JP7395759B2 - アミロイド沈着のｍｒｉのための標的造影剤 - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２９日に出願された米国仮出願第６２／９６７，２９５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月２９日に出願された米国仮出願第６２／９６７，２９５号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約番号Ｒ４４ＡＧ０５１２９２、Ｕ０１ＤＥ０２８２３３及びＲ０１ＨＤ０９４３４７の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約番号Ｒ４４ＡＧ０５１２９２、Ｕ０１ＤＥ０２８２３３及びＲ０１ＨＤ０９４３４７の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
アルツハイマー病（「ＡＤ」）の確定診断には、βアミロイド斑及び神経原線維タウタングルの死後の神経病理学的実証が必要である。しかしながら、これらのバイオマーカーのための陽電子放射断層撮影法（「ＰＥＴ」）イメージングプローブの開発の進歩により、インビボで疾患を研究し特徴付けるための新しい研究枠組みが促進されてきた。臨床診断のためには承認されていないが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄによって進められたこの枠組みは、インビボＰＥＴイメージング又はβアミロイド斑及び神経原線維タウタングルの他のバイオマーカー証拠のいずれかによって生物学的ＡＤを定義する。臨床研究における標的化ＰＥＴトレーサーの使用は、認知症の状況におけるＡＤバイオマーカーの進化の理解を劇的に改善した。そのような非侵襲的イメージングＡＤバイオマーカーの臨床展開は、ＡＤ関連認知症の早期診断を可能にし、早期介入を容易にし得る。
脳におけるβアミロイド斑の蓄積は、ＡＤにおける最も初期の病原性事象の１つである。ＰＥＴプローブを使用した前臨床及び臨床研究は、アミロイド斑の実質沈着がＡＤ関連認知症における認知障害の臨床提示の数十年前に始まることを実証している。さらに、アミロイド斑の形成は、神経原線維タウタングルの病因と因果関係がある。１８Ｆ－フロルベタベン、１８Ｆ－フロルベタピル、及び１８Ｆ－フルテメタモールなどのアミロイドイメージングＰＥＴプローブは、認知障害に至るＡＤ病態生理学の理解を実質的に進め、疾患修飾治験療法の評価のための臨床試験において重要な役割を果たしているが、一般集団に対するＰＥＴモダリティへのアクセス性は依然として世界的な問題である。磁気共鳴画像法（「ＭＲＩ」）と共に使用するためのアミロイドイメージング剤は、アクセス性の容易さ及び比較的低コストのために変革を起こし得る。
高いＴ１緩和能のアミロイド標的化リポソーム－ガドリニウム（Ｇｄ）ナノ粒子造影剤（リポソーム二重層の内面及び外面にコンジュゲートされた第１の直鎖Ｇｄキレート、Ｇｄ－ＤＴＰＡビス（ステアリルアミド）（「Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＳＡ」）、及びリポソームのコア内部に第２の直鎖Ｇｄキレート、ガドベン酸ジメグルミン（「Ｇｄ－ＢＯＰＴＡ」）を含有する）は、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイド斑のインビボＭＲＩを可能にした。国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号及びＧｈａｇｈａｄａ ＫＢ，Ｒａｖｏｏｒｉ Ｍ，Ｓａｂａｐａｔｈｙ Ｄ，Ｂａｎｋｓｏｎ Ｊ，Ｋｕｎｄｒａ Ｖ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｅｗ Ｄｕａｌ Ｍｏｄｅ Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（１０）；ｅ７６２８ Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７６２８を参照されたい。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかし、このような直鎖キレートから解離したＧｄの脳への沈着の証拠が明らかになっている。したがって、アミロイド斑のＭＲＩのためのより安定な標的化リポソームＧｄ造影剤が必要とされている。
一態様では、リポソーム組成物（「ＡＤｘ－００１」）が提供される。ＡＤｘ－００１は、第１のリン脂質、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質、大環状ガドリニウム系イメージング剤、及び第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、該第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされており、該標的化リガンドが、
で表され、
式中、
ピリミジン「Ｐ」は、０個、１個又は複数個の－ＯＨ、Ｏ－アルキル、及びＮＨ２で置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルを含む連結基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルであり、水素以外のＲ３は、０個、１個又は複数個の－ＯＨで置換されている、第３のリン脂質を含む。
で表され、
式中、
ピリミジン「Ｐ」は、０個、１個又は複数個の－ＯＨ、Ｏ－アルキル、及びＮＨ２で置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルを含む連結基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルであり、水素以外のＲ３は、０個、１個又は複数個の－ＯＨで置換されている、第３のリン脂質を含む。
さらなる態様では、第１のリン脂質は、水素化大豆Ｌ－α－ホスファチジルコリン（「ＨＳＰＣ」）を含み、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤は、コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）を含み、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）（「ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００」）を含み、大環状ガドリニウム系イメージング剤は、ガドリニウム（３＋）２－［４，７，１０－トリス（カルボキシラトメチル）－１，４，７，１０テトラザシクロドデカ－１－イル］アセタート（「ガドテラート」又は「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ」）を含み、第４のリン脂質、例えば、
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。一態様では、変数ｘは１６（コンジュゲート：「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ」）である。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、該第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている第３のリン脂質は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含み得る。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であり得る。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。一態様では、変数ｘは１６（コンジュゲート：「Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ」）である。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、該第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている第３のリン脂質は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含み得る。いくつかの態様では、変数ｎは、約１０～約１００の任意の整数、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９であり得る。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。
