JP7323895B2 - 発酵した固形物を触媒とする、エステルおよびバイオ潤滑剤の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体触媒の分野に関する。より具体的には、本発明は、バイオ潤滑剤として使用可能なエステルを酵素的経路で得るために実行できる事柄を拡張する、新たな生体触媒経路の開発に関する。

基油は潤滑油の主成分であり、鉱物油（石油を蒸留・精製して得られるもの）と合成油（石油化学工業からの材料の化学反応に基づいて得られるもの）とに分類される。潤滑剤の生産が石油の消費量に占める割合はごくわずかながら、潤滑剤は高い確率で適切に廃棄されていないため、環境への脅威となっている。例を挙げると、１リットルの鉱物油由来の潤滑剤の漏出は、１×１０^６リットルの水を汚染することに留意することが重要である。

欧州規格ＥＮ１３４３２のような環境法令によって課されるいっそう厳しい要件や、一定の国における、当該分野の産業向けの食品グレードの潤滑剤に対する需要、化石資源の限られた利用可能性に関する問題は、代替資源に由来する製品の開発に寄与しており、石油化学分野における最優先事項の１つである。

バイオ潤滑剤は、微生物の働きによって分解可能な生分解性潤滑剤であり、一般的には化学反応によって変化した植物油から得られ、漏出すると環境を損ねる可能性がある用途に使用される。

一般に、生分解性とは、１年以内に微生物によって代謝される潤滑剤の性質を表す。微生物が分解を引き起こす形態は、基本的に、それらの構造次第である。植物油はたいてい９９％の生分解性を有しており、添加剤の混合後は、通常、９０％～９８％に低下する。

生分解性潤滑剤として使用されるエステル類の主な種類は、ジエステル類（Diesters）、フタル酸エステル類（Phthalates）、トリメリット酸エステル類（Trimellitates）、Ｃ３６ダイマー酸（C36 dimerates）、およびポリオールエステル類（Polyol esters）である。ポリオールエステル類は、多価アルコール類（Polyhydric alcohols）と、モノカルボン酸（Monocarboxylic acids）またはジカルボン酸（Dicarboxylic acids）との反応において生成される。この種の生成物は、β位に二級水素がなく、中心に四級炭素原子が存在するために、並外れた安定性をもたらす。

生分解性潤滑剤として有用なエステルの製造に用いられる、化学触媒を使用する反応が、先行技術において知られている。

特許文献１には、ジブチル錫ジラウレート（Dibutyltin dilaurate; DBTDL）を触媒とし、ヒマシ油由来のバイオディーゼルとトリメチロールプロパンアルコール（Trimethylolpropane alcohol）とのエステル交換反応に基づいて生分解性潤滑剤を製造することが記載されている。なお、ジブチル錫ジラウレートを使用する場合、その反応条件は、１６８℃～１７２℃の温度と真空とを必要とする、過酷なものであることに注意されたい。

伯国特許出願公開第１０２０１３０３３５８２７号明細書

酵素触媒、または生体触媒は、化学触媒と比較してさまざまな利点を提供する。これらの利点には、基質に対する酵素の選択性が高いことや、収率が高いこと、温度や圧力などの反応条件が穏やかであること、機器の劣化がないこと、生体触媒の生分解性などが含まれる。

しかしながら、市販されている酵素製剤の高いコストは、付加価値が低く、販売量の多い製品の合成において、それらの工業的応用の経済上の実行可能性の妨げとなっていた。

固体発酵によって製造される、発酵した固形物の形での酵素の使用は、酵素を抽出、精製するステップが除外されるため、製造コストを低減するための代替手段となる。

ブラジル特許出願ＰＩ０７０４７９１－６の特許文献は、バイオディーゼルとして使用するためのエステルの合成方法に関し、セパシア菌（Burkholderia cepacia）による、固体発酵によって生成された、発酵した固形物の形でのリパーゼを触媒として用いた反応を利用する。

先行技術である上記文献の方法では、脂肪酸（エステル化反応の場合）またはトリグリセリドの供給源（エステル交換反応の場合）を、モノヒドロキシ化されたアルコール、好ましくはエタノールと反応させる。当該文献は、細菌由来の酵素を使用することはさておき、ポリヒドロキシ化されたアルコールを使用する、エステル交換反応やヒドロエステル化反応を想定していない。

