CN111699262B - 由发酵的固体催化的生产酯和生物润滑剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产酯的方法，其包括在生物催化剂存在下使甲基生物柴油或游离脂肪酸与多羟基化醇反应，该生物催化剂是含有通过固态发酵在农业废料上培养微生物而产生的米黑根毛霉脂肪酶的发酵的固体。

Description

由发酵的固体催化的生产酯和生物润滑剂的方法
发明领域
本发明涉及生物催化领域。更具体地，本发明涉及开发新的生物催化路线，其扩展了通过酶促路线获得可以用作生物润滑剂的酯的可能性。
发明背景
基础油是润滑油的主要成分，并且可以分类为矿物的(通过石油的蒸馏和炼制获得)和合成的(在来自石化工业的材料的化学反应的基础上获得)。虽然仅小部分的石油消耗于润滑剂的生产中，但是高百分比的这些产物没有被正确地丢弃，因此构成对环境的威胁。作为说明，重要的是要牢记一升矿物润滑剂的泄露可污染1×106升水。
通过环境立法如欧洲标准EN 13432所推行的日益严格的要求、在某些国家中对该领域中工业的食品级润滑剂的需求以及关于石化资源有限的可获得性的问题已经有助于开发来源于可替代源的产品，并且构成了石油化学领域的主要优先事项之一。
生物润滑剂是可生物降解润滑剂，其可通过微生物作用而分解，并且通常从通过化学反应改性的植物油获得，并且用于其中泄露的可能性可危及环境的应用中。
通常，可生物降解性表示润滑剂在至多一年的时间内被微生物代谢的倾向。微生物引起分解的形式基本上取决于它们的结构。植物油是典型地99％可生物降解，通常在与添加剂混合后下降到90％-98％。
用作生物润滑剂的酯的主要类型是二酯、邻苯二甲酸酯、偏苯三酸酯、C36二聚物和多元醇酯。多元醇酯是在多元醇和单羧酸或二羧酸之间的反应中产生的。这类产物提供非同寻常的稳定性，这归因于在β位上不存在仲氢和存在中心季碳原子。
在通过化学催化剂催化来生产可用作生物润滑剂的酯中所采用的反应是现有技术已知的。
文献BR1020130335827描述了基于由二月桂酸二丁基锡(DBTDL)催化的来自蓖麻油的生物柴油与三羟甲基丙烷酯的交换反应，来生产生物润滑剂。应当注意的是反应条件当使用DBTDL时是苛刻的，要求在168℃-172℃之间的温度和真空。
酶促催化剂或生物催化剂与化学催化剂相比提供了各种优点。这些优点包括例如酶对于它们的基底的高选择性、高产率、更温和的反应条件如温度和压力、没有设备的降解以及生物催化剂的可生物降解性。
然而，可商购的酶制剂的高成本已经成为它们在合成低附加值且高销售量的产品中的工业应用的经济可行性的一个障碍。
使用呈通过固态发酵所产生的发酵的固体形式的酶代表了降低生产成本的一个替代方案，因为消除了酶的萃取和纯化步骤。
专利文献PI0704791-6涉及一种合成用作生物柴油的酯的方法，其采用通过细菌洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacian)通过固态发酵产生的发酵的固体形式的脂肪酶而催化的反应。
在所述现有技术文献的方法中，脂肪酸(在酯化反应的情况下)或甘油三酯源(在酯交换反应的情况下)与单羟基化醇(其优选是乙醇)反应。该文献除了使用细菌来源的酶之外，没有设想采用多羟基化醇的酯交换和加氢酯化反应。
迄今为止，可以推断出现有技术中尚未描述这样的获得生物润滑剂酯的方法，其使用由通过在农业废料上培养微生物而获得的发酵的固体来催化的采用多羟基化醇的酯交换和加氢酯化反应。
本发明包括使用低成本脂肪酶，这有助于生物质的利用以及通过酶促路线来生产生物润滑剂的经济可行性。
发明概述
