JP7346526B2 - 養子細胞療法のための改良された細胞培養法 - Google Patents
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Description
この出願は、2010年12月8日に出願した「養子細胞療法のための改良された細胞培養法」(IMPROVED METHODS OF CELL CULURE FOR ADOPTIVE CELL THERAPY)(以後「親出願」)なる名称の米国特許第12/963597号の一部継続出願である。この米国特許は、2009年12月8日に出願した「養子細胞療法のための改良された細胞培養法」(IMPROVED METHODS OF CELL CULURE FOR ADOPTIVE CELL THERAPY)なる名称の米国仮特許出願第61/267761号の優先権を主張している。これらの文献はここで参照によりその全文を援用する。
接着細胞:生育面に付着した細胞
抗原提示細胞(APC):目的の細胞にトリガを加える作用をして特定の抗原に反応する細胞。
CTL:細胞傷害性T細胞
細胞密度:細胞の数と培地の単位体積との比率(細胞数/ml)
目的の細胞:作製プロセスによって量を増殖させたり回収させたりすることを目的としている特定のタイプの細胞。一般に、目的の細胞は非接着性であり、例としては、調節性T細胞(Treg)、ナチュラルキラー細胞(NK)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、初代Tリンパ球、および広範囲の抗原特異性細胞、そして他の多くのもの(それらのすべてがそれらの機能、in-vivo永続性、安全性を改変するために遺伝子操作も可能である)が含まれる。治療用途で必要な細胞は、フィーダ細胞や抗原提示細胞の一方あるいは両方を使って増殖させることができる。それらには、PBMC、PHAブラスト(blast)、OKT3 T、Bブラスト、LCL、およびK562(自然の、あるいは発現するように遺伝子改変されており、抗原および/あるいはエピトープや、41BBL、OX40、CD80、CD86、HLAなどの補助刺激分子など、その他多数)が含まれ、これらはペプチドあるいはその他の関連の抗原でパルスされていてもされていなくてもよい。
EBV:エプスタイン・バール・ウィルス
EBV-CTL:特異性で(specifically)認識されるEBV感染した細胞、あるいはそのT細胞表面受容体を介してEBV誘導ペプチドを発現あるいは提示する細胞。
EBV-LCL:エプスタイン・バール・ウィルスによって形質転換されたBリンパ芽球様細胞株。
フィーダ細胞:目的の細胞を量的に増殖させるよう作用する細胞。環境によっては抗原提示細胞もフィーダ細胞として作用することがある。
生育面:培養器具の中で細胞が上に載っている領域。
培養開始時:一般に培養プロセスの開始時や作製サイクルの開始時における条件のことを指している。
培地交換:細胞に栄養分を供給することと同義であり、通常は古い培地に新鮮な培地を補充するプロセスのことである。
PBMC:末梢血から抽出された末梢血単核細胞であり、目的の細胞のいくらかの源であり、フィーダ細胞として作用することができる。
レスポンダ(R):刺激細胞に反応する細胞。
静置細胞培養:培養器具がルーチンの操作のために場所を移されるとき、かつ/あるいは細胞に新鮮な培地などが定期的に供給されるときを除いて、撹拌あるいは混合されることのない培地中での細胞培養方法である。一般に、静置培養の培地は静穏状態にある。培地は、潅流システム(培地が容器の中を常時移動する)や、培地を動かすために培養器具が物理的に振動させられる振動システム、撹拌システム(そこでは器具内で撹拌棒が動いて培地と細胞を撹拌する)、あるいは培養のときに培地を動かし混合するために使用されるその他の任意の機構あるいは装置で起きるような強制的な動きは被らない。細胞は器具中で生育面に沈降し、ときどき行われる供給の期間を除いて乱されない状態でそこに存在する。供給の時には、培養物は、まず培地を取り出し、そのあと培地を追加することによって、あるいは培地を取り出さずに培地を追加することによって、あるいは培地および細胞を取り出し、その培地および細胞を新しい器具へ移してこれらの器具に新鮮な培地を追加することによって、新鮮な培地が提供される。供給プロセスを補助するポンプは一般的なものである。例えば、ガス透過性細胞培養バッグは、通常、閉じたシステムの中で流体を移動させるのに重力あるいはポンプに頼っている。培養期間の大部分は、細胞や培地が静穏で撹拌されない状態で存在する期間である。この発明は細胞静穏培養法を目指している。
刺激:抗原提示細胞および/あるいはフィーダ細胞が目的の細胞に対して有する効果。
スティミュレータ(S):レスポンダ細胞に影響を与える細胞。