現在までのところ、農業廃棄物中の微生物の培養によって得られる発酵した固形物を触媒とし、ポリヒドロキシ化されたアルコールを用いる、エステル交換反応やヒドロエステル化反応を利用したバイオ潤滑剤エステルを得るための方法は、先行技術には記載されていないものと推測される。

本発明は、低コストのリパーゼを使用することで、バイオマスの利用だけでなく、酵素的経路によるバイオ潤滑剤の製造の経済的実現性にも寄与する。

本発明の目的は、以上に列挙した先行技術の主な問題を解決する、エステルの製造方法を提供することである。

この目的を達成するために、本発明は、エステルを製造するための方法であって、生体触媒の存在下で、メチルバイオディーゼルまたは遊離脂肪酸（Free fatty acids; FFAs）とポリヒドロキシ化されたアルコールとの反応を使用し、上記生体触媒が、固体発酵による、農業廃棄物中の微生物の培養によって生成される、発酵した固形物である方法を提供する。

本発明の別の目的は、バイオ潤滑剤として製造された上記エステルの使用に関する。

本発明の別の目的は、本発明の方法によって生成された上記エステルを含む、上記バイオ潤滑剤に関する。

パーム油ケーキの発酵した固形物中に存在するリゾムコール・ミハイ（R. miehei）由来のリパーゼを触媒とする、大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの反応に基づくバイオ潤滑剤の合成を示すグラフである。 大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの反応に基づくバイオ潤滑剤の合成における、パーム油ケーキの発酵した固形物の再使用を示すグラフである。 パーム油ケーキの発酵した固形物中に存在するリゾムコール・ミハイ由来のリパーゼを触媒とする、ヒマシ油のバイオディーゼルとトリメチロールプロパンアルコールとの反応に基づくバイオ潤滑剤の合成を示すグラフである。 綿実油ケーキの発酵した固形物中に存在するリゾムコール・ミハイ由来のリパーゼを触媒とする、ヒマシ油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの反応に基づくバイオ潤滑剤の合成を示すグラフである。 綿実油ケーキの発酵した固形物中に存在するリゾムコール・ミハイ由来のリパーゼを触媒とする、ヒマシ油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの反応に基づくバイオ潤滑剤の合成を示すグラフである。 綿実油ケーキの発酵した固形物中に存在するリゾムコール・ミハイ由来のリパーゼを触媒とする、大豆油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの反応に基づくバイオ潤滑剤の合成を示すグラフである。 バイオ潤滑剤の合成において、溶媒で洗浄せずに数回再使用した後のパーム油ケーキの発酵した固形物（ＳＥＰ）の活性を示すグラフである。

ここで使用されるすべての技術的および科学的な用語は、他に定義されていない限り、本発明に関連する主題に精通している者によって理解されるのと同じ意味を有する。本発明の説明で使用される専門用語は、特にその実施形態の特徴を説明することを唯一の目的としており、教示する範囲を限定することを意図していない。本明細書および特許請求の範囲で使用される、量、割合および比率を表すすべての数値やその他の数値は、別段の記載がない限り、すべての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解しなければならない。したがって、本明細書および特許請求の範囲に示す数値パラメーターは、別段の記載がない限り、得られる特性次第で異なりうる近似値である。

本発明者らは、生体触媒の存在下で、メチルバイオディーゼルまたは遊離脂肪酸と、ポリヒドロキシ化されたアルコールとを反応させるステップを含む、エステルの製造方法を提供することにより、先行技術の問題を解決した。生体触媒は、固体発酵により、農業廃棄物中の微生物を培養することで製造される、発酵した固形物である。

第１の態様では、本発明は、バイオ潤滑剤エステルの合成に使用するための、低コストのリパーゼの製造を伴う。この目的のため、農業廃棄物が固体発酵プロセスにおいて培地として使用される。

固体発酵は、低コストの原料を、単一の発酵培地を有する微生物の培地として使用することを可能にする。この方法では、基質は、微生物の培養のための栄養分を供給するだけでなく、細胞の増殖のための土台としての役も果たす。

本発明の背景において、「農業廃棄物」という用語は、油性の原料の固形残留物質（ケーキ）として理解されるべきである。好ましくは、パーム油や綿実油の抽出による固形残留物質が使用される。