一態様では、標的化リガンドは、
を含む。
を含む。
一態様では、ｎは７９であり、ｍは１６であり（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００」）、標的化リガンドは化合物ｉｉｉ：
（コンジュゲート：「ＥＴ３－７３」）を含み、該化合物ｉｉｉは、その塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）として含む。
（コンジュゲート：「ＥＴ３－７３」）を含み、該化合物ｉｉｉは、その塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）として含む。
一態様では、対象のアミロイド沈着物をイメージングする方法が提供される。この方法は、検出可能な量のリポソーム組成物を対象に導入することを含み得る。この方法は、リポソーム組成物が１つ以上のアミロイド沈着物と会合するのに十分な時間を与えることを含み得る。この方法は、１つ以上のアミロイド沈着物と会合するリポソーム組成物を検出することを含み得る。
一態様では、対象のアミロイド沈着物をイメージングする方法のリポソーム組成物は、ＡＤｘ－００１を含み得る。一態様では、対象のアミロイド沈着物をイメージングする方法のリポソーム組成物は、Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ及びＥＴ３－７３を含み得る。一態様では、対象のアミロイド沈着物をイメージングする方法のリポソーム組成物は、ＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ、及びＥＴ３－７３を含み得る。
一態様では、リポソーム組成物は、患者のアミロイド沈着物のイメージングにおける使用に適しており、この使用は、検出可能な量のリポソーム組成物を患者に導入すること、リポソーム組成物が１つ以上のアミロイド沈着物と会合するのに十分な時間を与えること、及び１つ以上のアミロイド沈着物と会合するリポソーム組成物を検出することを含む。一態様では、使用は、ＭＲＩを使用して検出することを含む。
一態様では、使用は、１つ以上のアミロイド沈着物と会合するリポソーム組成物を検出することによって、患者をＡＤを有する可能性があると同定すること、タウ神経原線維変化の分析に患者を供すること、及び１つ以上のアミロイド沈着物と会合するリポソーム組成物を検出することと併せて、タウ神経原線維変化が存在すると判定すると、患者をＡＤを有すると診断することを含む。
新規なアミロイド標的化リポソーム－Ｇｄ造影剤、ＡＤｘ－００１が、高度に安定な大環状Ｇｄ－ＤＯＴＡイメージング部分に基づいて開発された。ＡＤｘ－００１は、一般に、図１に断面形態で示されているように理解され得る。図２は、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号及び／又はＴａｎｉｆｕｍ ＥＡ，Ｇｈａｇｈａｄａ Ｋ，Ｖｏｌｌｅｒｔ Ｃ，Ｈｅａｄ Ｅ，Ｅｒｉｋｓｅｎ ＪＬ，Ａｎｎａｐｒａｇａｄａ Ａ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｌａｑｕｅ ｂｙ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓ．２０１６．ｄｏｉ：１０．３２３３／ＪＡＤ－１５１１２４に記載されているように、コアカプセル化Ｇｄキレート及び表面コンジュゲート化Ｇｄキレートの両方を含有する国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号の二重Ｇｄリポソームと比較した、本明細書に記載の大環状ガドリニウム系イメージング剤（「ＳＣ－Ｇｄ」）と、リポソーム二重層の内面及び外面にコンジュゲートされたＧｄキレートとのコンジュゲート化の代表的な概略図を示す。
より高いＴ１緩和能を有する造影剤は、より強い増強をもたらす。図３は、本明細書に記載の、「遊離」Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ（すなわち、リポソームにコンジュゲートされていない）、先行技術のＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＴＰＡ－ＢＳＡリポソーム、及びＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥリポソーム（すなわち、ＡＤｘ－００１リポソーム）間の１Ｔ電界強度でのＧｄ（ＩＩＩ）形態のＴ１緩和能の比較を示す。ＡＤｘ－００１は、先行技術のＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＴＰＡ－ＢＳＡリポソームと比較して約３倍高いＴ１緩和能を示す。
より具体的には、リン脂質にコンジュゲートされたＧｄ ＤＯＴＡを有するリポソームＧｄ－ＤＯＴＡは、Ｇｄ－ＤＴＰＡがビス（ステアリルアミド）にコンジュゲートされたリポソームＧｄ－ＤＴＰＡ（Ｇｄ基準で約９．０ｍＭ－１ Ｓ－１及び１Ｔ電界強度でナノ粒子基準で約６６８，０００ｍＭ－１ Ｓ－１）よりも約３倍高いＴ１緩和能（Ｇｄ基準で約３１ｍＭ－１ Ｓ－１及び１Ｔ電界強度でナノ粒子基準で約２，２９５，０００ｍＭ－１ Ｓ－１）を示す。Ｇｄコンジュゲート化は、少なくとも３つの理由で重要である。第１に、Ｇｄキレートのマクロ分子へのコンジュゲート化は、Ｇｄ原子の回転相関を遅くし、したがって回転相関時間を増加させる。より長い回転相関時間は、より高いＴ１緩和能をもたらす。第２に、リン脂質（ここでは、ＤＳＰＥ）へのＧｄキレートのコンジュゲート化（Ｇｄ－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ）は、ビス（ステアリルアミド）にコンジュゲートされたＧｄキレート（Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＳＡ）と比較して回転相関時間をさらに増加させ、したがって、Ｇｄ－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥリポソームは、Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＳＡリポソームと比較してより良好に機能する（より高いＴ１緩和能）。最後に、真のリン脂質にコンジュゲートされることによって、二重層への挿入の安定性がより高くなる。対照的に、Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＳＡにホスファチジル基がない場合、分子の両親媒性、したがって挿入の安定性が低下する。
したがって、一態様では、ＡＤｘ－００１は、第１のリン脂質、リポソーム組成物を安定化することができる立体的にかさ高い賦形剤、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質、大環状ガドリニウム系イメージング剤、及び第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、該第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている、第３のリン脂質を含む。大環状ガドリニウム系イメージング剤は、第４のリン脂質にコンジュゲートされ得る。
リン脂質
いくつかの態様では、適切なリン脂質は、２つの炭化水素鎖が約１４～約２４個の炭素原子の長さで、様々な不飽和度を有するものを含む。いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、ＨＳＰＣ、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、及びそれらの２つ以上の混合物が挙げられる。適切なリン脂質は、天然に存在するものであってもよく、又は合成のものであってもよい。
