JP7406207B2 - 脂質ドメイン形成基板及び脂質ドメイン形成方法 - Google Patents
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Description
そこで本発明は、自立膜において秩序液体相が形成され安定的に維持されている脂質ドメイン形成基板、脂質ドメイン形成方法を提供することを目的とする。
図1に例示するように、本発明の脂質ドメイン形成基板1は、基板10に微小井戸20が形成され、該微小井戸20の開口部21が脂質二分子膜30によって覆われている。脂質二分子膜30は、井戸開口部の周縁に形成された支持膜31と、井戸開口部上に形成される自立膜32とから構成されている。
脂質二分子膜30には秩序液体相30aと無秩序液体相30bの二つの相状態が存在し、自立膜32は秩序液体相30aを有する。
脂質二分子膜30の脂質分子の種類は、脂質二分子膜(脂質二重膜)を形成できるものであれば特に制限されず、例えば、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトールホスフェイト(PIP)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルグリセロール(PG)、スフィンゴ脂質などの中性又はアニオン性の脂質分子や;1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン、トリメチルアンモニウムプロパン(TAP)、エチルホスホコリン(EPC)などのカチオン性の脂質分子等が挙げられる。これらの脂質分子は、1種類のみを用いてもよく、2種類以上を併用してもよい。
微小井戸20の内部を満たす溶液の溶質の種類は特に限定されない。溶質としては、例えば、各溶液のpHを調整するためのpH緩衝剤(例えば、HEPES、MOPS、TRIS、リン酸塩等);塩類(例えば、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、生理的塩類等);糖類(グルコース、スクロース等);アルコール類(例えば、グリセロール、キシリトール等);グリコール類等(例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)を例示できる。
微小井戸20の深さは、脂質二分子膜30が微小井戸20の底面に接触しない深さであれば特に限定されず、開口部21の直径に応じて適宜設計すればよく、例えば0.1μm~10μmの深さが挙げられる。
基板10の厚みや形状は用途に応じて適宜調整される。基板10に設けられた微小井戸20の数は特に限定されず、1個でもよく、2個以上でもよく、例えば1~10000個とすることができる。
薄膜層11の厚さは、例えば、50nm~500nmであることが好ましい。
サイズの揃ったベシクルを得るためには、ITO基板上に厚さ数十nm~数μmの均一なリン脂質分子の膜を形成することが好ましく、また、交流電場は数百mV~2V程度の印加条件が好ましい。
上述の脂質ドメイン形成基板1の脂質二分子膜30に対して、膜タンパク質を導入することができる。
予め目的の膜タンパク質が導入されたプロテオリポソームを公知方法により準備し、このプロテオリポソームを脂質二分子膜30に融合させる。この結果、目的の膜タンパク質を脂質二分子膜30に導入することができる。
図1に例示するように、脂質ドメイン形成基板1には、微小井戸20の底部に電極40が備えられてもよいし、微小井戸20の外部には対向電極(図示せず)が備えられていてもよい。例えば、電極対間の電位差や、脂質二分子膜30を透過する電流(イオン流)等を計測することにより、脂質二分子膜30に導入された膜タンパク質について、電気化学的な機能解析を行うことができる。電極40、対向電極の材料としては、例えば、銀/塩化銀、金、白金などが挙げられる。脂質ドメイン形成基板1において、電極は微小井戸20の内部又は外部の何れか一方のみに備えられていてもよい。