表面密度:その上に細胞が載っている器具内の生育面の単位面積当たりの細胞の量。
懸濁細胞:生育面に付着する必要のない細胞であり、非付着細胞と同義である。
この例のデータは、標準的な24ウェルの組織培養プレート(すなわちウェル1つ当たりの表面積2 cm2)において、ウェル一つ当たり体積2 mlの培地(すなわち培地高さ1.0 cmの、表面積に対する培地体積の比1 ml/cm2)を用いて、EBV-CTLを作製する従来の培養方法の限界を示している。
細胞表面:フィコエリトリン(PE)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ペリオジンクロロフィルタンパク質(PerCP)、およびベクトン・ディッキンソン社(Becton-Dickinson)(米国カリフォルニア州マウンテンビュー)から入手したCD3、CD4、CD8、CD56、CD16、CD62L、CD45RO、CD45RA、CD27、CD28、CD25、CD44に対するアロフィコシアニン(APC)共役モノクローナル抗体(MAb)で細胞を染色した。PE共役四量体(ベイラー医科大学(Baylor College of Medicine))とAPC共役五量体(英国オックスフォードのプロイミューン社(Proimmune)製)を使用して、EBV-CTL前駆体の頻度を定量した。細胞表面および五量体の染色に対して、FACSCaliburフローサイトメータ上でそれぞれ10000および100000の生体イベントを採取して、Cell Questソフトウェア(Becton Dickinson)を用いてデータを分析した。
作製サイクルの開始時における目的の細胞の個体数の表面密度を下げること、レスポンダ細胞とスティミュレータ細胞との間の表面密度比率を下げること、生育面をガス透過性材料から構成すること、かつ/あるいは培地体積と生育面積との比率を大きくするという条件を含めた種々の条件を用いると、研究用および細胞療法の医療用途のための細胞作製がいかに促進され、簡略化されるかを当業者に示すために例1~8を示した。例1~8は抗原特異性T細胞の作製に関するものであったが、これらの新規な培養条件は、調節性T細胞(Treg)やナチュラルキラー細胞(NK)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、初代Tリンパ球、広範囲の抗原特異性細胞、およびその他の多く(それらのすべてが、それらの機能やin-vivo持続性あるいは安全性を改善するために遺伝子的組み換えすることができる)を含む治療に関連した(あるいは治療前のマウスモデルによる概念実証に必要な)多くの重要な懸濁細胞タイプに適用することができる。細胞はフィーダ細胞や抗原提示細胞があると増殖できるが、それらにはPBMC、PHAblast、OKT3 T、B blast、LCL、K562(自然の、あるいは発現するように遺伝子組み換えされたもの、および抗原やエピトープ、そして41BBL、OX40L、CD80、CD86、HLAなどの副刺激分子、その他多数)が含まれ、これらはペプチドやこれと関係のある抗原でパルスされていてもされていなくてもよい。
a.目的の細胞は抗原提示細胞および/あるいはフィーダ細胞の存在のもとにあり、培 地体積と表面積との比率は、生育面がガス透過性材料から構成されていないなら1 ml/c m2までであり、生育面がガス透過性材料から構成されているなら2 ml/cm2までであ り、
b.作製サイクルの開始時における好ましい表面密度条件は、ターゲットの細胞表面密 度が好ましくは0.5×106個/cm2以下になるような、またさらに好ましくは図4に記 載されているように低減するようなものであり、
c.目的の細胞の表面密度に、抗原提示細胞および/あるいはフィーダ細胞の表面密度 を加えたものが、好ましくは少なくとも約1.25×105個/cm2である。
a.抗原提示細胞および/あるいはフィーダ細胞の存在のもとで、また培地体積と表面積との比率を少なくとも2 ml/cm2として、ガス透過性材料から構成された生育面積の上に目的の細胞を播種し、
b.作製サイクルの開始時において、好ましい表面密度条件を確立して、ターゲットの表面密度を細胞約0.5×106個/cm2の従来の密度範囲内にし、
c.目的の細胞の個体数を従来の細胞約2×106個/cm2の表面密度を超えて増殖できるようにし、
d.もしもっと多くの目的の細胞が必要な場合は、目的の細胞をガス透過性材料から構成された別の生育面へ再分布して、十分な目的の細胞が得られるまで段階a~dを繰り返す。
a.抗原提示細胞および/あるいはフィーダ細胞が存在する状態で、また培地体積と表面積との比率を少なくとも2 ml/cm2として、ガス透過性材料から構成された生育面積の上に目的の細胞を播種し、
