JP7367988B2 - 神経変性の疾患または障害のための治療戦略としてのドミナントネガティブsarm1分子 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年10月18日に出願された米国特許仮出願第62/573,967号、および2018年3月16日に出願された米国特許仮出願第62/644,090号の利益を主張し、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成金番号NS087632およびNS091448のもとで政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本開示は、一般に、SARM1活性の阻害に、および/または神経変性もしくは神経性の疾患もしくは障害を治療するのに有用な、様々な組成物および方法に関する。特に、本開示は、遺伝子療法で使用するための、ドミナントネガティブSARM1ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
軸索変性は、末梢神経障害、外傷性脳損傷および神経変性疾患を含めたいくつかの神経障害の顕著な特徴である(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gerdts et al. , SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD(+) destruction. Science 348 2016, pp. 453-457)。パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症では、例えば、軸索変性は、症状の発症および広範な神経細胞の消失に先立つ初期イベントである(Kurowska et al., 2017;Fischer et al., Axonal degeneration in motor neuron disease Neurodegener. Dis. 4 2007 pp. 431 -442;これらの両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
様々な態様の中で、本開示は、軸索変性または軸索障害をともなう多くの神経障害に対する治療介入として使用するためのドミナントネガティブSARM1分子を提供する。
出願ファイルは、カラーで製作された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面をともなう本特許出願公開コピーは、要求し、必要な手数料を支払うことによって特許庁により提供される。
本開示は、一般に、軸索変性に起因する疾患および障害を予防または改善する方法および組成物を提供する。特に、軸索変性または軸索障害をともなう多くの神経障害に対する治療介入として使用するためのドミナントネガティブSARM1分子が本明細書で提供される。
(a)ドミナントネガティブSARM1分子
本開示の一態様は、ドミナントネガティブSARM1ポリペプチドおよびそれをコードする核酸を提供する。本明細書で使用する場合、用語「ドミナントネガティブSARM1分子」は、ドミナントネガティブSARM1ポリペプチドとドミナントネガティブSARM1ポリペプチドをコードする核酸の両方を包含するように使用される。例示的ドミナントネガティブポリペプチドおよびコード核酸は以下に記載される。
本開示は医薬組成物も提供する。医薬組成物は、活性成分としてのドミナントネガティブSARM1、および少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のAAVベクターおよび医薬的に許容可能な(例えば、生理学的に許容可能な)担体を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物を提供する。組成物が本発明のAAVベクターおよび医薬的に許容可能な担体から本質的になる場合、組成物に実質的に影響を及ぼさないさらなる成分(例えば、補助剤、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤など)を含むことができる。組成物が本発明のAAVベクターおよび医薬的に許容可能な担体からなる場合、組成物はいかなるさらなる成分も含まない。本発明の文脈において任意の適切な担体を使用することができ、そのような担体は当技術分野で周知である。担体の選択は、組成物が投与され得る特定の部位および組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。組成物は、本明細書に記載のAAVベクターを除いて、適宜滅菌されてもよい。組成物は、保存のために凍結または凍結乾燥することができ、使用前に適切な滅菌担体中で復元することができる。組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. (2001)に記載されている従来の技法に従って生成することができる。
