JP7411607B2 - 洗剤用酵素安定化剤 - Google Patents

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Description

本発明は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼ阻害剤及び洗剤用酵素安定化剤に関する。
近年、ズブチリシンのようなＳ８セリンプロテアーゼは、液体洗剤を含めた殆どの洗濯用洗剤に使用される代表的な酵素で、垢汚れや血液、食べこぼし等のタンパク質汚れを落とす効果に優れている。
しかしながら、プロテアーゼは、自分自身を加水分解し（自己加水分解）、製剤中に含まれる他の酵素等を分解し、酵素活性低下の原因となる。斯かる現象は、プロテアーゼを含む製剤の貯蔵の間に起こりやすく、プロテアーゼ活性及び他の酵素の活性の損失を齎し、長期の貯蔵を阻む原因となっている。
斯かるプロテアーゼの作用に対して、従来より、プロテアーゼ阻害剤又は安定化剤を添加することにより、当該酵素の貯蔵安定性を改善することが行われている。プロテアーゼ阻害剤としては、従来よりホウ酸やボロン酸が知られているが、洗浄成分と望ましくない副産物を形成するという問題があった。近年では、２～５個のアミノ酸からなるペプチドアルデヒドに洗剤中のプロテアーゼを安定化する作用があることが報告されている。例えば、特許文献１には、ズブチリシン型プロテアーゼを安定化するためのペプチドアルヒデドＰｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｈ及びＰｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈが開示され、また特許文献２には、Ｚ-Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｈ（ここで、Ｚはベンジルオキシカルボニル基）のヒドロ亜硫酸付加物が開示されている。
一方、ロイペプチン（Ｎ－アセチル－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｈ）類似体で、ロイシン残基を有する３個のアミノ酸からなるペプチドアルデヒドである、Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｎｌｅ－Ｈ、Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ、Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈ、Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｈ等（ここで、Ｚはベンジルオキシカルボニル基）にはプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害する作用があること、特にＺ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈには優れたプロテアソーム阻害作用があり、ＰＣ１２ｈ細胞における神経突起伸長誘導効果が認められることが報告されている（非特許文献１）。
しかしながら、斯かるプロテアソームは、洗剤用酵素として使用されるズブチリシン様セリンプロテアーゼとは分子構造及び機能が異なっている。
特許第３２８５８６５号 特許第６３３４３９６号
Y. Saito, S. Tsubuki, H. Ito, and S. Kawashima, Neurosci. Lett., 120, 1 (1990).
本発明は、洗剤用プロテアーゼの貯蔵安定性を向上するために有用な新たなペプチドアルデヒド化合物を提供することに関する。
本発明者らは、Ｃ末端残基としてノルバリンを有するペプチドアルデヒド化合物が、ズブチリシン様セリンプロテアーゼの活性を阻害し、洗剤用酵素の安定性の向上に有用であることを見出した。
すなわち、本発明は以下の１）～５）に係るものである。
１）下記式（１）で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物を有効成分とする、ズブチリシン様セリンプロテアーゼ阻害剤。
２）下記式（１）で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物を有効成分とする、洗剤用酵素安定化剤。
３）下記式（１）で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物、及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する酵素組成物。
４）下記式（１）で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物、及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
５）下記式（１ａ）で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物。
Figure 0007411607000001
〔式中、Ａ１はＮ末端アミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基を示し、Ａ１ａはＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
本発明によれば、ズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物における、酵素の安定性が向上し、長期の保存が可能になる。
本明細書において、「アミノ酸」は、天然型の又は非天然型のα－もしくはβ－アミノ酸であることができ、Ｌ型とＤ型の両方が含まれる。
本明細書において、標準的なアミノ酸は、標準的な３文字記号を使って省略される。すなわち、天然アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）で表記される。また、非天然型アミノ酸は、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモフェニルアラニン（Ｈｐｈ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）のように表記される。
本明細書において「アミノ酸残基」は、例えば、アラニン（Ａｌａ）残基であれば、－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－で示される構造の基を示す。