本发明的目的是提供一种生产酯的方法，其解决了上述现有技术的主要问题。
为了实现此目的，本发明提供一种生产酯的方法，其包括在生物催化剂存在下使甲基生物柴油或游离脂肪酸(FFA)与多羟基化醇反应，其中该生物催化剂是通过固态发酵在农业废料中培养微生物而产生的发酵的固体。
本发明的另一目的涉及将所生产的酯用作生物润滑剂。
本发明的另一目的涉及生物润滑剂，其包含通过本发明的方法所生产的酯。
附图说明
图1显示了基于由存在于棕榈油饼的发酵的固体中的米黑根毛霉(R.miehei)脂肪酶催化的大豆生物柴油和新戊二醇之间的反应，来合成生物润滑剂。
图2显示了在基于大豆生物柴油和新戊二醇之间的反应合成生物润滑剂中，再次使用棕榈油饼的发酵的固体。
图3显示了基于由存在于棕榈油饼的发酵的固体中的米黑根毛霉(R.miehei)脂肪酶催化的蓖麻油生物柴油和三羟甲基丙烷醇之间的反应，来合成生物润滑剂。
图4显示了基于由存在于棉籽油饼的发酵的固体中的米黑根毛霉(R.miehei)脂肪酶催化的蓖麻油生物柴油和新戊二醇之间的反应，来合成生物润滑剂。
图5显示了基于由存在于棉籽油饼的发酵的固体中的米黑根毛霉(R.miehei)脂肪酶催化的蓖麻油的游离脂肪酸和新戊二醇之间的反应，来合成生物润滑剂。
图6显示了基于由存在于棉籽油饼的发酵的固体中的米黑根毛霉(R.miehei)脂肪酶催化的大豆的游离脂肪酸和新戊二醇之间的反应，来合成生物润滑剂。
图7显示了在生物润滑剂合成中，棕榈油饼的发酵的固体(SEP)在没有用溶剂洗涤的情形下，在再次使用若干次后的活性。
发明详述
除非它们另有定义，否则此处所用的所有科技术语具有与本发明主题所属领域的技术人员理解的相同含义。本发明的描述中所用的术语仅具有描述特定实施方案的目的，并且并非意图限制教导的范围。除非另有规定，否则说明书和权利要求中所用的所有表达量、百分比和比例以及其他数值的数字必须理解为在所有情况下被术语“约”来限定。因此，除非另有规定，否则说明书和权利要求中所示的数字参数是近似的，其可以根据所要获得的性质而变化。
本发明人通过提供一种生产酯的方法而解决了现有技术的问题，该方法包括在生物催化剂存在下使甲基生物柴油或游离脂肪酸与多羟基化醇反应，其中该生物催化剂是通过固态发酵在农业废料中培养微生物而产生的发酵的固体。
在第一方面，本发明包括生产低成本脂肪酶以用于合成生物润滑剂酯。为此目的，将农业废料用作固态发酵方法中的培养介质。
固态发酵使得可以使用低成本原材料作为用于微生物的培养介质，其具有单个发酵介质。在这种方法中，基底不仅提供培养微生物的营养物，而且充当细胞生长的载体。
在本发明的上下文中，术语“一种或多种农业废料”被理解为含油原材料的固体残留物(饼)。优选地，使用来自棕榈油和棉籽油萃取的固体残留物。
术语“接种体”被理解为用于引发发酵过程的呈孢子或植物细胞形式的微生物的细胞。优选地，该微生物是丝状真菌。更优选地，该真菌是根毛霉属的。甚至更优选地，该真菌是米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)物种。
术语“发酵罐”被理解为这样的室，其具有受控的温度和湿度，以用于在饼上培育微生物。
术语“发酵的固体”被理解为在固态发酵过程结束时的干发酵的饼，其含有微生物和脂肪酶的生物质。
在一种实施方案中，将水以对于发酵过程来说理想的比例加入至固态发酵的基底的棕榈油饼或棉籽油饼，和然后混入接种体。
然后将弄湿和经接种的饼在发酵罐中温育，在此期间微生物生长，并且作为它代谢的结果，产生一组具有高合成能力的脂肪酶。
在固态发酵结束时，发酵的饼进行干燥步骤，然后被用于催化反应。优选地，干燥通过冻干或强制通风来进行。