一実施形態では、賦形剤は希釈剤でもよい。希釈剤は、圧縮性(すなわち、可塑的に変形可能)でもよく、または摩耗脆性(abrasively brittle)でもよい。適切な圧縮性希釈剤の非限定例としては、微結晶セルロース(MCC)、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル(すなわち、アセテートとブチレートの混合エステル)、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トウモロコシデンプン、リン酸化トウモロコシデンプン、アルファ化トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン-ラクトース、デンプン-炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、ショ糖、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マルチトール(malitol)、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリンおよびトレハロースが挙げられる。適切な摩耗脆性希釈剤の非限定例としては、第2リン酸カルシウム(無水または二水和物)、第3リン酸カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムが挙げられる。
別の実施形態では、賦形剤は結合剤でもよい。適切な結合剤としては、限定されないが、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、C12~C18脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
別の実施形態では、賦形剤はフィラーでもよい。適切なフィラーとしては、限定されないが、炭水化物、無機化合物およびポリビニルピロリドンが挙げられる。非限定例として、フィラーは、二塩基性および三塩基性の両方の硫酸カルシウム、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、第2リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、加工デンプン、ラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールでもよい。
さらに別の実施形態では、賦形剤は緩衝剤でもよい。適切な緩衝剤の代表的な例としては、限定されないが、ホスフェート、カルボネート、シトレート、トリス緩衝剤および緩衝生理食塩水塩(例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水)が挙げられる。
様々な実施形態では、賦形剤はpH調整剤でもよい。非限定例として、pH調整剤は炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸またはリン酸でもよい。
さらなる実施形態では、賦形剤は崩壊剤でもよい。崩壊剤は非発泡性でもよく、または発泡性でもよい。非発泡性崩壊剤の適切な例としては、限定されないが、デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、これらのアルファ化および加工デンプン、甘味剤、粘土、例えばベントナイト、微結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム、例えば、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン(pecitin)およびトラガントが挙げられる。適切な発泡性崩壊剤の非限定例としては、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムおよび酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが挙げられる。
さらに別の実施形態では、賦形剤は、分散剤でもよく、または分散増強剤でもよい。適切な分散剤としては、限定されないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製した木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート(isoamorphous silicate)および微結晶セルロースを挙げることができる。
別の代替実施形態では、賦形剤は防腐剤でもよい。適切な防腐剤の非限定例としては、抗酸化剤、例えば、BHA、BHT、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンEまたはパルミチン酸レチニル、クエン酸、クエン酸ナトリウム;キレート剤、例えば、EDTAまたはEGTA;および抗菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノールまたはフェノールが挙げられる。
さらなる実施形態では、賦形剤は潤滑剤でもよい。適切な潤滑剤の非限定例としては、ミネラル、例えば、タルクまたはシリカ;および脂肪、例えば、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸が挙げられる。
さらに別の実施形態では、賦形剤は矯味剤でもよい。矯味材料としては、セルロースエーテル;ポリエチレングリコール;ポリビニルアルコール;ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールのコポリマー;モノグリセリドまたはトリグリセリド;アクリルポリマー;アクリルポリマーとセルロースエーテルの混合物;酢酸フタル酸セルロース;およびこれらの組み合わせが挙げられる。
代替実施形態では、賦形剤は着香剤でもよい。着香剤は、合成香料油および着香芳香族化合物ならびに/または植物、葉、花、果実およびこれらの組み合わせから抽出された天然油から選択することができる。