本発明の式（１）で表されるペプチドアルデヒド化合物は、Ｃ末端がノルバリン（Ｎｖａ）残基であるトリペプチドで、当該ノルバリン残基のＣ末端がカルボキシル基からアルデヒド基に変換された化合物である。本発明のペプチドアルデヒド化合物のＣ末端は、Ｎｖａ－Ｈ（ノルバリナール）と略記することもできる。
Ａ１で示されるアミノ酸残基としては、天然又は非天然、極性、疎水性、中性、酸性、塩基性のアミノ酸のいずれの残基であり得るが、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＰｈｇの残基であるのがより好ましく、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ又はＰｈｇの残基であるのがより好ましい。
なお、Ａ１で示されるアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＰｈｇであるペプチドアルデヒド化合物（式（１ａ））は、文献未記載の新規化合物である。
Ｎ末端アミノ基の保護基としては、ペプチド合成に使用することができる任意のアミノ末端保護基であってよい。例えば、ホルミル基、アセチル（Ａｃ）基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル基、フルオロメトキシカルボニル基、メトキシスクシニル基、芳香族及び脂肪族のウレタン保護基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アダマンチルオキシカルボニル基、ｐ－メトキシベンジルカルボニル（ＭＯＺ）基、ベンジル（Ｂｎ）基、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）基もしくはｐ－メトキシフェニル（ＰＭＰ）基、メトキシカルボニル（Ｍｏｃ）基、メトキシアセチル（Ｍａｃ）基、メチルカルバメート基、又はメチルアミノカルボニル／メチルウレア基から選択されうる。このうち、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基が好ましい。
本発明のペプチドアルデヒド化合物は、後述の実施例に示すとおり、公知のペプチド合成法（液相合成法あるいは固相合成法）に、公知の酸化反応を組み合わせることによって製造することができる。
反応は、基本的には、本発明のペプチドアルデヒド化合物におけるＣ末端のノルバリナール（Ｎｖａ－Ｈ）に対応するアルコール体であるノルバリノール（（Ｓ）－（＋）－２－アミノペンタノール）に、Ｎ末端アミノ基及び必要に応じて側鎖の水酸基等を保護した保護アミノ酸を縮合させた後、Ｃ末端のアルコール性水酸基を酸化し、必要に応じて保護基を脱離することにより、製造することができる。
重亜硫酸付加物は、式（１）において、ＲがＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）で示される化合物であるが、Ｍで示されるアルカリ金属としては、ナトリウム又はカリウムであるのが好ましい。
重亜硫酸付加物は、式（１）で表されるペプチドアルデヒド化合物と重亜硫酸又はその塩を反応させることにより製造することができる。
後述する実施例に示すとおり、本発明のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、ズブチリシンやＷＯ９９／１８２１８号に記載のＫＰ４３プロテアーゼのようなズブチリシン様セリンプロテアーゼの活性を阻害し、当該酵素の保存安定性を向上させる。ペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼの基質結合ポケットに挿入されて非共有状態で結合し、プロテアーゼの活性中心を可逆的にブロックしその活性を阻害するものと考えられる。これによって、当該プロテアーゼがそれ自体の分解を防ぐ効果、及び存在する他の酵素の分解を防ぐ効果が齎される。よって、本発明のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼを含む洗剤用酵素を安定化させると云える。
したがって、本発明のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼ阻害剤及び洗剤用酵素安定化剤となり得、ズブチリシン様セリンプロテアーゼを阻害するため及び洗剤用酵素の安定化を図るために使用できる。また、本発明のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼ阻害剤及び洗剤用酵素定化剤を製造するために使用できる。
本発明において、「プロテアーゼ阻害作用」は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼのタンパク質分解活性を抑制又は低下するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の作用を意味し、「洗剤用酵素の安定化作用」は、ペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物のプロテアーゼ阻害作用によってズブチリシン様セリンプロテアーゼがそれ自体の分解を防ぐ作用、及び共存する他の洗剤用酵素の分解を防ぐ作用を意味する。
洗剤用酵素の安定性は、プロテアーゼ阻害剤を含む溶液とプロテアーゼを含む酵素溶液を混合して所定の条件で一定期間放置した後の、残存するタンパク質分解活性を測定することにより評価することができる。
なお、プロテアーゼ阻害活性は、プロテアーゼ阻害剤を含むプロテアーゼ酵素溶液とプロテアーゼ阻害剤を含まないプロテアーゼ酵素溶液の、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を解析する、比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ウシミルクカゼイン（富士フィルム和光純薬０３３－２３２７１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ－９８７９）、及びウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ－１６２５）等が挙げられる。また、可溶性の合成基質スクシニル－アラニン－アラニン－プロリン－フェニルアラニン－ｐ－ニトロアニリド（ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ）等を用いたｐＮＡアッセイにより、プロテアーゼが加水分解した際に放出されるｐ－ニトロアニリンの放出速度を測定することでも評価することができる。
