JP7377821B2 - 金属酸化物粒子の水性分散液を調製するための方法 - Google Patents

金属酸化物粒子の水性分散液を調製するための方法 Download PDF

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Description

本発明は、金属酸化物粒子、より具体的には酸化鉄粒子の水性分散液を調製するための方法、およびその使用に関する。
本発明は、主に、磁気媒介プロセスを含む様々な用途で使用するための、特に磁気温熱治療で使用するための酸化鉄粒子の水性分散液の調製に使用するために開発され、本出願を参照して以下に説明する。しかしながら、本発明はこの特定の使用分野に限定されないことが理解される。
本発明の背景に関する以下の議論は、本発明の理解を容易にすることを意図している。ただし、この議論は、言及するいずれかの材料が、本明細書のいずれかのクレームの優先日においてオーストラリアまたはその他の国で公開された、知られている、または一般知識の一部であるという承認または承認ではないことを理解される。
ナノ材料(ナノ粒子およびマイクロ粒子)にはさまざまな用途があり、これらの用途は主に、これらの粒子が有機溶媒または水性溶媒のどちらに分散可能かによって異なる。例えば、酸化鉄粒子は、高いマグネタイトの生体適合性鉄(Fe3/O4)、マグヘマイト(γ－Fe2O3)に生物医学的用途のための磁気材料が期待される。この粒子は、磁気共鳴画像法(MRI)、磁気粒子イメージング(MPI)、癌の過熱治療、バイオセンシング、磁気記憶、重要な化学物質と生化学物質の磁気分離、環境修復など、さまざまな用途で使用されている。
これらの適用の大部分では、これらの酸化鉄粒子を水溶液に分散させる必要がある。ただし、高品質の酸化鉄粒子を生成するためのスケーラブルな合成ルートのほとんどは、有機溶媒でのみ可能である。
例えば、粒子表面にオレイン酸などのリガンドがコーティングされた酸化鉄粒子の合成に熱分解法を使用すると、ナノ粒子のサイズ、形態、その他の物理化学的特性を適切に制御できるが、結果として得られる粒子はオレイン酸および/または他の高沸点界面活性剤の厚い層で高度にコーティングされる。このコーティングは、磁気特性に悪影響を与えるだけではない：また、水への分散性が低いため、これらの高品質の超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)を生物医学的用途に採用する際にも課題がある。このオレイン酸－キャップSPIONの高品質を考慮して、リガンド交換、リガンド修飾、シラン化、および界面活性剤/ポリマーコーティングを通じて水分散性にするための努力がなされてきた。しかしながら、これらの追加の表面コーティングは、凝集、磁気不死層の増加、磁気相変化などの多くの要因からの寄与により、一貫して親粒子の磁化を低下させてきた。全体として、水相間移動後のSPIONの磁気特性の改善は依然として困難であるが、生物医学的応用の観点からは非常に望ましいものである。
そのため、臨床応用では、より長い沈降時間、高表面積、高正味磁化、およびより小さな磁気双極子相互作用を提供するより高品質のSPIONへのアクセスすることに引き続き高い需要がある。このようなSPIONの潜在的な用途の1つは、遠隔制御の磁気温熱療法である：ここでSPIONは、例えば外部交流磁気(AC)電界の存在下で悪性腫瘍を破壊する局所的な熱発生器として使用できる。高周波AC場にSPIONを露出すると、周囲の流体内での全体の磁気粒子の回転（ブラウン緩和、τB）および/または磁気コア内の磁気モーメントの回転(ネール緩和、τN)に起因する局在化された熱を発生することができる。SPIONによって生成される正味熱に対するこの緩和のそれぞれの正確な寄与を決定することは非常に困難であり、選択されたいくつかの研究だけがこれらの緩和の相対的な寄与を区別できた。
改善された品質のSPIONのさらに別の潜在的な用途は磁気粒子イメージング(MPI)であり；これはSPIONなどの超常磁性ナノ粒子を直接検出する新しい非侵襲的断層撮影技術である。MPIは、画像診断および治療に応用できる可能性がある。この技術は、速いタイムスケールにわたって有利に高解像度および高コントラストである。さらに、それは放射線フリーである。
上記を考慮すると、有機溶媒で生成された粒子は水性溶媒に分散できないため、そのような多くの用途、特に生物学的および臨床的用途には適さない可能性がある。
同じ制限が他の多くの粒子にも適用されるため、酸化鉄および他の無機粒子を有機相から水相に相間移動させるための効率的な経路を開発することが強く求められている。この文脈での効率とは、迅速、低コスト、および/または商業的/環境的に持続可能であり、相間移動後の元の材料の生体適合性およびその他の物理化学的特性に大きな影響を与えない方法を意味する。
粒子の相間移動を達成するための文献ベースのプロトコールは、通常、かさばる界面活性剤分子を使用するか、元の材料をシリカなどの別の無機材料でコーティングする。このプロトコールは、材料の元の特性を大幅に変更し、目的の用途に望ましくないものにする。
効率的な相間移動プロトコールのもう1つの望ましい特性は、相間移動後に得られる粒子が新しい水性溶媒に十分に分散し、凝集して大きな粒子にならないことである。凝集が発生すると、粒子は再び用途に焦点を合わせた望ましい特性と機能を失う可能性がある。
本発明は、金属酸化物粒子水性分散液を調製するための方法、およびその使用を提供しようとし、これは、先行技術の少なくともいくつかの欠陥を克服または実質的に改善するか、または少なくとも代替物を提供する。
本発明の第1の態様によれば、金属酸化物粒子水性分散液を調製するための方法が提供され、それには、金属酸化物粒子と第三級アミンおよび水の組合せを接触させて二相混合物を形成することによって金属酸化物粒子の表面に疎水性リガンドでキャップされた複数の金属酸化物粒子の相間移動を行い、および該二相混合物を撹拌して表面に疎水性リガンドおよび第三級アミンリガンドでキャップされた金属酸化物粒子の水性分散液を生成することが含まれる。
１つの実施形態において、二相混合物を5分を超えて超音波処理することによって二相混合物を攪拌する。
１つの実施形態において、その表面に疎水性リガンドおよび第三級アミンリガンドでキャップされた金属酸化物粒子は、一晩放置すると、二相混合物から水相に移動する。
1つの実施形態において、相間移動ステップの前に、この方法は、第三級アミンを溶媒に溶解して第三級アミンの溶液を形成するステップをさらに含む。
1つの実施形態において、非－極性溶媒は、ヘキサン、トルエン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
1つの実施形態において、溶媒は、水、メタノール、エタノール、プロパノール、エーテル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される極性溶媒である。
1つの実施形態において、この方法は、物理的分離手順を使用して、水溶液から、表面上で疎水性リガンドおよび第三級アミンリガンドでキャップされた酸化鉄粒子を分離するステップをさらに含む。
1つの実施形態において、疎水性リガンドおよび第三級アミンリガンドでキャップされた酸化鉄粒子は、二相混合物を1000gを超えて2分を超えて遠心分離することによって二相混合物から分離される。
1つの実施形態において、この方法は、相間移動ステップ前に、疎水性リガンドの有機溶液中に表面上に第三級アミンリガンドでキャップされた複数の金属酸化物粒子分散させて混合物を形成し、および前記混合物を攪拌して表面上に疎水性リガンドでキャップされた複数の金属酸化物粒子を形成するステップをさらに含む。
好ましくは、疎水性リガンドは、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、エーテル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される有機溶媒に溶解される。
1つの実施形態において、方法は、物理的分離手順を使用して、表面上に疎水性リガンドでキャップされた金属酸化物粒子を有機分散液から分離するステップをさらに含む。
好ましくは、物理的分離手順は、磁気分離、遠心分離、濾過およびデカンテーションからなる群から選択される。
1つの実施形態において、複数の金属酸化物粒子は酸化鉄粒子であり、相移動ステップ前に、この方法は、鉄(III)および鉄(II)イオンの水溶液を有機溶媒に溶解した第三級アミンおよび疎水性リガンドと接触させて鉄(III)および鉄(II)イオンの加水分解を促進し、表面上に疎水性リガンドでキャップされた金属酸化物粒子の有機分散液を生成するステップを含む。
好ましくは、鉄(III)および鉄(II)イオンは、2:1のモル比で水溶液中に存在する。
好適には、鉄(III)イオンはFeCl3・6H2Oの形態で提供され、鉄(II)イオンはFeCl2・4H2Oの形態で提供される。
好ましくは、有機溶媒は水溶液と混和性である。
好ましくは、有機溶媒はアセトンである。
1つの実施形態において、接触ステップは、70℃から85℃の範囲内にある温度で行われる。
1つの実施形態において、この方法は、表面上に疎水性リガンドでキャップされた金属酸化物粒子でキャップされた酸化鉄粒子をアセトン:メタノールの1:1(vol/vol)比の混合物で洗浄するステップをさらに含む。
1つの実施形態において、第三級アミンはトリアルキルアミンである。
好適には、トリアルキルアミンは、トリエチルアミンおよびトリメチルアミンからなる群から選択される。
好ましくは、第三級アミンはトリエチルアミンである。