なおさらなる実施形態では、賦形剤は着色剤でもよい。適切な着色添加剤としては、限定されないが、食品、薬物および化粧品着色料(FD&C)、薬物および化粧品着色料(D&C)または外用薬物および化粧品着色料(Ext.D&C)が挙げられる。
(i)剤形
組成物は、様々な剤形に製剤化することができ、治療有効量の活性成分をデリバリーするであろういくつかの異なる手段によって投与することができる。そのような組成物は、所望により、従来の無毒の医薬的に許容可能な担体、補助剤および媒体を含む投薬単位製剤において、経口的(例えば、吸入)、非経口的または局所的に投与することができる。局所投与は、経皮投与、例えば、経皮パッチまたはイオントフォレーシス装置の使用も含み得る。本明細書で使用する場合、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内または胸骨内の注射または注入技法を含む。薬物の製剤は、例えば、Gennaro, A. R., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (18th ed, 1995)、およびLiberman, H. A. and Lachman, L, Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (1980)で論じられている。特定の実施形態では、組成物は栄養補助食品でもよく、または組成物は化粧品でもよい。
本開示は、内在的に発現しているSARM1ポリペプチドの活性を測定可能な程度に阻害する方法を包含する。本開示は、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボでSARM1活性使用を阻害する方法を提供する。一般に、方法は、内在的に発現しているSARM1ポリペプチドの活性をダウンレギュレートするために、有効量のドミナントネガティブSARM1またはドミナントネガティブSARM1を含む組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブSARM1またはドミナントネガティブSARM1を含む組成物は、生物試料に投与される。本明細書で使用する場合、用語「生物試料」には、限定されないが、組織、細胞、細胞培養物またはそれらの抽出物;対象から得られる生検材料またはそれらの抽出物;および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙または他の体液またはそれらの抽出物が含まれる。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブSARM1またはドミナントネガティブSARM1を含む組成物は、それらを必要とする対象に投与される。適切なドミナントネガティブSARM1分子またはドミナントネガティブSARM1を含む組成物は、本明細書に開示される、例えば、セクションIに記載されているものである。
キットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載の薬剤または組成物を含むことができ、ある種の実施形態では、投与のための説明書を含むことができる。そのようなキットは、本明細書に記載の方法の実施を容易にし得る。キットとして供給される場合は、組成物の異なる成分を別の容器中に包装することができ、使用直前に混合することができる。成分としては、限定されないが、本明細書に記載のドミナントネガティブSARM1分子を含む組成物および医薬製剤が挙げられる。成分のそのような包装は、必要であれば、別々に、組成物を含む1つまたは複数の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置中に提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチック箔を含むことができる。成分のそのような包装はまた、場合によっては、成分の活性が消失することなく、別々に長期保存を可能にし得る。
すべての本明細書で使用される術語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、任意の方法または範囲に限定することを意図したものではないことを理解されたい。例えば、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が特に明示しない限り、複数の指示物を含むことができる。さらに、すべての単位、接頭辞および記号は、そのSIで許容される形式で示され得る。
強力なSARM1ドミナントネガティブを開発するために、個々の点突然変異をN末端およびTIRドメインの高度に保存された領域に導入し(図1A)、これらのコンストラクトのレンチウイルス媒介性発現がAxDを減少させるかどうかを試験した。すべてのコンストラクトは培養した後根神経節ニューロンで十分に発現した(図5)。軸索を切断し、損傷部位への軸索の再成長を回避するために、細胞体を除去した。ハイスループット自動画像化および自動AxD指数(Sasaki et al., 2009)を用いて、遠位軸索の断片化を経時的に評価した。軸索の断片化は切断から6時間に始まり、24時間までに完了する(図1B、図1C)。野生型DRGニューロンにおける、以前に発見されたドミナントネガティブSARM1-K597E(Summers et al., 2016)およびSARM1-デルタTIR(Gerdts et al., 2013)の発現は、軸索切断から36時間後までAxDを遅らせる(図1B、図1C)。