「接種原」という用語は、発酵プロセスを開始するために使用される、胞子または栄養細胞の形態の、微生物の細胞として理解されるべきである。好ましくは、微生物は、糸状菌（Filamentous fungus）である。より好ましくは、真菌は、リゾムコール（Rhizomucor）属である。さらに、より好ましくは、真菌は、リゾムコール・ミハイ（Rhizomucor miehei）種である。

「発酵槽」という用語は、ケーキ中の微生物の発生のために、温度および湿度が制御されたチャンバーとして理解されるべきである。

「発酵した固形物」という用語は、微生物のバイオマスおよびリパーゼを含む、固体発酵プロセスの終わりの、乾燥した発酵ケーキとして理解されるべきである。

ある実施形態では、固体発酵のための基質である、パーム油ケーキまたは綿実油ケーキに対して、発酵プロセスに理想的な割合で水が加えられ、次いで、接種原が混合される。

湿らされ、接種されたケーキは、その後、発酵槽内で保温される間に微生物が増殖し、その代謝作用の結果、高い合成能力を有するひとそろいのリパーゼを生成する。

固体発酵の終わりに、発酵したケーキは、反応の触媒作用に用いられる前に、乾燥ステップに供される。好ましくは、乾燥は、凍結乾燥によって、または強制給気によって行われる。

固体発酵プロセスによって生成された低コストの酵素生体触媒は、バイオ潤滑剤エステルの製造のための、エステル交換反応、またはヒドロエステル化反応において使用される。

エステル交換反応プロセスでは、メチルバイオディーゼルは、ポリヒドロキシ化されたアルコールと反応し、バイオ潤滑剤エステルを生成する。好ましくは、メチルバイオディーゼルは、大豆油のメチルバイオディーゼルまたはヒマシ油のメチルバイオディーゼルである。好ましくは、ポリヒドロキシ化されたアルコールは、ネオペンチルグリコール（Neopentyl glycol）、トリメチロールプロパン（Trimefhylolpropane）またはペンタエリスリトール（Pentaerythritol）である。

ある実施形態では、エステル交換反応は、バイオディーゼルとアルコールとのモル比を２～５とし、随意に１～３％（ｗ／ｗ）の水を加えることによって行われる。発酵した固形物は、１０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度で生体触媒として使用される。反応は、反応器内で、撹拌しながら、３０～５０℃の温度で、大気圧で行われる。

好ましい実施形態では、使用される反応器は、大気圧で温度制御された撹拌槽であり、エステル交換反応はそこで行われる。

これらの条件下では、メチルエステルはアルコールとエステル交換され、バイオ潤滑剤エステルおよびメタノールが副産物として生成されます。この生成物は、本プロセスの終わりに分離される。

ヒドロエステル化プロセスは、最初の加水分解反応と、２番目のエステル化反応とで構成される。

ある実施形態では、第１の反応（加水分解）は、油性オイルと緩衝液とを１：１（体積／体積）の比率で混合するステップと、次いでリパーゼを油の重量の１～２％（ｗ／ｖ）の割合で混合するステップとを含む。

反応は、反応器内で、撹拌しながら、３０～４０℃の温度で、大気圧で行われる。これらの条件下では、油は加水分解され、遊離脂肪酸およびグリセロールが副産物として生成される。遊離脂肪酸は、エステル化反応に使用される前に、緩衝液から、グリセロールから、そしてリパーゼから分離される。

好ましい実施形態では、油性オイルは、大豆油またはヒマシ油であり、リパーゼは、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）由来の市販のリパーゼ、または休眠状態のヒマシ油の植物種子から得られるリパーゼである。

好ましい実施形態では、使用される反応器は、大気圧で温度制御された撹拌槽であり、加水分解反応はそこで行われる。

ある実施形態では、第２の反応（エステル化）は、遊離脂肪酸と、ポリヒドロキシ化されたポリオールアルコールとを、遊離脂肪酸とアルコールとのモル比を２～５とし、随意に１～３％（ｗ／ｗ）の水と、混合することによって行われる。発酵した固形物は、１０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度で、生体触媒として使用される。反応は、反応器内で、撹拌しながら、３０～５０℃の温度で、大気圧で行われる。

