JP7335200B2 - 二つのベクターから発現されたｃａｓ９タンパク質を利用した遺伝子発現調節方法 - Google Patents

二つのベクターから発現されたｃａｓ９タンパク質を利用した遺伝子発現調節方法 Download PDF

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Description

本発明は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを各々細胞内に導入する工程を含む、遺伝子発現調節方法、前記組換えベクターを含む組成物、遺伝子発現調節用キット、及びＣａｓ９タンパク質の細胞内製造方法に関する。
また、本発明は、前記第一のドメインをパッケージングするウイルスベクター及び第二のドメインをパッケージングするウイルスベクターが導入された形質転換細胞及びこれから産生されたウイルスを含む組成物に関する。
現在、遺伝子工学で広く有用に使われているツールとして、制限酵素は現在分子生物学の研究の最も重要なツールの一つである。しかし、ゲノムサイズのＤＮＡを扱うのに有用な制限酵素として新しいＤＮＡ塩基配列の認知と「ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ」、すなわち９ｂｐ以上のＤＮＡを認知して切ることができる制限酵素の必要性が台頭するに伴い、様々な試みがなされてきた。
その一環として、細胞及び生物内で内在性遺伝子の変異、ターゲット遺伝子の挿入、及び染色体再配列を引き起こすことができるツールとしてメガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ジンク－フィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮｓ）及びＴＡＬ－エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮｓ）のような人工ヌクレアーゼが開発され、遺伝子工学で強力で多目的なツールとして生命工学、医薬などの分野で有用に使用することができる。近年、微生物の免疫体系として知られているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用した第３世代の遺伝子ハサミ、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）が開発されてから、生命工学分野のすべての分野で新たな発見や技術革新をもたらしている（Ｋｉｍ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２０１４，１５：３２１－３３４）。
前記のような人工ヌクレアーゼは、細胞内で特異的な標的塩基配列を認識して、ＤＮＡ二本鎖の損傷（ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢｓ）を引き起こす。誘発された細胞内ＤＳＢは、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）と非相同末端結合（ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）に区別される細胞の二つの内在的ＤＮＡ修復機序によって復旧できるが、この時、標的特異的な突然変異及び遺伝子改変が起こるようになる。真核細胞及び生物内で相同のＤＮＡ提供者が不在する時は、ヌクレアーゼによって誘導されたＤＳＢは、ＨＲに比べて段違いにＮＨＥＪ機序で復旧できる。ＨＲによる変異は、ＨＲ提供者ＤＮＡにある配列が、正確にコピーされて起こるが、ＮＨＥＪによる変異は、ランダムに起きるようになる。ＮＨＥＪは、エラーが発生しやすい（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）修復機序であるため、ＤＳＢが起こった部位で小さなサイズの挿入／欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ：ｉｎｄｅｌ突然変異）が起こることがあり、これはフレームシフト（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ）突然変異を誘発して遺伝子変異を引き起こす。
特に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ９タンパク質は、真核細胞及び生物内の遺伝子改変を設計するのに有用なツールであるにもかかわらず、これをコードする遺伝子のサイズが大きいため、ウイルスベクター内に挿入して細胞内に伝達しようとする場合、ウイルスベクターのパッケージングの限界によってウイルス産生効率及び細胞内への伝達効率が落ちる問題がある。そこで、Ｃａｓ９タンパク質をウイルスベクターを介して発現させるための研究が必要な実情である。
本発明者等は、ウイルスベクターのパッケージングの限界を克服して、ウイルスベクターを利用してＣａｓ９タンパク質を発現させることができるシステムを開発するために鋭意努力した結果、Ｃａｓ９タンパク質をウイルスベクターにパッケージできる大きさの二つのドメインに分けた後、前記各ドメインを発現させることができる組換えベクターを作製し、前記組換えベクターを細胞内に導入して、各ドメインが融合されて、ゲノム上の標的ＤＮＡに対してＩｎｄｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）効果を示すことを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の目的は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを各々細胞内に導入する工程を含む、遺伝子発現調節方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを含む組成物を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記組成物を含む遺伝子発現調節用キットを提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインをパッケージングするウイルスベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインをパッケージングするウイルスベクターが導入された形質転換細胞を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換細胞の培養液または溶解物を含む組成物を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを各々細胞内に導入する工程を含む、Ｃａｓ９タンパク質の細胞内製造方法を提供するところにある。
