JP7355723B2 - ヒヨコマメの根粒形成促進剤 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒヨコマメにおける根粒形成の促進及びヒヨコマメの増収技術に関する。
ヒヨコマメ（Cicer arietinum L.）はマメ科の一年生草本であり、子実（豆）、若い茎葉及び莢が食用に供される。ヒヨコマメの乾燥種子には、タンパク質２５％、脂質５％、炭水化物５９％、食物繊維１．２％の他、リン、カルシウム、鉄などのミネラル成分が豊富に含まれており、それを摂取することにより、ダイエットなどで動物性タンパク質を控える場合や穀物に不足がちな必須アミノ酸を補給できるという効果がある（非特許文献１）。
ヒヨコマメは、世界全体の豆類（Ｐｕｌｓｅｓ）のうち、収穫面積において２位、生産量において３位を占め、人口増加の著しいインドにおいて最も生産量と需要の大きい豆類である。しかしながら、インドにおけるヒヨコマメの単収は、試験圃場レベルと実際の生産者レベルとの間に乖離があると云われている（非特許文献２）。
ヒヨコマメは、根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ等）による根粒形成により収量が増加することが知られており（非特許文献３）、当該根粒を増強することが生産性確保に重要であると考えられる。従来から、特定の化合物を添加して根粒菌を増殖、活性化する等の技術が報告されているが、ヒヨコマメについては、経験的にダイズやインゲンマメ等と共生する根粒菌の活性化に用いられているダイゼインやナリンゲニンのようなフラボノイドが用いられていており、その効果は十分なものではない。
一方、レッドクローバー中に多く含まれるビオカニンＡ、ホルモノネチンのようなメチル化イソフラボンは、古くから女性ホルモン様作用があることが知られており、最近では、認知症緩和効果（特許文献１）やサルコペニアの予防又は治療効果（特許文献２）があることが報告されている。
しかしながら、メチル化イソフラボン類が根粒に対して如何なる作用を及ぼすかは全く知られていない。
しかしながら、メチル化イソフラボン類が根粒に対して如何なる作用を及ぼすかは全く知られていない。
Coastal Bioenvironment Center Saga University Volume 8 (2006) 35-40
Outlook on Agriculture, Volume 46, Issue 3 (2017) 1-6
European Journal of Agronomy, Volume 19, Issue 1 (2003) 15-21
本発明は、ヒヨコマメに共生する根粒菌による根粒形成の促進及びヒヨコマメの増収に関する技術を提供することに関する。
本発明者らは、土壌や環境を害さない天然素材について検討したところ、特定のメチル化イソフラボノイドに、ヒヨコマメに共生する根粒菌による根粒形成を促進させる作用があり、ヒヨコマメの収量増大に有用であることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）～６）に係るものである。
１）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの根粒形成促進剤。
２）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの収量増加剤。
３）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌を含有するヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物。
４）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの根粒形成促進方法。
５）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの収量増加方法。
６）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの栽培方法。
１）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの根粒形成促進剤。
２）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの収量増加剤。
３）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌を含有するヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物。
４）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの根粒形成促進方法。
５）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの収量増加方法。
６）下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの栽培方法。
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕
本発明によれば、ヒヨコマメに共生する根粒菌による根粒形成が促進され、ヒヨコマメの収量を増大することができる。
本発明において、「ヒヨコマメ」とは、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）ヒヨコマメ属のＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ．を意味する。種としては、カブリ種及びデシ種が知られているが、そのいずれでもよい。
本発明において、「根粒」とは、細菌（根粒菌）との共生によって植物の根に生じる瘤を意味する。根粒菌は、根粒中で大気中の窒素を還元してアンモニア態窒素に変換し、宿主へと供給するいわゆる共生的窒素固定を行う。
根粒菌は、共生可能な植物に対して特異性があるとされており、ヒヨコマメを宿主とする根粒菌としては、メソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）、メソリゾビウム・メディテラネウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｕｍ）等が知られている。本発明において、「根粒菌」はヒヨコマメと共生できるものであれば限定されないが、好ましくはメソリゾビウム・シセリである。
本発明において、「根粒」とは、細菌（根粒菌）との共生によって植物の根に生じる瘤を意味する。根粒菌は、根粒中で大気中の窒素を還元してアンモニア態窒素に変換し、宿主へと供給するいわゆる共生的窒素固定を行う。
根粒菌は、共生可能な植物に対して特異性があるとされており、ヒヨコマメを宿主とする根粒菌としては、メソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）、メソリゾビウム・メディテラネウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｕｍ）等が知られている。本発明において、「根粒菌」はヒヨコマメと共生できるものであれば限定されないが、好ましくはメソリゾビウム・シセリである。
本発明において、メチル化イソフラボン類は、下記式（１）で表されるように、４’位のヒドロキシ基がメチル化されたイソフラボンである。
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕
ここで、Ｒ１及びＲ２が共にヒドロキシ基である化合物（５，７，３’－トリヒドロキシ－４’－メトキシイソフラボン）は、「プラテンセイン（Ｐｒａｔｅｎｓｅｉｎ）」として知られ、Ｒ１がヒドロキシ基で、Ｒ２が水素原子である化合物（５，７－ジヒドロキシ－４’－メトキシイソフラボン）は、「ビオカニンＡ（Ｂｉｏｃｈａｎｉｎ Ａ）」として知られ、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である化合物（７－ヒドロキシ－４’－メトキシイソフラボン）は、「ホルモノネチン（Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）」として知られている。
このうち、根粒形成促進作用の点から、プラテンセインが好ましい。
このうち、根粒形成促進作用の点から、プラテンセインが好ましい。
斯かる本発明のメチル化イソフラボン類は、何れもムラサキツメクサ（レッドクローバー、Trifolium pratense）、シロツメクサ（ホワイトクローバー、Trifolium repens）、ヌスビトハギ（Podocarpium podocarpum）、ハリガネゴケ（Bryum capillare）等の植物に含まれることが報告されており、一般的には当該植物から公知の方法により抽出、単離、精製することができるが、市販品（プラテンセイン：富士フイルム和光純薬社、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社；ビオカニンＡ：Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社；ホルモノネチン：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用することもできる。また、既報（例えば、Wong, E. 1963. “Pratensein. 5, 7, 3′-Trihydroxy-4′-Methoxyisoflavone.” Journal of Organic Chemistry 28(9): 2336-39.）又はこれに準じる方法により製造された化学合成品であってもよい。