将通过固态发酵过程所产生的低成本酶促生物催化剂用于酯交换或加氢酯化反应中以生产生物润滑剂酯。
在酯交换方法中，甲基生物柴油与多羟基化醇反应，生产生物润滑剂酯。优选地，甲基生物柴油是大豆甲基生物柴油或蓖麻油甲基生物柴油。优选地，多羟基化醇是新戊二醇、三羟甲基丙烷或季戊四醇。
在一种实施方案中，酯交换反应以生物柴油:醇摩尔比为2-5和任选的1-3％(w/w)的水来进行。发酵的固体以10-30％(w/w)的浓度用作生物催化剂。反应在30-50℃温度下和在大气压下在搅拌下在反应器中进行。
在一种优选的实施方案中，所用的反应器是在大气压下温度受控的搅拌槽，在其中进行酯交换反应。
在这些条件中，甲基酯与醇进行酯交换，生产生物润滑剂酯和作为副产物的甲醇。所述产物在该方法结束时被分离。
加氢酯化方法由第一水解反应和第二酯化反应组成。
在一种实施方案中，第一反应(水解)包括将含油的油和缓冲剂以体积比1:1混合，随后加入比例为油重量的1-2％w/v的脂肪酶。
反应在30-40℃的温度和大气压下在搅拌下在反应器中进行。在这些条件中，油水解并且游离脂肪酸和甘油作为副产物产生。在用于酯化反应之前将游离脂肪酸与缓冲剂、甘油和脂肪酶分离。
在一种优选的实施方案中，含油的油是大豆油或蓖麻油并且脂肪酶是来自皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的商业脂肪酶或获自休眠蓖麻油植物籽的脂肪酶。
在一种优选的实施方案中，所用的反应器是在大气压下的温度受控的搅拌槽，其中进行水解反应。
在一种实施方案中，第二反应(酯化)通过将游离脂肪酸和多羟基化多元醇以游离脂肪酸:醇摩尔比为2-5和任选的1-3％(w/w)的水来进行。发酵的固体以10-30％(w/w)的浓度用作生物催化剂。反应在30-50℃温度和大气压下在搅拌下于反应器中进行。
在一种优选的实施方案中，所用的反应器是在大气压下温度受控的搅拌槽，在其中进行酯化反应。
在这些条件中，游离脂肪酸用多元醇来酯化，生产生物润滑剂酯和作为副产物的水。
通过本发明的方法获得的生物润滑剂酯在它们的理化性质方面进行了分析，其表现出与目前可获得的生物润滑剂一致的令人满意的理化特性。
该生物润滑剂的粘度是这些流体最重要的性质，因为它直接涉及膜的形成，该膜将保护金属表面抵抗侵蚀。
粘度指数是在温度下的油粘度行为的参数。该值越高，油粘度随温度变化的变化就越小。通常，粘度指数的值是通过考虑了产品在40℃和100℃的粘度的计算来确定的。
流点度量了油仍然流动的最低温度，并且是用于评价润滑油当经受低温时的行为的测试。
生物润滑剂的理化性质如粘度、粘度指数和流点高于矿物基润滑剂。
本发明的生物润滑剂的性质和性能可以通过使用添加剂来进一步改进，该添加剂与该润滑剂相容并且优选其是无毒且可生物降解的。
通过本发明的方法所生产的酯尤其可用于润滑应用，其中最大操作温度低于120℃，但是其中环境温度保持高于-40℃。
本发明的生物润滑剂可以用作机油、传压液体、轧制液体等。
本发明将通过以下不被认为是限制性的实施例来进一步说明。如本领域技术人员将显而易见的，本发明不限于这些特定的实施方案。
实施例
实施例1–产生发酵的固体
米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的发酵的固体作为棉籽油饼(压碎的)或棕榈油饼(压碎和过筛的，颗粒小于1.18mm)发酵的结果而获得。发酵在含有15g饼的烧杯中进行，并且对于棕榈油饼和棉籽油饼，分别将含水量调节到65％和50％。将每个含有饼的烧杯在121℃下在高压釜中灭菌15分钟，并且将饼以107个米黑根毛霉孢子/克固体(干重量)接种，并且在30℃下在相对湿度90％的气候室中温育72h。在发酵结束时，将发酵的介质冻干并且在4℃下储存直到使用。米黑根毛霉的发酵的固体通过固态发酵，使用棕榈油饼或棉籽油饼作为原材料获得，并且水解活性分别是17±2U/g和29±1U/g。