1つの実施形態において、疎水性リガンドは、アルカン酸、飽和または不飽和脂肪酸、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
好ましくは、疎水性リガンドはオレイン酸である。
好ましくは、金属酸化物粒子は酸化鉄粒子である。
好ましくは、酸化鉄粒子は、マグヘマイト(γ－Fe2O3)および/またはマグネタイト(Fe3O4)である。
本発明の第2の態様によれば、第1の態様の方法に従って調製された金属酸化物粒子が提供される。
本発明の第3の態様によれば、第1の態様の方法に従って生成された金属酸化物粒子の水性分散液の、磁気温熱治療、磁気ラベリング、磁気分離、磁気共鳴イメージング、磁気指向ターゲティング、および磁気誘導加熱からなるプロセスの群から選択される磁気媒介プロセスにおける磁気粒子としての使用が提供される。
本発明の第4の態様によれば、第1の態様の方法に従って生成された金属酸化物粒子の水性分散液を含む磁気媒介プロセスで使用するための組成物が提供され、磁気媒介プロセスは、磁気温熱治療、磁気ラベリング、磁気分離、磁気共鳴イメージング、磁気粒子イメージング、磁気指向ターゲティングおよび磁気誘導加熱からなるプロセスの群から選択される。
本発明の他の態様も開示する。
本発明の範囲内に含まれ得る他の形態にも関わらず、本発明の好ましい実施形態を、以下に添付する図面に参照して例示的に説明する。
図1は、経路Aに従う場合に、オレイン酸キャップ－超常磁性酸化鉄ナノ粒子(O－SPION）の相間移動を促進して、オレイン酸およびトリエチルアミンリガンド（AO－SPION）の両方でキャップした超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）の水性分散液を生成するトリエチルアミン（TEA）－媒介ステップを含む。
図2は、O－SPION粒子(ヘキサンに分散)およびAO－SPION粒子(水に分散)の粉末の溶解特性を比較した写真を示す。
図3は、O－SPION粒子（a1－a3）および図1の方法の（TEA）－媒介相間移動ステップに従って生成したAO－SPION粒子(b1－b3)のSAEDパターンを伴うTEMおよびHETEMイメージを示す。
図4は、(a)O－SPION粒子、および(b)図1の方法の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子のX線回折(XRD)パターンを示す。
図5は、さまざまなpH値で測定した場合の、図1の方法の(TEA)を介した相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子のゼータ電位を示すプロットを示す。
図6は、溶液を乱したり、混合したり、振ったりせずに経時的に測定した場合の、図1の方法の(TEA)媒介相間移動ステップに従って生成したAO－SPION粒子の流体力学的サイズの分散を示すプロットを示している。
図7は、(a)O－SPION粒子、および(b)図1の方法の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成したAO－SPION粒子を異なる温度(300K、100Kおよび4K)で測定した場合の磁気特性を比較したプロットを示す。
図8は、ある範囲の哺乳類細胞に対して評価した場合に、図1の方法の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子の生体適合性を示すプロットを提供する。
図9は、赤血球細胞に関して、図1の方法の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成したAO－SPION粒子の血液適合性を示すプロットを提供している。
図10は、図1と同じ概略図を示し、今回はオレイン酸およびトリエチルアミンリガンドの両方でキャップしたSPIONの水性分散液(AO－SPION)の調製への第2のパス(パスB)および第3のパス(パスC)を強調している。
図11は、パスBおよびパスCに従って生成したSPION粒子の粉末の溶解特性を比較する一連の写真を示し、(a)パスBからのトリエチルアミンリガンド(A－SPION)、(b)パスCからのオレイン酸リガンド(O－SPION)および(c)パスCからのオレイン酸およびトリエチルアミンでキャップされたSPIONが含まれる。
図12は、それぞれパスBおよびCに従って生成されたA－SPION粒子(a1－a3)およびO－SPION粒子(b1－b3)のSAEDパターンを伴うTEMおよびHRTEM画像を示す。
図13は、それぞれパスBおよびパスCに従って生成されたA－SPION粒子およびO－SPION粒子の(a)X線回折(XRD)パターンおよび(b)フーリエ変換赤外(FTIR)スペクトルの比較を提供する。
図14は、水中で測定した場合のパスBおよびCに従って生成されたA－SPION粒子、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子の(a)フーリエ変換赤外(FTIR)スペクトル、(b)熱重量分析(TGA)、(c)示差熱重量分析(DTG)、(d)の動的光散乱(DLS)プロファイル、ならびに(e)水、1XPBSおよび10%v/vのFBSを含む1XPBS中で測定した場合のAO－SPION粒子のDLSプロファイルを提供する。
図15は、パスBおよびパスCに従って生成されたA－SPION粒子、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子のコアレベルのX線光電子分光法(XPS)スペクトルを示す。
図16は、温度依存性(M－T)(a1－a3)および磁場依存性(MH)(b1－b3)の磁化曲線を示し、パスBおよびCに従って生成されたA－SPION粒子、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子の磁気特性を示す。
図17は、（a）SPION粒子の磁気ハイパーサーミア応答を試験するのに使用する磁気ハイパーサーミアユニットの模式図、(b)分散媒体［A－SPIONおよびAO－SPIONの場合は水、O－SPIONの場合はトルエン］の温度の変化から評価した、400kHzの固定AC磁界への曝露時間の関数としての、パスBに従って生成されたA－SPION粒子、およびパスCに従って生成されたO－SPION粒子およびAO－SPION粒子の磁気ハイパーサーミア応答のプロット、および(c)水、1XPBSおよび生物学的シナリオを模倣した1XPBS＋10%FBSで行った場合のAO－SPION粒子のハイパーサーミア性能を比較するプロット、を示す。
発明の詳細な説明
以下の説明は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、上記の説明に関して限定することを意図するものではないことを理解されたい。
本発明は、多くの用途、特に生物医学的用途で使用できる超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPON)の形態で金属酸化物粒子水性分散液を調製するための方法の発見に基づいている。この方法は、水に乏しい分散性の疎水性リガンドでキャップされた酸化鉄粒子の水相への相間移動を媒介するための独特の薬剤としての第三級アミンの使用を特定した。この方法では、SPIONを水分散性にするためにSPIONにコーティングを追加する必要がない;これらのSPIONの磁気特性に悪影響を与えることが広く知られている戦略であり、したがって、磁気ハイパーサーミアの治療などの生物医学的用途に有効である。従って、記載した方法によって調製した粒子は、基本的に、この治療に対するブラウン緩和(τB)及び(Nτ)ネール緩和の相対的な寄与を区別するための機会を提供する。
以下に記載する本発明の実施形態は、オレイン酸分子でキャップされた酸化鉄粒子の水性分散液を調製することに焦点を合わせているが、本発明がそのようなものに限定されないことは当業者によって理解されるであろう。同じまたは他の疎水性リガンドでキャップされた他の金属酸化物粒子は、現在請求されている本発明の範囲内に含まれ得る。
[パスA]
パスAの方法
本発明の好ましい実施形態によれば、金属酸化物粒子水性分散液を調製するための方法が提供される。
上に示したように、本発明の好ましい実施形態の理解を容易にするために使用される金属酸化物粒子は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)の形態で提供される。
図1に示す1つのアプローチ(パスA)によれば、この方法は次のステップを含む：表面上に疎水性リガンドでキャップされた超常磁性鉄酸化物ナノ粒子（SPION）を（1）第三級アミンおよび(2)水の予め混合した組合せと接触させることによって複数の超常磁性鉄酸化物ナノ粒子の相間移動を行って、水相および非－水相を有する二相混合物を形成し、ついで該二相混合物を撹拌して表面上に疎水性リガンドおよび第三級アミンリガンドの両方でキャップされた鉄酸化物粒子の水性分散液を生成する。
本質的に、第三級アミンは、水の存在下で作用して、疎水性リガンドでキャップされたSPIONの非水相から水相への迅速かつ容易な相間移動を促進する動的両親媒性リガンドである。
関連技術の当業者によって理解されるように、第三級アミンおよび水が疎水性リガンドでキャップされたSPION粒子に添加される順序は、図1(パスA)に示されたものに限定されない。
例えば、別のアプローチでは、疎水性リガンドでキャップされたSPION粒子を最初にヘキサン(またはトルエン)などの有機媒体に最初に分散させて、第三級アミンと水の混合済みの組み合わせを添加する前に非－水性分散液を形成する。