後記実施例に示すように、ヒヨコマメの種子を播種後、根粒菌を接種してヒヨコマメを栽培する場合において、本発明のメチル化イソフラボン類を添加すると、根粒重及び根粒数が増加し、植物個体あたりの子実重、子実数及びタンパク収量が増加し、その作用はナリンゲニン（４’，５，７－トリヒドロキシフラバノン）より優れている。
したがって、本発明のメチル化イソフラボン類は、ヒヨコマメの根粒形成促進剤又はヒヨコマメの収量増加剤となり得、ヒヨコマメの根粒形成促進又はヒヨコマメの収量増加のために使用することができ、また、ヒヨコマメの根粒形成促進剤又はヒヨコマメの収量増加剤を製造するために使用できる。
したがって、本発明のメチル化イソフラボン類は、ヒヨコマメの根粒形成促進剤又はヒヨコマメの収量増加剤となり得、ヒヨコマメの根粒形成促進又はヒヨコマメの収量増加のために使用することができ、また、ヒヨコマメの根粒形成促進剤又はヒヨコマメの収量増加剤を製造するために使用できる。
本発明において、「ヒヨコマメの根粒形成促進」とは、根粒菌がヒヨコマメに共生してできる根粒の形成能が増大することを意味し、具体的には根粒重若しくは根粒数、又はその両方がメチル化イソフラボン類未処理群よりも増加することを意味する。
また、「ヒヨコマメの収量増加」とは、ヒヨコマメから収穫される子実（豆）が増大することを意味し、例えば植物個体あたりの子実乾燥重若しくは子実数、又はその両方がメチル化イソフラボン類未処理群よりも増加することを意味する。
また、「ヒヨコマメの収量増加」には、ヒヨコマメから収穫されるタンパク収量が増加することも含まれる。「タンパク収量増加」とは、ヒヨコマメから収穫される子実（豆）に含まれるタンパク質の質量が増大することを意味し、例えば植物個体あたりの子実（豆）に含まれるタンパク質の質量がメチル化イソフラボン類未処理群よりも増加することを意味する。
また、「ヒヨコマメの収量増加」とは、ヒヨコマメから収穫される子実（豆）が増大することを意味し、例えば植物個体あたりの子実乾燥重若しくは子実数、又はその両方がメチル化イソフラボン類未処理群よりも増加することを意味する。
また、「ヒヨコマメの収量増加」には、ヒヨコマメから収穫されるタンパク収量が増加することも含まれる。「タンパク収量増加」とは、ヒヨコマメから収穫される子実（豆）に含まれるタンパク質の質量が増大することを意味し、例えば植物個体あたりの子実（豆）に含まれるタンパク質の質量がメチル化イソフラボン類未処理群よりも増加することを意味する。
上記のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤は、ヒヨコマメの根粒形成又は収量増加を促進するための組成物（ヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物）（例えば、各種農業又は園芸資材等）、或いは土壌、培地、養液栽培用溶液等のヒヨコマメを栽培するための栽培基材に直接又は水に希釈して添加・配合するための素材（単体）又は製剤となり得る。
上記組成物の形態は、液状又はゲル状組成物であってもよく、また固体状態（ブロック状、粉末状、顆粒状等）の組成物であってもよい。液状組成物の場合、そのまま、あるいは希釈して使用する濃縮タイプとすることができる。また、固体状態の組成物の場合は水に溶解して使用することもできる。
上記組成物の形態は、液状又はゲル状組成物であってもよく、また固体状態（ブロック状、粉末状、顆粒状等）の組成物であってもよい。液状組成物の場合、そのまま、あるいは希釈して使用する濃縮タイプとすることができる。また、固体状態の組成物の場合は水に溶解して使用することもできる。
上記組成物には、本発明のメチル化イソフラボン類の他に、任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒（例えば、水、緩衝液、培地、養液栽培用溶液等）、担体（珪藻土やバーミキュライト、パーライト、ピートモス、活性炭、ヒューマス、タルク、ゼオライト、クレー、カーボンブラック、パルプ、藁、大豆かす、ベントナイト、カオリン、モンモリロナイト、アルミナ等）、前記化合物の溶解を促すためのｐＨ調整剤、植物体又は土壌への展着力を高めるための展着剤、肥効を高めるための肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤、根粒菌（例えば、メソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）、メソリゾビウム・メディテラネウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｕｍ ）等のヒヨコマメを宿主とするメソリゾビウム属（ｇｅｎｕｓ Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の根粒菌）や菌根菌等の植物生育促進微生物、植物の必須栄養素、フラボノイド（ダイゼイン、ゲニステイン等）、有機酸、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、糖、１価アルコール、非イオン性界面活性剤、食品添加物、微生物抽出物、植物ホルモン、ｎｏｄ因子すなわちリポ－キトオリゴ糖、合成リポ－キトオリゴ糖、キトオリゴ糖、キチン性化合物、リノール酸又はその誘導体類、リノレン酸又はその誘導体類、カリキン、アシル－ホモセリンラクトン誘導体、ベタイン化合物、フェノール類化合物（フェルラ酸、クロロゲン酸等）、抗酸化剤等が挙げられる。
上記組成物の例としては、例えば、本発明のメチル化イソフラボン類を有効成分として含む栽培基材（例えば、農業用若しくは園芸用の土壌、培土、培地、養液栽培用溶液、水等）、肥料、水やり用の水、根粒菌資材等の微生物資材、土壌改良剤、農薬、播種用資材、植物用サプリメント（例えば、活性化剤、栄養剤等）、などが挙げられるが、これらに限定されない。
当該肥料、微生物資材、土壌改良剤、播種用資材、植物用サプリメントは、マメ科植物等の植物を栽培する土壌の改良に資するため好ましい。該肥料、微生物資材、土壌改良剤、播種用資材、植物用サプリメントは、固体であっても液体であってもよく、固体の場合はブロック状、粉末状、顆粒状等であり得るが、粉末若しくは顆粒であることが好ましい。該肥料、微生物資材、土壌改良剤、播種用資材、植物用サプリメントは、本発明のメチル化イソフラボン類を有効成分として含む以外に、通常、ヒヨコマメの栽培に使用される肥料、微生物資材、土壌改良剤、播種用資材、植物用サプリメントの成分を含み得る。
当該栽培基材、肥料、根粒菌資材等の微生物資材、土壌改良剤、農薬、播種用資材、植物用サプリメントは、通常の栽培基材（例えば、農業用若しくは園芸用の土壌、培土、培地、養液栽培用溶液、水等）、肥料、根粒菌資材等の微生物資材、土壌改良剤、農薬、播種用資材、植物用サプリメント（例えば、活性化剤、栄養剤等）などに、本発明のメチル化イソフラボン類を添加することによって調製されてもよい。
上記ヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物中の本発明のメチル化イソフラボン類の含有量は、施用量に適するように適宜設定することができるが、例えば、組成物全質量中、好ましくは０．０００００１質量％（０．０１μｇ／ｇ）以上、より好ましくは０．００００１質量％（０．１μｇ／ｇ）以上、さらに好ましくは０．０００１質量％（１μｇ／ｇ）以上であり、且つ好ましくは１質量％（１０，０００μｇ／ｇ）以下、より好ましくは０．１質量％（１，０００μｇ／ｇ以下、さらに好ましくは０．０１質量％（１００μｇ／ｇ）以下、よりさらに好ましくは０．００１質量％（１０μｇ／ｇ）以下である。また、好ましくは０．０００００１～１質量％、より好ましくは０．００００１～０．１質量％、さらに好ましくは０．０００１～０．０１質量％、よりさらに好ましくは０．０００１～０．００１質量％である。
上記ヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物としては、ヒヨコマメの根粒形成促進の点から、本発明のメチル化イソフラボン類とヒヨコマメを宿主とする根粒菌（例えば、メソリゾビウム・シセリ、メソリゾビウム・メディテラネウム等のメソリゾビウム属（ｇｅｎｕｓ Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の根粒菌）を含有する微生物資材である組成物が好ましく、メソリゾビウム・シセリを含有する資材であるのが特に好ましい。