好ましい実施形態では、使用される反応器は、大気圧で温度制御された撹拌槽であり、エステル化反応はそこで行われる。

これらの条件下では、遊離脂肪酸はポリオールでエステル化され、バイオ潤滑剤エステルおよび水が副産物として生成される。

本発明の方法によって得られたバイオ潤滑剤エステルは、その物理化学的特性について分析され、現在入手可能なバイオ潤滑剤と一致した、申し分のない物理化学的特性を示した。

バイオ潤滑剤の粘度は、攻撃から金属表面を保護する膜の形成に直接関係するため、これらの液体の最も重要な特性である。

粘度指数は、ある温度での油の粘度のふるまいのパラメーターである。値が大きいほど、温度変化に伴う油の粘度の変化は小さくなる。通常、粘度指数の値は、４０℃および１００℃での粘度を考慮した計算によって決定される。

フローポイント（Flow point）は、油がまだ流動する最低温度を測定し、低温にさらされたときの潤滑剤のふるまいを評価するために使用される基準である。

粘度や粘度指数、フローポイントなどのバイオ潤滑剤の物理化学的特性は、鉱物油をベースとした潤滑剤と比較して高い。

本発明のバイオ潤滑剤の特性や性能は、潤滑剤と相溶性がある添加剤、好ましくは毒性がなく、生分解性を有する添加剤を使用することにより、さらに向上させることができる。

本発明の方法により製造されるエステルは、最高使用温度が１２０℃未満であるが、周囲温度が－４０℃を超えたままである潤滑用途において、特に有用である。

本発明のバイオ潤滑剤は、モーターオイル、油圧作動油、圧延油などとして使用することができる。

＜実施例＞
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として見なすべきではない。当業者には明らかであるように、本発明は、これらの特定の実施形態に限定されない。

（実施例１：発酵した固形物の製造）
綿実油ケーキ（粉砕したもの）またはパーム油ケーキ（粉砕してふるいにかけた、粒子が１．１８ｍｍより小さいもの）を発酵させた結果、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物を得た。発酵は、パーム油ケーキおよび綿実油ケーキについて、含水率を６５％および５０％に調整したケーキを１５ｇ入れたビーカー内でそれぞれ行った。ケーキが入った各ビーカーを、オートクレーブ内で、１２１℃で１５分間滅菌し、固形物１ｇ（乾燥重量）あたり１０^７個のリゾムコール・ミハイの胞子をケーキに接種して、相対湿度９０％の人工気候室内で、３０℃で、７２時間保温した。発酵の終わりに、発酵培地を凍結乾燥させ、使用するまで４℃で保存した。パーム油ケーキまたは綿実油ケーキを原料に用いた固体発酵によって、１７±２Ｕ／ｇおよび２９±２Ｕ／ｇの加水分解活性を有する、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物をそれぞれ得た。

（実施例２：加水分解活性）
発酵した固形物の加水分解活性は、アセトニトリル（Acetonitrile）／ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulphoxide; DMSO）１：１の溶液中での、２５ｍＭの濃度における、基質であるｐ－ニトロフェニルラウレート（p-nitrophenyl laurate; p-NFL）の加水分解によって促進される、分光測光法における吸光度の変化から推定した。基質の加水分解反応のため、細胞内で、２５０μＬに分別したｐ－ＮＦＬ溶液をｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ）２．２ｍＬで希釈し、３０℃で２分間なじませた。その後、５０μＬに分別した液状の酵素抽出物を加えて、４１２ｎｍにおける吸光度を分光測光器（SHIMADZU UV- 1800）で測定した。１酵素単位（Ｕ）は、テスト条件下で１分あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノール（p-nitrophenol）を生成できる酵素の量に相当する。活性は、式１を用いて計算される。
－－－－（式１）
ここで、上記の方程式における、各変数および定数の内訳は以下の通りである。
α＝吸光度が直線的に増加する局面の間に経過した時間の間隔Δｔ（分単位）における、吸光度（ΔＡｂｓ）の変化
Ｄ＝酵素溶液の希釈度
ｆ＝０．０１～０．２μｍｏｌ．Ｌ^－１の間で変化する濃度でｐ－ＮＦＬの標準曲線を作成することによって得られる、変換係数（０．０９４μｍｏｌ．Ｌ^－１）
Ｖｆ＝反応容量（緩衝液中のｐ－ＮＦＬ溶液の体積および試料の体積；ｍＬ）
Ｖｓ＝テストに用いた酵素溶液の体積（ｍＬ）