いくつかの態様では、適切なリン脂質は、２つの炭化水素鎖が約１４～約２４個の炭素原子の長さで、様々な不飽和度を有するものを含む。いくつかの態様では、適切なリン脂質としては、ＨＳＰＣ、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＰＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ＤＳＰＣ」）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、及びそれらの２つ以上の混合物が挙げられる。適切なリン脂質は、天然に存在するものであってもよく、又は合成のものであってもよい。
いくつかの態様では、適切なリン脂質は、国際公開第２００５１０７８２０Ａ１号に列挙されているもののいずれかを含むことができ、その段落［００３１］～［００３３］の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ポリマー誘導体化リン脂質
いくつかの態様では、リポソーム組成物のリポソームは、可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖を含有するか、又は可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖でコーティングされた表面を含み得る。これらのポリマー鎖は、リポソームと血漿成分との間の相互作用を防止することができ、血漿成分は、血液の細胞によるリポソームの取り込み及び血液からのリポソームの除去において役割を果たす。リポソームは、単核食細胞系の器官、主に肝臓及び脾臓（細網内皮系）による取り込みを回避し得る。
いくつかの態様では、リポソーム組成物のリポソームは、可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖を含有するか、又は可撓性の水溶性（親水性）ポリマー鎖でコーティングされた表面を含み得る。これらのポリマー鎖は、リポソームと血漿成分との間の相互作用を防止することができ、血漿成分は、血液の細胞によるリポソームの取り込み及び血液からのリポソームの除去において役割を果たす。リポソームは、単核食細胞系の器官、主に肝臓及び脾臓（細網内皮系）による取り込みを回避し得る。
一態様では、誘導体化リン脂質中のポリマーはポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）であり得る。ＰＥＧは、様々な分子量のいずれかを有することができる。一例では、ＰＥＧ鎖は、約１，０００～１０，０００ダルトンの分子量を有し得る。リポソームが形成されると、ＰＥＧ鎖は、そのようなコーティングの非存在下でリポソームの血液循環時間を延長するのに十分な親水性鎖の表面コーティングを提供し得る。
いくつかの態様では、第１のポリマーで誘導体化された第２のリン脂質は、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００を含む。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質であって、該第２のポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている第３のリン脂質は、
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含み、式中、変数ｎは、約１０～約１００、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９の任意の整数であり得る。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００を含む。
又はその塩（例えば、リン酸アンモニウム塩）を含み、式中、変数ｎは、約１０～約１００、例えば、約６０～約１００、約７０～約９０、約７５～約８５、約７７、又は約７９の任意の整数であり得る。変数ｍは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。例えば、ｎは７７であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１４であってもよい。ｎは７７であってもよく、ｍは１６であってもよい。ｎは７９であってもよく、ｍは１６であってもよい。いくつかの態様では、第２のポリマーで誘導体化された第３のリン脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００を含む。
いくつかの態様では、適切なポリマーは、国際公開第２００５１０７８２０Ａ１号に列挙されているもののいずれかを含むことができ、その段落［００３４］～［００３８］の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ポリマーによって誘導体化されたリン脂質は、国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号に開示されている組み合わせのいずれかであり得る。
立体的にかさ高い賦形剤
いくつかの態様では、リポソームは、安定化賦形剤を含み得る。例えば、リポソーム組成物は、Ｃｈｏｌを含むように製剤化され得る。他の態様では、リポソーム組成物は、脂肪アルコール、脂肪酸、コレステロールエステル、他の薬学的に許容される賦形剤、及びそれらの混合物を含み得る。
いくつかの態様では、リポソームは、安定化賦形剤を含み得る。例えば、リポソーム組成物は、Ｃｈｏｌを含むように製剤化され得る。他の態様では、リポソーム組成物は、脂肪アルコール、脂肪酸、コレステロールエステル、他の薬学的に許容される賦形剤、及びそれらの混合物を含み得る。
大環状ガドリニウム系イメージング剤
リポソーム組成物は、大環状Ｇｄ系イメージング剤を含む。いくつかの態様では、大環状ガドリニウム系イメージング剤は、リン脂質にコンジュゲートされたＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ、例えば、
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。一態様では、変数ｘは１６であり、コンジュゲートはＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥである。
リポソーム組成物は、大環状Ｇｄ系イメージング剤を含む。いくつかの態様では、大環状ガドリニウム系イメージング剤は、リン脂質にコンジュゲートされたＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ、例えば、
又はその塩（例えば、ナトリウム塩）を含む。いくつかの態様では、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり得る。一態様では、変数ｘは１６であり、コンジュゲートはＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥである。
他の態様では、大環状ガドリニウム系イメージング剤は、
を含む。
を含む。
標的化リガンド
リポソーム組成物は、ポリマーで誘導体化された少なくとも１つのリン脂質であって、該ポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている少なくとも１つのリン脂質を含む。したがって、いくつかの態様では、リン脂質は、スペーサー鎖を含むように修飾される。スペーサー鎖は、親水性ポリマーであってもよい。親水性ポリマーは、典型的には、標的化リガンドにカップリングするために末端官能化されていてもよい。官能化された末端基は、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ジスルフィド基、活性化エステル又はアルデヒド基であり得る。ヒドラジド基は、多くの生物学的に関連する化合物で生成され得るアルデヒドに対して反応性である。ヒドラジドはまた、活性エステル又はカルボジイミド活性化カルボキシル基によってアシル化され得る。アシル化種として反応性のアシルアジド基は、ヒドラジドから容易に得ることができ、アミノ含有リガンドの付着を可能にする。