上記根粒菌の菌数は、施用量に適するように適宜設定することができるが、例えば、組成物１ｇあたり、根粒菌数は好ましくは１０４ｃｆｕ以上、より好ましくは１０５ｃｆｕ以上、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ以上であり、且つ好ましくは１０１１ｃｆｕ以下、より好ましくは１０１０ｃｆｕ以下、さらに好ましくは１０９ｃｆｕ以下、よりさらに好ましくは５×１０８ｃｆｕ以下である。また、好ましくは１０４～１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０５～１０１０ｃｆｕ、さらに好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８ｃｆｕである。
また、根粒菌及びメチル化イソフラボン類の含有量は、例えば、組成物１ｇあたり、好ましくは根粒菌数が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１０，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～１，０００μｇ、さらに好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が１～１００μｇ、よりさらに好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が１～１０μｇである。
また、根粒菌とメチル化イソフラボン類の含有量比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８である。
また、根粒菌とメチル化イソフラボン類の含有量比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８である。
本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の供給方法としては、ヒヨコマメにおける根粒形成が促進され、ヒヨコマメの収量増加効果が発揮できるように施用すれば、その態様は特に限定されない。
すなわち、植物体又は植物の根圏の土壌に本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤が接触するか、又は送達される限り特に制限されず、土壌への表面散布、潅注、鋤込み、植物への葉面散布、肥料に混合しての施用、水耕溶液への添加、又は、播種前の種子への塗布若しくは塗抹（例えば種子粉衣）等が挙げられる。
ここで、土壌は、ヒヨコマメの栽培が可能な土壌を用いればよく、ヒヨコマメの栽培が可能な土壌から調製した土壌菌液を添加した土壌を用いることもできる。ここで、土壌菌液は、土壌質量に対して０．１～１０倍の質量の滅菌水を加えた土壌を濾過した濾液として調製することが出来る。
すなわち、植物体又は植物の根圏の土壌に本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤が接触するか、又は送達される限り特に制限されず、土壌への表面散布、潅注、鋤込み、植物への葉面散布、肥料に混合しての施用、水耕溶液への添加、又は、播種前の種子への塗布若しくは塗抹（例えば種子粉衣）等が挙げられる。
ここで、土壌は、ヒヨコマメの栽培が可能な土壌を用いればよく、ヒヨコマメの栽培が可能な土壌から調製した土壌菌液を添加した土壌を用いることもできる。ここで、土壌菌液は、土壌質量に対して０．１～１０倍の質量の滅菌水を加えた土壌を濾過した濾液として調製することが出来る。
本発明のメチル化イソフラボン類を用いるヒヨコマメの栽培においては、メチル化イソフラボン類に加えて、上述したヒヨコマメと共生する（ヒヨコマメを宿主とする）根粒菌を組み合わせて、土壌又は植物に適宜接種することが可能である。この場合は、根粒菌（例えば、根粒菌含有溶液）及びメチル化イソフラボン類をそれぞれ植物の種子を播種した土壌へ添加すること、或いは予め上述したヒヨコマメを宿主とする根粒菌と本発明のメチル化イソフラボン類を含有する組成物（微生物資材）を調製し、当該資材をヒヨコマメの種子若しくはヒヨコマメを栽培する土壌へ添加することが挙げられる。
本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の施用量は、施用方法、施用時期、植物の種類、栽培密度、生育段階等によっても異なり得るが、例えば、本発明のメチル化イソフラボン類としての使用量は、ヒヨコマメを栽培するための前記栽培基材中の濃度として、好ましくは０．０００００１～１質量ｐｐｍ、より好ましくは０．００００１～０．１質量ｐｐｍ、さらに好ましくは０．０００１～０．０１質量ｐｐｍ、よりさらに好ましくは０．０００１～０．００１質量ｐｐｍであればよい。
例えば、栽培基材１リットル容量あたりの本発明のメチル化イソフラボン類の使用量は、好ましくは０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは０．１～１０μｇ、よりさらに好ましくは０．１～１μｇであればよい。ヒヨコマメを土耕栽培する場合であれば、土地１０アールあたり、好ましくは０．０００１～１００ｇ、より好ましくは０．００１～１０ｇ、さらに好ましくは０．０１～１ｇ、よりさらに好ましくは０．０１～０．１ｇの量で、土壌に本発明のメチル化イソフラボン類を添加すればよい。
すなわち、上記本発明のメチル化イソフラボン類を有効成分として含む組成物、例えば肥料、微生物資材、土壌改良剤、播種用資材、植物用サプリメント等の場合、該組成物の使用量は、該組成物中に含まれるメチル化イソフラボン類の濃度に依存する。例えば、該組成物中に含まれる該メチル化イソフラボン類の濃度が０．００５質量％である場合、該組成物の土地１０アールあたりの使用量は、好ましくは２～２，０００，０００ｇ、より好ましくは２０～２００，０００ｇ、さらに好ましくは２００～２０，０００ｇ、よりさらに好ましくは２００～２，０００ｇとなる。
本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤は、一度に前記範囲の量を施用してもよく、複数回に分けて施用してもよい。
例えば、栽培基材１リットル容量あたりの本発明のメチル化イソフラボン類の使用量は、好ましくは０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは０．１～１０μｇ、よりさらに好ましくは０．１～１μｇであればよい。ヒヨコマメを土耕栽培する場合であれば、土地１０アールあたり、好ましくは０．０００１～１００ｇ、より好ましくは０．００１～１０ｇ、さらに好ましくは０．０１～１ｇ、よりさらに好ましくは０．０１～０．１ｇの量で、土壌に本発明のメチル化イソフラボン類を添加すればよい。
すなわち、上記本発明のメチル化イソフラボン類を有効成分として含む組成物、例えば肥料、微生物資材、土壌改良剤、播種用資材、植物用サプリメント等の場合、該組成物の使用量は、該組成物中に含まれるメチル化イソフラボン類の濃度に依存する。例えば、該組成物中に含まれる該メチル化イソフラボン類の濃度が０．００５質量％である場合、該組成物の土地１０アールあたりの使用量は、好ましくは２～２，０００，０００ｇ、より好ましくは２０～２００，０００ｇ、さらに好ましくは２００～２０，０００ｇ、よりさらに好ましくは２００～２，０００ｇとなる。
本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤は、一度に前記範囲の量を施用してもよく、複数回に分けて施用してもよい。
また、メチル化イソフラボン類に加えて、ヒヨコマメと共生する（ヒヨコマメを宿主とする）根粒菌を組み合わせて土壌又は植物に施用する場合においては、施用する根粒菌の菌数は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは１０４ｃｆｕ以上、より好ましくは１０５ｃｆｕ以上、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ以上、よりさらに好ましくは１０７ｃｆｕ以上であり、且つ、好ましくは１０１１ｃｆｕ以下、より好ましくは１０１０ｃｆｕ以下、さらに好ましくは１０９以下、よりさらに好ましくは５×１０８ｃｆｕ以下である。また、好ましくは１０４～１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０５～１０１０ｃｆｕ、さらに好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８ｃｆｕである。
また、当該組み合わせ施用におけるメチル化イソフラボン類の施用量は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは０．００１μｇ以上、より好ましくは０．０１μｇ以上、さらに好ましくは０．１μｇ以上であり、且つ、好ましくは１，０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下、よりさらに好ましくは５μｇ以下である。また、好ましくは０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは０．１～１０μｇ、よりさらに好ましくは０．１～５μｇである。
