JP7376065B2 - コーヒーチェリー素材 - Google Patents
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Description
(1-1) 動物
日本チャールズリバー株式会社から購入したICRマウスを標準飼料「MF粉末」(日本チャールズリバー株式会社)で自家繁殖し、各種の試験に用いた。
(1-2) 被験物質
コーヒーチェリーからコーヒー豆に用いる種子部分を採取した後の残渣を乾燥粉末化してなる、コーヒーチェリー残渣粉末を、住友食品株式会社から入手し、各種の試験に用いた。なお、入手した被験物質は常温で2年間保管したものである。
(2-1) 飼育条件
8週齢の雄ICRマウスを使用し、被験物質を投与する投与群と、被験物質を投与しないコントロール群とに分けた。投与群では、コーヒーチェリー残渣粉末を標準飼料粉末中に混合し、粉末給餌器を用いて投与した。各群マウスは、室温23-25℃、光周期12L:12D(午前7時に点灯)で飼育した。
(2-2) 暑熱ストレス負荷
被験物質の投与開始から7日目に、マウスに暑熱ストレス負荷を与えた。具体的には、麻酔後に体下半分を41℃もしくは42℃のお湯に15-20分間暴露した。暑熱ストレス負荷を与えない非処理群では、麻酔後、室温で静置した。
実験結果は、平均値±SE(Standard error)で示した。2群間のデータはT検定を用いて有意差検定を行った。また、3群間以上のデータはHolm検定を用いて有意差検定を行い、P<0.05のときに有意な差があると判断した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群と(以下、単に「C」で表わす場合がある。)、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷した暑熱ストレス群(以下、単に「H」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ30mg/kg体重(以下、単に「30」で表わす場合がある。)、100mg/kg体重(以下、単に「100」で表わす場合がある。)、又は300mg/kg体重(以下、単に「300」で表わす場合がある。)の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与し、暑熱ストレスの負荷を実施した後、更に2日間投与を継続した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC / heat」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control / RT」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷した暑熱ストレス群(以下、単に「Control / Heat」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ300mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与し、暑熱ストレスの負荷を実施した後、更に2日間投与を継続した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ300mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与した。
マウスから摘出した精巣は-80℃で保存した。氷上で融解後にRNA抽出用試薬「Isogen II」(株式会社ニッポンジーン)を精巣一個あたり800μL加え、ホモジナイズした。精巣溶液を遠心(12,000rpm,15min,4℃)し上清を回収した。上清と同量のイソプロパノールを加えて混合した後、10分間静置し、遠心後(12,000rpm,10min,4℃)に沈殿を得た。70%エタノール/DEPC water を加えて遠心洗浄(7,500rpm,5min,4℃)した。DEPC waterを用いて溶解しRNA溶液を得た。
RNA1μgを65℃で5分間熱変性させ、cDNA合成用の「ReverTra Ace qPCR kit」(東洋紡株式会社)を使用し、キット付属のプロトコールに従って、逆転写反応を行った。調製したcDNA溶液は、Tris-EDTAで濃度を16ng/μLに調整した。
定量的PCR用の「KAPA SYBR Fast qPCR kit」(Kapa Biosystems)を使用し、キット付属のプロトコールに従って、cDNA溶液と、表1に示す各種特異的なプライマーと共にPCR装置(「7300real-time PCR system」、Thermo Fisher Scientific. Tokyo, Japan)に供し、内部標準は18S rRNAを使用して、mRNAの発現量を測定した。PCRの条件としては、50℃で2分間、95℃で15秒間反応後、95℃で15秒間と、60-65℃で30-60秒間の2工程を40サイクル繰り返した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ300mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与した。
マウスから摘出した精巣を2mLエッペンに回収し、-80℃で保存した。RIPA Buffer(10% Glycerol、3 μg/mL Antipain、100 mM NaF、150 mM NaCl、0.25% Sodium Cholate、0.01% Digitonin、0.1% SDS、200 μM PMSF、1 mM EDTA、1 mM Na3VO4, 50 mM Tris-HCl pH7.6)を800μL加えて氷上でホモジナイズし、13,200rpm、4℃の条件で10分間遠?を行った。上清を1.5mLエッペンに回収し、RIPA Bufferにて4倍希釈したものを、以下の活性測定に用いた。
用意したエッペンに1×TEを5μLと、10 mM H2O2を85μL加え、37℃で2分間反応させた。その後、上記ライゼートを10μL加え、吸光度計を?いて240nmの吸光度を測定した。測定は30秒間隔で300秒間行い、吸光度の経時的変化を測定した。ブランクには1×TEを50μLと脱イオン蒸留水(DDW)950μLを混合したものを?いた。対照としては、上記ライゼートの代わりにRIPA Bufferを10μL加えて測定した。各サンプルのタンパク量あたりの吸光度の変化量を算出し、その値を酵素活性とした。
用意したエッペンに1×TEを25μL、脱イオン蒸留水(DDW)を145μL加えた。測定を?うエッペンに0.1 M Glutathone (GSH) の5μL、10 units/ml Glutathione reductase (GR) の25μL、2 mM NADPHの25μLをそれぞれ加え、37℃で2分間反応させた。その後 7 mM t-BuOOHを5μL、上記ライゼートを25μL加え、吸光度計を?いて340nmの吸光度を測定した。測定は30秒間隔で300秒間行い、吸光度の経時的変化を測定した。ブランクには1×TEを100μLと、10 units/ml GR の100μLと、0.1 M GSH の20μLと、脱イオン蒸留水(DDW)780μLを混合したものを?いた。対照としては、上記ライゼートの代わりにRIPA Bufferを25μL加えて測定した。各サンプルのタンパク量あたりの吸光度の変化量を算出し、その値を酵素活性とした。