b.作製サイクルの開始時において好ましい表面密度条件を確立して、目的の細胞の表面密度を従来の密度よりも小さく、好ましくは約0.5×106個/cm2と約3900個/cm2の間にし、目的の細胞と抗原提示細胞および/あるいはフィーダ細胞の全数を少なくとも約1.25×105個/cm2にし、
c.目的の細胞の個体数を従来の約2×106個/cm2の表面密度を超えて増殖できるようにし、
d.もしもっと多くの目的の細胞が必要な場合は、目的の細胞をガス透過性材料から構成された別の生育面へ再分布して、十分な目的の細胞が得られるまで段階a~dを繰り返す。
A=培地のグルコースのベースライン濃度
B=個体数を推定する時間におけるグルコース濃度の測定値
C=最大表面密度に達するのに必要なグルコース濃度の全低下
D=培地のベースライン体積
E=ベースラインのあとに加えられた培地の体積
F=最大表面密度に達するのに必要な最小全培地体積
G=最大表面密度
E=生育面の面積
としたとき、[(A-B)/C]×[(D+E)/F]×G×E=器具内の培養個体群における推定細胞数。培地を追加しても表面密度が最大容積以上に増大することはないことから、比例配分された最小培地体積は100%を超えることはないことに注目のこと。例えば、もし最大表面密度に達するのに培養は10 mlが必要であるとし、培地のベースライン体積と追加された培地の体積の合計が10 mlを超えるなら、比例配分された最小培地体積としては100%を使用しなければならない。
培地のベースライン体積=10 ml
グルコース濃度のベースライン=475 mg/dl
培地の追加=0 ml
グルコースサンプル=300 mg/dl
生育面の面積=100 cm2
この場合、計算は以下のようになるであろう。
[((475 mg/dl-300 mg/dl)/250 mg/dl)×(10 ml+0 ml)/10 ml]×12E+06個/cm2×100 cm2= 840×106個。
培地のベースライン体積=6 ml
グルコース濃度のベースライン=475 mg/dl
培地の追加=2 ml
グルコースサンプル:300 mg/dl
生育面の面積=100 cm2
この場合、計算は以下のようになるであろう。
[((475 mg/dl-300 mg/dl)/250 mg/dl)×(6 ml+2 ml)/10 ml]×12E+06個/cm2×100 cm2= 672×106個。
培地のベースライン体積=6 ml
グルコース濃度のベースライン=475 mg/dl
培地の追加=7 ml
グルコースサンプル:300 mg/dl
生育面の面積=100 cm2
この場合、培養に追加された全培地体積は最大表面密度に達するのに必要な最小全培地体積を超えるため、比例配分された最小培地体積は100%に達し、したがって比例配分された値は1に等しく、計算は以下のようになるであろう。
[(475 mg/dl-300 mg/dl)/250 mg/dl×(1)]×12E+06個/cm2×100 cm2=840×106個。
a.ガス透過性材料から形成された生育面と、
b.器具が動作中は、生育面は水平状態にあり、
c.培地取り出し開口部を有する培地取り出し管と、
d.細胞取り出し開口部を有する細胞取り出し管と、
e.内部体積と
f.内部体積の最上部位置の境界を形成する上部境界と、
g.上部境界から生育面までの距離が可能な培地高さであり、上部境界から生育面までの距離が2.0 cmを超え、
h.生育面が水平状態にあるとき、培地取り出し管が生育面の上方にある距離が、生育面の少なくとも0.2 cm上方であり、可能な培地高さの50%を超えることはない。
a.細胞および培地を器具の中に追加し、
b.細胞は哺乳類のもので、非接着細胞タイプとし、
c.生育面を水平方向に向け、細胞を生育面の上に載せて、細胞培養に適した雰囲気中に、細胞培養に適した温度で細胞培養および細胞回収器具を設置し、
d.細胞を生育面の上に沈降させ、
e.生育面の上に沈降した細胞の数と、培地体積との比率が、初期の静置培養細胞密度であり、
f.生育面の上に沈降した細胞の数と、生育面の表面積との比率が、初期の静置培養表面密度であり、
g.培地体積と、生育面の表面積との比率が、初期の静置培養培地体積と生育面積との比率であり、
h.もっとも低い培地位置からもっとも高い培地位置までの距離が、初期の静置培養培地高さであり、
i.ある時間の間にわたって細胞が静置培養の状態に存在できるようにし、またさらに、細胞培養および細胞回収器具からの細胞を回収するために以下からなるステップを有し、
j.細胞を抜き取ることなく、細胞取り出し管の培地取り出し開口部を介して培地の一部を取り出す段階からなる回収前のステップであり、ここで器具中に残った培地体積が細胞回収培地体積であり、
k.生育面が水平状態にあるときに細胞回収培地のもっとも上の位置から細胞回収培地のもっとも下の位置までの距離が、細胞回収培地の高さであり、
l.細胞回収培地の体積と、生育面の表面積との比率が、細胞回収培地体積と生育面積との比率であり、