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、活性部位に活性に必須のアミノ酸残基としてセリン残基が存在する酵素である（Ｗｈｉｔｅ，Ｈａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９７３“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，ｐｐ．２７１－２７２）。本発明において、「ズブチリシン様セリンプロテアーゼ」とは、ペプチダーゼデータベースのＭＥＲＯＰＳ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ，Ｄ２７０～２７２（２００６）を参照）に記載されるようなＳ８セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバー（Ｓ８ファミリーサブクラス）を意味する。本発明のズブチリシン様セリンプロテアーゼは、化学修飾又は遺伝子修飾された突然変異体（タンパク質工学操作された変異体）を含めて、動物起源、植物起源又は微生物起源であり得る。
ズブチリシン様セリンプロテアーゼは、分子量により大きく２８ｋダルトン群と４３ｋダルトン群に大別され、本発明のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、何れの群のズブチリシン様セリンプロテアーゼに対しても作用するが、２８ｋダルトン群のズブチリシン様セリンプロテアーゼに対して、より優れた保存安定性向上効果を発揮する。
２８ｋダルトン群のズブチリシンプロテアーゼとしては、例えば、バチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンＳａｖｉｎａｓｅ（バチルス ルテウス由来、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ．Ｐ２９６００）、ズブチリシンＢＰＮ’（バチルス アミノリクエファシエンス由来、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ．Ｐ００７８２）やズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ（バチルス リケニフォルミス由来、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ． Ｐ００７８０）、ズブチリシン（バチルス プラミス由来、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ．Ｐ０７５１８）等が挙げられる。
また、４３ｋダルトン群のズブチリシンプロテアーゼとしては、ＫＰ４３［バチルスエスピーＫＳＭ－ＫＰ４３（ＦＥＲＭＢＰ－６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８］、及びＫＰ４３（ＷＯ９９／１８２１８において配列番号２で示される）のアミノ酸配列と８０％以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。具体的には、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０［バチルス エスピーＫＳＭ－ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ－６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０３］、プロテアーゼＥ－１［バチルス Ｎｏ．Ｄ－６（ＦＥＲＭ Ｐ－１５９２）由来、特開昭４９－７１１９１， ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０２］、プロテアーゼＹａ［バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０２９）由来、特開昭６１－２８０２６８， ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０４］、プロテアーゼＳＤ５２１［バチルスＳＤ５２１（ＦＥＲＭ Ｐ－１１１６２）由来、特開平３－１９１７８１，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０５］、プロテアーゼＡ－１［ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８／０１２９３，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０４６４０６］、プロテアーゼＡ－２［ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ９８／５６９２７］、プロテアーゼ９８６５〔バチルス エスピーＫＳＭ－９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５６６）由来，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕や、特開２００２－２１８９８９、特開２００２－３０６１７６、特開２００３－１２５７８３、特開２００４－０００１２２、特開２００４－０５７１９５、特開２００４－３０５１７５、特開２００４－３０５１７６、特開２００６－１２９８６５に記載の変異プロテアーゼ、又はこれらとアミノ酸配列において８０％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。
尚、アミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本発明のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼと共に使用すること、又はズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物に使用することにより、組成物中のズブチリシン様セリンプロテアーゼ及び共存する酵素の安定化を図ることができる。したがって、本発明は、ペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する酵素組成物及び洗浄剤組成物を提供する。
本発明の酵素組成物又は洗浄剤組成物において、ズブチリシン様セリンプロテアーゼは、貯蔵中、ペプチドアルデヒド化合物と複合体を形成し、自身のプロテアーゼによるタンパク質分解から保護される（タンパク質分解に対する安定化）。そして、洗浄剤組成物においては、洗浄過程で製剤が水で希釈されると複合体は分解し、ズブチリシン様セリンプロテアーゼはタンパク質分解活性を復活する。