用意したエッペンに50 mM Potassium Phosphate Buffer(PH7.0)を840μL、1 mM EDTAを10μL、0.1% BSAを10μL加えた。測定を行うエッペンに1 mM Glutathione disulfide (GSSG)を20μL、1 mM NADPHを100μL加え、28℃で5分間反応させた。その後、上記ライゼートを20μL加え、吸光度計を?いて340nmの吸光度を測定した。測定は30秒間隔で300秒間行い、吸光度の経時的変化を測定した。ブランクには50 mM Potassium Phosphate Buffer(pH7.0)を840μL、1 mM EDTAを10μL、0.1% BSAを10μL、1 mM GSSGを20μL、脱イオン蒸留水(DDW)を120μL加えたものを用いた。対照としては、上記ライゼートの代わりにRIPA Bufferを20μL加えて測定した。各サンプルのタンパク量あたりの吸光度の変化量を算出し、その値を酵素活性とした。
SOD activity assay kit (Dojindo)を用いて測定を行った。上記ライゼートは4倍希釈したものに加え、RIPA Bufferにて10倍及び100倍希釈したものを作成した。96 wellプレートの各ウェルに、上記ライゼート20μL、WST working solutionを200μL、Enzyme working solutionを20μL加え、37℃で20分間反応させた後、450nmの吸光度を測定した。ブランクは3つ作成し、ブランク1とブランク3には上記ライゼートの代わりに超純水を、ブランク2とブランク3にはEnzyme working solutionの代わりにDilution bufferをそれぞれ20μLずつ加えた。測定後、阻害率50%の希釈倍率を算出した。その後、タンパク量あたりに換算し、その値を酵素活性とした。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC / Heat」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control / RT」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷した暑熱ストレス群(以下、単に「Control / Heat」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ200mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与し、暑熱ストレスの負荷を実施した後、更に24時間投与を継続した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC / Heat」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control / RT」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷した暑熱ストレス群(以下、単に「Control / Heat」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ300mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与し、暑熱ストレスの負荷を実施した後、更に28日間投与を継続した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与した投与群(以下、単に「CC」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与しないコントロール群(以下、単に「Control」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ200mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷した暑熱ストレス群(以下、単に「Heat」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ200mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与し、暑熱ストレスの負荷を実施した後、更に24時間投与を継続した。
過排卵処理を行うため、性成熟した雌ICRマウスに5 IU妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)を腹腔投与した。投与から48時間後に、5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を腹腔投与し、過排卵を誘発させた。投与から15時間後に雌ICRマウスの卵管膨大部を摘出し、3 mg/ml BSAを含んだHTF medium(Irvine scientific, CA, USA)に入れて静置した。18Gの針で卵管膨大部に1ヶ所切り込みを入れ、貯蓄された排卵卵子を掻き出した。
卵子を採取する1時間前に、受精能獲得のための精子の前培養を行った。具体的には、解剖時に精巣上体尾部を摘出し、3 mg/ml BSAを含んだHTF medium(Irvine scientific, CA, USA)に入れて静置した。18Gの針で精巣上体尾部の1ヵ所に切り込みを入れ、貯蔵された成熟精子を掻き出した。37℃、5%CO2条件下で30分間培養後、精子運動解析システム(SMAS: Sperm Motility Analysis System)(ディテクト, Tokyo, Japan)を使用して、精子濃度を確認した。
培養した受精卵をmHTF medium(3 mg/ml, 1mM glutamine, 0.1mM EDTA)に移した。37℃、5%CO2条件下で5時間培養した。なお、本実験では雄と雌を1対1の組合せにして、実験を行った。
培養した受精卵をmHTF medium(3 mg/BSA, 1 mM Glutamine, 0.1mM EDTA)に移した。37ど、5%CO2条件下で48時間培養後、新たなmHTF mediumに移し、同条件下で更に48時間培養した。受精卵培養から24時間後に2細胞、48時間後に4細胞、96時間後に胚盤胞(Blast)への到達度を、それぞれ顕微鏡下で測定した。
8週齢の雄ICRマウスを用いた動物実験において、被験物質としてコーヒーチェリー残渣粉末を投与して暑熱ストレスを負荷した投与群(以下、単に「CC / Heat」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷しないコントロール群(以下、単に「Control / RT」で表わす場合がある。)と、被験物質を投与せず暑熱ストレスを負荷した暑熱ストレス群(以下、単に「Control / Heat」で表わす場合がある。)とを試験群として設けて、マウスを各試験群に振り分けた。その投与群には、コーヒーチェリー残渣粉末を、一日当たりおよそ300mg/kg体重の摂取量になるように、標準飼料粉末中に混合して7日間投与し、暑熱ストレスの負荷を実施した後、更に25日間投与を継続した。
Claims (5)
- コーヒーチェリーの種子の部分を除いた残渣の全体を乾燥粉末状にしてなる、該コーヒーチェリー残渣粉末を有効成分とすることを特徴とする男性もしくは雄の生殖機能改善用組成物。
- 精巣機能改善用のものである、請求項1記載の組成物。
- 受胎率改善用のものである、請求項1記載の組成物。
- 家畜動物の不妊の予防・改善のためのものである、請求項1記載の組成物。
- 飲食品、飲食品用添加物、医薬品、医薬品用添加物、サプリメント、動物飼料、又は動物飼料用添加物の形態である、請求項1~4のいずれか1つに記載の組成物。
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