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質の標的特異性を向上させることができ、また、Ｃａｓ９タンパク質をウイルスベクターにも適用することができるようにするため、Ｃａｓ９タンパク質を利用した遺伝子発現調節に有用に使用できる。
Ｃａｓ９タンパク質の第一のドメインと第二のドメインを各々含む組換えベクターを作製した後、細胞内に導入させて発現させることにより、これらの各タンパク質が細胞内で融合して完全なＣａｓ９タンパク質（Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９と命名）を形成する模式図を示したものである。 細胞内でＳｐｌｉｔ－Ｃａｓ９タンパク質が形成されてｓｇＲＮＡと共に作用して、ＨＰＲＴ、ＤＭＤ及びＣＣＲ５遺伝子の全てにＩｎｄｅｌを誘導することをＴ７Ｅ１分析を介して確認した結果を示したものである（１）Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ、２）第二のドメイン＋ｓｇＲＮＡ、３）第一のドメイン＋ｓｇＲＮＡ、４）Ｍｏｃｋ）。 Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９タンパク質の標的遺伝子に対する変異効率をｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎシーケンスを介して分析した結果を示したものである。 Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９タンパク質の標的遺伝子に対する特異性を分析した結果を示したものである。（ａ）Ｈｅｌａ細胞及び（ｂ）Ｈｅｐ１細胞で標的位置（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）と、各非標的位置（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）における遺伝子変異効率をｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎシーケンスを介して分析した結果を示したものである。特異性は、標的位置の変異効率を４つの非標的位置における各変異効率で割った比（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｒａｔｉｏ）で分析した。 ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９のベクター作製及び機能を確認した結果を示したものである。（ａ）及び（ｂ）ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９を伝達するアデノ随伴ウイルスベクター作製を模式化したものである。アデノ随伴ウイルスベクター内にＵ６プロモーター、ｓｇＲＮＡ、ＥＦＳプロモーター、第一のドメインが順次挿入されて一つのベクター内にパッケージングするウイルスベクターを作製した。また、第二のドメインを含むか、第二のドメインとＵ６プロモーター、ｓｇＲＮＡを同時にパッケージングすることができるアデノ随伴ウイルスを作製した。（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター内にＵ６プロモーター、ｓｇＲＮＡ、ＥＦＳプロモーター、第一のドメインがパッケージングされているウイルスと第二のドメインをパッケージングするウイルスを各々１０、５０、１００ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）でＨｅｌａ細胞に同時感染させた後、５日、７日、１０日後にＤＭＤ遺伝子の変異を誘導することをｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎシーケンスを介して分析した結果を示したものである。
前記目的を達成するための本発明の一具現例は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを各々細胞内に導入する工程を含む、遺伝子発現調節方法を提供する。
本発明において、用語「遺伝子発現調節」とは、遺伝子の発現を増加させるか、減少させるいずれの行為をいう。特に、本発明の目的上、前記遺伝子発現調節はＣａｓ９タンパク質によって行われるものであってもよい。具体的に、Ｃａｓ９タンパク質を利用して遺伝子の発現を増加させるか、減少させるすべての方法が本発明の範囲に含まれてもよい。例えば、前記遺伝子発現調節は、ゲノム編集、遺伝子発現増加または遺伝子発現減少を意味してもよい。
本発明において用語、「ゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）」とは、ヒト細胞をはじめとする動植物の細胞のゲノム塩基配列に標的化された突然変異を導入することができる技術であって、特定の遺伝子をノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）またはノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）するか、タンパク質を生成しない非－コードＤＮＡ配列に変異を導入することをいう。また、ゲノム編集を介してゲノム上のＤＮＡを欠失、重複、逆位、交換、または再配列させることができる。