脂質二分子膜で覆われた微小井戸内外の電位差、あるいは脂質二分子膜を透過する電流を計測する事により、脂質二分子膜に導入した膜タンパク質の機能解析が可能である。
図1に例示するように、脂質ドメイン形成基板1において、微小井戸20の内部の溶液は、蛍光分子23を含んでもよい。蛍光分子(蛍光プローブ)23としては、例えば、微小井戸20の内部の状態変化が起こった場合に蛍光を発する水溶性のものが挙げられる。蛍光分子の蛍光強度変化を計測する事により、脂質二分子膜に導入した膜タンパク質の機能解析が可能である。
蛍光分子の具体例としては、微小井戸20の内部のカルシウムイオン濃度の変化に伴い蛍光強度が変化する、Fluo4、Quin2等が挙げられる。脂質二分子膜30にカルシウムイオン透過性の膜タンパク質を導入した場合、その膜タンパク質を介してカルシウムイオンが脂質二分子膜30を透過し、微小井戸20内のカルシウムイオン濃度が変化すると、蛍光分子からの蛍光強度が変化する。この変化を蛍光顕微鏡等によって検出することにより、膜タンパク質の機能を解析することができる。
(第1実施形態)
脂質ドメイン形成方法の第1実施形態は、微小井戸20が形成された基板10の表面に巨大脂質膜ベシクルを添加し、前記基板10の表面で前記巨大脂質膜ベシクルを展開させることにより、前記微小井戸20の開口部21を脂質二分子膜30で覆う工程と、前記脂質二分子膜30から秩序液体相30a及び無秩序液体相30bを形成させる工程とを有する。前記脂質二分子膜30は頭部に親水性高分子鎖を有する脂質を含有し、前記開口部上の前記脂質二分子膜30(自立膜32)は前記秩序液体相を有する。この一連の工程を経ることにより、図1に示す脂質ドメイン形成基板1が得られる。
脂質ドメイン形成方法の第2実施形態は、微小井戸20が形成された基板10の表面に溶液を滴下し、前記溶液を前記微小井戸の内部に充填し、且つ前記基板の表面を前記溶液で覆う工程と、前記基板10の表面を覆う前記溶液に巨大脂質膜ベシクルを添加し、前記基板10の表面で前記巨大脂質膜ベシクルを展開させることにより、前記微小井戸20の開口部21を脂質二分子膜30で覆う工程と、前記脂質二分子膜30に光を照射して、前記開口部21上の前記脂質二分子膜30(自立膜32)において秩序液体相30aを形成させる工程とを有する。前記溶液のカルシウムイオン濃度は5mM未満である。前記溶液のカルシウムイオン濃度は、3mM未満であってもよく、1mM未満であってもよく、100μM未満であってもよく、10μM未満であってもよい。
(ガングリオシドによる秩序液体相の形成)
脂質二分子膜にガングリオシドを含有させることにより、自立膜部分に秩序液体相を形成させた。
基板本体の材料としてシリコン基板を用いた。基板本体の上面に、120nmの厚さのシリコン酸化膜層(薄膜層)を、熱酸化法により形成した。さらに、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法を用いて、円形状の開口部を持つ微小井戸を形成した。微小井戸の深さは1μmであり、微小井戸の開口部の直径は4μmであった。さらに、水酸化カリウム溶液(濃度:10重量%)により、シリコン酸化膜層の下の基板本体を選択的にエッチングすることにより、微小井戸の開口部の四隅にオーバーハング部を形成した。
脂質二分子膜は以下のように形成した。ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、スフィンゴミエリン(SM)及びコレステロール(Chol)を等モルで含有する混合クロロホルム溶液を調製した。この溶液に、0.5モル%、1モル%、3モル%、4モル%、5モル%又は10モル%のGM1を含有させた。また、対照として、GM1を含有しない溶液を準備した。得られたこれらの溶液に対して、更に、無秩序液体相用蛍光ラベル剤として、0.05モル%のローダミン‐ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(Rhod-DOPE)を0.05モル%含有させた。
続いて、ITO基板(ガラス上に膜厚100nmのITO薄膜が成膜された基板、サイズ40×40mm、50~100Ω)上に、200μLの前記混合クロロホルム溶液を均一に塗布した。