さらに別の代替アプローチにおいて、疎水性リガンドでキャップされたSPION粒子を最初にヘキサン(またはトルエン)に分散させて非水分散液を形成し、次いで第三級アミンを添加する前に水を非水分散液に添加する。
さらに別の代替アプローチにおいて、疎水性リガンドでキャップされたSPIONを最初にヘキサン(またはトルエン)に分散させて非水分散液を形成し、次に水を添加する前に第三級アミンを非水分散液に添加する。
第三級アミンは、純粋な形で使用されることに限定されず、実際には、疎水性リガンドでキャップされたSPIONを分散させる前に、ヘキサンまたはトルエンなどの非－極性溶媒または水、メタノールまたはエタノールなどの極性溶媒に溶解しれ得ることは理解される。キャップされたSPION。
どちらのアプローチを採用する場合でも、この方法を機能させるためには、疎水性リガンドでキャップされたSPION粒子を第三級アミンおよび水の両方にさらさなければならない。疎水性リガンドでキャップされたSPION粒子がこれらの成分のいずれにもさらされない場合、疎水性リガンドでキャップされたSPION粒子は水相への相間移動を受けない。
反応物自体に関して、本発明者らは、疎水性リガンドを、アルカン酸、飽和または不飽和脂肪酸、またはそれらの組み合わせからなる群から選択し得ることを見出した。一方、第三級アミンは、トリエチルアミンなどのトリアルキルアミンとし得る。
図1の概略図に示すように、パスAをたどる場合、SPIONをキャップする疎水性リガンドがオレイン酸(OA)分子であり、これらのオレイン酸キャップSPION粒子（O－SPIONという）非水相から水相への相間移動を仲介するために使用される第三級アミンがトリエチルアミン(TEA)である場合に良好な結果が示される。
本発明者らは、適切な条件の下で、トリメチルアミンも相移動ステップを促進するための剤として有効であることを証明し得ると考える。
このTEA－媒介相間移動の結果、オレイン酸およびトリエチルアミンの両方のリガンドでキャップされたSPION粒子(AO－SPIONという)の水性分散液が生成される。
以下は、パスAをたどる場合の、図1に示される方法の1つの特定の実施形態の説明である。
1gのO－SPION粒子に40mLのヘキサンを加えてスラリーを形成する。次に、スラリーを振とうして、これらのO－SPION粒子を有機溶媒に分散させ、非水相を形成する。ヘキサンは良好な結果を提供することが示されているが、当業者には、トルエンなどの他の非－極性溶媒を使用し得ることが理解される。いずれの場合も、有機溶媒の体積は、必要に応じて1mLから5000mLまで変化させ得る。
次に、40mLの水を非水相に添加して、二相混合物を形成する。水の体積は1mLから5000mLまで変化させることができるが、必ずしも使用するヘキサンの体積と同じである必要はない。
次に、1mLのトリエチルアミン(TEA)を、(i)正味の形、(ii)ヘキサン、トルエン、またはそれらの組み合わせなどの非－極性溶媒に溶解し、(iii)水、メタノール、エタノール、プロパノール、エーテル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびそれらの任意の組み合わせなどの極性溶媒に溶解するか。次に、混合物を5分以上超音波処理して、乳白色のエマルジョンの形で現れる二相混合物を形成する。この場合も、TEAの体積は必要に応じて0.001mLから100mLまで変化し得る。
この乳白色のエマルジョンは、(i)AO－SPION粒子をエマルジョンから水相に移動させるために、水相と非水相に別々に自己分解することを妨げることなく一晩放置するか、(ii)1000gを超えて約2～10分間遠心してエマルジョンを2つの別々の相(非水相と水相)に急速に分解し、AO－SPION粒子を水相に分散させる。
最後に、得られたAO－SPION粒子は、遠心分離、磁気分離、ろ過、デカンテーション、溶媒蒸発などの物理的分離手順のいずれか1つを使用して、水相から収集し得る。単離したら、AO－SPION粒子を乾燥し、将来の使用のために粉末として保存する。このようにして得られた乾燥粉末は、必要に応じて水性溶媒に容易に再分散し得る。
パスAの場合、使用したO－SPION粒子は、Park、J.ら、Nature Materials、2004、vol.3、891－895[1]に記載されている熱分解法に従って得、および手順に従って精製は両方ともPCT/AU2017/050981[2]に記載の手順に従って精製した。これら両方のプロトコールは出典明示して本明細書の一部とみなす。
パスAに従って調製されたSPION粒子の特徴付け
図2は、O－SPION粒子(ヘキサンに分散)およびAO－SPION粒子(水に分散)の粉末の溶解特性を比較した写真を示す。ここでは、左側に示されているサンプルバイアルの画像から明らかなように、すべてのO－SPION粒子が非水相に存在している。
右側に示されているサンプルバイアルの画像は、TEAを介した相間移動ステップにより、すべてのO－SPION粒子が非水相から水相に相間移動したことを示している。
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、この結果は、O－SPION粒子(ヘキサン中)が水中でTEA媒介相移動ステップを受ける場合に、O－SPION粒子の表面上の一部のバルキーなオレイン酸分子がその方向に再配置され、より小さなTEA分子によって置き換えられると考えている。これにより、得られた粒子は、粒子の表面にオレイン酸およびトリエチルアミン分子の混合物を有する。これらの二重アミン/オレイン酸でキャップされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子を、以下、AO－SPION粒子という。
図3は、透過型電子顕微鏡(TEM)および高分解能透過型電子顕微鏡(HRTEM)の画像を、O－SPION粒子(a1－a3)、および図1の方法の（TEA）－媒介相関移動ステップ（パスA）に従って生成したAO－SPION粒子(b1－b3)の制限視野電子回折(SAED)パターンを示す。
全体として、この図に示されているこのデータは、粒子の形態学的および結晶品質が、水相へのTEA媒介相間移動法の間に変化しないことを確認している。事実、画像a2、a3、b2およびb3のd－間隔および格子面は、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子の両方がマグヘマイトの高品質単結晶(γ－のFe2O3)であることを確認している。
図4は、(a)O－SPION粒子、および(b)図1(パスA)の方法の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子のX線回折(XRD)パターンを示す。
AO－SPION粒子のX線回折データは、これらの粒子がマグヘマイト(γ－Fe2O3)から構成され、その構造は、TEA媒介性相間移動中に変化しないことを確認している。
図5は、さまざまなpH値で測定した場合の、図1の方法(パスA)の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成したAO－SPION粒子のゼータ電位を示すプロットを提供する。
(電荷に関係なく)高いゼータ電位値は、この水相移動粒子がさまざまなpH値にわたって非常に安定したままであることを示唆している。粒子表面は、4以上のpH値で負に帯電するが、3以下のpH値では正に帯電した表面に切り替わることができる。いずれの場合も、このAO－SPION粒子はゼータ電位が高く、静電荷反発メカニズムによってコロイド安定性が高いことを示している。
図6は、経時的に測定した場合の、図1の方法(パスA)の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子の流体力学的サイズの分散を示すプロットを提供する。このプロットは、AO－SPIONが水中で超高コロイド安定性を有することを確認している。
本願で特許請求する相間移動法の品質を試験するために、水分散性AO－SPION粒子を、AO－SPION粒子のコロイド懸濁液を乱すことなく、24時間にわたって粒子の動的光散乱(DLS)プロファイルを取得することを含む厳密な試験に付した。このAO－SPION粒子の流体力学的サイズが、この24時間にわたって約25nmで一定のままであることは注記する。
このAO－SPION粒子がこの時間枠の間に凝集したとしたら、流体力学的径は増加したであろう。ナノマテリアルの合成手順と相間移動法の大部分は、この厳密なテストで失敗する傾向がある。したがって、研究者はさまざまな読み取り中に粒子溶液を振る傾向がある。ここで、しかしながら、コロイド溶液は、24時間にわたって読み取りを行っている間は乱されなかったが、粒子のサイズは同じままであった。これは、これらのAO－SPION粒子が潜在的な凝集なしに水相で超安定であることを非常に強く示している。このような超安定特性は、これらのAO－SPIONを生物医学およびその他の用途に利用するための驚くべき可能性を提供し、この用途では、材料の長期安定性が引き続き懸念される。
図7は、異なる温度(300K、100K、および4K)で測定した場合の、(a)O－SPION粒子、および(b)図1の方法(パスA)の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子の磁気特性を比較するプロットを提供する。これらの測定は、相間移動法の前後に粒子の乾燥粉末で行った。
背景のセクションで説明したように、文献ベースのプロトコールよれば、粒子の相間移動は通常、粒子の表面にかさばる界面活性剤分子を結合するか、粒子の表面にシリカなどの無機材料を成長させることによって行う。このような相間移動アプローチは、材料の磁気特性を劣化(低下)させる。