本発明で、「欠失」とは、染色体の一部またはＤＮＡ上の塩基の一部が欠落して起こる突然変異をいう。
本発明で、「重複」とは、ゲノム内に同じ遺伝子が２つまたはそれ以上存在することをいう。
本発明で、「逆位」とは、ゲノムの一部が元のゲノムと比較すると逆転して配置されたものをいう。
本発明で、「交換」とは、一つのヌクレオチド配列が互いに交換されること（つまり、情報を有する配列の交換）を意味し、必ずしも一つのポリヌクレオチドが他のポリニュークレテッドに化学的または物理的に交換されるだけを意味するものではない。
本発明で、「再配列」とは、染色体上の遺伝子の位置及び順序の変化を起こす構造的変化を意味し、トランスポゾンなど転移因子が挿入されることも含まれる。さらに、ＤＮＡ分子内で塩基再配列による遺伝情報の変換を含むことができる。
本発明で、「Ｃａｓ９タンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの主要タンパク質構成要素で、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）及び複合体を形成して活性化されたエンドヌクレアーゼまたはｎｉｃｋａｓｅを形成する。
Ｃａｓ９タンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから取得することができるが、これに限定されない。例えば、前記Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列でコードされるものであり得るが、これに限定されずガイドＲＮＡと共に標的特異的ヌクレアーゼ活性を有することができるものであれば、いずれも本発明の範囲に含まれ得る。また、Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）と連結され得る。前記タンパク質伝達ドメインは、ポリ－アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であり得るが、これに限定されない。さらに、前記Ｃａｓ９タンパク質は、その目的に応じて当業者によって追加のドメインが適切に連結され得る。
また、前記Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９だけではなく、不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）のようなＣａｓ９の変異体を全て含むことができる。前記不活性化されたＣａｓ９は、ｄＣａｓ９にＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを連結したＲＦＮ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、または転写活性因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）または抑制ドメイン（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｄｏｍａｉｎ）を連結したｄＣａｓ９であってよく、前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９またはＨ８４０Ａ Ｃａｓ９であり得るが、これに限定されない。
本発明のＣａｓ９タンパク質は、その由来においてもこれに制限されない。前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、フランシセラ‐ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、またはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）の由来であってもよい。本発明の目的上、前記Ｃａｓ９タンパク質は、サイズが大きいので、ウイルスベクターで効果的に発現されることができないものであってもよいが、これに制限されない。
本発明では、Ｃａｓ９をウイルスベクターで発現させるために、Ｃａｓ９の一部分を発現することができるベクターを作製した。つまり、Ｃａｓ９タンパク質をウイルスベクターでパッケージングが可能な大きさに分けて、各ベクターで発現させようとした。本発明でＣａｓ９タンパク質の第一のドメイン及び第二のドメインは、Ｃａｓ９タンパク質の一部の部位を指し示すもので、これらが別途のベクターで発現されて細胞内で融合されるようにしたものである。本発明では、前記のような方法で作製されたＣａｓ９タンパク質を「ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９」と命名した（図１）。
本発明のｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９は、既存のサイズが大きくて、ウイルスベクターなどを介してパッケージングできなかったＣａｓ９タンパク質をパッケージング可能なサイズに分けてこれらを各々ベクターを介して発現させても、細胞内でその機能を失わないことを技術的特徴とする。
本発明で用語「第一のドメイン」とは、前記のような目的のために切断されたＣａｓ９の一部を発現させる場合、元のＣａｓ９タンパク質のＮ－末端部位を含むドメインをいい、「第二のドメイン」とは、元のＣａｓ９タンパク質のＣ－末端部位を含むドメインをいう。これらの各ドメインは、本発明の「ハーフドメイン」との用語と混用して使用した。前記各ドメインは、ウイルスベクターで発現させるためのものであるため、各ウイルスベクターでパッケージングできるサイズである４００ｂｐ～３．７ｋｂｐの大きさであり得る。具体的には、本発明では、前記第一のドメイン及び第二のドメインが融合されて、元のＣａｓ９タンパク質全体を構成するので、一つのドメインの大きさは、Ｃａｓ９タンパク質全体のサイズから他の一つのドメインのサイズを差し引いたものになる。