实施例2–水解活性
发酵的固体的水解活性由分光光度法中吸光度的变化来估算，该分光光度法通过在乙腈/二甲基亚砜(DMSO)1:1的溶液中浓度为25mM的基底对硝基苯基月桂酸酯(p-NFL)的水解来促进。对于基底的水解反应，将250μL的p-NFL溶液的等分试样在小室中的2.2mL的磷酸钠缓冲剂pH 7.0(25mM)中稀释，其在30℃下驯化2分钟。这个时间之后，加入50μL的液体酶促提取物的等分试样，并且在分光光度计(SHIMADZU UV-1800)中在412nm处监测吸光度。1个酶单位(U)对应于在测试条件中能够每分钟产生1μmol的对硝基酚的酶的量。活性是使用等式1计算：
其中：
α＝在吸光度线性增加的阶段期间，在所逝去的时间间隔Δt(以分钟计)中吸光度的变化(Δ吸光度)；
D＝酶溶液的稀释度；
f＝转换因子(0.094μmol.L-1)，其通过构建浓度在0.01-0.2μmol.mL-1之间变化的p-NFL的标准曲线来获得；
Vf＝反应体积，其是缓冲剂中p-NFL溶液的体积和样品体积(mL)；
Vs＝测试中使用的酶溶液的体积(mL)。
每克干燥饼所表达的水解活性(U/g)由等式2计算：
其中：
Vt＝萃取酶中所用缓冲剂的体积；
m＝饼的干重。
实施例3–酯交换反应
实施例3.1–大豆生物柴油和新戊二醇
大豆生物柴油和新戊二醇之间的反应在由棕榈油饼上产生的米黑根毛霉(R.miehei)的发酵的固体催化反应48h后以85.5％的转化率得到产物。
大豆生物柴油与新戊二醇的反应以摩尔比2:1-3.1:1的醇/生物柴油，10-30％(w/w)的生物催化剂，并且水含量是1-2.5％(w/w)和温度是35-50℃，在搅拌下在大气压下进行(图1)。
由棕榈油饼的发酵的固体脂肪酶催化的大豆生物柴油和新戊二醇之间的反应的产物以相当大的体积(200ml)生产，并且经表征以确定所生产的生物润滑剂的性质(表1)。除了酸度指数，评价的所有其他性质是令人满意的。
表1：大豆生物柴油和新戊二醇之间的反应所生产的生物润滑剂的特性。
测试结果
水分(ppm)884.4
粘度100℃(mm2/s)4.290
粘度40℃(mm2/s)15.41
粘度指数206
流度(℃)-6
酸度指数(mgKOH/g)19.8
旋转泵(min)30
棕榈油饼的发酵的固体在再次用于大豆生物柴油和新戊二醇之间的反应方面进行评价。在24h或72h的反应时间之后，将酶用溶剂(己烷或乙醇)洗涤，随后在布氏漏斗中过滤和在干燥器中温育一整夜。在这个程序结束时，将酶再次用于实施例1所述的反应中。棕榈油饼的发酵的固体在用己烷或乙醇洗涤后可以再次使用至少一次(图2)。还测试了在不用溶剂洗涤的情形下的再次使用。在这种情况下，在反应72h后，在倾析了发酵的固体之后，将产物在反应器顶部除去。然后将新的反应介质以与抽出的产物重量相等的重量加入至反应器中(图7)。
实施例3.2–蓖麻油生物柴油和醇类三羟甲基丙烷和季戊四醇
蓖麻油生物柴油分别与醇类三羟甲基丙烷和季戊四醇之间的反应在72h中以52％的转化率得到产物。反应利用在棕榈油饼上产生的米黑根毛霉(R.miehei)的发酵的固体作为生物催化剂来进行。
蓖麻油生物柴油与醇类三羟甲基丙烷和季戊四醇之间的反应以摩尔比2-3.75:1醇/生物柴油，10-30％(w/w)的生物催化剂，并且水含量是1-3％(w/w)和温度是30-50℃，在搅拌下在大气压下进行(图3)。