ここで、しかしながら、TEA－媒介相間移動法によって生成されたAO－SPIONは、O－SPIONよりも高い磁気特性を示す。これは、一般的な温度で測定した場合の図7Aと図7(b)に示すスペクトルの比較から明らかである。ここで、水中のAO－SPIONナノ粒子の図7Bに示す磁化値はヘキサン中のO－SPIONナノ粒子について図7Aに示すものである。
Figure 0007377821000001
上記および図7に示した磁気特性の改善は、表1から定量的に明らかである。
ここで、温度に関係なく、すべての場合において、相間移動後に飽和磁化が改善されることは明らかである。この飽和磁化データは、等量の鉄酸化物粒子に関するものである。
トリエチルアミン(TEA)はオレイン酸よりも小さい分子であり、相転移法の後、オレイン酸分子はTEA分子に置き換わる可能性があるため、同重量の2つの材料(両方とも鉄酸化物結晶であるが、1つは主にかさばるオレイン酸でコーティングされたヘキサン中であり、もう1つは主に小さなTEA分子でコーティングされた水中である)、2つの場合に存在する鉄酸化物結晶の数は異なる。本質的に、この考え方に基づいて、物質の同じ重量のために、水溶性AO－SPION粒子中に存在する鉄酸化物結晶よりもO－SPION粒子中に存在する鉄酸化物結晶が少ない可能性がある。したがって、TEA－媒介相間移動法の後に観察された磁気特性の改善は、潜在的な測定アーティファクトであると考えることができる。

Figure 0007377821000002
相間移動後に各鉄酸化物結晶の磁気特性が改善するかどうかを検証するために、表2に正規化されたデータを示す。これにより、元の粉末の重量から界面活性剤(またはキャッピング剤－オレイン酸とTEA)の重量を差し引いた後に磁化値を計算する。それぞれの場合の界面活性剤の重量は、これらの粒子の熱重量分析(TGA)を使用して決定した。一方で、鉄酸化物の真の重量を考慮し、いずれか潜在的な表面不純物の効果を打ち消しても、これらの鉄酸化物（個々の単一の結晶）の磁気特性が相間移動後に顕著に改善されることは明らかである。全体として、MRI、温熱療法、磁気粒子イメージング(MPI)などのような磁気特性に関連する用途には、より高い磁化値が望ましい。
磁気共鳴画像法(MRI)用のこれらの水性TEA－媒介相関移動AO－SPION粒子の電位は、9.4 Tesla Bruker Biospec MRIスキャナーを使用して緩和度（relaxivity）を計算し、緩和度値(relaxivity value)を熱分解法から得られたO－SPIONの緩和度値と比較することによって評価した。MRIファントムは相間移動前後の粒子について、それぞれ、196.9モル－1および238.5モル－1の計算T2値を明らかにした。これらの高いT2値は、これらの鉄酸化物粒子が磁気共鳴画像法中に暗色化効果を引き起こす優れた能力と、生物医学的造影剤として機能する能力を示している。このO－SPION粒子のT2値がその相間移動後に顕著に改善してAO－SPIONを形成するということは特に注記し、これは、TEA－媒介相間移動プロトコールが異なる生物医学的用途に対して物質の能力を高める顕著な機構を提供することは特に注記する。
図8は、ある範囲の哺乳類細胞に対して評価した場合に、図1の方法(パスA)の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子の生体適合性を示すプロットを提供する。
図8の結果から、異なる濃度の粒子について試験した場合の4つの異なる哺乳動物細胞株(MDA－MB－231、フィブロブラスト、A549、およびU87MG)で示されているように、これらのAO－SPION粒子が生体適合性である(すなわち、重大な細胞毒性を引き起こさない)ことは明らかである。図8に示されている濃度(10、50、100μｇ／ｍＬ）は、（鉄酸化物粒子の重量ではなく）Fe濃度と同等である。
特に、これらの粒子の高い100μｇ／ｍＬ Fe同等の濃度の場合でも、細胞生存率は80%よりも優れている。これは、Feがそのような高濃度である程度の毒性を示し始めるのが一般的であることを考えると、非常に高い生体適合性である。
図9は、図1(パスA)の方法の(TEA)－媒介相間移動ステップに従って生成されたAO－SPION粒子の血液適合性(赤血球細胞に関して)を示すプロットを提供する。
このアッセイは、高感度の赤血球に対するAO－SPION粒子の毒性を試験することを含む。溶血は粒子によって破壊される赤血球の割合を表す。さまざまな濃度のAO－SPION粒子(10、50、100、500μｇ／ｍＬ)では、溶血率が適度に低い(2～4%)ことが示されており、これは、この粒子が生物医学的用途に潜在的に適していることをさらに確認している。
材料と方法(パスAの場合)
すべての化学物質は受け取ったままの状態で使用した。すべての化学物質および溶媒はSigma－Aldrich Australiaから入手し、さらに精製することなく使用した。
合成に使用したすべての水溶液および試薬は、特に明記しない限り、Milli－Q（商標）逆浸透システムを使用して精製した脱イオン水を使用して調製した。
鉄酸化物ナノ粒子の調製
超常磁性鉄酸化物コアを有するナノ粒子は、二段階のプロセスを介して合成した。
第1の段階では、出展明示して本明細書の一部とみなす文献の方法(Park J.ら，2004)[1]に従って、熱分解によって鉄酸化物ナノ粒子を生成する。具体的には、第1段階のプロセスは、塩化鉄3.24gおよびオレイン酸ナトリウム18.25gを、40mLのエタノール、30mLの蒸留水および70mLのヘキサンからなる溶液に溶解することによってオレイン酸鉄錯体を合成することによって行った。ホモジナイズした後、溶液を70℃で4時間還流させた。上部有機層の分離は、分液漏斗を使用して行った。分離したら、オレイン酸鉄層を脱イオン水で2回洗浄し、分液漏斗を使用して再度分離した。最後に、ヘキサンを蒸発させて、ワックス状のオレイン酸鉄錯体を残した。鉄酸化物ナノ粒子は、オレイン酸の1.77グラムおよび1－オクタデセンの60.3mLの鉄オレイン酸錯体を溶解し、つづいて窒素下、320℃で30分間還流することによって形成した。次に、得られた混合物を室温まで冷却させた。
次に、第2段階で、熱分解法により得られた鉄酸化物ナノ粒子を、本発明者らが開発した国際PCT出願番号PCT/AU2017/050981(Gammilonghiら)の主題となる洗浄プロトコールを用いて精製し[2]、これは出典明示して本明細書の一部とみなす。この点で、磁気ナノ粒子は、1mLの不純な鉄酸化物ナノ粒子を、1:1(vol/vol)の比率のジエチルエーテルおよびメタノールを含む49mLの第1溶媒組成物で洗浄し、続いて粒子を磁気分離することによって精製し、続いて、ヘキサンおよびエタノールの比率が1:1(vol/vol)の第2溶媒組成物20mLで洗浄した後、遠心分離と真空乾燥により、精製された鉄酸化物ナノ粒子粉末(パスAのO－SPION)を最終的に得る。
[パスB]および[パスC]
図10は、図1と同じ概略図を示し、今回は、本発明の別の好ましい実施形態によるオレイン酸およびトリエチルアミンリガンドの両方でキャップされたSPION粒子（AO－SPION）の水性分散液の調製への第2のパス(パスB)および第3のパス(パスC)を強調している。
理解されるように、パスBおよびパスCはそれぞれ、パスAに関して使用したように、文献[1,2]で提供されるプロトコールを使用して事前合成されたO－SPION粒子に依存するのではなく、O－SPINO粒子を合成する手段を提供する。
両方の経路によれば、第三級アミンであるトリエチルアミン(TEA)は、O－SPION粒子の合成においてオレイン酸などの有機リガンドの存在下で加水分解剤として最初に使用される。合成されると、これらのO－SPION粒子は、パスAで強調表示されているのと同じ第三級アミン媒介相間移動ステップを受けて、AO－SPIONの水性分散液を生成する。
パスBおよびパスCの方法
パスBの場合、アミンでコーティングされた水分散性鉄酸化物ナノ粒子は、加水分解剤およびキャッピング剤の両方としてトリエチルアミン(TEA)を使用してMannaら，Langmuir，2018，vol.34，2748－2757[3]に記載の方法に従う単一ステップで最初に調製した。
具体的には、2:1のモル比で第二鉄イオンと第一鉄イオンを含む水溶液をTEAにさらすと、TEAはこれらの鉄前駆体の瞬間的な加水分解を促進し、式(1)および(2)に従って鉄酸化物ナノ粒子を形成する。
Figure 0007377821000003
好適には、鉄(III)イオンは、FeCl3・6H2Oの形態で提供され、鉄(II)イオンはFeCl2・4H2Oの形態で提供される。
形成されたマグネタイト(Fe3O4）結晶は、その後、式(3)に従って周囲条件下で酸素の豊富な母溶媒中でさらにマグヘマイト(γFe2O3)まで酸化する。
Figure 0007377821000004
ここで、反応の間に生成したカチオン性アミン分子((CH3CH2)3NH+、水中の共役酸についてpKa－10.75)は、表面ヒドロキシル基を介して鉄酸化物ナノ粒子の表面に同時に吸着し、これは水性母液中でより分散性とする。これらのコロイド懸濁液を磁気的に分離でき、「A－SPION」粒子と示すアミンでキャップされた超常磁性鉄酸化物ナノ粒子の形態で真空乾燥し得る。