本発明の具体的な一実施例では、第一のドメインを２．１ｋｂｐ、第二のドメインを１．９ｋｂｐにしてプラスミドベクターやウイルスベクターに導入し、前記各ベクターを利用して細胞内でｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９が標的位置でＩｎｄｅｌを誘導することができることを確認した。
また、前記第一のドメイン及び第二のドメインは、その目的に応じて当業者によって特定機能を有するヌクレオチドを追加して製造することができ、例えば、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、タグ（ｔａｇ）配列、またはスプライシングドナー（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ）／スプライシングアクセプタ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ）配列などをさらに含むことができる。さらに、これに限定されないが、前記第一のドメインは、配列番号３のヌクレオチドでコードされるものであってもよく、第二のドメインは、配列番号５のヌクレオチドでコードされるものであってもよい。
本発明で「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
本発明で「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と目的するタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、本発明のヌクレアーゼのＤＮＡ第一のドメインまたはＤＮＡ第二のドメインを暗号化する配列は、プロモーターに作動可能に連結させることで、前記暗号化配列の発現は、このプロモーターの影響または調節下にあるようになる。二つの核酸配列（ＤＮＡ第一のドメインまたはＤＮＡ第二のドメインを暗号化する配列と、この配列の５’末端のプロモーター部位配列）は、プロモーター作用が誘導されることで、前記暗号化配列が転写される場合、作動可能に連結されたものであり、前記二つの配列間の連結特性がフレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導せず、発現調節配列が、前記各ドメインの発現を支配する能力を阻害しない場合、作動可能に連結された。組換えベクターとの作動可能な連結は、当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができて、部位－特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で一般に知られた酵素などを使用して行うことができる。
本発明のベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含むことができ、目的に応じて多様に製造されることができる。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性でありうる。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができ、複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができる。ベクターは、自己複製するか宿主ＤＮＡに統合され得る。前記ベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、ウイルスベクターなどを含むことができ、具体的には、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）など、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）などから由来したベクターを含むか、これに制限されない。
本発明で、「細胞内に導入する工程」は、当業界に知られている公示のいかなる方法も使用することができ、形質感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）または形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によって外来ＤＮＡを細胞に流入させることもできる。形質感染は、カルシウムホスフェート－ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン－媒介形質感染法、ポリブレン－媒介形質感染法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミンおよび原形質体融合法などの当分野で公知の様々な方法によって行われてもよい。
本発明の一実施例では、Ｃａｓ９タンパク質中、第一のドメインと第二のドメインを各々コードする各組換えベクターを作製した後（図１）、これを細胞内に導入させて発現された各ドメインが細胞内で融合して完全な形態のＣａｓ９タンパク質として機能することを確認した。具体的には、各ハーフドメインである第一のドメイン及び第二のドメインを各々発現する組換えベクターから各ハーフドメインが発現した後、融合して形成されたＣａｓ９タンパク質がｓｇＲＮＡと共に作用して、ターゲット遺伝子全てにＩｎｄｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を誘導することを確認した（図２及び図３）。
本発明の他の一実施例では、Ｈｅｌａ細胞及びＨｅｐ１細胞でｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９タンパク質を利用して標的特異性を確認した結果、野生型Ｃａｓ９の特異性に比べて８０倍～２２０倍のレベルで顕著に増加することを確認した（図４）。これは、本発明のｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９を細胞内で発現させる場合、非標的効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）を最小化して、所望の標的位置に作用するようにできることを示唆している。