また、当該組み合わせ施用における根粒菌及びメチル化イソフラボン類のヒヨコマメの種子１粒あたりの施用量は、好ましくは根粒菌が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～１０μｇ、よりさらに好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～５μｇである。
また、当該組み合わせ施用における根粒菌とメチル化イソフラボン類の施用量比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数（ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８である。
また、当該組み合わせ施用におけるメチル化イソフラボン類の施用量は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは０．００１μｇ以上、より好ましくは０．０１μｇ以上、さらに好ましくは０．１μｇ以上であり、且つ、好ましくは１，０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下、よりさらに好ましくは５μｇ以下である。また、好ましくは０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは０．１～１０μｇ、よりさらに好ましくは０．１～５μｇである。
また、当該組み合わせ施用における根粒菌及びメチル化イソフラボン類のヒヨコマメの種子１粒あたりの施用量は、好ましくは根粒菌が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～１０μｇ、よりさらに好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～５μｇである。
また、当該組み合わせ施用における根粒菌とメチル化イソフラボン類の施用量比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数（ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８である。
ヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の施用の時期及び回数は、植物の種類等によっても異なり得るが、通常、土壌等の栽培基材への表面散布、潅注、鋤込み、若しくは種子粉衣により施用する場合は播種前若しくは播種と同時に１回又は１～３回施用することが好ましく、また播種後に施用する場合には、生殖生長期に入る前の栄養成長期初期が好ましい。具体的には播種当日～３０日の間、好ましくは播種当日～１４日の間に、１回又は１～３回施用することが好ましい。
さらに別の一実施形態においては、前記播種前や播種と同時及び／又は播種後における栽培基材（例えば、土壌、培土、培地、養液栽培用溶液、水等）への本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の添加と、播種前の種子への該ヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の塗布若しくは塗抹（例えば種子粉衣）を組み合わせてもよい。
尚、播種前の種子への該ヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の塗布若しくは塗抹（例えば種子粉衣）においては、ピートモス等の担体のほか、展着剤や界面活性剤等を使用することが好ましい。
さらに別の一実施形態においては、前記播種前や播種と同時及び／又は播種後における栽培基材（例えば、土壌、培土、培地、養液栽培用溶液、水等）への本発明のヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の添加と、播種前の種子への該ヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の塗布若しくは塗抹（例えば種子粉衣）を組み合わせてもよい。
尚、播種前の種子への該ヒヨコマメの根粒形成促進剤又は収量増加剤の塗布若しくは塗抹（例えば種子粉衣）においては、ピートモス等の担体のほか、展着剤や界面活性剤等を使用することが好ましい。
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの根粒形成促進剤。
＜２＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの収量増加剤。
＜３＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌を含有するヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物。
＜４＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの根粒形成促進方法。
＜５＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの収量増加方法。
＜６＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの栽培方法。
＜７＞さらに土壌又は植物にヒヨコマメを宿主とする根粒菌を組み合わせて施用する、＜４＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞予め根粒菌とメチル化イソフラボン類を含有する微生物資材を調製し、当該資材をヒヨコマメの種子若しくはヒヨコマメを栽培する土壌へ施用する、＜７＞に記載の方法。
＜９＞根粒菌がメソリゾビウム属（ｇｅｎｕｓ Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の根粒菌、好ましくはメソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）又はメソリゾビウム・メディテラネウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｕｍ ）である、＜７＞又は＜８＞に記載の方法。
＜１０＞土壌がヒヨコマメの栽培が可能な土壌から調製した土壌菌液を添加した土壌である、＜４＞～＜９＞のいずれかに記載の方法。
＜１＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの根粒形成促進剤。
＜２＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの収量増加剤。
＜３＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌を含有するヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物。
＜４＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの根粒形成促進方法。
＜５＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの収量増加方法。
＜６＞下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの栽培方法。
＜７＞さらに土壌又は植物にヒヨコマメを宿主とする根粒菌を組み合わせて施用する、＜４＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞予め根粒菌とメチル化イソフラボン類を含有する微生物資材を調製し、当該資材をヒヨコマメの種子若しくはヒヨコマメを栽培する土壌へ施用する、＜７＞に記載の方法。
＜９＞根粒菌がメソリゾビウム属（ｇｅｎｕｓ Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の根粒菌、好ましくはメソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）又はメソリゾビウム・メディテラネウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｕｍ ）である、＜７＞又は＜８＞に記載の方法。
＜１０＞土壌がヒヨコマメの栽培が可能な土壌から調製した土壌菌液を添加した土壌である、＜４＞～＜９＞のいずれかに記載の方法。
＜１１＞ヒヨコマメの根粒形成促進剤を製造するための、下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類の使用。
＜１２＞ヒヨコマメの収量増加剤を製造するための、下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類の使用。
＜１３＞ヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物を製造するための、下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌の使用。