酵素組成物又は洗浄剤組成物の形態は、特に限定されず、液体、粉体、顆粒、ペースト、固形のいずれでもよく、製剤形態としては、固形状、液状、ペースト状又はゲル状であってもよい。
洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤等として使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられる。
酵素組成物又は洗浄剤組成物は、ズブチリシン様セリンプロテアーゼに加えて１つ又はそれ以上の酵素（本発明において、「洗剤用酵素」と称する）を含有することができる。当該酵素としては、例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等が挙げられる。このうち、アミラーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にセルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
洗浄剤組成物には、公知の洗浄剤成分が配合される。当該公知の洗浄剤成分としては、例えば、界面活性剤、二価金属イオン捕捉剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、漂白剤、蛍光剤が挙げられる。また、洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩等）、抑泡剤（シリコーン等）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸等）、その他の添加剤を含有させることができる。
本発明の酵素組成物又は洗浄剤組成物において、ペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の含有量は、ペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物が活性を示す量であれば特に制限されないが、組成物１ｇあたり好ましくは０．００００００１ｍｇ以上、より好ましくは０．００００１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．００１ｍｇ以上、よりさらに好ましくは０．１ｍｇ以上である。また、組成物１ｇあたり好ましくは１００ｍｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ以下、さらに好ましくは１ｍｇ以下、よりさらに好ましくは０．２ｍｇ以下である。また、組成物１ｇあたり好ましくは０．００００００１～１００ｍｇ、より好ましくは０．００００１～１０ｍｇ、さらに好ましくは０．００１～１ｍｇ、よりさらに好ましくは０．１～０．２ｍｇである。
また、ズブチリシン様セリンプロテアーゼに対するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の配合比（モル比）は、好ましくは１：０．００００４以上で、より好ましくは１：０．００４以上で、さらに好ましくは１：０．４以上であり、よりさらに好ましくは１：４以上である。また、ズブチリシン様セリンプロテアーゼに対するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の配合比（モル比）は、好ましくは１：４０００００以下で、より好ましくは１：４００００以下で、さらに好ましくは１：４０００以下で、よりさらに好ましくは１：４００以下である。
また、ズブチリシン様セリンプロテアーゼに対するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の配合比（モル比）は、好ましくは１：０．００００４～１：４０００００で、より好ましくは１：０．００４～１：４００００で、さらに好ましくは１：０．４～１：４０００であり、さらにより好ましくは１：４～１：４００である。
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞下記式（１）：
Figure 0007411607000002
〔式中、Ａ１はＮ末端アミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物を有効成分とするズブチリシン様セリンプロテアーゼ阻害剤。
＜２＞下記式（１）：
Figure 0007411607000003
〔式中、Ａ１はＮ末端アミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物を有効成分とする洗剤用酵素安定化剤。
＜３＞Ａ１で示されるアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＰｈｇの残基、好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ又はＰｈｇの残基である、＜１＞又は＜２＞記載の剤。
＜４＞Ｎ末端アミノ基の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の剤。
＜５＞下記式（１）：
Figure 0007411607000004
〔式中、Ａ１はＮ末端アミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物、及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する酵素組成物。
＜６＞下記式（１）：
Figure 0007411607000005
〔式中、Ａ１はＮ末端アミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物、及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
＜７＞ズブチリシン様セリンプロテアーゼが、セリンプロテアーゼのＳ８ファミリーサブクラスに属するタンパク質又はＳ８ファミリーサブクラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、ズブチリシンと同等の機能を有するタンパク質である、＜５＞記載の酵素組成物又は＜６＞記載の洗浄剤組成物。
＜８＞更に、アミラーゼ、セルラーゼ及びリパーゼから選ばれる１種以上の洗剤用酵素を含む、＜５＞記載の酵素組成物又は＜６＞記載の洗浄剤組成物。