さらに、本発明の他の一実施例では、ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９をアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターを利用して発現させて、産生されたウイルスを細胞に感染させた結果、有効にＩｎｄｅｌを誘導することを確認した（図５）。そこで、本発明のｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９を使用して、ウイルスベクターを介しても効果的にＣａｓ９タンパク質を利用することができることを確認した。
具体的には、前記細胞内導入時、配列特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を追加で導入することができる。より具体的には、前記各ベクター、ガイドＲＮＡの導入は、同時、順次、または逆順に行うことができる。
本発明で、「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」は、二つのＲＮＡ、すなわち、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）で構成されてもよい。また、前記ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主な部分の融合で製造されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ＲＮＡ）であってもよい。また、前記ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡであってもよい。
第３世代の遺伝子ハサミとして知られているＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質及びｄｕａｌ ＲＮＡで構成されるか、Ｃａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡで構成され得る。ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に一つ以上の追加のヌクレオチドを含むことができ、ＲＮＡまたは前記ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞内に伝達され得る。
本発明のさらに他の具現例は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを含む組成物を提供する。前記組成物を前記細胞内に導入して所望の遺伝子の発現を調節することができる。前記組成物は、配列特異的なガイドＲＮＡをさらに含んでもよい。Ｃａｓ９タンパク質及び組換えベクターは前述した通りである。
本発明の一実施例では、前記第一のドメインを発現する組換えベクター及び第二のドメインルル発現する組換えベクターを細胞内に導入した。これは、ベクター内にパッケージングが困難な大きさを有するＣａｓ９タンパク質をより効率的に細胞内に伝達して発現させるためのものであり、前記各組換えベクターを含む組成物を利用して、細胞内でＣａｓ９タンパク質をより容易に発現させることができる。前記組成物は、第一のドメインを発現する組換えベクター及び第二のドメインを発現する組換えベクターの他にも、細胞を維持することができる培地用組成物または組換えベクターを細胞内に導入するのに必要な物質は、制限せず含むことができる。
本発明のさらに他の具現例は、前記Ｃａｓ９タンパク質の第一のドメインを発現する組換えベクター及び第二のドメインを発現する組換えベクターを含む、遺伝子発現調節用キットを提供する。具体的には、前記キットは、配列特異的なガイドＲＮＡをさらに含んでもよい。
また、前記キットは、組換えベクターの発現が行われるか促進できるようにする物質または細胞を維持できるようにする培地用組成物だけでなく、組換えベクターの作製や細胞内への導入などを容易にできる組成物、組換えベクターの作製または細胞内への導入のための説明書などを含むことができる。
本発明のさらに他の具現例は、Ｃａｓ９タンパク質の第一のドメインをパッケージングするウイルスベクター及び第二のドメインをパッケージングするウイルスベクターが導入された形質転換細胞を提供する。
本発明で用語「形質転換細胞」とは、宿主細胞に目的とするポリヌクレオチドを導入した細胞を意味する。形質転換は、前記「導入」方法によって行われることができ、当分野で公示された通り、宿主細胞により適した標準技術を選択して行うことができる。
前記「宿主細胞」は、一つ以上のＤＮＡまたはベクターが導入される真核または原核細胞を指し、特定対象細胞だけではなく、その子孫あるいは潜在的子孫も指すものと理解されるべきである。突然変異あるいは環境的影響により、前記子孫が親細胞と完全に同一でなくても、本明細書で使用されたように、前記用語のカテゴリ内に含まれる。本発明で、前記形質転換細胞は、各ハーフドメインをコードするウイルスベクターが導入されたもので、これからＣａｓ９の各ドメインをコードするヌクレオチドをパッケージングするウイルスを取得することができる。具体的には、前記形質転換細胞の培養液または前記細胞の溶解物から前記ウイルスを取得することができる。
前記細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞、イースト、真菌、原生動物、高等植物、昆虫などの真核細胞、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ－１のような哺乳類細胞などが含まれることができ、前記例示に限定されるものではない。