本発明者らは、TIR NADaseの活性部位内の重要な触媒残基として、グルタミン酸E642を最近特定した(Essuman et al., 2017)。酵素機能をブロックすることが強力なドミナントネガティブをもたらすかどうかを評価するために、野生型ニューロンでSARM1-E642Aを発現させた。SARM1-E642Aは、SARM1-KOニューロンで発現させる場合機能的でないが(Essuman et al., 2017)、野生型ニューロンでSARM1-E642Aを発現させる場合、EGFP-ベクターを発現する野生型軸索におけるものと同じキネティクスで軸索の断片化が進行する(図1B)。驚いたことに、SARM1-E642A突然変異型は機能的でないが、ドミナントネガティブとして作用せず、これによって、この突然変異型が、野生型TIR NADaseの活性化を可能にするTIR-TIR相互作用を乱すことができないことが示唆される。これに対して、TIRドメイン中の別の高度に保存された位置H685の残基に点突然変異を導入すると(図1A)、軸索切断から72時間にわたって強力に軸索を保護するドミナントネガティブが生じる(図1B、図1C)。H685をYまたはAのいずれかへ突然変異させると、ドミナントネガティブ効力が識別不能なコンストラクトがもたらされ、これによって、ドミナントネガティブ効果を生じさせるのは、任意の特定のアミノ酸への変換ではなく、Hの消失であることが示唆される(図6)。したがって、このヒスチジンは、SARM1活性に関与するTIR-TIR相互作用に必要である可能性がある。最も強いドミナントネガティブ効果は、N末端の193のリジンが突然変異した場合に観察された(図1A)。このリジンは、SARM1の損傷誘導性活性化に必要であり得ると本発明者らが仮定した、N末端の高度に保存された領域内に存在する。野生型DRGにおけるSARM1-K193Rの発現は、軸索切断から72時間にわたって軸索を強力に保護する(図1B、図1C)。H685と同様に、K193をRまたはAのいずれかへ突然変異させると、ドミナントネガティブ活性が識別不能なコンストラクトが生成され、これによって、SARM1の損傷誘導性活性化をブロックするのはリジンの消失であることが示唆される(図6)。
SARM1-K193R(図1B、図1C)およびSARM1-H685A(図6A)の発現は、軸索切断後のAxDを強く遅らせるが、保護はSARM1の欠失ほどロバストではない(図1B、図1C)。したがって、本発明者らは、K193とH685の両方に突然変異を有するSARM1分子がさらにいっそう強力なドミナントネガティブ活性をもたらすかどうかを評価した。本発明者らは、両方の突然変異および第3の突然変異H194Aを有するコンストラクトを生成し、このコンストラクトをSARM1-複合ドミナントネガティブ(SARM1-CDN)と名付ける。その後の解析によって、H194Aを加えてもSARM1-CDNの効力に影響しないことが示されたが(図6B)、これは、最初に生成され、かつそのような強いドミナントネガティブ効果を与えたので、残りの解析はSARM1-CDNを用いる。SARM1-CDNの発現はAxDを完璧に予防し(図2A、図2B)、軸索切断後少なくとも96時間にわたってTMRM陽性のミトコンドリアを保存する(図2C)。活性化の際に、野生型SARM1はNAD+を急速に分解し(Gerdts et al., 2015;Sasaki et al., 2016;Essuman et al., 2017)、これは、局部的代謝不全(Gerdts et al., 2015;Yang et al., 2015)およびその後のAxDをもたらす。SARM1-CDNがSARM1のこの分子活性もブロックするかどうかを評価するために、健常な軸索および損傷した軸索における軸索NAD+レベルを測定した。予想通り、切断してから4時間に、対照ベクターを発現する野生型ニューロンにおいてNAD+はほとんど枯渇している(図2D)。これに対して、ARM1-CDNを発現する野生型ニューロンにおいて、およびSARM1-KOニューロンにおいて、NAD+は維持される(図2D)。したがって、野生型ニューロンにおけるSARM1-CDNの発現は、SARM1の酵素機能およびその変性促進活性を強力にブロックする。
次に、インビボにおけるSARM1-CDNの任意の軸索保護特質を解析した。効力の最もロバストな試験であると考えるので、概念実証として、重度の病的AxDのモデルとしての坐骨神経切断を利用した。EGFPに融合したSARM1-CDN(図3A)またはEGFP単独をAAV8ベクターにクローニングし、これをニューロン特異的シナプシン(Syn)プロモーターの下で発現させた(図3A)。AAV8-Syn-SARM1-CDN-EGFP(AAV-SARM1-CDN)または対照EGFPウイルスの髄腔内投与から5週後に(図3B)、DRGならびに坐骨神経(図3C、図3D)および肋間神経(図3C)を含めた末梢神経のロバストなEGFP標識が観察された。DRGは、ニューロンマーカーPGP9.5での染色による判定では、効率的に形質導入されている(図3D)。
坐骨神経切断から5日後、EGFP蛍光がないことならびに神経フィラメントおよびペリフェリン染色の消失によって証明されるように、対照ウイルスを注射したマウスの遠位神経セグメントに軸索はほとんど存在しない(図3E)。これに対して、AAV-SARM1-CDNを注射したマウスの神経において、EGFP蛍光および神経フィラメントおよびペリフェリン染色が容易に観察され(図3E)、これによって、ドミナントネガティブを発現する軸索が変性から保護されることが示される。