この基板を、室温で2時間、減圧乾燥して、クロロホルム溶媒を完全に除去することで、均一な脂質分子薄膜をITO基板上に形成した。その上に,サイズ20×20mmでくり貫いた窓部を有するシリコーンゴム(外寸30×30mm、厚さ1mm)を密着して配置し、窓部に500μLの200mM スクロース水溶液を滴下した。
さらに、その上部にITO基板を気泡が入らないように配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をITO基板で挟み込んだ。続いて、ITO基板にクリップ電極を接合し、37℃で交流電場(正弦波,1V,10Hz)を2時間印加することで、電界形成法により巨大脂質膜ベシクルをスクロース溶液中に分散して形成させた。
上述の方法により得られる巨大脂質膜ベシクルは、分離した秩序液体相及び無秩序液体相のドメイン構造を有している。励起波長559nmを使用してのローダミンの蛍光を観察することにより、無秩序液体相を可視化することができる。
井戸部を有する基板本体の上に、溶液(200mM グルコース,5mM 塩化カルシウム)を滴下した。さらに、前記巨大脂質膜ベシクル分散液を溶液中に滴下し、静置することで巨大脂質膜ベシクルを基板上に展開した。これにより、球状の巨大脂質膜ベシクルは基板に衝突させ、その球状構造が破壊して井戸部を覆うように単分子膜を形成させた。
巨大脂質膜ベシクルがGM1を含有しない場合、巨大脂質膜ベシクルを展開すると、図2(a)又は図2(b)に示すような脂質二分子膜が形成され、時間経過とともに、最後は図2(a)に示すような脂質二分子膜が形成された。
また、巨大脂質膜ベシクルにおけるGM1の含有量が0.5モル%又は1モル%の場合、GM1を含有しない巨大脂質膜ベシクルを展開した場合と同様であった。
また、巨大脂質膜ベシクルにおけるGM1の含有量が3モル%、4モル%、5モル%又は10モル%の場合、巨大脂質膜ベシクルを展開すると、図2(a)又は図2(b)に示すような脂質二分子膜が形成され、時間経過とともに、最後は図2(c)に示すような脂質二分子膜が形成された。
(光照射による秩序液体相の形成)
脂質二分子膜に光を照射することにより、自立膜部分に秩序液体相を形成させた。
すなわち、Ca(+)溶液を用いた場合には、自立膜部分に秩序液体相が形成されないことが明らかになった。一方、Ca(-)溶液を用いた場合には、自立膜部分に秩序液体相が形成されることが明らかになった。また、巨大脂質膜ベシクルがGM1を含有するか否かに関わらず、井戸内の溶液のカルシウムイオン濃度を調節することによって、秩序液体相の形成を制御できることが明らかになった。
10・・・基板(基板本体)
11・・・薄膜層
11a・・・オーバーハング部
20・・・微小井戸
21・・・開口部
23・・・蛍光分子(蛍光プローブ)
30・・・脂質二分子膜
30a・・・秩序液体相
30b・・・無秩序液体相
31・・・支持膜
32・・・自立膜
40・・・電極
Claims (2)
- 基板に微小井戸が形成され、該微小井戸の開口部が脂質二分子膜によって覆われている脂質ドメイン形成基板において、
前記開口部上の前記脂質二分子膜は秩序液体相を有し、
前記脂質二分子膜はガングリオシドを含有し、
前記ガングリオシドの含有量は、前記脂質二分子膜の総量に対して、3モル%以上である、脂質ドメイン形成基板。 - 微小井戸が形成された基板の表面に巨大脂質膜ベシクルを添加し、前記基板の表面で前記巨大脂質膜ベシクルを展開させることにより、前記微小井戸の開口部を脂質二分子膜で覆う工程と、
前記脂質二分子膜から秩序液体相及び無秩序液体相を形成させる工程とを有し、
前記脂質二分子膜はガングリオシドを含有し、
前記開口部上の前記脂質二分子膜は前記秩序液体相を有し、
前記ガングリオシドの含有量は、前記脂質二分子膜の総量に対して、3モル%以上である、脂質ドメイン形成方法。
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