＜９＞組成物中のペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の含有量が、組成物１ｇあたり好ましくは０．００００００１ｍｇ以上、より好ましくは０．００００１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．００１ｍｇ以上、よりさらに好ましくは０．１ｍｇ以上であり、また、組成物１ｇあたり好ましくは１００ｍｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ以下、さらに好ましくは１ｍｇ以下、よりさらに好ましくは０．２ｍｇ以下であり、また、組成物１ｇあたり好ましくは０．００００００１～１００ｍｇ、より好ましくは０．００００１～１０ｍｇ、さらに好ましくは０．００１～１ｍｇ、よりさらに好ましくは０．１～０．２ｍｇである、＜５＞～＜８＞のいずれかに記載の酵素組成物又は＜６＞～＜８＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１０＞ズブチリシン様セリンプロテアーゼに対するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の配合比（モル比）が、好ましくは１：０．００００４以上で、より好ましくは１：０．００４以上で、さらに好ましくは１：０．４以上であり、よりさらに好ましくは１：４以上であり、また、ズブチリシン様セリンプロテアーゼに対するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の配合比（モル比）は、好ましくは１：４０００００以下で、より好ましくは１：４００００以下で、さらに好ましくは１：４０００以下で、よりさらに好ましくは１：４００以下であり、また、ズブチリシン様セリンプロテアーゼに対するペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の配合比（モル比）は、好ましくは１：０．００００４～１：４０００００で、より好ましくは１：０．００４～１：４００００で、さらに好ましくは１：０．４～１：４０００であり、さらにより好ましくは１：４～１：４００である、＜５＞～＜９＞のいずれかに記載の酵素組成物又は＜６＞～＜９＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１１＞下記式（１ａ）：
Figure 0007411607000006
〔式中、Ａ１ａはＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物。
参考例１ Ｌｅｕ－ノルバリノールの製造
Figure 0007411607000007
（１）Ｚ－Ｌｅｕ－ノルバリノールの製造：
窒素雰囲気下、３００ｍＬフラスコにベンジルオキシカルボニルロイシン（Ｚ－Ｌｅｕ、東京化成工業株式会社Ｃ０７３９、２．６５ｇ、１０ｍＭ）、ジクロロメタン（１００ｍＬ）、（Ｓ）－（＋）－２－アミノペンタノール（ノルバリノール、シグマアルドリッチ５３４５８７、１．０３ｇ、１０ｍＭ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、株式会社ペプチド研究所１０２２、１．４９ｇ、１１ｍＭ）を加えた。氷浴で冷却しながら、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ、株式会社同仁化学研究所Ｗ００１、２．１１ｇ、１１ｍＭ）を加え、氷浴を除き徐々に室温に戻し一夜撹拌した。反応終了後、クロロホルム（５０ｍＬ）で洗浄しながら分液ロートに移し、水（１００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（４０ｍＬ）を加え、水層を除いた。有機層を飽和食塩水で洗浄後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９５：５）を行った。Ｚ－Ｌｅｕ－ノルバリノールの収量３．０４ｇ（収率８７．１％）。
（２）Ｌｅｕ－ノルバリノールの製造：
２００ｍＬフラスコにＺ－Ｌｅｕ－ノルバリノール（３．０３ｇ、８．７ｍＭ）を加え、減圧下空気を除いた後に、窒素置換を行った。メタノール（６０ｍＬ）、５％Ｐｄ－Ｃ触媒（東京化成工業株式会社Ｐ１４９０、５５％含水物０．５５ｇ）を加え、水素ガス雰囲気下、一夜撹拌した。触媒をろ別し、ろ液を濃縮、凍結乾燥を行った。Ｌｅｕ－ノルバリノールの収量１．８７ｇ（収率９９．７％）。
製造例１ Ｚ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物１）の製造
Figure 0007411607000008
（１）Ｚ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ノルバリノールの合成＜縮合工程＞：
窒素雰囲気下、１００ｍＬフラスコにＺ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（富士フィルム和光純薬株式会社ＳＳ－００３９、０．１９ｇ、０．５ｍＭ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、Ｌｅｕ－ノルバリノール（０．１１ｇ、０．５ｍＭ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、株式会社ペプチド研究所１０２２、０．０７４ｇ、０．５５ｍＭ）を加えた。氷浴で冷却しながら、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ、株式会社同仁化学研究所Ｗ００１、０．１１ｇ、０．５５ｍＭ）を加え、氷浴を除き徐々に室温に戻し一夜撹拌した。反応終了後、クロロホルム（５ｍＬ）で洗浄しながら分液ロートに移し、水（１０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（１０ｍＬ）を加え、水層を除いた。有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９５：５）を行った。Ｚ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ノルバリノールの収量０．２８ｇ（収率９８．７％）。
（２）Ｚ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈの合成＜酸化工程＞：
窒素雰囲気下、１００ｍＬフラスコにＺ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ノルバリノール（０．２８ｇ、０．４９ｍＭ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、氷浴で冷却しながらＤｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（シグマアルドリッチ２７４６２３、０．２７ｇ、０．６４ｍＭ）を加え、氷浴を除き１時間撹拌した。反応終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９７：３）を行った。Ｚ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈの収量０．２４ｇ（収率８７．１％）。