次に、A－SPION粒子をオレイン酸分子の有機溶液に分散させて混合物を形成し、次にこれを攪拌してO－SPION粒子を形成する。有機溶液を形成するために、オレイン酸分子は、最初に、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、エーテル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される有機溶媒に溶解する。
パスCの場合、2:1のモル比で第二鉄と第一鉄のイオンを含むこの同じ水溶液をアセトン中のTEAおよびオレイン酸(OA)分子の混合物にさらし、次に攪拌してO－SPION粒子を生成する。攪拌ステップは、好ましくは、70℃から85℃、より好ましくは80℃の範囲内の温度で、約5分程度の期間にわたって行う。
どちらのパスをたどるか(パスBまたはパスC)に関係なく、合成されたままのO－SPION粒子は、アセトン:メタノールの1:1(vol/vol)比の混合物で洗浄し、上記の物理的分離手順の１つによって溶液から単離され、その後に乾燥させて粉末を形成する。
洗浄したら、さらなるTEAを相間移動剤として用いて、パスAに関して前記したのと同じプロトコールにより容易に水分散性のAO－SPION粒子の形成を媒介する。
以下は、パスCをたどる場合の、図10に示す方法の1つの特定の実施形態の説明である。
方法の第1のステップに従って、2:1のモル比の塩化第二鉄(0.2M Fe3+)および塩化第一鉄(0.1M Fe2＋)を含む水溶液40mLを調製し、80℃で5分間撹拌する。
第2のステップに従って、0.5mLのオレイン酸分子を含む5mLのアセトン溶液を上記の溶液に加え、2分間撹拌した[注:オレイン酸は疎水性(油)であるため、水溶液に直接オレイン酸を加えると、水と混合できない]。アセトンは、油と水の両方を溶解できるので、アセトン、オレイン酸を予め混合した後、鉄前駆体の水溶液中に注入し、同時に両方のFe2＋とFe3＋イオンおよびオレイン酸を含む均一な溶液の形成を可能にする。このプロセス中に、アセトンは、有機リガンド(オレイン酸)の高い溶解性を可能にすると同時に、水相との混和性を提供する他の溶媒と置き換え得る。そのような溶媒の例には、アセトン、エタノール、メタノール、エーテル、クロロホルム、DMFおよびDMSOが含まれる。
第3のステップよると、5mL(量は0.1から5mL以上まで変化し得る)のトリエチルアミン(TEA)を混合溶液に注入し、鉄前駆体の瞬間的な加水分解がオレイン酸でキャップされた超常磁性鉄酸化物ナノ粒子(O－SPION)の形成を可能にする。
次に、マグネチックスターラーを伴って、反応物を周囲条件下で冷却した。反応の終わりに、ナノ粒子は水溶液中に分散せず、むしろ反応容器の底に沈殿することが見出された。
得られたO－SPIONを磁気分離を介してアセトン:メタノール(1:1)溶液で5回洗浄し、残留溶媒を60℃のオーブンで一晩蒸発させて固体粉末を得た。得られたO－SPION粒子は、ヘキサン(および試験した他の有機溶媒)に非常によく分散するが、水には分散しないことが見出された。
パスBまたはパスCに従って調製した粒子の特性評価
図11は、(a)トリエチルアミンリガンド(A－SPION)でキャップされたSPION粒子の場合、パスBにより製造した、(b)オレイン酸リガンド(O－SPION)および(c)オレイン酸およびトリエチルアミンリガンド(AO－SPION)でキャップされたSPION粒子の場合、パスCにより製造した、SPION粒子の粉末の溶解性特性評価を比較する一連の写真を示す。
図12に、パスBにより製造したA－SPION粒子(a1－a3)、およびパスCにより製造したO－SPION粒子(b1－b3)の代表的なTEMおよびHRTEM画像とSAEDパターンを示す。
TEM画像(a1、b1)は、サブ10nmサイズの準球形の粒子を反映している。対応するHRTEM画像(a2、b2)は、得られたSPIONが、結晶面間の格子間隔から検証されるように、マグヘマイト(γ－Fe2O3)の高品質単結晶であることを示す。
図13は、パスBにより製造したA－SPION粒子およびパスCにより製造したO－SPION粒子の(a)X線回折(XRD)パターンおよび(b)フーリエ変換赤外(FTIR)スペクトルの比較を提供する。
具体的には、A－SPION粒子およびO－SPION粒子のXRDパターンは、γ－Fe2O3相に対応する明確に定義された格子面およびミラー指数から決定されるように、この粒子に関連する高い結晶性を明らかにしている(図13(a))。
マグヘマイト(γ－Fe2O3)とマグネタイト(Fe3O4)のXRDパターンの類似性により、フーリエ変換赤外(FTIR)分光法を用いて製造されたままのA－SPIONおよびO－SPION粒子の間でこれら2つの相を確実に区別できない(図13B(b))。
図13(b)に示すように、A－SPION粒子とO－SPION粒子の両方のFTIRスペクトルの選択された領域では、ほぼ630cm－1および448cm－1の広いピークが、γ－Fe2O3のFe－O結合の四面体サイトでの伸縮振動の特徴的である。これは、TEAを介したO－SPION粒子の合成がマグヘマイト相の形成をもたらすことを示唆している。
図14は、水、1×PBSおよび10% v/v FBSを含む1×PBS中で測定した場合の、パスBにより製造したA－SPION、水中で測定した場合のパスCにより製造したA－SPIONの(a)フーリエ変換赤外(FTIR)スペクトル、(b)熱重量分析(TGA)、(c)示差熱重量分析(DTG)、(d)動的光散乱(DLS)プロフィール、ならびに（e）AO－SPION粒子のDLSプロフィールを提供する。
図14(a)に示すように、A－SPION粒子の広範囲のFTIRスペクトルは、ほぼ3398および1632cm－1の－OH振動から明らかなように、ナノ粒子表面のヒドロキシル基の存在に対応する強い信号を明らかにしている。TEA分子に対応する追加の信号は、それぞれほぼ1360cm－1および1057cm－1の－CHおよび－CNの伸縮振動からも反映される。このように、A－SPION粒子のFTIRスペクトルは、このナノ粒子の表面がヒドロキシル基に富み、アミン(TEA)分子で覆われており、A－SPION粒子を水性溶媒に高度に分散させるという事実を裏付けている。
一方、O－SPION粒子の場合、ヒドロキシル基に対応する振動特性はほとんど存在せず、FTIRスペクトルは、粒子の表面を覆うオレイン酸分子の振動モードによって支配され、それを有機溶媒に分散可能なものにしている。これは、それぞれほぼ1519cm－1および1408cm－1の非対称および対称－COO伸縮モードとともに、ほぼ2920cm－1および2851cm－1における－CH2－伸縮モードから反映される。オレイン酸の－COO基とSPION表面との相互作用のモードは、Δν－ COO(111cm－1)バンドに基づいてさらに解明でき、これは、オレイン酸分子の－COO基が二座および/または架橋配位を介してナノ粒子表面に結合するという事実の裏付けである。さらに、このオレイン酸分子は、1701cm－1で観察された遊離カルボン酸塩の特徴から明らかなように、ナノ粒子表面上に二層構造を形成している。
実際、O－SPION粒子のFTIRスペクトルをAO－SPION粒子のFTIRスペクトルと比較すると、後者はO－SPIONの水へのTEA支援相間移動から得られたものであり、2つのFTIRスペクトルはほとんど変化していない。例えば、AO－SPION粒子の場合、2923および2847cm－1の－CH2伸縮振動および1522および1405cm－1の－COO振動の出現から明らかなように、オレイン酸分子は粒子表面に化学吸着されたままである。観察された117cm－1のΔν－ COOは、O－SPION粒子の場合のように、オレイン酸が二座および/または架橋配位を介して粒子表面に結合したままであるということも支持する。
さらに、AO－SPION粒子の場合の遊離オレイン酸のC=O伸縮に関連するバンドの存在は、オレイン酸が相移動後にその二層構造を維持するということを支持し、TEA分子と粒子表面との相互作用が粒子表面からオレイン酸を除去するのに十分に強くないということを示唆している。
もう1つの注目すべき観察結果は、TEA－媒介相間移動AO－SPION粒子では、粒子表面のヒドロキシル基の数が顕著に増加しないということである。これは、TEA分子の両親媒性が、この第三級アミンの炭化水素鎖が疎水性相互作用を介してオレイン酸の長鎖と相互作用することを許容するが、その末端アミン基が粒子に水分散性を提供することを示している。
ナノ粒子表面へのリガンド結合の性質をさらに理解するために、SPIONの熱重量分析(TGA)－微分熱重量分析(DTG)分析を行った(図14(b)－(c))。
ナノ粒子表面から観察される熱による重量損失は、3つの領域に分類し得る：領域Iは、吸着した水分または表面ヒドロキシルの除去による重量損失を表し；領域IIは、緩く結合した/物理吸着したリガンドによる重量損失を表し；領域IIIは、強く結合した化学吸着種を広く示す。それぞれの重量損失値を表3に記録する。
Figure 0007377821000005
重要な観察結果の1つは、A－SPION粒子が、他の2つのSPION粒子(O－SPIONおよびAO－SPIONの両方について22.7%)と比較して、全温度範囲で加熱した場合に重量損失が顕著に少ない(～2.6%)ことである。これは、オレイン酸を含まずTEAのみを含むA－SPION粒子の合成時に、その後者は非常に大きな分子であり、したがってO－SPIONおよびAO－SPIONの場合、全体的に高い熱誘導の重量損失をもたらすと予想される。第二に、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子の重量損失プロフィールはほぼ類似しており、相間移動中にTEA分子がオレイン酸分子とリガンド交換を受けないというFTIRの結果を検証する。このように、A－SPION粒子の場合、領域IIおよび領域IIIで観察された無視できる重量損失は、表面に結合したTEA分子の熱分解に起因する。