また、体細胞、生殖細胞、逆分化幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞など、ヒトのすべての細胞に適用することができる。
前記体細胞は、胚だけでなく、子供、成人の体から得られる生殖細胞を除くすべての細胞をいい、これらから由来した遺伝子改変細胞まで含むことができる。また、前記成体幹細胞は、ヒト胚（ｅｍｂｒｙｏ）、新生児及び成人の体から得られるすべての成体幹細胞だけでなく、臍帯血由来の幹細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、胎盤由来幹細胞（ｐｌａｃｅｎｔａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、臍帯幹細胞（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、羊水幹細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、羊膜上皮幹細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）など胚体外幹細胞（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と、これらから派生した遺伝子改変細胞を含むことができる。
また、前記細胞は、培養された細胞（試験管内）、移植片及び１次培養物（試験管内及び生体外）及び生体内細胞であってもよく、当業界で通常使用される細胞であって、その制限をかけない。
本発明のさらに他の具現例は、前記形質転換細胞の培養液または細胞溶解物を含む組成物を提供する。形質転換細胞、これの培養液及び溶解物は、前記説明した通りである。前記組成物は、各ドメインをコードするヌクレオチドをパッケージングするウイルスを含むため、遺伝子発現調節の用途で使用することができる。
本発明は、Ｃａｓ９タンパク質に対するベクターパッケージの限界を克服し、前記Ｃａｓ９タンパク質の切断された二つの部位を各々独立して発現させる組換えベクターを作製して、これを細胞内に伝達して発現させることにより、Ｃａｓ９タンパク質の細胞内への伝達効率を増加させたものである。したがって、本発明者等が開発した本発明の原理を利用して、細胞の種類、Ｃａｓ９タンパク質の種類に関係なく適用して細胞内への伝達効率を増加させて遺伝子発現を効率的に調節することができる。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。しかし、下記の実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明が下記の実施例によって限定されるのではない。
実施例１．Ｃａｓ９タンパク質の第一のドメイン及び第二のドメインを各々発現させる組換えベクターの作製
野生型（Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ＷＴ）Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）タンパク質（配列番号２）の中間部位に存在するｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｌｉｎｋｅｒ（配列番号９；ａｇｃｇｇｃｃａｇｇｇｃ；ＳＧＱＧアミノ酸をエンコードするシーケンス）の中間部位を切断してＳＧアミノ酸とＱＧアミノ酸が第一のドメインと第二のドメインに各々連結された二つのハーフドメインを作製した。
各ハーフドメインは、ＣＭＶプロモーターによって独立した発現が誘導されるようにした。第一のドメインの切断３’－ｅｎｄの部位に停止コドン（Ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）をＰＣＲクローニングを介して挿入することにより、発現が完了できるようし、第二のドメインの切断５’－ｅｎｄの部位に開始コドン（Ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）を連結して発現が開始できるように作製した。第一のドメインの５－ｅｎｄ部位の開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）の下方にＨＡタグ（ｔａｇ）とＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）が順次挿入されており、第二のドメインの３’－ｅｎｄと停止コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）との間にＮＬＳ部位とＨＡタグを順次挿入して、核内への伝達及びＨＡ抗体でタンパク質の発現量を測定することができるように作製した。
実施例２．各ハーフドメインを発現させる組換えベクターとｓｇＲＮＡの細胞内への導入及びターゲット遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）確認
前記実施例１で作製した各ハーフドメインを発現させる組換えベクターとＣＣＲ５、ＨＰＲＴ及びＤＭＤの各遺伝子に対するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を発現する各プラスミドをリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）を利用した形質注入でＨｅｌａ細胞内に伝達した。
ＣＣＲ５遺伝子の対立遺伝子ノックアウトのために使用できる標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、すべてのヒトに共通して存在する保存された配列を使用して、ＣＣＲ５エクソン２に存在する５’－ＴＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＴＣＧＧ－３’」配列（配列番号１１）を標的とした。