リポソーム組成物は、ポリマーで誘導体化された少なくとも１つのリン脂質であって、該ポリマーが標的化リガンドにコンジュゲートされている少なくとも１つのリン脂質を含む。したがって、いくつかの態様では、リン脂質は、スペーサー鎖を含むように修飾される。スペーサー鎖は、親水性ポリマーであってもよい。親水性ポリマーは、典型的には、標的化リガンドにカップリングするために末端官能化されていてもよい。官能化された末端基は、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ジスルフィド基、活性化エステル又はアルデヒド基であり得る。ヒドラジド基は、多くの生物学的に関連する化合物で生成され得るアルデヒドに対して反応性である。ヒドラジドはまた、活性エステル又はカルボジイミド活性化カルボキシル基によってアシル化され得る。アシル化種として反応性のアシルアジド基は、ヒドラジドから容易に得ることができ、アミノ含有リガンドの付着を可能にする。
いくつかの態様では、標的化リガンドは、リポソームの表面からアクセス可能であり得、例えば、１つ以上の分子又は抗原に特異的に結合又は付着し得る。これらの標的化リガンドは、リポソームを特定の細胞又は組織、例えばアミロイドβ斑に指向又は標的化することができ、細胞もしくは組織上の又は細胞もしくは組織と会合した分子又は抗原に結合することができる。
標的化リガンドは、
で表され、
式中、
ピリミジン「Ｐ」は、０個、１個又は複数個の－ＯＨ、Ｏ－アルキル、及びＮＨ２で置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルを含む連結基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルであり、水素以外のＲ３は、０個、１個又は複数個の－ＯＨで置換されている。
で表され、
式中、
ピリミジン「Ｐ」は、０個、１個又は複数個の－ＯＨ、Ｏ－アルキル、及びＮＨ２で置換されていてもよく、
Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルを含む連結基であり、
Ｒ３は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルコキシアルキルであり、水素以外のＲ３は、０個、１個又は複数個の－ＯＨで置換されている。
一態様では、標的化リガンドは化合物ｉｉｉである。一態様では、リン脂質ポリマー標的化リガンドコンジュゲートはＥＴ３－７３である。
さらなる態様では、標的化リガンドは、国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号に開示されている化合物ｉ～ｘｉｉｉのいずれかである。なおさらなる態様では、標的化リガンドは、国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号に開示されている化合物ｉｉ、ｉｉｉ、ｘｉ及びｘｉｉｉである。
リポソーム
「リポソーム」とは、一般に、内部空洞を含む球状又はほぼ球状の粒子を指す。リポソームの壁は、脂質の二重層を含み得る。これらの脂質はリン脂質であり得る。多数の脂質及び／又はリン脂質が、リポソームを作るために使用され得る。一例は、疎水性及び極性頭部基部分を有する両親媒性脂質であり、これは、リン脂質によって例示されるように、水中の二重層小胞に自発的に形成され得るか、又は、その疎水性部分が二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、その極性頭部基部分が膜の外部の極性表面に向いた状態で、脂質二重層に安定に組み込まれ得る。リポソームは、本明細書の例、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号及び国際公開第２０１２１３９０８０Ａ１号に記載されているものを含む、任意の公知の方法によって調製され得る。図１は、アミロイド沈着のＭＲＩのための標的造影剤を含むリポソームの例示的な断面図を提供する。
「リポソーム」とは、一般に、内部空洞を含む球状又はほぼ球状の粒子を指す。リポソームの壁は、脂質の二重層を含み得る。これらの脂質はリン脂質であり得る。多数の脂質及び／又はリン脂質が、リポソームを作るために使用され得る。一例は、疎水性及び極性頭部基部分を有する両親媒性脂質であり、これは、リン脂質によって例示されるように、水中の二重層小胞に自発的に形成され得るか、又は、その疎水性部分が二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、その極性頭部基部分が膜の外部の極性表面に向いた状態で、脂質二重層に安定に組み込まれ得る。リポソームは、本明細書の例、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６０５７８１２Ａ１号及び国際公開第２０１２１３９０８０Ａ１号に記載されているものを含む、任意の公知の方法によって調製され得る。図１は、アミロイド沈着のＭＲＩのための標的造影剤を含むリポソームの例示的な断面図を提供する。
一態様では、ＡＤｘ－００１は、ＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、ＥＴ３－７３、及びＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥを含む。いくつかの態様では、第１のリン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、又はＤＰＰＣとＤＳＰＣとの混合物を含み得る。一態様では、ＡＤｘ－００１中の成分の脂質組成及びモル比（％）は、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＥＴ３－７３＝約３１．５：約４０：約２．５：約２５：約１である。いくつかの態様では、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＥＴ３－７３のいずれか１つのモル比は、最大１０％、したがって、３１．５±１０％：４０±１０％：２．５±１０％：２５±１０％：１±１０％だけ調整され得る。一態様では、ＡＤｘ－００１中の成分の脂質組成及びモル比（％）は、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ：ＥＴ３－７３＝約３２．５：約４０：約２：約２５：約０．５である。
一態様では、ＡＤｘ－００１中のＨＳＰＣ含有量は、約２４ｍｇ／ｍＬ～約３２ｍｇ／ｍＬ（総脂質）である。一態様では、ＡＤｘ－００１中のＣｈｏｌ含有量は、約１４ｍｇ／ｍＬ～約１９ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００１中のＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ～約７ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００１中のＧｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥ含有量は、３０ｍｇ／ｍＬ～４５ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００１中のＥＴ３－７３含有量は、約２ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬである。一態様では、ＡＤｘ－００１中の遊離ガドリニウム含有量は、２．５μｇ／ｍＬ未満を含む１００μｇ／ｍＬ以下である。
一態様では、リポソーム組成物は６．４～８．４のｐＨを有する。さらなる態様では、リポソームは、２００～４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する。さらなる態様では、リポソームは、動的光散乱で測定して、１５０ｎｍ（Ｄ５０）未満を含む、約１４０ｎｍ（Ｄ５０）を含む、及び約１２０ｎｍ（Ｄ５０）を含む２００ｎｍ（Ｄ５０）未満の小胞サイズ（Ｚ平均）を有する。
数字に関連する「約」という用語は、その数字の±１０％を含むことが意図されている。これは、「約」が独立した数字を変更することであるか、数字の範囲の両端のいずれか又は両方で数字を変更することであるかにかかわらず当てはまる。言い換えると、「約１０」は９～１１を意味する。同様に、「約１０～約２０」は、９～２２及び１１～１８を意図する。「約」という用語がない場合、正確な数が意図される。言い換えると、「１０」は１０を意味する。
例