点突然変異を組み合わせることが損傷誘導性軸索変性からの保護を増大させるかどうかを研究するために、2つまたは3つの点突然変異を有するSARM1コンストラクトを生成した。K193R/E642AおよびH685A/E642AはK193RまたはH685A単独よりも大きく軸索変性を予防しないが、K193RおよびH685Aに点突然変異を有するSARM1コンストラクトを発現させることにより、少なくとも120時間にわたって、かつSARM1 KOと同じ程度まで、軸索切断誘導性軸索変性が予防される。SARM1点突然変異を組み合わせることによって、SARM1 KOと同程度に強力に損傷誘導性軸索変性を予防する強力なドミナントネガティブがもたらされる(図8A)。化学療法剤に対する軸索完全性の保護におけるドミナントネガティブSARM1分子の効力を研究するために、示されるコンストラクト(ベクター、K193R/E642A、H685A/E642A、K193R/H194A/H685A、K193R/E642A、H685A)を発現する野生型(WT)DRGニューロン、または空ベクターを発現するSARM1 KO DRGを40nMビンクリスチンとともにインキュベートし、示された時点で軸索変性を評価した(図9A)。空ベクターを発現するWT DRGでは、軸索は24時間までに変性し、ビンクリスチン投与から48時間で完璧に断片化する。これに対して、SARM1の2重および3重点突然変異を発現するWTの軸索およびSARM1 KOニューロンの軸索は、少なくとも120時間にわたってビンクリスチン誘導性軸索変性から保護される。SARM1の2重および3重突然変異型の発現は、化学療法剤ビンクリスチンに対し、軸索完全性を維持する。さらに、K193における多くのアミノ酸置換は、強力なドミナントネガティブSARM1コンストラクトを生成する。SARM1導入遺伝子は、示されるアミノ酸置換(K193A、K193E、K193Q、K193Mおよび上記のK193R)を用いて生成された。野生型軸索で発現させた場合、すべての示される突然変異型は強力なドミナントネガティブであり、軸索切断後に長期持続性軸索保護をもたらす。したがって、多種多様のアミノ酸タイプへのK193の突然変異が、強力なドミナントネガティブSARM1導入遺伝子を生成する。K193Aが特に強力であることに留意されたい(図10)。
すべての手順は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針において義務付けられ、Washington University of Saint Louis Medical Schoolの動物実験委員会(プロトコール#20170030および20150043)によって認められた指針に従って行った。この原稿はARRIVE指針に準拠して作成した。妊娠中のC57BI/6NTacマウスはTaconic(Rensselaer、NY)から購入し、妊娠中のCD1マウスはCharles River(Wilmington、MA)から購入した。SARM1ノックアウトマウスはMarco Colonna(Szretter et al., 2009)からの寄贈物であり、本発明者らのコロニーで繁殖させた。すべての実験に雄と雌のマウスを使用した。別段指示がない限り、化学薬品はSigma Aldrich(Saint Louis、MO)から購入した。
ダルベッコ改変イーグル培地中で、後根神経節(DRG)を胎生期13.5(E13.5)またはE14.5のCD-1(Charles River)から、またはE13.5 SARM1ノックアウトマウスの胚から切り離した。DRGニューロンを37℃の0.05%トリプシン-EDTA中で切り離し、2%のB27(Invitrogen)、50ng/mLの神経成長因子(Harlan Laboratories)、1μΜの5-フルオロ-2-デオキシウリジンおよび1μΜのウリジンを含むNeurobasal培地(Invitrogen)に再懸濁し、ポリ-D-リジンおよびラミニンでコーティングされた48ウェルプレート中にプレーティングした。翌日(DIV1日目)、濃縮したレンチウイルスを50倍の最終希釈で加えた。直接比較をともなうすべての実験は、変動性を最小限にするために同じプレート上で行った。
哺乳類発現コンストラクトは、ユビキチンプロモーターおよびVenusマーカーを含むFCIVレンチウイルスベクター(Araki et al., 2004)に由来した。VenusがタグされたSARM1融合タンパク質は、SARM1のC末端とVenusの間にAla-Thr-Thrリンカーを用いて、VenusとインフレームにSARM1 cDNAを挿入することによって作出した。SARM1突然変異型コンストラクトは、メガプライムPCR方法によって生成した。InFusionシステムを使用して、残基2~27および561~724を欠くSARM1欠失突然変異型(デルタTIR)をFCIVにサブクローニングした。対照ベクターは、venusまたはユビキチンプロモーターの制御化にある高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)(EGFPベクター)を含んでいた。シークエンシングによってクローンの挿入が成功していることを確認した。以前に記載されているように(Araki et al., 2004)、レンチウイルス発現ベクターFCIVとレンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX2および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質のHEK293T細胞への同時トランスフェクションによってレンチウイルス粒子を生成した。トランスフェクション後48時間目にレンチウイルス粒子を収集し、これを、Lenti-X濃縮器(Clontech)を用いて1~10×107感染粒子/mlの終濃度に濃縮した。コンストラクトのレンチウイルス発現は、細胞体中の陽性蛍光シグナルによって確認し、92.2±7.6%(SARM1-デルタTIR)から98.8±0.7%(SARM1-E642A;図6)の感染DRGの範囲であった。