实施例3.3–蓖麻油生物柴油和新戊二醇
蓖麻油生物柴油和新戊二醇之间的反应在96h中以91％的转化率得到产物。反应利用在棉籽油饼上产生的米黑根毛霉的发酵的固体作为生物催化剂来进行。
蓖麻油生物柴油与新戊二醇之间的反应以摩尔比2-4:1醇/生物柴油，10-30％(w/w)的生物催化剂，并且水含量是1-3％(w/w)和温度是30-50℃，在搅拌下在大气压下进行(图4)。
由棕榈油饼的发酵的固体的脂肪酶催化的蓖麻油生物柴油和新戊二醇之间的反应的产物以相当大的体积(200ml)生产，并且经表征以确定所生产的生物润滑剂的性质(表2)。除了酸度指数之外，其他性质是令人满意的。
表2：蓖麻油生物柴油和新戊二醇之间的反应所生产的生物润滑剂的特性。
棉籽油饼的发酵的固体在再次用于蓖麻油生物柴油和新戊二醇之间的反应方面进行评价。在24h的反应时间之后，将酶用溶剂(乙醚或乙醇)洗涤，随后在布氏漏斗中过滤和在干燥器中温育一整夜。在这个程序结束时，将酶再次用于上述反应中。在用醚或乙醇洗涤后，棉SEP可以再次使用至少一次。
实施例4-加氢酯化反应
实施例4.1–蓖麻油的游离脂肪酸(FFA)和新戊二醇
蓖麻油的FFA和新戊二醇之间的反应在96h中以65％的转化率得到产物。反应利用在棉籽油饼上所产生的米黑根毛霉(R.miehei)的发酵的固体作为生物催化剂来进行。
蓖麻油的FFA与新戊二醇的反应以摩尔比2-4:1醇/FFA，10-30％(w/w)生物催化剂，并且水含量是1-3％(w/w)和温度是30-50℃，在搅拌下在大气压下进行(图5)。
由棉SEP的脂肪酶催化的蓖麻油的FFA和新戊二醇之间的反应的产物以相当大的体积(200ml)生产，并且经表征以确定所生产的生物润滑剂的性质(表3)。除了酸度指数之外，评价的所有其他性质是令人满意的。
表3：蓖麻油的FFA和新戊二醇之间的反应所生产的生物润滑剂的特性。
实施例4.2–大豆游离脂肪酸(FFA)和新戊二醇
大豆FFA和新戊二醇之间的反应在72h中以82％的转化率得到产物。反应利用在棉籽油饼上所产生的米黑根毛霉(R.miehei)的发酵的固体作为生物催化剂来进行。
大豆FFA与新戊二醇之间的反应以摩尔比2-4:1醇/FFA，10-30％(w/w)的生物催化剂，并且水含量是1-3％(w/w)和温度是30-50℃，在搅拌下在大气压下进行(图6)。
由棉SEP的脂肪酶催化的大豆FFA和新戊二醇之间的反应的产物以相当大的体积(200mL)生产，并且经表征以确定所生产的生物润滑剂的性质(表4)。除了酸度指数、流度和水分之外，评价的所有其他性质是令人满意的。
表4：大豆FFA和新戊二醇之间的反应所生产的生物润滑剂的特性。
测试结果
水分(ppm)2150.3
粘度100℃(mm2/s)20.27
粘度40℃(mm2/s)5.034
粘度指数191
流度(℃)15
酸度指数(mgKOH/g)105.5
旋转泵(min)28
酸败仪(h)3.08
实施例5–反应酸度的确定
油和产物中的游离脂肪酸的含量通过中和滴定来确定。将游离脂肪酸(约0.2g的样品)用0.04mol.L-1NaOH溶液在Mettler DG 20牌号的自动滴定仪中滴定直到pH 11.0，并且样品的酸度由等式3确定。
可替代地，对于具有较大体积的样品，将来自约0.5-1g的样品的游离脂肪酸用0.25mol.L-1的NaOH溶液使用酚酞作为指示剂来滴定，并且样品的酸度由等式3确定。
其中：
V＝样品滴定中所用氢氧化钠的体积(mL)；
M＝NaOH溶液的摩尔浓度(mol.L-1)；
AG＝以最高浓度存在于油*中的脂肪酸的分子量(g)；
m＝样品重量(g)。
*大豆油＝亚油酸(280g)；蓖麻油＝蓖麻油酸(298g)。