ＡＤｘ－００１の動物モデルにおける用量応答、薬物動態及び体内分布を研究した。用量範囲の有効性研究を、早期発症ＡＤのＴｇマウスモデルにおいて行った。イメージングは、Ｔ１ｗ－ＳＥ及びＦＳＥ－ＩＲ配列を使用して１テスラ永久磁石ＭＲスキャナーで実施した。ＡＤｘ－００１を、０．１０、０．１５、及び０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇの３つの用量レベルで試験した。Ｔｇ及び年齢が一致するＷＴ対照動物（ｎ＝６／用量レベル／遺伝子型）を、造影前及びＡＤｘ－００１の投与の４日後（遅延造影後）にイメージングした。造影前及び遅延造影後画像を定性的及び定量的に分析して、アミロイドβ斑の死後組織学的同定に対する感度、特異性及び精度を決定した。ＡＤｘ－００１の薬物動態をサル及びイヌにおいて研究した。ＡＤｘ－００１の投与後の複数の時点で血液試料を採取し、ＧｄレベルをＩＣＰ－ＭＳによって分析した。ＡＤｘ－００１の体内分布をラットにおいて研究した。標的器官（肝臓、脾臓、腎臓、皮膚、骨及び脳）中のＧｄレベルを、ＡＤｘ－００１の投与後４日目及び２８日目にＩＣＰ－ＭＳによって測定した。
ＡＤｘ－００１の動物モデルにおける用量応答、薬物動態及び体内分布を研究した。用量範囲の有効性研究を、早期発症ＡＤのＴｇマウスモデルにおいて行った。イメージングは、Ｔ１ｗ－ＳＥ及びＦＳＥ－ＩＲ配列を使用して１テスラ永久磁石ＭＲスキャナーで実施した。ＡＤｘ－００１を、０．１０、０．１５、及び０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇの３つの用量レベルで試験した。Ｔｇ及び年齢が一致するＷＴ対照動物（ｎ＝６／用量レベル／遺伝子型）を、造影前及びＡＤｘ－００１の投与の４日後（遅延造影後）にイメージングした。造影前及び遅延造影後画像を定性的及び定量的に分析して、アミロイドβ斑の死後組織学的同定に対する感度、特異性及び精度を決定した。ＡＤｘ－００１の薬物動態をサル及びイヌにおいて研究した。ＡＤｘ－００１の投与後の複数の時点で血液試料を採取し、ＧｄレベルをＩＣＰ－ＭＳによって分析した。ＡＤｘ－００１の体内分布をラットにおいて研究した。標的器官（肝臓、脾臓、腎臓、皮膚、骨及び脳）中のＧｄレベルを、ＡＤｘ－００１の投与後４日目及び２８日目にＩＣＰ－ＭＳによって測定した。
例１：ＥＴ３－７３の調製
図４を参照して、出発材料（Ｅ）－２－（（２－アミノエチル）（４－（２－（ピリミジン－４－イル）ビニル）フェニル）アミノ）エタン－１－オール（ＳＭ１）をＤＩＰＥＡと反応させてＥＴ３－７３中間体１を形成した。ＥＴ３－７３中間体１をＴＢＤＭＳ－ＯＴｆ（ＴＢＤＭＳ－トリフラート）と反応させてＥＴ３－７３中間体２を得た。ＥＴ３－７３中間体２をＨＯ－ＰＥＧ３５００－ＮＨ２（ＳＭ２）とカップリングさせてＥＴ３－７３中間体３を形成した。ＥＴ３－７３中間体３をビス－ペンタフルオロフェニル－カルボナートと反応させ、活性化したＥＴ３－７３中間体３を、ビス－トリメチルシリル－アセトアミドを使用してシリル化したＤＳＰＥと合わせて、ＥＴ３－７３中間体４を得た。最後に、ＴＢＡＦを使用した脱保護、続いて酢酸ナトリウムアンモニウムとの反応によってＥＴ３－７３アンモニウム塩を形成した。
図４を参照して、出発材料（Ｅ）－２－（（２－アミノエチル）（４－（２－（ピリミジン－４－イル）ビニル）フェニル）アミノ）エタン－１－オール（ＳＭ１）をＤＩＰＥＡと反応させてＥＴ３－７３中間体１を形成した。ＥＴ３－７３中間体１をＴＢＤＭＳ－ＯＴｆ（ＴＢＤＭＳ－トリフラート）と反応させてＥＴ３－７３中間体２を得た。ＥＴ３－７３中間体２をＨＯ－ＰＥＧ３５００－ＮＨ２（ＳＭ２）とカップリングさせてＥＴ３－７３中間体３を形成した。ＥＴ３－７３中間体３をビス－ペンタフルオロフェニル－カルボナートと反応させ、活性化したＥＴ３－７３中間体３を、ビス－トリメチルシリル－アセトアミドを使用してシリル化したＤＳＰＥと合わせて、ＥＴ３－７３中間体４を得た。最後に、ＴＢＡＦを使用した脱保護、続いて酢酸ナトリウムアンモニウムとの反応によってＥＴ３－７３アンモニウム塩を形成した。
例２：Ｇｄ（ＩＩＩ）－ＤＯＴＡ－ＤＳＰＥの調製
図５を参照して、合成スキームを、ＤＯＴＡ－トリス（ｔｅｒｔ－ブチルエステル）（ＳＭ１）とペンタフルオロフェノール（ＨＯｐＦＰ）とのさらなるエステル化から始める。ＴＦＡ及びトリメチルクロルシラン（ＴＭＳＣｌ）を使用して、ｔｅｒｔ－ブチルエステル保護基を除去した。ＢＳＡ及びＮＭＭの存在下でペンタフルオロフェニルエステルをＤＳＰＥにカップリングさせて、ＤＳＰＥ－ＤＯＴＡを形成した。ガドリニウムのキレート化及び塩形成は、酢酸塩としてのガドリニウム［Ｇｄ（ＯＡｃ）３］の添加、続いてスカベンジャーＳｉｌｉａＭｅｔＳ ＴＡＡｃＯＮａ（トリアミンテトラアセタート、ナトリウム塩官能化シリカゲル）の添加によって起こり、最終的なＤＳＰＥ－ＤＯＴＡ－Ｇｄナトリウム塩を形成した。
図５を参照して、合成スキームを、ＤＯＴＡ－トリス（ｔｅｒｔ－ブチルエステル）（ＳＭ１）とペンタフルオロフェノール（ＨＯｐＦＰ）とのさらなるエステル化から始める。ＴＦＡ及びトリメチルクロルシラン（ＴＭＳＣｌ）を使用して、ｔｅｒｔ－ブチルエステル保護基を除去した。ＢＳＡ及びＮＭＭの存在下でペンタフルオロフェニルエステルをＤＳＰＥにカップリングさせて、ＤＳＰＥ－ＤＯＴＡを形成した。ガドリニウムのキレート化及び塩形成は、酢酸塩としてのガドリニウム［Ｇｄ（ＯＡｃ）３］の添加、続いてスカベンジャーＳｉｌｉａＭｅｔＳ ＴＡＡｃＯＮａ（トリアミンテトラアセタート、ナトリウム塩官能化シリカゲル）の添加によって起こり、最終的なＤＳＰＥ－ＤＯＴＡ－Ｇｄナトリウム塩を形成した。
例３：ＡＤｘ－００１の調製
図６を参照して、ＡＤｘ－００１を以下のように調製した。
図６を参照して、ＡＤｘ－００１を以下のように調製した。
ステップ１（緩衝溶液）：塩化ナトリウム及びヒスチジンを混合しながら水に溶解し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。溶液は公称ｐＨ７．５であった。
ステップ２（脂質溶液）：ＤＳＰＥ－ＤＯＴＡ－Ｇｄ、ＨＳＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ Ｉｎｃ．、米国ニュージャージー州ニューアーク）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００（Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａ、スイス、リースタール）、Ｃｈｏｌ（Ｌｉｐｏｉｄ Ｉｎｃ．、米国ニュージャージー州ニューアーク）及びＥＴ３－７３（３１．５：４０：２．５：２５：１モル比）を混合しながらｔｅｒｔ－ブチルアルコールに溶解した。
ステップ３（リポソーム形成）：脂質溶液（ステップ２）を緩衝溶液（ステップ１）の一部に添加した。必要に応じて、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを公称ｐＨ６．５～７．０に調整した。このステップは、不確定なサイズ及びラメラ性のリポソームを生成した。薬物物質（ＤＳＰＥ－ＤＯＴＡ－Ｇｄ）及び他の脂質成分（ＨＳＰＣ、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ２０００、コレステロール及びＥＴ３－７３）は、リポソームの脂質二重層内に存在する。
ステップ４（押出）：リポソーム小胞サイズを低減するために、プロセス材料を高圧でトラックエッチポリカルボナートフィルターを通して押し出した。処理中の動的光散乱試験によって測定して、所望の小胞サイズ（約１４０ｎｍの公称サイズ）が達成されるまで処理を続けた。
ステップ５（限外濾過）：５００，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）等級の接線流濾過アセンブリを使用して、プロセス材料に対して限外濾過を行った。限外濾過の間、リポソームナノ粒子を再循環させ、限外濾過器によって保持し、一方、担体溶液の一部（緩衝溶液＋溶媒ｔｅｒｔ－ブチルアルコール）は限外濾過器を通過して透過廃液流に入った。限外濾過ステップは３つの部分からなっていた。まず、プロセス材料を、限外濾過器からの透過液を廃棄することによって濃縮した。第２に、限外濾過アセンブリをダイアフィルトレーションモードで操作した。ダイアフィルトレーションモードでは、透過廃液流を緩衝溶液で補充することによって一定の濃度が維持される（ステップ１）。第３に、最終製剤の公称９８ｍｇ／ｍＬの総脂質組成物よりわずかに高い濃縮レベルに達するように、プロセス材料を濃縮した。
ステップ６（前濾過）：所望の濾過性が達成されるまで、プロセス材料をトラックエッチポリカルボナートフィルターに通した。