DRGニューロンを48ウェルマイクロタイタープレート中で培養し、自動化顕微鏡による軸索の画像化を可能にするように細胞体を隔離した。DIV8日目に、DRGの軸索を、顕微鏡のガイダンスの下で3mm幅の平たい刃を用いてソマエ(somae)の近くで手作業により切断した。軸索再生を防ぐために細胞体を除去した。ビンクリスチン(DMSO中40nM)または媒体(DMSO)をDIV8日目に加え、実験の終わりまでウェル中に残した。
生軸索についてウェルあたり15~20個の明視野画像を、20×対物レンズを有するOperettaハイコンテンツ画像化システム(PerkinElmer)を使用して示された時点で取得した。ImageJベースのスクリプト(Sasaki et al., 2009)を使用して、軸索変性を軸索形態に基づいて定量化し「変性指数」(DI)として報告し、DIは0(完全にインタクト)から1(完全に断片化)の範囲である。0.5を超える値は大規模な軸索変性を示す。すべての画像を詳しく調べ、軸索がないフィールドかまたは不適切な画像化を除外した。ウェルあたり10~15個の画像を技術的複製物として測定した。すべての実験は少なくとも3回行い、各実験について、条件あたり3~5ウェルを平均した。ミトコンドリア電位を評価するために、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM;ThermoFisher Scientific)を加え、30分後に、倒立Olympus CKX41顕微鏡およびNikon DS-QiIMCカメラを用いて、軸索を画像化した。コンストラクト間で露出時間を一定に保った。同じ顕微鏡およびカメラを使用して、位相差で明視野画像を得た。
CD1 E13.5 DRGおよびSARM1 KO E13.5 DRGを、ポリ-D-リジンおよびラミニンでコーティングされた24ウェルプレート中にスポット培養としてプレーティングした。DIV1日目に、ユビキチン(Ubquitin)-EGFPまたはユビキチン-SARM1-CDN-Venusを発現する濃縮したウイルスをニューロンに形質導入した。DIV6日目に、記載のように、軸索を切断し、細胞体を除去した。即時(=0時間時点)または軸索切断後4時間で、軸索を0.9%冷食塩水で洗浄し、0.5M過塩素酸の添加により溶解した。抽出物を遠心分離し、上清を収集し、3MのK2CO3で中和し、リン酸カリウム緩衝液中に希釈した。LC-18T HPLCカラム(Supelco)による1ml/分の流速のHPLによって、NAD+をアッセイした。溶出ピークをNAD+標準と一致させた。条件あたり4ウェルを平均し、3つの独立の実験を行った。
ヒトシナプシンプロモーターの制御化にあるEGFPを発現するAAVベクターはAddgene(Bryan Rothからの寄贈物;Addgene#50465)から得て、EGFP-ベクター対照(Addgeneウイルス調製(prep)#50465-AAV8)として使用した。pAAV-hSyn-EGFP(Addgene#50465)をBamHIおよびNcoIで切断し、inFusion (Clontech)システムを使用して、SARM1-K193R/H194A/H685A(SARM1-CDN)をシナプシンプロモーターとEGFP配列の間に挿入した。AAV8-hSYN-SARM1-CDN-EGFPは、Washington University Saint Louisのviral vector core of the Hope Center for Neurological Diseasesによって生成された。イオジキサノール勾配超遠心分離法によってウイルス粒を精製し、ドットブロットによってウイルス力価を測定した。アバチンによる軽い麻酔の下で、出生後日数11または12の雄(n=7)および雌(n=10)のC57BI/6マウス(Taconic)中に6×1011ウイルスゲノム(vg)をL6/S1で髄腔内注射した。EGFP-ベクターを注射した2匹の雌マウスはその後死亡したが、SARM1ドミナントネガティブコンストラクトを注射したマウスはどれも死亡しなかった。
ウイルス注射から5週間後に、マウス(n=9)の1つの群をイソフルランで麻酔し、右坐骨神経を切断し、再接続を予防するために神経末端を曲げて互いに離した。神経切断から5日後、マウスにアバチンで麻酔し、坐骨神経および腓腹神経を切離摘出した後、4%パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝食塩水で経心的に灌流した。脊髄および後根神経節を切離摘出し、30%ショ糖中で一晩凍結保護し、ドライアイスで冷却した液状2-メチルブタン中のO.C.T(Tissue Tec)中で凍結した。ウイルス注射から8週間後にマウス(n=6)の第2群の坐骨神経を切断し、上記のように、10日後に組織を収集した。比較のために、年齢が一致する(11週)SARM1ノックアウトマウス(n=10;5匹の雄/5匹の雌)に坐骨神経切断を加え、切断したから5日後(n=5匹のマウス;2匹の雌/3匹の雄)または10日後(n=5匹のマウス、3匹の雌/2匹の雄)に坐骨神経および腓腹神経を切離摘出した。