O－SPION粒子およびAO－SPION粒子のTGA－DTGプロフィールについてさらに説明する前に、純粋なオレイン酸は通常、ほぼ250℃で一段階の熱分解を示し、いずれかの表面に対するその結合はこの熱劣化温度を高めると予想される。
遊離オレイン酸とは対照的に、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子の場合には、関心のある領域で徐々の二段階の重量損失の傾向が観察され、領域IIの最初の重量損失はこれらのSPIONの表面に物理吸着したオレイン酸分子の分解と、それに続く、オレイン酸の炭化水素鎖間の疎水性相互作用によって二重層を形成する、強く化学吸着したオレイン酸分子の損失に対応する領域IIIの損失によるものとし得る。
これらのSPIONにおける表面リガンドとしてのTEAの役割についてさらに洞察を得るために、これらの材料は、被写界深度がわずか数ナノメートルの表面感度の高い手法であるXPSを使用して分析した。
具体的には、図15は、パスBにより製造したA－SPION粒子、およびパスCにより製造したO－SPION粒子およびAO－SPION粒子のコアレベルX線光電子分光法(XPS)スペクトルを提供する。
すべての3つのSPIONのXPS分析は、それぞれ、ほぼ711.1eVおよび724.5eV(より高い結合エネルギー(BE)のサテライトピークを伴う)のFeの2p3/2およびFeの2p1/2コアレベルの結合エネルギー(BE)を明らかにした。これらの特徴は、マグヘマイト中のFe3に典型的なものであり、SPIONの相純度を確認している。さらに、N 1sコアレベルの分析により、399.7eVのBEを有するA－SPIONおよびAO－SPION粒子にのみTEAが存在することが明らかになったが、O－SPION粒子ではN 1s信号は観察されなかった。これは、水へのTEAを介した相間移動中にO－SPION粒子を水分散性にしてAO－SPION粒子を形成する際のTEA分子の関与を支持する。
方法の相間移動ステップの品質を理解するために、A－SPIONおよびAO－SPION粒子については水中で測定し、O－SPION粒子についてはヘキサン中で測定した場合の、動的光散乱(DLS)測定(図14（d）)を使用して異なるSPION粒子の流体力学的径を分析した。
ここで、合成されたままのA－SPIONおよびO－SPION粒子は、それぞれ8.5nmおよび7nmの平均流体力学的径が明らかになった。しかし、O－SPION粒子と比較して、A－SPION粒子はより広い粒子サイズ分布を示し、有機溶媒中でのこれらのマグヘマイトナノ粒子のTEA－媒介合成がより望ましいことを示唆している。有機溶媒中での鉄酸化物ナノ粒子の合成は、水性溶媒で得られるものと比較してより高品質の結晶を提供することがよく知られているため、この観察は驚くべきことではない。今回の場合では、O－SPION粒子を有機溶媒中で合成した後に動的相移動剤として作用するTEA分子の能力は、水性媒体中に高品質の最終生成物を得る明らかな利点を提供する。これは、O－SPION粒子とAO－SPION粒子とのDLSスペクトルの比較から明らかであり、水相に移動したSPION粒子が、8.5nmの平均流体力学的径と低い多分散性を保持していることを示唆している。さらに、水相中のSPION粒子のゼータ電位測定により、A－SPIONおよびAO－SPION粒子でそれぞれ－32mVおよび－46mVの値が明らかになり、有機媒体中で合成されたマグヘマイトナノ粒子が水相間移動後に安定したコロイド懸濁液を形成するという知見を支持している。
A－SPION粒子の場合、負の表面電荷は表面のヒドロキシル基から生じるのに対し、AO－SPION粒子で観察される負の表面電荷は、カルボニル基、トリエチルアミン、水分子が関与する水素－結合環境中の表面に存在する遊離の－COO基から生じると考えられる。
これらのSPION粒子の生物学的適用性については、粒子が生理学的条件下でコロイド安定性を保持し、塩や生体分子の存在下で凝集しないことが重要である。通常、塩および生体分子はナノ粒子の表面の電荷を中和する可能性があり、したがってそれらの存在はナノ粒子の凝集を引き起こし、それらの全体的な特性に影響を与える可能性がある。これらの条件でのコロイドの安定性は、合成および相間移動戦略に大きく依存し、高い安定性は潜在的な生物医学的用途にとって重要である。
ここで、O－SPION粒子は水分散性ではなく、A－SPION粒子は比較的広いサイズ分布を示すため、粒子サイズ分布が狭いAO－SPION粒子のみを生物学的に適切な条件下で安定性試験に付した。これには、AO－SPION粒子のDLSプロフィールの、生理学的浸透圧を模倣するリン酸バッファー生理食塩水(1XPBS)と、1XPBSと10%ウシ胎児血清(1XPBS 10%v/v FBS)は、生物学的流体存在する血清タンパク質を表し生物学的流体(図14E))を含む混合物に個別に曝露した後の研究が含まれる。流体力学的サイズは、溶液中の粒子の有効な水和サイズに関する情報を提供する。粒子の凝集が発生した場合、これにより、流体力学的サイズが大幅に広がり、それに伴って増加する。対照的に、周囲の溶液中の生体分子が粒子と相互作用して生体分子コロナを形成する場合、これは流体力学的サイズのわずかな増加として現れる。
図14（e）から明らかなように、水中に分散したAO－SPION粒子の平均流体力学的径（8.5nm）は、1XPBSの存在下では大きく変化しない(8.9nm)が、追加のFBSの存在下ではわずかに増加する。(10.6nm)。しかしながらFBSの存在が粒度分布に有意に影響を与えないことは注目に値し、そのため、この流体力学的径の増加は粒子表面上の血清タンパク質コロナの形成に帰結し得る。これらの結果は、方法のTEA－媒介相間移動ステップの後に生成されるAO－SPION粒子の高い安定性を明確に示しており、生物医学的用途でのこのAO－SPION粒子の潜在的な使用を支持する。
次に、A－SPION粒子、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子の磁気特性を、温度依存(M－T)および磁場依存(M－H)の磁化曲線を測定することにより調べた。
図16は、パスBにより製造したA－SPION、およびパスCにより生成したO－SPION粒子およびAO－SPION粒子の磁気特性を示す、温度依存(M－T)(a1－a3)および磁場依存(M－H)(b1－b3)の磁化曲線を提供する。
図16に示すように、3つのケースすべてで、M－T曲線は、FC(冷却した磁場)磁化と比較した場合に、ZFC(冷却したゼロフィールド)磁化が温度の上昇とともに単調に増加することを示している(図16A)。これらすべての場合において、ZFC曲線とFC曲線は室温(ブロッキング温度－Tb)以上で重なるかまたは上であり、このSPION粒子の室温の超常磁性を支持している。
超常磁性挙動は、300Kの場合と比較して低温(4K)でより高い飽和磁化(Ms)を示すM－H曲線からも明らかである(図16(b)および表4)。
Figure 0007377821000006
A－SPION粒子、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子は、それぞれ78.7、50.2および59.3emu/gの室温Ms値を示した。高いMs値は高い緩和能に対応し、MRIから温熱療法に至るまでのさまざまな生物医学的用途に適している。そのため、現在のケースで得られた値は、マグヘマイトナノ粒子で通常観察されるバルク飽和磁化の上限にある。A－SPION粒子の表面にはかさばるオレイン酸分子がないため、O－SPION粒子およびAO－SPION粒子に比べてA－SPION粒子からは高いMsが予想される。もう1つの注目すべき治験は、O－SPION粒子が相間移動されて水に移行すると、AO－SPIONのMsが約20%増加することである(表4)。
FTIR、TGA－DTGおよびXPSのデータがリガンド交換メカニズムを支持しなかったことを考慮すると、飽和磁化のこの増加は、粒子サイズが小さくなると効果がより顕著になる表面スピン傾斜や反フェリ磁性交換相互作用のフラストレーションなど、他の多くの要因に起因する可能性がある。
ハイパーサーミア（Hyperthermia）
水性媒体と非水性媒体の両方で同じ組成および粒子サイズ分布を有する同様のナノ粒子がそれらの温熱性能について評価された研究はこれまでほとんど行われていない。SPION粒子の電界依存加熱能力を評価する際に周囲の媒体が大きな役割を果たすため、これはかなり重要なパラメータである。
ここで報告するTEAを介した合成および相間移動プロトコールにより、高周波(RF)－誘導加熱の熱感受性としてのこのSPION粒子の特性を評価することにより、この直接的な比較が可能になる。
潜在的な温熱療法へのこのSPIONの加熱能力を調べるために、磁場の不均一性の効果を最小限に抑えるために固定の鉄当量濃度を選択し、図17(a)に示す設定を使用して測定を行った。
簡単に説明すると、図17(a)は、パスBにより生成したA－SPION粒子、およパスCにより生成したO－SPION粒子およびAO－SPION粒子の温熱反応の試験に使用する磁気ハイパーサーミアユニットの概略図を示す。
具体的には、図17(a)に示すように、磁気ハイパーサーミアユニットには、(1)1秒の分解能で温度変化を記録するコンピューター、(2)温度ベースコントローラー、(3)光ファイバーベースの温度計、(4)サンプルホルダー、(5)交流発電機(400キロヘルツ)に結合した水冷式の2の銅リング、および(6)示したネール(τB)およびブラウン(τB)緩和を有する代表的なSPIONを含む。