ステップ７（清澄濾過）：プロセス材料を０．２μｍフィルター（ポリエーテルスルホン膜を含むＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＩ）に通した。
ステップ８（希釈）：プロセス材料を緩衝溶液（ステップ１）で３８．７ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＥ－ＤＯＴＡ－Ｇｄの目標標識強度に希釈した。公称濃度は９８ｍｇ／Ｌ総脂質であった。
ステップ９（滅菌濾過）：無菌条件下で、プロセス材料を０．２μｍ滅菌グレードフィルター（ポリエーテルスルホン膜を含むＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＩ）に通した。
ステップ１０（無菌充填）：無菌条件下で、プロセス材料をバイアルに充填し、栓をし、密封した。充填作業中に充填重量チェックを行い、充填バイアルを微粒子及び容器の閉鎖欠陥について１００％目視検査した。複数の例示的バッチのバッチデータを表１に示す。
例４：ＭＲＩ研究
研究を、早期発症ＡＤのＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ１ｄＥ９（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景、１１～１８月齢）二重Ｔｇマウスモデル（ＪＡＸ ＭＭＲＲＣ Ｓｔｏｃｋ＃００５８６４）において行った。Ｔｇマウスは、６～７月齢前後の脳にアミロイド斑を発症する。例３で調製したＡＤｘ－００１を３つの用量レベル、０．１０、０．１５及び０．２０（ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ）で試験した。各用量レベルで、ＡＤｘ－００１をＴｇマウス（ｎ＝６）及びＷＴマウス（両変異を欠くマウス）（ｎ＝６）で試験した。ＡＤｘ－００１を尾静脈を介して低速ボーラス注射として静脈内投与した。
研究を、早期発症ＡＤのＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ１ｄＥ９（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景、１１～１８月齢）二重Ｔｇマウスモデル（ＪＡＸ ＭＭＲＲＣ Ｓｔｏｃｋ＃００５８６４）において行った。Ｔｇマウスは、６～７月齢前後の脳にアミロイド斑を発症する。例３で調製したＡＤｘ－００１を３つの用量レベル、０．１０、０．１５及び０．２０（ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ）で試験した。各用量レベルで、ＡＤｘ－００１をＴｇマウス（ｎ＝６）及びＷＴマウス（両変異を欠くマウス）（ｎ＝６）で試験した。ＡＤｘ－００１を尾静脈を介して低速ボーラス注射として静脈内投与した。
イメージングは、１Ｔ永久ＭＲＩスキャナー（Ｍ７システム、Ａｓｐｅｃｔ Ｉｍａｇｉｎｇ、イスラエル、ショハム）で実施した。２．５又は３％イソフルランを使用して動物を鎮静させ、吸入による連続麻酔送達（１～２％イソフルラン）のための一体型フェイスコーン（ｆａｃｅ－ｃｏｎｅ）を備えた特注のスレッド（ｓｌｅｄ）に置いた。呼吸数は、腹部領域の下に配置された空気圧制御圧力パッドによって監視した。２つのＭＲＩ配列、Ｔ１ｗ－ＳＥ配列及び流体減衰反転回復配列に近似する２Ｄ ＦＳＥ－ＩＲを試験した。ＳＥパラメータは、ＴＲ＝６００ｍｓ、ＴＥ＝１１．５ｍｓ、スライス厚＝１．２ｍｍ、マトリックス＝１９２×１９２、ＦＯＶ＝３０ｍｍ、スライス＝１６、ＮＥＸ＝４であった。ＦＳＥ－ＩＲパラメータは、ＴＲ＝６５００ｍｓ、ＴＥ＝８０ｍｓ、ＴＩ＝２０００ｍｓ、スライス厚＝２．４ｍｍ、マトリックス＝１９２×１９２、ＦＯＶ＝３０ｍｍ、スライス＝６、ＮＥＸ＝６であった。コイル較正、ＲＦ較正、及びシミングを、各対象について研究の開始時に行った。すべての動物に造影前スキャンを行い、続いてＡＤｘ－００１を静脈内投与した。遅延造影後スキャンを、造影剤投与の４日後に取得した。Ｔ１ｗ－ＳＥ及びＦＳＥ－ＩＲ配列の両方を使用して、造影前及び造影後のスキャンを取得した。
造影後スキャン後に動物を安楽死させ、０．９％生理食塩水、続いて４％ホルマリン溶液で灌流した。脳を切除し、４％ホルマリン溶液で２４時間固定し、凍結保護のために３０％スクロースに移した。脳をＯＣＴに包埋し、切片化の準備ができるまで－８０℃で保存した。厚さ１５μｍの脳切片を切断し、アミロイド沈着の死後表現型確認のために使用した。切片を５％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）中で１時間インキュベートし、続いて蛍光タグ付き抗アミロイドβ抗体（ＡＦ６４７－４Ｇ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）と共に３％ ＢＳＡ中で４℃にて一晩インキュベートした。切片を核マーカー（ＤＡＰＩ）でさらに染色し、洗浄し、マウントし、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用してカバースリップし、適切なフィルターセットを用いて共焦点顕微鏡でイメージングした。アミロイド結合ＡＤｘ－００１ナノ粒子の存在をＦＩＴＣチャネルにおけるイメージングによって分析した。
ＯｓｉｒｉＸ（バージョン５．８．５、６４ビット）及びＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（バージョン２０１５ａ）において、ＭＲＩ画像の定性及び定量分析を実施した。ＯｓｉｒｉＸにおいて閾値と手動セグメンテーションとの組み合わせによって脳抽出を行った。造影前画像と遅延造影後画像との間のシグナル変化を、画像スタックの中心付近の皮質領域におけるシグナル強度の定量化によって評価した（図７参照）。アミロイド陽性動物を、皮質及び海馬の造影前評価と遅延造影後評価との間のシグナル増強の定性的評価によって同定した。造影前画像と造影後画像との間のシグナルの変化を、ＭＲＩボリュームの中央スライスの皮質組織を包含するＲＯＩにおけるシグナルの積分によって定量化した。シグナル変化（％）を式（１）：
のように計算した。
のように計算した。
アミロイド陽性動物のＭＲＩにおけるシグナル増強の観察結果（免疫蛍光によって決定される）を真陽性結果としてカウントした。逆に、アミロイド陰性動物についての造影前画像と遅延造影後画像との間のシグナル増強の欠如を真陰性とみなした。感度は、免疫蛍光分析による死後アミロイド斑染色のゴールドスタンダードによって同定された真陽性の総数に対するＭＲＩによって同定された真陽性の比によって決定した。特異性は、真陰性の総数に対するＭＲＩで同定された真陰性の比として決定した。全体的な精度は、死後の免疫蛍光によって決定されたアミロイド真陽性と比較してＭＲＩによって正確に同定された動物の総数として計算した。
ＷＴマウス（アミロイド陰性）は、ＡＤｘ－００１の任意の用量レベルでＴ１ｗ－ＳＥ又はＦＳＥ－ＩＲを使用して取得した遅延造影後画像において脳シグナル増強を示さなかった。しかし、Ｔｇマウス（アミロイド陽性）は、０．２０及び０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１用量で、Ｔ１ｗ－ＳＥ遅延造影後画像において皮質及び海馬領域において中程度から高いＭＲシグナル増強を示した。したがって、図８に示されるように、ａ）０．２ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１を投与したＷＴ動物は、注射の４日後にシグナル増強を示さず、ｂ）Ｔｇ動物は、０．２ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１投与の４日後に皮質領域（上の矢印）及び海馬領域（下の矢印）において高い増強を示し、ｃ）Ｔｇ動物は、０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１投与の４日後に皮質領域（上の矢印）及び海馬（下の矢印）領域において中程度の増強を示し、ｄ）Ｔｇ動物は、０．１０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１投与の４日後に皮質領域（矢印）において低い増強を示す。