＜１２＞ヒヨコマメの収量増加剤を製造するための、下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類の使用。
＜１３＞ヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物を製造するための、下記式（１）で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌の使用。
＜１４＞＜１＞～＜１３＞において、メチル化イソフラボン類は、プラテンセイン、ビオカニンＡ又はホルモノネチン、好ましくはプラテンセインである。
＜１５＞＜１＞～＜１４＞において、ヒヨコマメは、好ましくはカブリ種である。
＜１６＞＜１＞、＜２＞、＜１１＞又は＜１２＞の剤が組成物である場合において、当該組成物中のメチル化イソフラボン類の含有量は、組成物全質量中、好ましくは０．０００００１質量％以上、より好ましくは０．００００１質量％以上、さらにより好ましくは０．０００１質量％以上であり、且つ好ましくは１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１％以下、さらに好ましくは０．００１質量％以下である。また、好ましくは０．０００００１～１質量％、より好ましくは０．００００１～０．１質量％、さらにより好ましくは０．０００１～０．０１質量％、且つ好ましくは０．０００１～０．００１質量％である。
＜１７＞＜３＞の組成物において、根粒菌の菌数は、組成物１ｇあたり、好ましくは１０４ｃｆｕ以上、より好ましくは１０５ｃｆｕ以上、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ以上であり、好ましくは１０１１ｃｆｕ以下、より好ましくは１０１０ｃｆｕ以下、さらに好ましくは１０９ｃｆｕ以下、且つ好ましくは５×１０８ｃｆｕ以下であるか、好ましくは又は１０４～１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０５～１０１０ｃｆｕ、さらに好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ、且つ好ましくは２×１０６～５×１０８ｃｆｕである。
＜１８＞＜３＞の組成物において、根粒菌及びメチル化イソフラボン類の含有量は、組成物１ｇあたり、好ましくは根粒菌数が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１０，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が好ましくは０．１～１，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が１～１００μｇ、より好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が好ましくは１～１０μｇである。
＜１９＞＜３＞の組成物において、根粒菌とメチル化イソフラボン類の含有量比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数（ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８である。
＜２０＞＜４＞～＜１０＞のいずれかの方法において、メチル化イソフラボン類の使用量は、ヒヨコマメを栽培するための栽培基材中の濃度として、好ましくは０．０００００１～１質量ｐｐｍ、より好ましくは０．００００１～０．１質量ｐｐｍ、０．０００１～０．０１質量ｐｐｍ又は０．０００１～０．００１質量ｐｐｍである。
＜２１＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用する根粒菌の菌数は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは１０４ｃｆｕ以上、より好ましくは１０５ｃｆｕ以上、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ以上、且つ好ましくは１０７ｃｆｕ以上であり、且つ、好ましくは１０１１ｃｆｕ以下、より好ましくは１０１０ｃｆｕ以下、さらに好ましくは１０９以下、且つ好ましくは５×１０８ｃｆｕ以下である。また、好ましくは１０４～１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０５～１０１０ｃｆｕ、さらに好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ、且つ好ましくは２×１０６～５×１０８ｃｆｕである。
＜２２＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用するメチル化イソフラボン類の量は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは０．００１μｇ以上、より好ましくは０．０１μｇ以上、さらに好ましくは０．１μｇ以上であり、且つ、好ましくは１，０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下、且つ好ましくは５μｇ以下であるか、又は好ましくは０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは０．１～１０μｇ、且つ好ましくは０．１～５μｇである。
＜２３＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用する根粒菌及びメチル化イソフラボン類のヒヨコマメの種子１粒あたりの施用量は、好ましくは根粒菌が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～１０μｇ、且つ好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～５μｇである。
＜２４＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用する根粒菌とメチル化イソフラボン類の比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、且つ好ましくは２×１０６～５×１０８である。
＜１５＞＜１＞～＜１４＞において、ヒヨコマメは、好ましくはカブリ種である。
＜１６＞＜１＞、＜２＞、＜１１＞又は＜１２＞の剤が組成物である場合において、当該組成物中のメチル化イソフラボン類の含有量は、組成物全質量中、好ましくは０．０００００１質量％以上、より好ましくは０．００００１質量％以上、さらにより好ましくは０．０００１質量％以上であり、且つ好ましくは１質量％以下、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１％以下、さらに好ましくは０．００１質量％以下である。また、好ましくは０．０００００１～１質量％、より好ましくは０．００００１～０．１質量％、さらにより好ましくは０．０００１～０．０１質量％、且つ好ましくは０．０００１～０．００１質量％である。
＜１７＞＜３＞の組成物において、根粒菌の菌数は、組成物１ｇあたり、好ましくは１０４ｃｆｕ以上、より好ましくは１０５ｃｆｕ以上、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ以上であり、好ましくは１０１１ｃｆｕ以下、より好ましくは１０１０ｃｆｕ以下、さらに好ましくは１０９ｃｆｕ以下、且つ好ましくは５×１０８ｃｆｕ以下であるか、好ましくは又は１０４～１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０５～１０１０ｃｆｕ、さらに好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ、且つ好ましくは２×１０６～５×１０８ｃｆｕである。
＜１８＞＜３＞の組成物において、根粒菌及びメチル化イソフラボン類の含有量は、組成物１ｇあたり、好ましくは根粒菌数が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１０，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が好ましくは０．１～１，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が１～１００μｇ、より好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が好ましくは１～１０μｇである。
＜１９＞＜３＞の組成物において、根粒菌とメチル化イソフラボン類の含有量比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数（ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、よりさらに好ましくは２×１０６～５×１０８である。
＜２０＞＜４＞～＜１０＞のいずれかの方法において、メチル化イソフラボン類の使用量は、ヒヨコマメを栽培するための栽培基材中の濃度として、好ましくは０．０００００１～１質量ｐｐｍ、より好ましくは０．００００１～０．１質量ｐｐｍ、０．０００１～０．０１質量ｐｐｍ又は０．０００１～０．００１質量ｐｐｍである。