図17Bは、分散媒体[A－SPIONおよびAO－SPIONの場合は水、O－SPIONの場合はトルエン]の温度変化から評価した、400kHzの固定AC磁界への曝露時間の関数としての、パスBにより生成したA－SPION粒子、およびパスCにより生成したO－SPION粒子およびAO－SPION粒子の磁気ハイパーサーミア応答のプロットを示す。
温熱測定では、A－SPIONおよびAO－SPION粒子を直接水に懸濁し、O－SPION粒子は溶媒が110.6℃の高沸点を与えるためトルエンに懸濁して高体温測定を行った。外部温度勾配の影響を取り除くために、2ターンの銅コイル(5)を循環冷水で冷却し、サンプルを厚いポリスチレンフォーム断熱材で覆ったプラスチック製バイアルの形でのサンプルホルダー(4)に入れて、断熱状態に近い状態を達成した。RFソース(周波数400または200kHz、フィールド振幅10kA.m－1)で切り替えた後、温度計(3)を使用して1秒ごとに合計300秒の温度を記録した。
生物学的温熱療法に関連する現在の実験を維持するために、RFパラメータを、生物学的に安全であると考えられる400kHz以下に選択した。400kHzでは、深さ15cmの組織への電界浸透は99%以上であるが、渦電流による周囲の水や組織のバックグラウンドの非特異的加熱は、350～400kHzの周波数範囲では重要でないままである。インビボ実験はまた、振幅が37.3kA.m－1の500kHzのAC磁場が磁気ハイパーサーミアの間に動物に健康への悪影響を引き起こさないことを示した。これらの以前の観察は、我々のRFパラメータが生物医学的温熱療法の安全な操作限界に関連性があることを示唆している。
400kHzでの異なるSPIONの時間依存温度上昇プロフィールの線形回帰分析から得られる比吸収率(SAR)は、A－SPION粒子で96.9W.g－1、O－SPION粒子で65.3W.g－1のSAR値を明らかにし(図17(b))、その計算については次の「材料と方法」のセクションで詳しく説明し、さまざまな条件下での比吸収率(SAR)を表5にまとめる。
Figure 0007377821000007
A－SPION粒子のこの約50%高いSAR値は、これらの材料の相対飽和磁化と一致しており、この場合、A－SPION粒子はO－SPION粒子よりも約50%高いMsを示した。興味深いことに、O－SPION粒子が水に相移動すると、得られるAO－SPION粒子のSAR値は45%向上して139.9W.g－1になる。この顕著なSARの向上は、磁場－誘導加熱の原因となる2の主要な要因に基づいて理解し得る。これらには、(i)SPIONの固有の磁化の向きの変化を含むネール(Nτ)緩和、および(ii)印加された磁場下での周囲の分散媒に対するSPIONの回転を含むブラウン緩和(τB)が含まれる。O－SPION及びAO－SPION粒子の無機成分(組成、結晶構造、サイズ、多分散性)は正確に同じであるため、磁気ハイパーサーミアに対するネール(Nτ)緩和の寄与は両方の場合に同等と安全に考え得る。したがって、それは、相間移動AO－SPION粒子のSAR値の向上に重要な役割を果たしているようにみえるブラウン緩和(τB)の性質の変化である。より低い周波数(200kHz)におけるさらなるSAR測定により、SAR値の約50%の減少が明らかになり(表5)、これはSARと印加周波数との間の線形関係を考慮すると予想される。
また、AO－SPION粒子は、さまざまな生理学的関連条件下で狭い粒子サイズ分布と高い安定性を示すため(図14(e))、水に分散したAO－SPION粒子のSAR活性を1XPBSまたは10%FBSと一緒の1XPBSのいずれかに分散した後のものと比較した(図17(c))。これらの粒子のSAR活性はわずかに低下しただけであり、高いSAR活性を示し続けており、これは、塩と血清の存在下でのこれらの相間移動した粒子の高い安定性に起因し得る。
全体として、これらの観察は、高品質の鉄酸化物を水相に移動するのに用いた適切な相間移動プロトコールの重要性を反映している。このように、この場合、TEAは動的リガンドとして機能し、水性溶媒と有機溶媒の両方で鉄酸化物ナノ結晶の直接的な合成を可能とするだけでなく、最終生成物がハイパーサーミア適用に適切であることを保証しながら、有機媒体で合成されたナノ粒子の水性媒体への相間移動を促進する。
本発明の様々な実施形態は、水性環境および有機環境の両方で容易に分散し得る疎水性リガンドおよびトリエチルアミンリガンドの両方でキャップされたマグヘマイト相のナノ超常磁性鉄酸化物ナノ結晶を生成するための動的分子としてのトリエチルアミンの使用に依存する。特に、トリエチルアミンは、疎水性オレイン酸でキャップされたSPION粒子(O－SPION)の非水相から水相への単一のステップでの相間移動を促進することを観察した。この新しい相間移動プロトコールは、迅速かつ高効率であるだけでなく、オレイン酸およびトリエチルアミン分子の両方でキャップされた得られたSPION粒子(AO－SPION)の磁気特性が水相への移動後に改善することも明らかである。既存の相間移動プロトコールは、通常、このようなO－SPIONの磁気特性を劣化させるため、これは稀なケースである。
これらの相間移動したAO－SPION粒子は、磁気ハイパーサーミアにおける概念実証を証明するために利用できる優れた磁気特性を示す。この実験で報告する材料は生物医学的用途に使用し得そうであるが、さまざまな用途向けのユニークな両親媒性第三級分子としてのTEA分子の多様性を強調することは重要である。
磁気ハイパーサーミアに加えて、容易に水性の分散可能なAO－SPION粒子は、これらのSPIONの磁気特性に依存する他の用途での使用が見出されると予想される。例えば、そのような磁気媒介用途には、磁気標識、磁気分離、磁気指向ターゲティング、磁気共鳴画像法、磁気粒子イメージング、および磁気誘導加熱が含まれ得るが、これらに限定されない。
材料および方法(パスBおよびパスCの場合)
材料:塩化鉄(III)六水和物(FeCl3・6H2O)、塩化鉄(II)四水和物(のFeCl2・4H2O)、オレイン酸(純度90%)、トルエン、トリエチルアミン(純度99%)、リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)、ウシ胎児血清(FBS)、アセトン、メタノールはすべてSigma－Aldrichから購入し、受け取ったままの状態で使用した。脱イオンMilli－Q水をすべての実験で使用した。
ナノ粒子合成:A－SPION合成－第二鉄イオン(0.2M Fe3＋)および第一鉄イオン(0.1M Fe2＋)イオンを2:1のモル比で含む40mLの水溶液を、周囲環境下、80℃のオイルバスで5分間撹拌した。これに続いて、溶液に5mLのTEAを迅速に注入し、鉄前駆体を加水分解して鉄酸化物ナノ粒子を形成できるようにした。次に、反応生成物を、磁気撹拌を伴って、周囲条件下で1時間にわたって冷却させた。得られたナノ粒子を、磁気分離によりアセトン:メタノール(1:1)溶液で5回洗浄し、残留溶媒を60℃のオーブンで一晩蒸発させた。
O－SPION合成－合成プロトコールは、TEAを第二鉄(Fe3＋)および第一鉄(Fe2＋)イオンを含む水溶液に注入する前に、0.5mLのオレイン酸を含む5mLのアセトン溶液を鉄前駆体に加え、2分間撹拌する以外は、A－SPIONとほぼ同じである。
ナノ粒子相間移動:AO－SPION合成－前節で述べたアプローチで合成したO－SPIONを出発物質として供した。0.1gのO－SPION粉末に1mLのTEAを加え、標準的なベンチトップソニケーター(Unisonics FXP4M、動作電力40W)を使用して1分間超音波処理した。
過剰なTEAおよびオレイン酸リガンドは、過剰な水の存在下で、12kDaのカットオフ透析膜を使用し、4回水を交換して24時間透析することにより除去した。適切な量の水を加えて、事前に定義したナノ粒子濃度の水分散性AO－SPION粒子を調製し得る。
材料特性評価:粒子サイズおよびサイズ分布は、100kVで動作するJEOL 1010 TEM装置を使用して得た透過型電子顕微鏡(TEM)画像から評価した。TEMは、ナノ粒子の対応する選択領域の電子回折(SAED)パターンを取得するためにも使用した。高分解能TEM(HRTEM)画像は、80kVで動作するJEOL 2100F顕微鏡を使用して得た。
Pyris 1 TGA装置(Perkin－Elmer、Inc.)を使用して、不活性(N2)雰囲気下、30～600℃の温度範囲で5℃/minのランピン速度の熱重量分析(TGA－DTG)を行い、オレイン酸コーティングの程度を定量化した。
X線回折(XRD)およびフーリエ変換赤外分光法(FTIR)の実験を行い、ナノ粒子表面の鉄酸化物相および表面化学を決定した。XRDパターンは、Bruker AXS D4エンデバー広角X線回折装置を使用して、室温でCuKα放射線(λ:1.5406オングストローム)を使用して記録した。
ナノ粒子のFTIRスペクトルは、Perkin Elmerスペクトル100分光計を使用して、4000～400cm－1の範囲で4cm－1の分解能で収集した。示すすべてのスペクトルは、256回スキャンの平均である。
X線光電子分光法(XPS)の場合、100nmの熱蒸着Au薄膜でコーティングされたSi基板上にサンプルをドロップキャストしてサンプルを調製し、1×10－9トル(1トル＝1.333×102Pa)よりも良好な圧力で、AlKαX－線源γ線源(1486.7eV)を使用したThermo Scientific K－AlphaXPS装置を使用して測定を行った。一般的なスキャンおよびC1S、鉄2Pに、Siの2p、O1sと、サンプルのためのN1Sコアレベルのスペクトルは20eVでのパスエネルギーおよび90°の電子離陸角度で非単色MgKα線(1253.6 eVの光子エネルギー)で記録した。XPS測定の全体的な分解能は0.1eVとした。コアレベルのスペクトルは、シャーリーアルゴリズムを使用してバックグラウンド補正し、化学的に異なる種は、標準のガウス－ローレンツ関数を使用して解像した。