（３）Ｚ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈの合成＜脱保護工程＞：
窒素雰囲気下、５０ｍＬフラスコにＺ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（５７ｍｇ、０．１ｍＭ）、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加え、室温下、１時間撹拌した。撹拌後、減圧下、トリフルオロ酢酸を除き、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９５：５）を行った。Ｚ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈの収量２７ｍｇ（収率５２．７％）
製造例２ Ｚ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物２）の製造
Figure 0007411607000009
製造例１（１）のＺ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）に代えてＺ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）（シグマアルドリッチ９６１２９）を用い、製造例１（１）～（３）と同様の方法により、表題のＺ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物２）を製造した。
製造例３ Ｚ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物３）の製造
Figure 0007411607000010
製造例１（１）のＺ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）に代えてＺ－Ａｌａ（東京化成工業株式会社Ｃ０６３３）を用い、製造例１（１）～（２）と同様の方法により、表題のＺ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物３）を製造した。
製造例４
製造例３のＺ－Ａｌａに代えてＮ末端のアミノ基を保護したアミノ酸を用いて、同様の方法により表１－１～１－３に示す化合物４～８を製造した。
製造例５ Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物９）の製造
（１）Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ノルバリノールの合成＜縮合工程＞：
窒素雰囲気下、１００ｍＬフラスコに、ｔ－ブトキシカルボニルフェニルアラニン（Ｂｏｃ－Ｐｈｅ、東京化成工業株式会社Ｂ１３３２、０．１３ｇ、０．５ｍＭ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、Ｌｅｕ－ノルバリノール（０．１１ｇ、０．５ｍＭ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、株式会社ペプチド研究所１０２２、０．０７４ｇ、０．５５ｍＭ）を加えた。氷浴で冷却しながら、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ、株式会社同仁化学研究所Ｗ００１、０．１１ｇ、０．５５ｍＭ）を加え、氷浴を除き徐々に室温に戻し一夜撹拌した。反応終了後、クロロホルム（５ｍＬ）で洗浄しながら分液ロートに移し、水（１０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（１０ｍＬ）を加え、水層を除いた。有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９５：５）を行った。Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ノルバリノールの収量０．２１ｇ（収率９１．３％）。
（２）Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈの合成＜酸化工程＞：
窒素雰囲気下、１００ｍＬフラスコにＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ノルバリノール（０．２１ｇ、０．４５ｍＭ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、氷浴で冷却しながらＤｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（シグマアルドリッチ２７４６２３、０．２５ｇ、０．５９ｍＭ）を加え、氷浴を除き１時間撹拌した。反応終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７：３→１：１）を行った。Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈの収量０．１７ｇ（収率７９．９％）。
製造例６ Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－ＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｎａ（化合物１０）の製造
窒素雰囲気下、１００ｍＬフラスコにＺ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ（化合物６）５０ｍｇ（０．１０ｍＭ）、重亜硫酸ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社１９６－０１３７２、１０．５ｍｇ、０．１０ｍＭ）、水２ｍＬ、ジメチルホルムアミド２ｍＬを加え、２時間撹拌した。反応終了後、水１０ｍＬ、酢酸エチル１０ｍLを加え、液々分配により水層を取得した。水層を凍結乾燥を行い、白色固体を得た。Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－ＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｎａの収量３７．７ｍｇ（収率６１．９％）。