＜２１＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用する根粒菌の菌数は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは１０４ｃｆｕ以上、より好ましくは１０５ｃｆｕ以上、さらに好ましくは１０６ｃｆｕ以上、且つ好ましくは１０７ｃｆｕ以上であり、且つ、好ましくは１０１１ｃｆｕ以下、より好ましくは１０１０ｃｆｕ以下、さらに好ましくは１０９以下、且つ好ましくは５×１０８ｃｆｕ以下である。また、好ましくは１０４～１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０５～１０１０ｃｆｕ、さらに好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ、且つ好ましくは２×１０６～５×１０８ｃｆｕである。
＜２２＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用するメチル化イソフラボン類の量は、ヒヨコマメの種子１粒あたり好ましくは０．００１μｇ以上、より好ましくは０．０１μｇ以上、さらに好ましくは０．１μｇ以上であり、且つ、好ましくは１，０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下、且つ好ましくは５μｇ以下であるか、又は好ましくは０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは０．１～１０μｇ、且つ好ましくは０．１～５μｇである。
＜２３＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用する根粒菌及びメチル化イソフラボン類のヒヨコマメの種子１粒あたりの施用量は、好ましくは根粒菌が１０４～１０１１ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．００１～１，０００μｇ、より好ましくは根粒菌が１０５～１０１０ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．０１～１００μｇ、さらに好ましくは根粒菌が１０６～１０９ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～１０μｇ、且つ好ましくは根粒菌が２×１０６～５×１０８ｃｆｕ且つメチル化イソフラボン類が０．１～５μｇである。
＜２４＞＜７＞又は＜８＞の方法において、施用する根粒菌とメチル化イソフラボン類の比（メチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数ｃｆｕ）は、好ましくは１０５～５×１０９、より好ましくは１０６～５×１０９、さらに好ましくは２×１０６～５×１０９、且つ好ましくは２×１０６～５×１０８である。
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子又はヒドロキシ基を示す。〕
実施例１ メチル化イソフラボン類のヒヨコマメの根粒形成及び初期生育に対する効果
初期肥効型培土（タキイセル培土ＴＭ－１、タキイ種苗（株））とバーミキュライト細粒（あかぎ園芸(株)）を体積比１：１で混合し、当該土壌約１．１Ｌをポット（ロングプラ１２０、日本ポリ鉢販売（株））に充填した。ヒヨコマメ（カブリ種）の種子を２粒ずつ、当該ポットに、土壌表面から約１～２ｃｍの深さで播種した。
初期肥効型培土（タキイセル培土ＴＭ－１、タキイ種苗（株））とバーミキュライト細粒（あかぎ園芸(株)）を体積比１：１で混合し、当該土壌約１．１Ｌをポット（ロングプラ１２０、日本ポリ鉢販売（株））に充填した。ヒヨコマメ（カブリ種）の種子を２粒ずつ、当該ポットに、土壌表面から約１～２ｃｍの深さで播種した。
別途、Ｙｅａｓｔ－Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ＹＭ）培地（Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ＮａＣｌ ０．１ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．４ｇ、Ｍａｎｎｉｔｏｌ １０ｇ、蒸留水１Ｌ（ｐＨ６．８））に１．５％の寒天（和光純薬工業（株））を加えて固形培地を調製し、当該固形培地上でヒヨコマメ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）ＮＢＲＣ１００３８９Ｔ株を３０℃にて約７２時間静置培養した。生育した根粒菌を一白金耳とり、容積５００ｍＬの坂口フラスコ中のＹＭ液体培地５０ｍＬに植菌し、３０℃にて約７２時間振盪培養した。濁度（ＯＤ６００）の値を滅菌水で０．０２（７．０×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）に調整した根粒菌培養液１ｍＬを、播種時に、マイクロピペッターを用いて種子に滴下接種した後、覆土した。
次いで、１μｇのメチル化イソフラボンおよび比較化合物を次の様に施用した。すなわち、０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液に、１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）となるように溶解したナリンゲニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ５８９３）、ホルモノネチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｃａｔ．Ｎｏ．４７７５２－５ＭＧ－Ｆ）、ビオカニンＡ（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳＢ－００００２２７６－００５）及びプラテンセイン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社，ＡＳＢ－０００１６０８０－００１）の各溶液を、マイクロピペッターを用いて１ｍＬずつ各々の試験区の種子の上に滴下した。加えて、０．１％ＤＭＳＯ水溶液１ｍＬのみを施用した試験区をコントロール区とした。各試験区の反復数は５とした（ｎ＝５）。
栽培は屋内で行い、栽培条件は、明期１６時間、２５℃、ＬＥＤ光源（オーゲツ株式会社；型番：ＶＧＬ－１２００Ｗ）、光量４００～４４０μｍｏｌ／ｍ2／ｓとした。播種から７日後に、１ポットあたり１植物となるように間引きを行った。水やりは、ポットの下に置いたバットの水がなくなった後に、新たにポットの下部５ｃｍ程度が浸かる量の水をバットに加えることで行った。２５日間栽培を行った後、ポットから植物体を取り出し、水で根を洗浄してから根粒を採取した。採取した根粒について、植物個体あたりの根粒新鮮重及び根粒数の測定を行った。また、植物体を１００℃で３日間乾燥させたのち、植物体の地上部乾燥重及び地下部乾燥重を測定した。
栽培は屋内で行い、栽培条件は、明期１６時間、２５℃、ＬＥＤ光源（オーゲツ株式会社；型番：ＶＧＬ－１２００Ｗ）、光量４００～４４０μｍｏｌ／ｍ2／ｓとした。播種から７日後に、１ポットあたり１植物となるように間引きを行った。水やりは、ポットの下に置いたバットの水がなくなった後に、新たにポットの下部５ｃｍ程度が浸かる量の水をバットに加えることで行った。２５日間栽培を行った後、ポットから植物体を取り出し、水で根を洗浄してから根粒を採取した。採取した根粒について、植物個体あたりの根粒新鮮重及び根粒数の測定を行った。また、植物体を１００℃で３日間乾燥させたのち、植物体の地上部乾燥重及び地下部乾燥重を測定した。
測定結果を図１～図４に示す。各図のグラフは平均値±標準偏差を表す。
各図中のＣｏｎｔ．、Ｎａｒ１、Ｆｏｒ１、Ｂｉｏ１、Ｐｒａ１はそれぞれコントロール区ならびにナリンゲニン、ホルモノネチン、ビオカニンＡ及びプラテンセインの１ｐｐｍ溶液の施用区を表す。
各図中のＣｏｎｔ．、Ｎａｒ１、Ｆｏｒ１、Ｂｉｏ１、Ｐｒａ１はそれぞれコントロール区ならびにナリンゲニン、ホルモノネチン、ビオカニンＡ及びプラテンセインの１ｐｐｍ溶液の施用区を表す。
根粒重は、コントロール区に対して、ホルモノネチン区で５５％、ビオカニンＡ区で２６％、プラテンセイン区で７１％の増加傾向を示した（図１）。根粒数は、コントロール区に対して、ホルモノネチン区で１５％、ビオカニンＡ区で２５％、プラテンセイン区で３８％の増加傾向を示したが、ナリンゲニン区では増加傾向は認められなかった（図２）。
また、地上部重は、コントロール区に対して、ホルモノネチン区で１９％、ビオカニンＡ区で５％、プラテンセイン区で２３％の増加傾向を示した（図３）。地下部重は、コントロール区に対して、ホルモノネチン区で３４％、ビオカニンＡ区で５％、プラテンセイン区で１１％の増加傾向を示したが、ナリンゲニン区では増加傾向は認められなかった（図４）。