腓腹神経および坐骨神経を、新しく調製した3%グルタルアルデヒドの0.1M PBS中に浸漬することによって一晩固定し、最近記載されたように(Geisler et al., 2016)処理した。Leica EM UC7ウルトラミクロトームを使用して横断切片(400nm厚)を切断し、これを1%トルイジンブルー(Fisher Scientific)で染色した。Leica DFC 7000-Tカメラを備えたLeica DMI 4000B顕微鏡の63×油浸対物レンズを用いて、腓腹神経の切片を画像化した。Leicaのソフトウェアを使用して顕微鏡写真をステッチし、横断切片あたりのすべての軸索をImageJで数えた。軸索のサイズ分布および坐骨神経のG比を決定するために、横断切片あたり4つの重複していない領域をZeiss Axioskopの100×油対物レンズを用いて画像化し、Hitachiのカメラで撮影した。カスタマイズされた半自動二値画像化解析方法(Hunter et al., 2007)を用いて写真を解析した。処理群あたり3つの神経を解析し、神経あたり4領域の結果を平均した。すべての解析は盲検観察者によって行われた。
腓腹神経の選択されたブロックを使用して、90nm厚の超薄切片を切断し、これを酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、JEOL JEM 1400 TEMで見て調べた。
後根神経節および坐骨神経の6μm厚の切片をクリオスタット(Leica CM1860)で切断し、スライドにマウントし、最近記載されたように(Geisler et al., 2016)処理した。群間の直接比較をともなう実験は、変動性を最小限にするために並行して行った。一次抗体は、ウサギ抗タンパク質遺伝子産物9.5(1:1000、EMD Millipore#AB1761-1-I)、ウサギ抗ペリフェリン(1:250、EMD Millipore#AB1530)、ウサギ抗神経フィラメント200(1:1000、Sigma Aldrich#N4142)およびalexa-fluor488にコンジュゲートしたマウス抗緑色蛍光タンパク質(1:250、ThermoFisherScientific#A-21311)を含んでいた。二次抗体は、1:500希釈のAlexa Fluor594コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ(Invitrogen)であった。DAPIを含むVectashield(Vector laboratories)を用いて切片にカバーガラスをかけて、核の可視化を可能にした。坐骨神経およびDRGを、それぞれ40×および20×の浸漬油対物レンズを使用して、Leica DMI 4000Bの共焦点モードで画像化した。Image Jにおいて、全DRGの1つのステッチされた共焦点スライス中のPGP9.5陽性およびGFP陽性のDRGニューロンを数えた。動物あたり2つの異なるDRGのそれぞれ1切片を数え、値を平均した。AAV8-Syn-SARM1-CDN-EGFPの注射後に、PGP9.5陽性DRGニューロンの85±0.4%でGFPが発現していた。
別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差(SEM)としてデータを報告する。群間比較は、必要に応じて一元配置または二元配置ANOVAで行った。全体を通して両側有意性検定を使用し、P<0.05を統計学的に有意であるとみなした。すべての統計値は、Prismソフトウェアを用いて計算した。
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Claims (24)
- 突然変異型ステライルアルファおよびTIRモチーフ含有タンパク質1(SARM1)ポリペプチドを含む組成物であって、突然変異型SARM1ポリペプチドが、ドミナントネガティブなSARM1活性を有し、配列番号1と少なくとも90%の同一のアミノ酸配列からなり、配列番号1に示す配列を含む野生型ヒトSARM1ポリペプチドと比較して位置189、190、および193の1つ以上のアミノ酸置換を含み、突然変異型SARM1ポリペプチドが、損傷または傷害の後に軸索の断片化を予防する、組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置675~700に対応する領域中に少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置193にアミノ酸置換を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置685にさらにアミノ酸置換を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置193および位置685にアミノ酸置換を含み、位置194にさらにアミノ酸置換を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置575~600に対応する領域中に少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置550~575に対応する領域中に少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記突然変異型SARM1ポリペプチドが、位置189、190または193に第一のアミノ酸置換を含み、位置570または685に第二のアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の組成物。