また、ＨＰＲＴ遺伝子の対立遺伝子ノックアウトのために使用できるターゲット配列として、ＨＰＲＴエクソン３に存在する５’－ＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧ－３’」配列（配列番号１２）を標的とした。
また、ＤＭＤ遺伝子の対立遺伝子ノックアウトのために使用できるターゲット配列として、ＤＭＤエクソン５１に存在する５’－ＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧ－３’配列（配列番号１３）を標的とした。
以後、Ｈｅｌａ細胞からゲノムＤＮＡを抽出した後、ＨＰＲＴ、ＤＭＤ及びＣＣＲ５各遺伝子内の標的配列の部位をＰＣＲで増幅させた。
以降、Ｉｎｄｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が誘導されたか否かをＴ７Ｅ１（Ｔ７ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ）ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙで分析を行い、アガロースゲル分析の結果を図２に示した。Ｔ７Ｅ１分析（Ｔ７Ｅ１ ａｓｓａｙ）は、従来公知の方法で行った。要約すると、メーカーの指示に従ってゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｇ－ＤＥＸ ＩＩｃ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）を利用して分離した。
図２に示したように、細胞内に導入された実施例１で作製した各ハーフドメインを発現する組換えベクターから各ハーフドメインが発現した後融合されて、Ｃａｓ９タンパク質（Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９と命名）を形成することにより、ｓｇＲＮＡと共に作用してＨＰＲＴ、ＤＭＤ及びＣＣＲ５遺伝子の全てにＩｎｄｅｌを誘導することが分かった。
実施例３．Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９とターゲット遺伝子特異的ｓｇＲＮＡによるノックアウト効率分析
ターゲット遺伝子のノックアウト効率を分析するために、ターゲットシーケンス部位をＰＣＲで増幅させた後、ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙで標的配列を分析した。分析結果、ＨＰＲＴ遺伝子で２７．１％、ＤＭＤ遺伝子で２３．７５％、ＣＣＲ５遺伝子で２０．２７％のＩｎｄｅｌ効果が現れた。対照群として、第一または第二のドメインの１つのハーフドメインのみ細胞内に注入して発現させ、このような場合には、Ｉｎｄｅｌが現れなかった（図３）。
前記のような結果から、Ｃａｓ９に対する各ハーフドメインを発現させる組換えベクターを細胞内に注入した場合、各ハーフドメインが正常に発現した後融合されて、完全なＣａｓ９タンパク質を形成することにより、ｓｇＲＮＡと共に標的遺伝子に対してＩｎｄｅｌ効果を示すことができることが分かった。本発明は、ウイルスベクター内のパッケージングが可能なサイズを超えるＣａｓ９発現カセットの大きさのため、細胞内への伝達効率が落ちるＣａｓ９に対して、第一のドメイン及び第二のドメインを各々独立して細胞内に導入して、各発現後融合されて機能できるようにすることで、Ｃａｓ９タンパク質のベクター内へのパッケージングの問題を解決したものである。
実施例４．Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９の標的配列の部位切断特異性分析
ターゲット遺伝子の非標的（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）効果を分析するために、細胞にｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９と野生型Ｃａｓ９プラスミドを各々処理した後、３日後にＨＢＢ遺伝子標的（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）配列と配列不一致を有している類似のシーケンス部位をＰＣＲで増幅させた後、ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙで標的配列を分析した。
Ｈｅｌａ細胞内で標的効率を非標的効率で割った時、ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９による特異性が野生型Ｃａｓ９の特異性に比べて、最大２２０倍以上増加することを確認した（図４Ａ）。また、Ｈｅｐ１細胞内でｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９の特異性が野生型Ｃａｓ９に比べて最大８０倍増加することを確認した（図４Ｂ）。
実施例５．Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９を発現するアデノ随伴ウイルスによる標的配列の部位切断特異性分析
Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９がウイルスベクターを利用した場合にも効果的に作用するか否かを確認するために、第一のドメイン及び第二のドメインを各々アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクタープラスミドにクローニングした（図５Ａ及び５Ｂ）。
第一のドメインのＣ－末端部位にスプライシングドナー（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ）を連結し、第二のドメインのＮ－末端部位にスプライシングアクセプタ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ）を連結した。各ハーフドメインをパッケージングするウイルスを産生し、これを回収して細胞内伝達した後、標的配列部位の切断率を分析した。
