの試薬、を含む、前記キット。
  14. 前記1種以上のプロテアーゼインヒビターが、プロテアーゼインヒビターカクテルを含む、請求項13記載のキット。
  15. 前記疾患又は障害が：
    (a)子癇前症であり、かつ前記疾患タンパク質プロファイルが、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra、及びHGFからなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む;又は、
    (b)結腸直腸癌であり、かつ該疾患タンパク質プロファイルが、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、エオタキシン、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF、及びIL-12p40からなる群から選択される1種以上のタンパク質を含む、請求項7記載の方法。
  16. 前記対象が：
    (i)1日に1回以上、1日に2回以上、1日に3回以上、1日に4回以上、及び1日に5回以上からなる群から選択される回数;
    (ii)1週間に1回以上、1週間に2回以上、1週間に3回以上、1週間に4回以上、1週間に5回以上、1週間に6回以上、及び1週間に7回以上からなる群から選択される回数;
    (iii)1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、及び4週間に1回からなる群から選択される回数;又は、
    (iv)毎日;
    モニタリングされる、請求項10記載の方法。
  17. 前記プロテアーゼインヒビターカクテルが、アンチパイン二塩酸塩、ベスタチン、E-64、ロイペプチン、ペプスタチン、ホスホラミドン、Pefabloc SC、EDTA-Na2、及びアプロチニンを含む、A8127sである、請求項14記載のキット。
  18. 前記タンパク質プロファイルが、前記(A)記載の工程に従って得られる、請求項1、8、11、又は12のいずれか1項記載の方法。
  19. 前記タンパク質プロファイルが、前記(B)記載の工程に従って得られる、請求項1、8、11、又は12のいずれか1項記載の方法。
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