ドライケーキ１ｇあたりで表される加水分解活性（Ｕ／ｇ）を、式２より算出した。
－－－－（式２）
ここで、上記の方程式における、各変数および定数の内訳は以下の通りである。
Ｖｔ＝酵素の抽出に使用した緩衝液の体積
ｍ＝ケーキの乾燥重量

（実施例３：エステル交換反応）
（実施例３．１：大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコール）
大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの反応は、パーム油ケーキ上に生成された、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物を触媒とした４８時間の反応の後、８５．５％の転化率の生成物をもたらした。

大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの反応は、アルコール／バイオディーゼルのモル比を１：３．１～１：２とし、１０～３０％（ｗ／ｗ）の生体触媒を用いて、１～２．５％（ｗ／ｗ）の含水率、および３５～５０℃の温度において、大気圧で撹拌して行った（図１）。

パーム油ケーキの発酵した固形物のリパーゼを触媒とした、大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応の生成物は、相当な量（２００ｍｌ）が生成され、製造するバイオ潤滑剤の特性を決定するために、特徴づけられた（表１）。酸性度指数を除いて、評価した他のすべての特性は、満足のいくものであった。

パーム油ケーキの発酵した固形物を、大豆油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールとの反応中で再使用することについて評価した。２４時間または７２時間の反応時間の後、酵素を溶媒（ヘキサンまたはエタノール）で洗浄したのちに、ブフナー漏斗でろ過し、デシケーターで一晩、保温した。この手順の終わりに、実施例１に述べた反応に、酵素を再び使用した。パーム油ケーキの発酵した固形物は、ヘキサンまたはエタノールで洗浄した後、少なくとも１度は再使用できる（図２）。また、溶媒で洗浄せずに再使用することもテストした。この場合、７２時間の反応の後、発酵した固形物を別の容器に移したのちに、反応器の上部から生成物を除去した。そして、除去した生成物の重量と同等の重量の新鮮な反応媒体を反応器に追加した（図７）。

（実施例３．２：ヒマシ油のバイオディーゼルとアルコール類（トリメチロールプロパンおよびペンタエリスリトール））
ヒマシ油のバイオディーゼルと、トリメチロールプロパンおよびペンタエリスリトールといったアルコール類との間の反応は、７２時間で、５２％の転化率を有する生成物をそれぞれもたらした。この反応は、パーム油ケーキ上に生成された、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物を生体触媒として行った。

ヒマシ油のバイオディーゼルと、トリメチロールプロパンおよびペンタエリスリトールといったアルコール類との反応は、アルコール／バイオディーゼルのモル比を１：３．７５～２とし、１０～３０％（ｗ／ｗ）の生体触媒を用いて、１～３％（ｗ／ｗ）の含水率、および３０～５０℃の温度において、大気圧で撹拌して行った（図３）。

（実施例３．３：ヒマシ油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコール）
ヒマシ油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応は、９６時間で、９１％の転化率を有する生成物をもたらした。この反応は、綿実油ケーキ上に生成された、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物を生体触媒として行った。

ヒマシ油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの反応は、アルコール／バイオディーゼルのモル比を１：４～２とし、１０～３０％（ｗ／ｗ）の生体触媒を用いて、１～３％（ｗ／ｗ）の含水率、および３０～５０℃の温度において、大気圧で撹拌して行った（図４）。

パーム油ケーキの発酵した固形物のリパーゼを触媒とした、ヒマシ油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応の生成物は、相当な量（２００ｍｌ）が生成され、製造するバイオ潤滑剤の特性を決定するために、特徴づけられた（表２）。酸性度指数を除いて、評価した他のすべての特性は、満足のいくものであった。

綿実油ケーキの発酵した固形物を、ヒマシ油のバイオディーゼルとネオペンチルグリコールとの反応中で再使用することについて評価した。２４時間の反応時間の後、酵素を溶媒（エチルエーテルまたはエタノール）で洗浄したのちに、ブフナー漏斗でろ過し、デシケーターで一晩、保温した。この手順の終わりに、上述した反応に、酵素を再び使用した。綿ＳＥＰの発酵した固形物は、エーテルまたはエタノールで洗浄した後、少なくとも１度は再使用できる。