实施例6–甲基酯含量的确定
为了确定酯交换反应产物中甲基酯(生物柴油)的含量，将20μL的等分试样在480μL的正庚烷中稀释，并且注入色谱仪中。使用气相色谱仪(SHIMADZU 2010)，其装备有火焰离子化检测器(FID)和Omegawax毛细管柱(长度30m、内径0.25mm和膜厚0.25μm)。分析的条件是：初始温度200℃持续5分钟，然后以20℃/min的速率程序化直到260℃，在260℃下保持6min。检测器和注射器的温度分别是250℃和260℃。流速为2.0mL/min的氦气用作载气并且注入以1:20的分流模式完成。十七烷酸甲酯用作内标物，并且酯的含量是使用等式4计算。
实施例7-酯化反应中的转化率
游离脂肪酸到生物润滑剂的转化通过其中观察到FFA消耗的滴定方法(酸度)监测。反应的转化率由等式5或等式6计算。
来自等式5的结果以经酯化的FFA的百分比的形式表达，而无视反应中过量的FFA，以便100％转化率等价于被酯化的醇的羟基的100％。来自等式6的结果以经酯化的FFA的百分比的形式表达，以便100％转化率等价于经酯化的FFA的100％。
其中：
Ai＝初始酸度(％w/w)；
Af＝最终酸度(％w/w)；
RM＝初始摩尔比FFA/醇；
H＝醇分子中的羟基数目
实施例8–酯交换反应中的转化率
酯交换反应中的转化率由等式7计算。结果以经酯交换的生物柴油的百分比形式表达，而无视反应中过量的生物柴油和所形成的游离脂肪酸，以便100％转化率等价于被酯化的醇的羟基的100％。
其中：
Ei＝初始酯含量(％w/w)；
Ef＝最终酯含量(％w/w)；
Ai＝初始酸度(％w/w)；
Af＝最终酸度(％w/w)；
RM＝初始摩尔比生物柴油/醇；
H＝醇分子中的羟基数目
很显然提出以上实施例仅为了说明目的，并且对本领域技术人员显而易见的是对其的改变和变形被认为包括在如本文以下给出的权利要求所定义的本发明的范围内。

Claims (9)

1.生产生物润滑剂酯的方法，其特征在于该方法包括：
a)通过固态发酵在农业废料上培养微生物以获得生物催化剂；和
b)在由步骤a)获得的生物催化剂存在下使甲基生物柴油与多羟基化醇反应，以产生一种或多种生物润滑剂酯，
其中
该农业废料是棉籽饼或棕榈油饼，
该生物催化剂包含由微生物对农业废料进行固态发酵而产生的发酵的固体，
该甲基生物柴油是大豆生物柴油或蓖麻油生物柴油，和
该生物催化剂以10-30wt％的浓度使用。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于该甲基生物柴油与该多羟基化醇的反应是酯交换反应。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于使用2:1-5:1的甲基生物柴油与醇的摩尔比。
4.根据权利要求1或2的方法，其特征在于该多羟基化醇是新戊二醇、三羟甲基丙烷或季戊四醇。
5.根据权利要求1或2的方法，其特征在于该微生物是真菌。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于该真菌是米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)。
7.根据权利要求1或2的方法，其特征在于将该发酵的固体以冻干物的形式加入至该反应中。
8.根据权利要求1或2的方法，其特征在于该发酵的固体再次使用至少一次。
9.根据权利要求1或2的方法，其特征在于它另外包括纯化所生产的酯的步骤。
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