各合成化合物の化合物データを表１－１～１－４に示す。
Figure 0007411607000011
Figure 0007411607000012
Figure 0007411607000013
Figure 0007411607000014
試験例 残存プロテアーゼ活性
本発明の化合物を含む溶液（プロテアーゼ阻害剤溶液）とズブチリシン様セリンプロテアーゼを含む酵素溶液を以下の通り調製し、両者を混合して所定の条件で一定期間保存した後の、残存タンパク質分解活性を測定した。結果を表３に示す。
（１）酵素溶液
ＫＰ４３（ＷＯ９９／１８２１８に記載の酵素）：造粒酵素０．５ｇに２ｍＭ塩化カルシウム水溶液５ｍＬを加え、氷浴で時々振とうさせながら５分溶解させ、３，０００ｒｐｍで１０分遠心した。上清を０．２μｍフィルターろ過を行い、１０％酵素溶液とした。１０％酵素溶液１ｍＬに２ｍＭ塩化カルシウム水溶液９ｍＬを加え１％ＫＰ４３溶液を調製した。
Ｓａｖｉｎａｓｅ（シグマアルドリッチＰ３１１１（酵素濃度16KNPU/g））：市販酵素溶液０．３ｍＬに２ｍＭ塩化カルシウム水溶液９９．７ｍＬを加え０．３％Ｓａｖｉｎａｓｅ溶液を調製した。
（２）プロテアーゼ阻害剤溶液
下記表３に記載の化合物５ｍｇにジメチルスルホキシド（和光０４６－２１９８１）０．５ｍＬを加え１０，０００ｐｐｍ溶液とした。１０，０００ｐｐｍ溶液５０μＬにジメチルスルホキシド４５０μＬを加え１，０００ｐｐｍ溶液とした。
なお、比較化合物及び化合物１１は下記の市販品を使用した。
比較化合物（Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈ）：ペプチド研究所３１７５－ｖ
化合物１１（Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｎｖａ－Ｈ）：ペプチド研究所３１７０－ｖ
（３）基質溶液
ＡＡＰＬ（ペプチド研究所３１２９）１２１ｍｇにジメチルスルホキシド１，０００μＬを加え２００ｍＭ溶液とした。２００ｍＭ溶液１５０μＬ、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）３００μＬ、水（ｍｉｌｌｉＱ水）２，５５０μＬを加え基質溶液とした。
（４）保存溶液の調製
１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）（和光３１４－９００６５）１００μＬ、１０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム水溶液１，０００μＬ、１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム（和光０３６－００４８５）水溶液２０μＬ、上記酵素溶液１００μＬ、上記プロテアーゼ阻害剤溶液（１，０００ｐｐｍ）２００μＬ、水（ｍｉｌｌｉＱ水）５８０μＬを加え保存溶液２ｍＬを調製した（溶液の処方を表２に示す）。
保存期間は３日間とし、酵素溶液としてＫＰ４３を用いた場合は４０℃、Ｓａｖｉｎａｓｅを用いた場合は３０℃の温度で静置した。
Figure 0007411607000015
（５）測定
測定溶液５０μＬに基質溶液５０μＬを加え、プレートリーダー（Ｆａｌｃｏｎ９６穴プレート３５１１７２）で４０℃、１５分間反応させ４０８ｎｍの吸光度を測定した。この時の酵素反応速度ＯＤ／ｍｉｎを酵素活性とした。保存前の酵素活性に対し、保存後の酵素活性の割合を残存活性とした。
（６）結果
結果を表３に示す。ペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物の添加により、ズブチリシン様セリンプロテアーゼを安定化することが確かめられた。
Figure 0007411607000016

Claims (7)

  1. 下記式（１ａ）：
    Figure 0007411607000017
     〔式中、Ａ １ａ はＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
    で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物を有効成分とするズブチリシン様セリンプロテアーゼ阻害剤。
  2. 下記式（１ａ）：
    Figure 0007411607000018
     〔式中、Ａ １ａ はＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
    で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物を有効成分とする洗剤用酵素安定化剤。
  3. Ｎ末端アミノ基の保護基が、ベンジルオキシカルボニル基又はｔ－ブトキシカルボニル基である、請求項１又は２記載の剤。
  4. 下記式（１ａ）：
    Figure 0007411607000019
     〔式中、Ａ １ａ はＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
    で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物、及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する酵素組成物。
  5. 下記式（１ａ）：
    Figure 0007411607000020
     〔式中、Ａ １ａ はＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
    で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物、及びズブチリシン様セリンプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。
  6. 更に、アミラーゼ、セルラーゼ及びリパーゼから選ばれる１種以上の洗剤用酵素を含む、請求項４記載の酵素組成物又は請求項５記載の洗浄剤組成物。
  7. 下記式（１ａ）：
    Figure 0007411607000021
     〔式中、Ａ１ａはＮ末端アミノ基が保護されていてもよい、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ及びＰｈｇから選ばれるアミノ酸の残基を示し、Ａ２はロイシン残基を示し、ＲはＣＨＯ又はＣＨＯＨ－ＳＯ３Ｍ（Ｍは水素原子又はアルカリ金属を示す）を示す。〕
    で表されるペプチドアルデヒド化合物又はその重亜硫酸付加物。
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