（実施例４：ヒドロエステル化反応）
（実施例４．１：ヒマシ油の遊離脂肪酸（ＦＦＡｓ）とネオペンチルグリコールアルコール）
ヒマシ油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応は、９６時間で、６５％の転化率を有する生成物をもたらした。この反応は、綿実油ケーキ上に生成された、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物を生体触媒として行った。

ヒマシ油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの反応は、アルコール／遊離脂肪酸のモル比を１：４～２とし、１０～３０％（ｗ／ｗ）の生体触媒を用いて、１～３％（ｗ／ｗ）の含水率、および３０～５０℃の温度において、大気圧で撹拌して行った（図５）。

綿ＳＥＰの発酵した固形物のリパーゼを触媒とした、ヒマシ油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応の生成物は、相当な量（２００ｍｌ）が生成され、製造するバイオ潤滑剤の特性を決定するために、特徴づけられた（表３）。酸性度指数を除いて、評価した他のすべての特性は、満足のいくものであった。

（実施例４．２：大豆油の遊離脂肪酸（ＦＦＡｓ）およびネオペンチルグリコールアルコール）
大豆油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応は、７２時間で、８２％の転化率を有する生成物をもたらした。この反応は、綿実油ケーキ上に生成された、リゾムコール・ミハイ由来の発酵した固形物を生体触媒として行った。

大豆油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの反応は、アルコール／遊離脂肪酸のモル比を１：４～２とし、１０～３０％（ｗ／ｗ）の生体触媒を用いて、１～３％（ｗ／ｗ）の含水率、および３０～５０℃の温度において、大気圧で撹拌して行った（図６）。

綿ＳＥＰの発酵した固形物のリパーゼを触媒とした、大豆油の遊離脂肪酸とネオペンチルグリコールアルコールとの間の反応の生成物は、相当な量（２００ｍｌ）が生成され、製造するバイオ潤滑剤の特性を決定するために、特徴づけられた（表４）。酸性度指数、流動性および水分を除いて、評価した他のすべての特性は、満足のいくものであった。

（実施例５：反応の酸性度の測定）
油および生成物中の遊離脂肪酸の含有量を、中和滴定法によって測定した。試料０．２ｇについての遊離脂肪酸を、メトラー（Mettler）社製ＤＧ２０型自動滴定装置で、０．０４ｍｏｌ．Ｌ^－１の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液でｐＨ１１．０まで滴定した後、試料の酸性度を式３から求めた。

あるいはまた、より大きな体積の試料については、試料約０．５～１ｇについての遊離脂肪酸を、フェノールフタレインを指示薬として用いて、０．２５ｍｏｌ．Ｌ^－１の水酸化ナトリウム水溶液で滴定した後、試料の酸性度を式３から求めた。
－－－－（式３）
ここで、上記の方程式における、各変数および定数の内訳は以下の通りである。
Ｖ＝試料の滴定に使用した水酸化ナトリウムの量（ｍＬ）
Ｍ＝水酸化ナトリウム水溶液のモル濃度（ｍｏｌ．Ｌ^－１）
ＡＧ＝油^＊中に最高濃度で存在する脂肪酸の分子量（ｇ）
ｍ＝試料重量（ｇ）
^＊大豆油＝リノール酸（２８０ｇ）；ヒマシ油＝リシノール酸（２９８ｇ）

（実施例６：メチルエステルの含有量の測定）
エステル交換反応の生成物中のメチルエステル（バイオディーゼル）の含有量を測定するために、２０μＬを分別して４８０μＬのｎ－ヘプタン（n-heptane）で希釈し、クロマトグラフに注入した。水素炎イオン化検出器（Flame ionization detector; FID）およびOmegawaxキャピラリーカラム（長さ３０ｍ，内径０．２５ｍｍ，膜厚０．２５μｍ）を備えたガスクロマトグラフ（SHIMADZU 2010）を使用した。分析条件は、２００℃の初期温度を５分間、その後、プログラムにより２０℃／分の速度で２６０℃までコントロールして、２６０℃を６分間維持した。検出器およびインジェクターの温度は、それぞれ２５０℃、２６０℃であった。キャリアガスとして、ヘリウムを２０ｍＬ／分の流量で使用し、１：２０のスプリットモードで注入した。内部標準物質として、ヘプタデカン酸メチル（Methyl heptadecanoate）を使用し、式４を用いてエステルの含有量を算出した。
－－－－（式４）