同様に、Ｔｇマウスは、０．２０及び０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１用量での遅延造影後ＦＳＥ－ＩＲ画像において中程度から高いシグナル増強を示し、０．１０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇでは比較的軽度のシグナル増強を示した。図９に示すように、ＦＳＥ－ＩＲ軸方向画像は、Ｔｇ ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ１ｄＥ９マウスのＡＤｘ－００１遅延造影後スキャンにおいてＭＲシグナル増強を示すが、同齢のＷＴ対照マウスでは示さない。具体的には、（ａ）０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ ＡＤｘ－００１を投与したＷＴ動物は、遅延造影後画像においてシグナル増強を示さず、（ｂ）０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ ＡＤｘ－００１を投与したＴｇ動物は、遅延造影後画像において皮質（上の矢印）及び海馬（下の矢印）領域で高いシグナル増強を示し、（ｃ）０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ ＡＤｘ－００１を投与したＴｇ動物は、遅延造影後画像において、皮質領域（上の矢印）で中程度のシグナル増強を示し、海馬領域（下の矢印）で低い増強を示し、（ｄ）０．１０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ ＡＤｘ－００１を投与したＴｇ動物は、遅延造影後画像において皮質領域（矢印）で低いシグナル増強を示す。すべての遅延造影後画像を、ＡＤｘ－００１投与の４日後に取得した。
皮質ＲＯＩの定量分析により、造影後遅延画像におけるＭＲシグナル増強の定性的観察が確認され、すべての用量レベルでＴｇ動物とＷＴ動物との間の造影後シグナル変化に統計学的有意差が見出された。図１０に示すように、Ｔｇマウスは、ＡＤｘ－００１のすべての用量レベルにおいて、対応するＷＴと比較して皮質脳領域においてＭＲシグナル増強を示す。具体的には、ボックスプロットは、ａ）０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ、ｂ）０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ、及びｃ）０．１０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＡＤｘ－００１の用量レベルについて、造影前及び遅延造影後のＴ１ｗ－ＳＥ画像間のシグナル変化（パーセンテージで表す）を示す。同様のシグナル変化が、ｄ）０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ、ｅ）０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ、及びｆ）０．１０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇの用量レベルについて、造影前及び遅延造影後のＦＳＥ－ＩＲ画像間で示される。ウィルコクソンの順位和統計検定を適用して群差を比較した。ｐ≦０．０５の値を統計的に有意とみなした。図１０では、ｐ＜０．０５（＊）及びｐ＜０．００５（＊＊）である。
ＷＴマウス及びＴｇマウスの造影前シグナルが区別できないことを確立した後、すべての試験マウスの造影前（ベースライン）スキャンからシグナル差異閾値を推定した（図１１参照）。推定ベースラインシグナル閾値は、５．１％（ＦＳＥ－ＩＲ）及び５．６％（Ｔ１ｗ－ＳＥ）であった。アミロイド陽性マウスを、これらのカットオフを超えるシグナル増強を示した場合に同定した。
これらの閾値を使用して、ＡＤｘ－００１は、Ｔ１ｗ－ＳＥ及びＦＳＥ－ＩＲ配列の両方を使用して、すべての用量レベルで優れた特異性（１００％）を示した。以下の表２に示すように、Ｔ１ｗ－ＳＥイメージングでは、ＡＤｘ－００１は、０．２０及び０．１０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量レベルで高感度（８０％超）を示したが、ＦＳＥ－ＩＲイメージングでは、ＡＤｘ－００１は、０．２０及び０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量レベルで高感度（８０％超）を示した。Ｔ１ｗ－ＳＥ及びＦＳＥ－ＩＲの両方において、ＡＤｘ－００１は、最高用量レベル（０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ）で最も高い精度（９０％超）を示した。
ＷＴマウス及びＴｇマウスにおける縦断的イメージング研究は、シグナル増強が造影後投与の４日後に最適であり、シグナルが造影後投与の２１日後までにベースラインレベル付近に戻ったことを実証した（図１２を参照）。
免疫蛍光顕微鏡分析により、Ｔｇマウスの皮質及び海馬領域におけるＡＤｘ－００１の優先的な濃度及びアミロイド斑沈着物との共局在が確認された。比較すると、ＷＴ動物はアミロイド斑沈着物を示さず、結合したＡＤｘ－００１ナノ粒子の存在も示さなかった。図１３は、Ｔｇ動物におけるマウスａ）皮質及びｂ）海馬領域におけるアミロイド斑へのＡＤｘ－００１結合の代表的な蛍光顕微鏡画像を示す。ＷＴｃ）皮質及びｄ）海馬領域についての代表的な画像も示されている。ＷＴマウスは、アミロイド斑沈着物（４Ｇ８抗体染色）の証拠も、結合したＡＤｘ－００１の存在（アミロイドリガンド蛍光シグナルについて観察）の証拠も示さなかった。画像を６０倍の倍率で取得した。
例５：薬物動態研究
ＡＤｘ－００１の薬物動態（「ＰＫ」）をカニクイザル及びビーグル犬で評価した。非ナイーブ雄カニクイザル（ｎ＝３、２～５歳、２．３～３．１ｋｇ体重）に、較正された注入ポンプを使用して０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで約６０分間かけてＡＤｘ－００１を静脈内投与した。血液試料を、投与前、注入終了直後、ならびに注射開始（「ＳＯＩ」）の４、８、２４、４８、９６、１６８、３３６及び６７２時間後にすべての動物から採取した。ビーグル犬におけるＰＫ分析のために、動物（ｎ＝５、５～７月齢、６．２～７．９ｋｇ体重）に、ＡＤｘ－００１を０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで約６０分間かけて静脈内注入した。血液試料を血漿に処理し、分析の準備ができるまで凍結保存した。
ＡＤｘ－００１の薬物動態（「ＰＫ」）をカニクイザル及びビーグル犬で評価した。非ナイーブ雄カニクイザル（ｎ＝３、２～５歳、２．３～３．１ｋｇ体重）に、較正された注入ポンプを使用して０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで約６０分間かけてＡＤｘ－００１を静脈内投与した。血液試料を、投与前、注入終了直後、ならびに注射開始（「ＳＯＩ」）の４、８、２４、４８、９６、１６８、３３６及び６７２時間後にすべての動物から採取した。ビーグル犬におけるＰＫ分析のために、動物（ｎ＝５、５～７月齢、６．２～７．９ｋｇ体重）に、ＡＤｘ－００１を０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで約６０分間かけて静脈内注入した。血液試料を血漿に処理し、分析の準備ができるまで凍結保存した。
血漿試料中のＧｄ濃度をＩＣＰ－ＭＳを使用して決定した。血漿試料（１００μＬ）を９０℃で１５分間、９０％濃縮ＨＮＯ３（７５０μＬ）中で消化した。消化した試料を脱イオン（「ＤＩ」）水で希釈し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、Ｇｄ濃度がＩＣＰ－ＭＳ較正標準（１～５００ｐｐｂ）の範囲内になるように上清をＩＣＰ－ＭＳ分析のためにさらに希釈した。
ＡＤｘ－００１は、有害作用なしにイヌ及びサルにおいて十分に忍容された。図１４は、ＡＤｘ－００１の長い血液半減期を示す。血漿Ｇｄ濃度は、イヌ（▲）及びサル（・）へのＡＤｘ－００１の投与後の様々な時点でＩＣＰ－ＭＳを使用して決定した。一次速度論を仮定すると、排出速度は０．０１７時間－１であり、サルでは約４１時間の血液半減期が得られた。Ｇｄの血漿レベルは、サルにおいて、ＳＯＩ後９６時間で約８０％低下し、ＳＯＩ後３３６時間で９９％超低下した。サルにおける同等のリポソーム系ＭＲＩ造影剤の血液半減期に関する文献はないが、マウスにおける研究では１４～２４時間の範囲の血液半減期が示されている。イヌでは、排出速度は０．０２９７時間－１であり、約２３時間の血液半減期が得られた。Ｇｄの血漿レベルは、イヌにおいて、ＳＯＩ後９６時間で約８５％低下し、ＳＯＩ後１６８時間で約９９％低下した。