また、地上部重は、コントロール区に対して、ホルモノネチン区で１９％、ビオカニンＡ区で５％、プラテンセイン区で２３％の増加傾向を示した（図３）。地下部重は、コントロール区に対して、ホルモノネチン区で３４％、ビオカニンＡ区で５％、プラテンセイン区で１１％の増加傾向を示したが、ナリンゲニン区では増加傾向は認められなかった（図４）。
実施例２ メチル化イソフラボンのヒヨコマメの収量に対する効果
中期肥効型培土（タキイ含水セル培土、タキイ種苗(株)）とバーミキュライト（あかぎ園芸(株)）を体積比１：１で混合し、当該土壌をポット（直径３０ｃｍ、高さ３０ｃｍ）に充填した。当該ポットの中央付近に約１～２ｃｍの深さで設けた４ヶ所の播種穴に、ヒヨコマメ（カブリ種）の種子を１粒ずつ、計４粒播種した。実施例１と同様に、濁度（ＯＤ６００）の値を滅菌水で０．０２（７．０×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）に調整したヒヨコマメ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）ＮＢＲＣ１００３８９Ｔ株の菌液を種子に滴下接種した。
中期肥効型培土（タキイ含水セル培土、タキイ種苗(株)）とバーミキュライト（あかぎ園芸(株)）を体積比１：１で混合し、当該土壌をポット（直径３０ｃｍ、高さ３０ｃｍ）に充填した。当該ポットの中央付近に約１～２ｃｍの深さで設けた４ヶ所の播種穴に、ヒヨコマメ（カブリ種）の種子を１粒ずつ、計４粒播種した。実施例１と同様に、濁度（ＯＤ６００）の値を滅菌水で０．０２（７．０×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）に調整したヒヨコマメ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）ＮＢＲＣ１００３８９Ｔ株の菌液を種子に滴下接種した。
次いで、０．１μｇ又は１μｇのメチル化イソフラボンおよび比較化合物を次の様に施用した。すなわち、０．１％ＤＭＳＯ水溶液に溶解したナリンゲニン及びプラテンセインの０．１ｐｐｍ又は１ｐｐｍの溶液を、マイクロピペッターを用いて、１ｍＬずつ各々の試験区の種子の上に滴下した。加えて、０．１％ＤＭＳＯ水溶液１ｍＬのみを施用した試験区をコントロール区とした。各試験区は１１反復とした（ｎ＝１１）。
栽培は、２０１８年１１月から２０１９年５月にかけて、太陽光が入るガラスハウス内で行った。当該ハウス内の空調は２０℃設定とした。播種から１１日後に、１ポットあたり１植物となるように、かつ見かけ上生育に問題がない個体を残すように間引きを行った。水やりは、原則として１週間に１回シャワーで適量を潅水することにより行い、土壌表面の乾燥が見られた際には適宜追加で潅水を行った。莢が自然に乾燥した後に収穫を行い、莢から子実（豆）を取り出した。得られた子実について、植物個体あたりの子実乾燥重及び子実数の測定を行った。
測定結果を図５及び図６に示す。
各図のグラフは平均値±標準偏差を表す。各図中の略号は実施例１におけるものと同様である。子実重は、コントロール区に対して、プラテンセイン０．１ｐｐｍ区で５％、同１ｐｐｍ区で２５％の増加傾向を示した（図５）。子実数は、コントロール区に対して、プラテンセイン０．１ｐｐｍ区で９２％、同１ｐｐｍ区で５５％の有意な増加を示した（図６）。なお、有意差検定はＷｉｌｌｉａｍｓ法を用いて行い、有意差（Ｐ＜０．０２５）が認められた場合はアスタリスク（＊）を付して表した。
各図のグラフは平均値±標準偏差を表す。各図中の略号は実施例１におけるものと同様である。子実重は、コントロール区に対して、プラテンセイン０．１ｐｐｍ区で５％、同１ｐｐｍ区で２５％の増加傾向を示した（図５）。子実数は、コントロール区に対して、プラテンセイン０．１ｐｐｍ区で９２％、同１ｐｐｍ区で５５％の有意な増加を示した（図６）。なお、有意差検定はＷｉｌｌｉａｍｓ法を用いて行い、有意差（Ｐ＜０．０２５）が認められた場合はアスタリスク（＊）を付して表した。
実施例３
実施例２で収穫したヒヨコマメの子実に含まれるタンパク質含量を測定し、タンパク収量に換算した結果を表１に示す。プラテンセイン１ｐｐｍ区でタンパク収量が増加傾向を示した。なお、タンパク収量（ｇ／株）は子実重(ｇ／株)×{子実タンパク質含量(ｇ／１００ｇ)／１００}で求めた。ヒヨコマメの子実に含まれるタンパク質含量の測定は食品分析センターにて行った。測定には燃焼法を用い、定量される全窒素に対して窒素・タンパク質換算係数として６．２５を乗じることによりタンパク質含量を算出した。
実施例２で収穫したヒヨコマメの子実に含まれるタンパク質含量を測定し、タンパク収量に換算した結果を表１に示す。プラテンセイン１ｐｐｍ区でタンパク収量が増加傾向を示した。なお、タンパク収量（ｇ／株）は子実重(ｇ／株)×{子実タンパク質含量(ｇ／１００ｇ)／１００}で求めた。ヒヨコマメの子実に含まれるタンパク質含量の測定は食品分析センターにて行った。測定には燃焼法を用い、定量される全窒素に対して窒素・タンパク質換算係数として６．２５を乗じることによりタンパク質含量を算出した。
実施例４ 根粒菌とプラテンセインの併用による相乗効果
実際のヒヨコマメ栽培土壌には様々な微生物が存在しており、そのような条件下においても根粒菌の接種やメチル化イソフラボンの効果が発揮されることが望まれる。本実施例では圃場土から微生物を抽出した下記に説明する土壌菌液を培土に混和した条件、すなわち実際の栽培土壌に近い条件下で、根粒菌接種とメチル化イソフラボンの併用が根粒形成に与える影響を評価した。評価した試験区１～６は以下のとおりである。
試験区１．土壌菌液なし
試験区２．土壌菌液あり
試験区３．土壌菌液あり＋根粒菌接種
試験区４．土壌菌液あり＋根粒菌接種＋プラテンセイン施用
試験区５．土壌菌液あり＋根粒菌接種（前日にプラテンセインを培地に添加）
試験区６．土壌菌液あり＋プラテンセイン施用
実際のヒヨコマメ栽培土壌には様々な微生物が存在しており、そのような条件下においても根粒菌の接種やメチル化イソフラボンの効果が発揮されることが望まれる。本実施例では圃場土から微生物を抽出した下記に説明する土壌菌液を培土に混和した条件、すなわち実際の栽培土壌に近い条件下で、根粒菌接種とメチル化イソフラボンの併用が根粒形成に与える影響を評価した。評価した試験区１～６は以下のとおりである。
試験区１．土壌菌液なし
試験区２．土壌菌液あり
試験区３．土壌菌液あり＋根粒菌接種
試験区４．土壌菌液あり＋根粒菌接種＋プラテンセイン施用
試験区５．土壌菌液あり＋根粒菌接種（前日にプラテンセインを培地に添加）
試験区６．土壌菌液あり＋プラテンセイン施用
（１）土壌菌液の調製と播種
中期肥効型培土（タキイ含水セル培土中期肥効型、タキイ種苗（株））とバーミキュライト細粒（あかぎ園芸（株））を体積比１：１で混合し、当該土壌をポリポット（直径１０．５ｃｍ、高さ９ｃｍ）に充填した。栃木県内の圃場土５００ｇに５００ｍLの滅菌したｍｉｌｌｉＱ水を添加し、攪拌後、円形定量ろ紙 Ｎo．５Ａ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過したろ液を土壌菌液とし、この菌液を上記１ポットあたり４５ｍＬ給水させた（試験区２～６）。土壌菌液なしの試験区１は滅菌水のみを同量給水させた。なお、土壌の水分量を調整するために別途水道水を１ポットあたり２００ｍＬ給水させた。なお、各試験区の反復数は４～６とした（ｎ＝４～６）。ヒヨコマメ（カブリ種）の種子を各ポットに２粒ずつ、土壌表面から約１～２ｃｍの深さで播種した。
中期肥効型培土（タキイ含水セル培土中期肥効型、タキイ種苗（株））とバーミキュライト細粒（あかぎ園芸（株））を体積比１：１で混合し、当該土壌をポリポット（直径１０．５ｃｍ、高さ９ｃｍ）に充填した。栃木県内の圃場土５００ｇに５００ｍLの滅菌したｍｉｌｌｉＱ水を添加し、攪拌後、円形定量ろ紙 Ｎo．５Ａ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過したろ液を土壌菌液とし、この菌液を上記１ポットあたり４５ｍＬ給水させた（試験区２～６）。土壌菌液なしの試験区１は滅菌水のみを同量給水させた。なお、土壌の水分量を調整するために別途水道水を１ポットあたり２００ｍＬ給水させた。なお、各試験区の反復数は４～６とした（ｎ＝４～６）。ヒヨコマメ（カブリ種）の種子を各ポットに２粒ずつ、土壌表面から約１～２ｃｍの深さで播種した。
（２）根粒菌の接種
Ｙｅａｓｔ－Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ＹＭ）培地（Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ＮａＣｌ ０．１ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．４ｇ、Ｍａｎｎｉｔｏｌ １０ｇ、蒸留水１Ｌ（ｐＨ６．８））に１．５％の寒天（和光純薬工業（株））を加えて固形培地を調製し、当該固形培地上でヒヨコマメ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）ＮＢＲＣ１００３８９Ｔ株を３０℃にて約７２時間静置培養した。生育した根粒菌を一白金耳とり、容積５００ｍＬの坂口フラスコ中のＹＭ液体培地５０ｍＬに植菌し、３０℃にて約７２時間振盪培養した。播種前日に濁度（ＯＤ６００）の値を滅菌水で０．１（３．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した根粒菌培養液１ｍＬを、播種時に、マイクロピペッターを用いて種子に滴下接種した（試験区３および４）。また、播種前日にプラテンセインが１．５ｐｐｍ（終濃度０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシド含有）となるように培養液１ｍＬあたり１．５μｇのプラテンセインを添加し、２４時間培養したものも上記と同様に濁度を調整して、播種時に１ｍＬ接種した（試験区５）。