その結果、各ハーフドメインが融合された後、ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｃａｓ９タンパク質を形成することにより、遺伝子切断効果を示すことができることが分かった。Ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９を伝達するアデノ随伴ウイルスをＨｅｌａ細胞内１０、５０、１００ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）で感染させた後、５、７、１０日後に標的配列の切断率を分析した結果、約５％の標的配列の切断効果を確認することができた（図５Ｃ）。そこで、本発明のｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９がウイルスベクターを利用する場合にも効果的に機能していることが分かった。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

Claims (15)

  1. Ｃａｓ９タンパク質のＮ－末端を含む第一のドメインを発現する組換えベクター及びＣａｓ９タンパク質のＣ－末端を含む第二のドメインを発現する組換えベクターを含む、組成物であって、前記第一のドメインのＣ－末端部位にスプライシングドナーを連結し、前記第二のドメインのＮ－末端部位にスプライシングアクセプタを連結し、前記Ｃａｓ９タンパク質における配列番号１０のリンカーの中間部位が切断され、前記Ｃａｓ９タンパク質の前記第一のドメイン及び第二のドメインが作製され、そして前記第一のドメイン及び第二のドメインが融合し、完全なＣａｓ９タンパク質を形成する、組成物。
  2. 前記組成物は、遺伝子発現調節用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物は、配列特異的なガイドＲＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  4. 前記Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９、不活性化されたＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）である請求項１に記載の組成物。
  5. 前記不活性化されたＣａｓ９は、ｄＣａｓ９にＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを連結したＲＦＮ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、または転写活性因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）または抑制ドメイン（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｄｏｍａｉｎ）を連結したｄＣａｓ９である請求項４に記載の組成物。
  6. 前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９またはＨ８４０Ａ Ｃａｓ９である請求項４に記載の組成物。
  7. 前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、フランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）からなる群から選択されるいずれか一つの由来である請求項１に記載の組成物。
  8. 前記組換えベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、またはウイルスベクターである請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ウイルスベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクター、および単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ベクターからなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
  10. 前記第一のドメイン及び第二のドメインが、前記導入された組換えベクターのそれぞれから発現され、前記第一のドメイン及び第二のドメインの融合によってＣａｓ９タンパク質が形成される、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記第一のドメイン及び第二のドメインは、それぞれ４００ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）～３．７ｋｂｐ（ｋｉｌｏ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）の大きさのヌクレオチドでコードされる請求項１に記載の組成物。
  12. 前記第一のドメイン及び第二のドメインは、それぞれＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、ＨＡ－タグ（ｔａｇ）配列、またはこれらの組み合わせをさらに含む請求項１に記載の組成物。
  13. 前記第一のドメインは、配列番号３のヌクレオチドでコードされ、第二のドメインは、配列番号５のヌクレオチドでコードされる請求項１に記載の組成物。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物を含む遺伝子発現調節用キット。
  15. 前記キットは、配列特異的なガイドＲＮＡをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載のキット。
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