m.細胞回収培地体積と培地体積との比率が、培地の減少割合になり、以下からなる細胞回収ステップを有し、
n.細胞を細胞回収培地の中に混合する段階と、
o.回収培地中の細胞の数と、細胞回収培地の体積との比率が、回収した細胞密度になり、
p.細胞取り出し管の細胞取り出し開口部を介して、細胞と細胞回収培地を、細胞培養および細胞回収器具から取り出す段階。
Claims (22)
- 静置細胞培養のための細胞培養・細胞回収器具であって、
生育面と生育面に対向する上部限界とを境界とする細胞培養区画と、
生育面から離れて存在する培地取り出し開口部を含む培地取り出し管と、
生育面と接触している細胞取り出し管とを備え、
生育面は、液体不透過性かつガス透過性の材料を備え、ガス透過性材料の底部が生育面サポートに接触しており、生育面サポートは培養の間、ガス透過性材料を水平位置に保つものであり、生育面サポートによって、雰囲気ガスを強制的に接触させることなくガス透過性材料の下面に接触可能としており、
細胞取り出し管は、器具の下端に沿って配置される細胞取り出し開口部を含み、器具が細胞回収の向きにあるときに、生育面は水平でなく、細胞取り出し管が培地と細胞とを器具の低所から抜き取る働きをし、
器具が静置細胞培養の向きにあるときに、生育面が水平位置にあり、生育面から培地取り出し開口部までの距離が、生育面から上部限界までの距離の半分未満である、器具。 - 請求項1に記載の器具であって、器具が静置細胞培養の位置にあるときに、生育面から培地取り出し開口部までの距離が少なくとも0.2cmである、器具。
- 請求項1に記載の器具であって、生育面から培地取り出し開口部までの距離が2.0cmを超えない、器具。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具を用いた細胞培養の方法であって、細胞と培地を器具内に有し、器具が細胞培養に適した雰囲気ガスのある場所にあり、かつ、静置細胞培養の向きにある、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、細胞がT細胞を含む、方法。
- 請求項4または5に記載の方法であって、ガス透過性材料がシリコーンからなる、方法。
- 請求項4~6のいずれか一項に記載の方法であって、器具が2つ以上の培地取り出し開口部を含む、方法。
- 請求項4~7のいずれか一項に記載の方法であって、器具が透明であり、目視で評価可能である、方法。
- 請求項4~8のいずれか一項に記載の方法であって、器具が堅固である方法。
- 請求項4~6のいずれか一項に記載の方法であって、細胞取り出し管が上部限界より高い位置まで延びている、方法。
- 請求項4~10のいずれか一項に記載の方法であって、細胞培養に適した雰囲気ガスが、生育面との間でガスを行き来させるためのポンプまたはその他の機構を用いる必要なく、ランダムな動きによって生育面と接触するようになっている、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、細胞が膵島である、方法。
- 請求項4に記載の方法であって、もっとも高い培地位置が生育面と平行である、方法。
- 請求項1に記載の器具であって、ガス透過性材料が非多孔質である、器具。
- 請求項4~13のいずれか一項に記載の方法であって、培地取り出し管が入れ子式チューブである、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、細胞取り出し管が入れ子式チューブである、方法。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具であって、ガス透過性材料がシリコーンから なる、器具。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具であって、2つ以上の培地取り出し開口部を 含む、器具。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具であって、透明であり、目視で評価可能であ る、器具。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具であって、堅固である、器具。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具であって、細胞取り出し管が上部限界より高 い位置まで延びている、器具。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の器具であって、培地取り出し管が入れ子式チュー ブである、器具。
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