- 医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の突然変異型SARM1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を含む組成物。
- 請求項1~8のいずれか1項に記載の突然変異型SARM1ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸を含むベクターを含む組成物。
- ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項11に記載の組成物。
- ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項12に記載の組成物。
- 請求項12または13に記載の組成物および医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の突然変異型SARM1ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する単離ウイルス粒子を含む組成物。
- 単離ウイルス粒子がアデノ随伴ウイルスのビリオンである、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の突然変異型SARM1ポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む組成物。
- AAVベクターがヒトまたは非ヒトアデノ随伴ウイルスを使用して生成される、請求項17に記載の組成物。
- 医薬的に許容可能な担体をさらに含む請求項18に記載の組成物。
- 内在的に発現しているSARM1の活性を阻害するおよび/または神経変性もしくは神経性の疾患もしくは障害を治療するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組成物。
- 神経変性または神経性の疾患または障害が、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄性疾患、橋中心髄鞘崩壊症、神経損傷疾患または障害、代謝疾患、ミトコンドリア性疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーに起因する軸索傷害と関係がある、請求項20に記載の組成物。
- 神経変性または神経性の疾患または障害が、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症、先天性ミエリン形成不全、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中心ミエリン分解、浸透圧性低ナトリウム血症、低酸素脱髄、虚血性脱髄、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ニーマンピック病、ペリツェウスメルツバッヘル病、脳室周囲白質軟化症、グロボイド細胞白質ジストロフィー(クラッベ病)、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症(ALS、ルーゲーリック病)、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ-サックス病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、放射線後損傷、化学療法の神経学的合併症(化学療法誘導性神経障害;CIPN)、神経障害、急性虚血性視神経症、ビタミンB12欠乏症、単独ビタミンE欠乏症候群、バッセン-コーンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮症、レーバー先天黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性不全対麻痺ヒトTリンパ球向性ウイルス1(HTLV-1)関連脊髄症、西ナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス脳炎、本態性振戦、シャルコー-マリー-トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症(SMA)、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー(HSAN)、副腎脊髄神経障害、進行性核上性麻痺(PSP)、フリートライヒ運動失調症、遺伝性運動失調症、騒音性難聴、前頭側頭認知症、鋭角緑内障および先天性難聴からなる群から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 対象において軸索障害を治療するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組成物。
- SARM1活性を阻害するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の組成物。
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