例６：組織体内分布
ＡＤｘ－００１の体内分布をラットモデルで研究した。Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎラット（１０週齢、２５７～２９６ｇ体重、ｎ＝１３／処置群）に、ＡＤｘ－００１を０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ（ｎ＝１３）又は０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで単回静脈内ボーラス注射として投与した。動物を、ＡＤｘ－００１の投与後４日目（ｎ＝７／用量レベル）及び２８日目（ｎ＝６／用量レベル）に安楽死させた。組織を採取して、標的器官（肝臓、脾臓、腎臓、皮膚、骨及び脳）におけるＧｄレベルを決定した。組織試料を液体窒素中で直ちに凍結し、分析の準備ができるまで－２０℃で保存した。
ＡＤｘ－００１の体内分布をラットモデルで研究した。Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎラット（１０週齢、２５７～２９６ｇ体重、ｎ＝１３／処置群）に、ＡＤｘ－００１を０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ（ｎ＝１３）又は０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで単回静脈内ボーラス注射として投与した。動物を、ＡＤｘ－００１の投与後４日目（ｎ＝７／用量レベル）及び２８日目（ｎ＝６／用量レベル）に安楽死させた。組織を採取して、標的器官（肝臓、脾臓、腎臓、皮膚、骨及び脳）におけるＧｄレベルを決定した。組織試料を液体窒素中で直ちに凍結し、分析の準備ができるまで－２０℃で保存した。
組織試料中のＧｄ濃度をＩＣＰ－ＭＳを使用して定量した。湿潤組織（約１００ｍｇ）を９０％濃縮ＨＮＯ３（約７５０μＬ）中、９０℃で１０～１５分間消化した。消化した試料をＤＩ水で希釈し、激しくボルテックスし、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を分離し、Ｇｄ濃度が較正標準（１～５００ｐｐｂ）の範囲内に入るように必要に応じてさらに希釈した。分析実行の開始時、中間時及び終了時に品質管理試料（５０及び１００ｐｐｂ）を含めた。
ＡＤｘ－００１は、０．３０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇまでの用量でラットにおいて十分に忍容性であり、臨床毒性、臨床病理学、又は組織病理学のエンドポイントに対する観察可能な有害作用はなかった（データは示さず）。組織Ｇｄレベルは、すべての器官において用量に関連した増加を示した。したがって、図１５は、０．１５ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量レベル（▲）及び０．３ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量レベル（・）でのＡＤｘ－００１の静脈内投与後４日目及び２８日目のａ）脾臓、ｂ）肝臓、ｃ）腎臓、ｄ）骨、ｅ）皮膚、及びｆ）脳におけるＧｄレベルを例示するＩＣＰ－ＭＳ分析を示す。組織Ｇｄ含量は、湿潤組織１グラム当たりのｍｇＧｄとして表す。最も高いＧｄ組織レベルが肝臓及び脾臓において観察され、ＰＥＧ化リポソーム剤のクリアランスについての公知の器官と一致した。最も低いＧｄレベルは脳で観察された。２８日目のＧｄの組織レベルは、すべての器官における４日目のＧｄ組織レベルと比較して９０％超低下した。
動物実験は、動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。試験はＮＣ３ＲＳ－ＡＲＲＩＶＥガイドラインに従った。
ＡＤｘ－００１増強ＭＲＩは、すべての用量レベルでＷＴ（アミロイド陰性）マウスと比較してＴｇマウス（アミロイド陽性）において有意に高い（ｐ＜０．０５）脳シグナル増強を示した。ＡＤｘ－００１増強Ｔ１ｗ－ＳＥイメージングは、０．１０及び０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで高感度（８０％超）を示したが、ＡＤｘ－００１増強ＦＳＥ－ＩＲイメージングは、０．１５及び０．２０ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇで高感度（８０％超）を示した。ＡＤｘ－００１のすべての用量レベルで優れた特異性（１００％）が観察された。薬物動態研究は、長い血液半減期（イヌでは２３時間、サルでは４１時間）を示した。体内分布研究は、主に単核食細胞系（細網内皮系としても知られる）を介したＡＤｘ－００１の全身クリアランスを実証した。２８日目のすべての器官の組織Ｇｄレベルは、４日目と比較して９０％超減少し、クリアランスが進行していることを示唆している。
手短に言えば、アミロイド標的化リポソーム大環状ガドリニウム造影剤、ＡＤｘ－００１は、マウス脳におけるβアミロイド斑のインビボイメージングに対して高い感度及び優れた特異性を示した。毒性の徴候は検出されず、薬物動態はＰＥＧ化ナノ粒子について予想されるパターンに従った。
特に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「～の１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は互換的に使用される。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、それらの複数形を含む。端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、同等でオープンエンドであることを意図している。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句は、組成物又は方法が追加の成分及び／又はステップを含み得るが、追加の成分及び／又はステップが特許請求される組成物又は方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。「からなる群から選択される」という語句は、列挙された群の混合物を含むことを意味する。
Claims (7)
- 以下を含む、リポソーム組成物：
大環状ガドリニウム系イメージング剤、ただし、下記を含むリン脂質又はその塩にコンジュゲートされている：
標的化リガンド、ただし該標的化リガンドは、
である。 - リポソームを含むリポソーム組成物、ただし該リポソームは下記を含む：
リン脂質にコンジュゲートされた大環状ガドリニウム系イメージング剤、ただし、前記大環状ガドリニウム系イメージング剤は：
又はその塩を含み、式中、変数ｘは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つであり；及び
ポリマーで誘導体化された第２のリン脂質、ただし該ポリマーは、標的化リガンドにコンジュゲートされており、第２のリン脂質、前記ポリマー、及び標的化リガンドのコンジュゲートは：
又はその塩を含み、
ここで、変数ｎは７０～９０の任意の整数であり、
変数ｍは１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のうちの１つである。 - 以下を含むリポソーム組成物：
以下を含むリポソーム；
水素化大豆Ｌ－α－ホスファチジルコリン；
コレステロール；
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）；
。 - リポソーム組成物中のリポソームの平均直径（Ｄ５０）が１００ｎｍ～１４０ｎｍである、請求項１～３のいずれかに記載のリポソーム組成物。
- ６．４～８．４のｐＨを有する、請求項１～３のいずれかに記載のリポソーム組成物。
- ２．５μｇ／ｍＬ未満の遊離ガドリニウム含有量を含む、請求項１～３のいずれかに記載のリポソーム組成物。
- リポソームが２００～４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項１～３のいずれかに記載のリポソーム組成物。
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