Ｙｅａｓｔ－Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ＹＭ）培地（Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ＮａＣｌ ０．１ｇ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．４ｇ、Ｍａｎｎｉｔｏｌ １０ｇ、蒸留水１Ｌ（ｐＨ６．８））に１．５％の寒天（和光純薬工業（株））を加えて固形培地を調製し、当該固形培地上でヒヨコマメ根粒菌（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）ＮＢＲＣ１００３８９Ｔ株を３０℃にて約７２時間静置培養した。生育した根粒菌を一白金耳とり、容積５００ｍＬの坂口フラスコ中のＹＭ液体培地５０ｍＬに植菌し、３０℃にて約７２時間振盪培養した。播種前日に濁度（ＯＤ６００）の値を滅菌水で０．１（３．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）に調整した根粒菌培養液１ｍＬを、播種時に、マイクロピペッターを用いて種子に滴下接種した（試験区３および４）。また、播種前日にプラテンセインが１．５ｐｐｍ（終濃度０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシド含有）となるように培養液１ｍＬあたり１．５μｇのプラテンセインを添加し、２４時間培養したものも上記と同様に濁度を調整して、播種時に１ｍＬ接種した（試験区５）。
（３）プラテンセインの施用
１．５μｇのプラテンセインを次の様に施用した。すなわち、プラテンセインが１．５ｐｐｍ（終濃度０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシド含有）となるように溶解したプラテンセイン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社）の溶液を、マイクロピペッターを用いて１ｍＬずつ種子の上に滴下した（試験区４および６）。
１．５μｇのプラテンセインを次の様に施用した。すなわち、プラテンセインが１．５ｐｐｍ（終濃度０．１（ｖ／ｖ）％ジメチルスルホキシド含有）となるように溶解したプラテンセイン（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ社）の溶液を、マイクロピペッターを用いて１ｍＬずつ種子の上に滴下した（試験区４および６）。
（４）栽培条件
栽培は屋内で行い、栽培条件は、明期１６時間、２５℃、ＬＥＤ光源、光量４００～４４０μｍｏｌ／ｍ2／ｓとした。播種から７日後に、１ポットあたり１植物となるように間引きを行った。水やりは、ポットの下に置いたバットの水がなくなった後に、新たにポットの下部５ｃｍ程度が浸かる量の水道水をバットに加えることで行った。２１日間栽培を行った後、ポットから植物体を取り出し、水で根を洗浄してから根粒を採取した。採取した根粒について、植物個体あたりの根粒新鮮重及び根粒数の測定を行った。また、植物体を１００℃で３日間乾燥させたのち、植物体の地上部乾燥重及び地下部乾燥重を測定した。
栽培は屋内で行い、栽培条件は、明期１６時間、２５℃、ＬＥＤ光源、光量４００～４４０μｍｏｌ／ｍ2／ｓとした。播種から７日後に、１ポットあたり１植物となるように間引きを行った。水やりは、ポットの下に置いたバットの水がなくなった後に、新たにポットの下部５ｃｍ程度が浸かる量の水道水をバットに加えることで行った。２１日間栽培を行った後、ポットから植物体を取り出し、水で根を洗浄してから根粒を採取した。採取した根粒について、植物個体あたりの根粒新鮮重及び根粒数の測定を行った。また、植物体を１００℃で３日間乾燥させたのち、植物体の地上部乾燥重及び地下部乾燥重を測定した。
（５）結果
測定結果を図７～８に示す。図中のグラフは平均値±標準偏差を表す。なお、有意差検定はＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法を用いて行い、各群間で異なる文字（a、ab、b）は有意差（Ｐ＜０．０５）が認められたことを示す。
試験区１、２およびプラテンセイン単独施用区である試験区６ではほとんど根粒が着生しなかった。試験区３では根粒菌接種により着生数が増加したが、効果は限定的であった。播種時にプラテンセインを根粒菌と同時に施用する試験区４、ならびにプラテンセインを根粒菌の培養液に事前に添加し２４時間培養したものを接種する試験区５では、根粒数がそれぞれ試験区３に対して２．３倍および２．５倍であった（図７）。根粒重も同様に、試験区３に対して試験区４および５ではそれぞれ２．３倍および２．２倍であった（図８）。
以上のことから、プラテンセインを根粒菌と同時に施用した場合、および根粒菌培養液へプラテンセインを事前添加した場合のいずれにおいても、根粒菌単独接種またはプラテンセイン単独施用に対して根粒着生効果が相乗的に高まることが明らかとなった。
測定結果を図７～８に示す。図中のグラフは平均値±標準偏差を表す。なお、有意差検定はＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法を用いて行い、各群間で異なる文字（a、ab、b）は有意差（Ｐ＜０．０５）が認められたことを示す。
試験区１、２およびプラテンセイン単独施用区である試験区６ではほとんど根粒が着生しなかった。試験区３では根粒菌接種により着生数が増加したが、効果は限定的であった。播種時にプラテンセインを根粒菌と同時に施用する試験区４、ならびにプラテンセインを根粒菌の培養液に事前に添加し２４時間培養したものを接種する試験区５では、根粒数がそれぞれ試験区３に対して２．３倍および２．５倍であった（図７）。根粒重も同様に、試験区３に対して試験区４および５ではそれぞれ２．３倍および２．２倍であった（図８）。
以上のことから、プラテンセインを根粒菌と同時に施用した場合、および根粒菌培養液へプラテンセインを事前添加した場合のいずれにおいても、根粒菌単独接種またはプラテンセイン単独施用に対して根粒着生効果が相乗的に高まることが明らかとなった。
Claims (12)
- 下記式（１’）：
で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの根粒形成促進剤。 - 下記式（１’）：
で表されるメチル化イソフラボン類を有効成分とするヒヨコマメの収量増加剤。 - 下記式（１）：
で表されるメチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌を含有するヒヨコマメの根粒形成促進又は収量増加用組成物。 - 根粒菌とメチル化イソフラボン類の含有量比であるメチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数ｃｆｕが１０５～５×１０９である、請求項３記載の組成物。
- 根粒菌及びメチル化イソフラボン類の含有量が、組成物１ｇあたり、根粒菌数が１０４～１０１１ｃｆｕ、メチル化イソフラボンが０．０１～１０，０００μｇである、請求項３又は４記載の組成物。
- 下記式（１’）：
で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの根粒形成促進方法。 - 下記式（１’）：
で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの収量増加方法。 - 下記式（１’）：
で表されるメチル化イソフラボン類を土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの栽培方法。 - 下記式（１）：
で表されるメチル化イソフラボン類とヒヨコマメを宿主とする根粒菌を組み合わせて土壌又は植物に施用する工程を含む、ヒヨコマメの根粒形成促進方法又はヒヨコマメの収量増加方法。 - 前記メチル化イソフラボン類及びヒヨコマメを宿主とする根粒菌を含有する組成物を土壌又は植物に施用する、請求項９記載の方法。
- 根粒菌とメチル化イソフラボン類の施用量比であるメチル化イソフラボン類１μｇに対する根粒菌数ｃｆｕが１０５～５×１０９である、請求項９又は１０記載の方法。
- 土壌がヒヨコマメの栽培が可能な土壌から調製した土壌菌液を添加した土壌である、請求項６～１１のいずれか１項記載の方法。
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