（実施例７：エステル化反応における転化率）
遊離脂肪酸のバイオ潤滑剤への転化率を、遊離脂肪酸の消費量を観察する滴定法（酸性度）によって測定した。反応の転化率は、式５または式６から算出した。

式５からの結果は、反応における余剰な遊離脂肪酸を無視した、エステル化された遊離脂肪酸を割合の形で表しており、１００％の転化率は、アルコールのヒドロキシ基が１００％エステル化することに相当する。式６からの結果は、エステル化された遊離脂肪酸を割合の形で表しており、１００％の転化率は、１００％の遊離脂肪酸がエステル化することに相当する。
－－－－（式５）
－－－－（式６）
ここで、上記の各方程式における、各変数および定数の内訳は以下の通りである。
Ａｉ＝当初の酸性度（％ｗ／ｗ）
Ａｆ＝最終的な酸性度（％ｗ／ｗ）
ＲＭ＝遊離脂肪酸／アルコールの当初のモル比
Ｈ＝アルコール分子中のヒドロキシ基の数

（実施例８：エステル交換反応における転化率）
エステル交換反応における転化率を、式７より算出した。結果は、反応における余剰なバイオディーゼルおよび形成された遊離脂肪酸を無視した、エステル交換されたバイオディーゼルを割合の形で表しており、１００％の転化率は、アルコールのヒドロキシ基が１００％エステル化することに相当する。
－－－－（式７）
ここで、上記の方程式における、各変数および定数の内訳は以下の通りである。
Ｅｉ＝当初のエステル含有率（％ｗ／ｗ）
Ｅｆ＝最終的なエステル含有率（％ｗ／ｗ）
Ａｉ＝当初の酸性度（％ｗ／ｗ）
Ａｆ＝最終的な酸性度（％ｗ／ｗ）
ＲＭ＝バイオディーゼル／アルコールの当初のモル比
Ｈ＝アルコール分子中のヒドロキシ基の数

上記の各実施例は、例示の目的で提示されたものに過ぎず、当業者の目には明らかなそれらの変更や変形は、本明細書および特許請求の範囲の記載において定義されているように、本発明の範囲に含まれる、と考えられることは明らかである。

Claims (12)

1. エステルを製造するための方法であって、
   生体触媒の存在下で、メチルバイオディーゼルまたは遊離脂肪酸をポリヒドロキシ化されたアルコールと反応させるステップを含み、
   前記生体触媒は、固体発酵による、農業廃棄物中の微生物の培養によって生成される、発酵した固形物であり、
   前記農業廃棄物は、綿実ケーキまたはパーム油ケーキであり、
   前記生体触媒は、反応物中の前記発酵した固形物の濃度として、１０～３０ｗｔ％の濃度で使用され、
   アルコールとメチルバイオディーゼルまたは遊離脂肪酸とのモル比が、１：２から１：５であり、
   前記メチルバイオディーゼルまたは遊離脂肪酸とポリヒドロキシ化されたアルコールとの反応は、１～２．５％（ｗ／ｗ）の含水率、３０～５０℃の温度、及び大気圧で行われる、ことを特徴とする、方法。
2. 前記メチルバイオディーゼルと前記ポリヒドロキシ化されたアルコールとの前記反応が、エステル交換反応であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記遊離脂肪酸と前記ポリヒドロキシ化されたアルコールとの前記反応が、ヒドロエステル化反応であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記バイオディーゼルが、大豆油のバイオディーゼルまたはヒマシ油のバイオディーゼルであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記遊離脂肪酸は、大豆油またはヒマシ油と、生体触媒との反応によって得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 前記生体触媒が、１つ以上の市販のリパーゼ、または休眠状態のヒマの種子から得られる１つ以上のリパーゼであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記ポリヒドロキシ化されたアルコールが、ネオペンチルグリコール、トリメチロールプロパンまたはペンタエリスリトールであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記微生物は、真菌であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記真菌は、リゾムコール・ミハイ（Rhizomucor miehei）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 前記発酵した固形物は、凍結乾燥した状態で前記反応に添加されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記発酵した固形物は、少なくとも一度は再使用されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記製造されたエステルを精製するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。