コアレベルの結合エネルギー(BE)は、285eVの偶発的な炭素結合エネルギーと一致した。ナノ粒子の流体力学的サイズは、Malvern Zetasizerを使用した動的光散乱(DLS)測定から得た。
超伝導量子干渉デバイス(SQUID)磁力計MPMS－XL(Quantum Design、USA)を使用して、磁気特性を特性評価した。ゼロ磁場冷却(ZFC)測定では、外部磁場がない状態でサンプルを4Kで冷却した。次に、100 Oeの磁場を印加し、温度を上昇しながら磁化を測定した。界磁冷却(FC)測定では、100Oeの磁場の存在下でサンプルを4Kで冷却した後、温度を上昇させながら磁化を測定した。磁場に依存する磁化は、300K、100K、および4Kで測定した。測定した磁化は、鉄酸化物の正味質量に関して正規化した。すなわち、界面活性剤の重量を推定した(TGA－DTGによって決定)。
ハイパーサーミア測定:ナノ粒子の加熱特性は、公称出力2.5kWの400kHzジェネレーターを使用して、300秒の範囲内で測定し、時間に対する温度の上昇を測定した。ブラウン緩和(τB)およびネール緩和(Nτ)の機構を介した交流磁場下で熱を放散するナノ粒子の能力は、以下の式を使用した特定の吸収率(SAR)の観点で測定した：
Figure 0007377821000008
 式中、ΔTは温度の変化であり、Δtは時間の変化であり、ΔT/Δtは温度上昇曲線の直線セクションから評価される、酸化鉄ナノ粒子のコロイド分散の加熱速度であり；wNPは、サンプル中の鉄酸化物ナノ粒子の質量分率であり；cpは、調べた温度範囲での比熱容量の平均値である。
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定義
温度範囲、時間範囲、または濃度範囲などの範囲が本明細書に示されている場合は、常に、すべての中間範囲およびサブ範囲、ならびに与えられた範囲に含まれるすべての個々の値が本開示に含まれることを意図する。本明細書の説明に含まれる範囲またはサブ範囲内の任意のサブ範囲または個々の値は、本明細書の特許請求の範囲から除外し得ることが理解される。
本明細書に定義および使用するすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書内の定義、および/または定義された用語の通常の意味を制御するように理解される。
本願の全体を通して、「約」という用語は、値がデバイスの誤差の固有の変動、値を決定するために使用される方法、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用する。
本明細書中で使用する不定冠詞は、「a」および「an」は、明確に反対に示さない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解される。
本明細書中で使用する「および/または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解される。「および/または」で列挙される複数の要素は、同様に解釈あれ、すなわち、そのように結合された要素の「1つ以上」である。「および/または」節によって具体的に同定される要素以外の他の要素は、具体的に同定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」という言及は、1つの実施形態では、「～を含む」などのオープンーエンドの言語と組み合わせて使用される場合、Aのみ(任意にB以外の要素を含む)を示すことができ；もう1つの実施形態において、Bのみ(任意にA以外の要素を含む)を示すことができ；さらに別の実施形態では、AおよびBの両方に対して(任意に他の要素を含む)、などをいうことができる。
本明細書で使用する「混合物」という用語は、一緒に均一に混合される成分(例えば、相、部分、溶媒、溶質、分子など)を有する溶液だけでなく、以下の組み合わせも含むと理解される。組み合わせた場合に必ずしも均一、均一、または規則的に分布しているとは限らない成分または材料(例えば、成分の不均一に混合された組み合わせ、非混和性成分の分離層、不均一に分布した懸濁液など)。
そのような「内側」、「外側」、「下側」、「下」、「低い」、「上」、「上方」など、空間的に相対的な用語は、または、図に示されているように、別の要素または特徴の関係を説明するための容易な記載のために本明細書で使用し得る。空間的に相対的な用語は、図に示す方向に加えて、使用中または操作中のデバイスさまざまな方向を包含することを意図する場合がある。
本発明を限られた数の実施形態と併せて説明してきたが、当業者であれば、前述の説明に照らして多くの代替、修正、および変形が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された本発明の精神および範囲内に入る可能性があるすべてのそのような代替、修正、および変形を包含することを意図する。
本明細書(特許請求の範囲を含む)において「含む」、「含む」、「含まれる」または「含んでなる」という用語が使用される場合、それらは、記載された特徴、整数、ステップまたは成分の存在を指定するものとして解釈されるべきであるが、1つまたは複数の他の機能、整数、ステップまたは要素、またはそれらの群の存在を排除するものではない。
本出願は、1つまたは複数の将来の出願に関する基礎または優先順位として使用でき、そのような将来の出願の請求項は、本出願に記載されている任意の1つの特徴または特徴の組み合わせに向けることができる。そのような将来の出願には、以下の請求項の1つまたは複数が含まれる場合がある。これらは、例として示され、将来の出願で請求される可能性のあるものに関して非限定的である。

Claims (12)

  1. 表面上がオレイン酸リガンドおよびトリエチルアミンリガンドでキャップされた鉄酸化物粒子の水性分散液を調製するための方法であって:
    表面上がオレイン酸リガンドでキャップされた複数の鉄酸化物粒子を含む有機分散液をトリエチルアミンおよび水の組み合わせと接触させて二相混合物を形成し、ついで、前記二相混合物を攪拌して表面上がオレイン酸リガンドおよびトリエチルアミンリガンドでキャップされた鉄酸化物粒子の水性分散物を生成することを含む、方法。
  2. 二相混合物を5分を超えて超音波処理することによって二相混合物を攪拌する、請求項1に記載の方法。
  3. 相間移動ステップの前に、溶媒中にトリエチルアミンを溶解してトリエチルアミンの溶液を形成するステップをさらに含み、溶媒が、ヘキサン、トルエン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される無極性溶媒であり、または溶媒が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、エーテル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される極性溶媒である請求項1に記載の方法。
  4. 物理的分離手順を使用して、表面上のオレイン酸リガンドおよびトリエチルアミンリガンドでキャップされた鉄酸化物粒子を水性分散液から分離するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  5. オレイン酸リガンドおよびトリエチルアミンリガンドでキャップされた鉄酸化物粒子が、二相混合物を1000×gを超えて2分を超えて遠心分離することによって二相混合物から分離される、請求項1に記載の方法。
  6. 相間移動ステップの前に:
    鉄(III)イオンおよび鉄(II)イオンの水溶液を、有機溶媒に溶解したトリエチルアミンおよびオレイン酸と接触させて、鉄(III)イオンおよび鉄(II)イオンの加水分解を促進して、表面上がオレイン酸リガンドでキャップされた鉄酸化物粒子の有機分散液を生成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  7. 鉄(III)イオンおよび鉄(II)イオンが2:1のモル比で水溶液中に存在する、請求項6に記載の方法。
  8. 有機溶媒が水溶液と混和性であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
  9. 有機溶媒がアセトンであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
  10. 疎水性リガンドが、アルカン酸、飽和または不飽和脂肪酸、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  11. 鉄酸化物粒子がマグヘマイト(γ－Fe2O3)および/またはマグネタイト(Fe3O4)である、請求項１に記載の方法。
  12. 磁気ハイパーサーミアの治療、磁気標識、磁気分離、磁気共鳴イメージング、磁気粒子イメージング、磁気－指向性ターゲティングおよび磁気－誘導加熱からなる群から選択される磁気媒介プロセスにおける磁気粒子としての、請求項1に記載の方法に従って生成された表面がオレイン酸リガンドおよびトリエチレンアミンリガンドでキャップされた鉄酸化物粒子の水性分散液の使用。
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