JP7317964B2 - 組換えコラーゲンの局所製剤 - Google Patents

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Description

相互参照
この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年４月１日に出願した米国仮出願第６２／８２７，６６２号の利益を主張する。
背景
コラーゲンタンパク質および類似タンパク質は、生物圏において最も豊富なタンパク質である。コラーゲンは、動物および他の組織の皮膚、結合組織、および骨で見つかった構造タンパク質である。ヒトの場合、身体に存在するコラーゲンの量は総タンパク質の約３分の１であり、皮膚の乾燥重量の約４分の３を占める。
天然コラーゲンの構造は、３つのポリペプチド鎖が一緒になってらせん状コイルを形成する三重らせんであり得る。個々のポリペプチド鎖は、ＧＬＹ－Ｘ－Ｙとして示される反復トリプレットアミノ酸配列で構成されている。ＸおよびＹは任意のアミノ酸であり得るが、最初のアミノ酸はグリシンである。アミノ酸のプロリンおよびヒドロキシプロリンがコラーゲン中に高濃度で確認されている。最も一般的なトリプレットは、コラーゲン中のトリプレットの約１０．５％を占めている、グリシン－プロリン－ヒドロキシプロリン（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ）である。
ゼラチンは、ある特定の（例えば天然の）コラーゲンを部分的に加水分解することによって得られる生成物である。典型的には、ゼラチンは、酸加水分解、アルカリ加水分解、および酵素加水分解によって、またはコラーゲンを水溶液中で熱に暴露することによって（例えば、動物の骨および皮膚を煮沸させること、魚のうろこを煮沸させることなどによって）生成される。
ゼラチンは、化粧品、食品、医薬品、医療用デバイス、写真フィルム、接着剤、結合剤、および他の多くのものを含む、多数の製品で使用されている。ゼラチンの物理的性質および化学的性質は、特定の用途に合わせて調整される。これらの物理的／化学的性質としては、ゲル強度、融点温度、粘度、色、濁度、ｐＨ、等電点などが挙げられる。
要旨
ある特定の実施形態では、様々なポリペプチド、そのようなポリペプチドを含む組成物、ならびにそのようなポリペプチドおよび／またはその組成物を使用する方法がある。ある特定の実施形態では、そのようなポリペプチドは、天然コラーゲン、例えば本明細書に記載されているような天然コラーゲンに比べて短縮された１つまたは複数のアミノ酸配列を含むような、天然には存在しないポリペプチドおよび／または組換えポリペプチドを含む。ある特定の事例では、そのようなポリペプチドは、本明細書では「短縮型コラーゲン」として記載されている。特定の実施形態では、ポリペプチドは、天然ヒトコラーゲンの１つまたは複数の（例えば、２つまたはそれより多くの）短縮型アミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、天然クラゲコラーゲンの１つまたは複数の（例えば２つまたはそれより多くの）短縮型アミノ酸配列を含む。一態様では、皮膚（例えば、個体、例えばヒトの皮膚）に利点を提供する（例えば、皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持（hydration）、触覚テクスチャー、または視覚テクスチャーを増加させる）方法が提供される。いくつかの実施形態での方法は、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、本明細書に記載されているような、天然に存在しない短縮型コラーゲン）または製剤（例えば、これは天然に存在しない短縮型コラーゲンのようなポリペプチドを含む）を皮膚に局所的に塗布することを含む。
ある特定の態様では、皮膚に存在する線もしくは皺を減少させるか、または皮膚の紅斑を減少させる方法が提供される。いくつかの実施形態での方法は、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、本明細書に記載されているような、天然に存在しない短縮型コラーゲン）、またはその製剤を皮膚に局所的に塗布することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチド、例えば、天然に存在しない短縮型コラーゲンを含む製剤もまた本明細書で提供される。
ある特定の事例では、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、短縮型コラーゲン）は、皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャー、および／または視覚テクスチャーを増加させることにおいて、またはそれらを増加させるために有用である。いくつかの事例では、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、短縮型コラーゲン）は、皮膚に存在する線もしくは皺を減少させるか、または皮膚の紅斑を減少させることにおいて、またはそれらを減少させるために有用である。特定の実施形態では、ポリペプチド（例えば、短縮型コラーゲン）は、短縮型クラゲコラーゲン（例えば、天然に存在するクラゲコラーゲンの短縮型アミノ酸配列）であるか、またはそれを含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチド（例えば短縮型コラーゲン）は、短縮型ヒトコラーゲン（例えば、天然に存在するヒトコラーゲンの短縮型アミノ酸配列）であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に開示されている方法において有用な）ポリペプチド（例えば、短縮型コラーゲン）は、天然（例えば、ヒトまたはクラゲ（ヒドロ虫））コラーゲンと比べて短縮型アミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの事例では、そのようなポリペプチドは、本明細書では、天然に存在しないコラーゲンと呼ばれる。特定の実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および／または配列番号２９のアミノ酸配列、またはそれらの相同体（例えば、それらに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する相同体）であるか、またはそれらを含む。より特定の実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、または配列番号２９のアミノ酸配列、またはそれらの相同体（例えば、それらに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する相同体）である。
ある特定の実施形態では、本明細書では組成物が提供される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、本明細書に記載されている任意のポリペプチド（例えば、短縮型コラーゲンまたは天然に存在しないコラーゲン）を含む。一態様では、本明細書で提供されている任意のポリペプチド（例えば、短縮型コラーゲンまたは天然に存在しないコラーゲン）の任意の適切な量、例えば、０．００５％～３０％ｗ／ｗを含む組成物が提供される。組成物は、賦形剤、局所用担体、または防腐剤を含む少なくとも１つの追加の成分をさらに含むことができる。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供されている組成物は、局所組成物、例えば、局所投与または局所使用のために製剤化される、および／または適切である組成物である。一態様では、本明細書では、個体の皮膚に（例えば、本明細書に記載されている）利点を提供するような方法であって、局所組成物を皮膚に局所投与することを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、局所組成物は、皮膚損傷を減少させる、損傷を受けた皮膚の修復を促進する、または皮膚細胞によるコラーゲンの産生を刺激するための方法において使用される。ある特定の実施形態では、局所組成物は、皮膚におけるエラスチン産生を増加、促進、刺激、またはその他の形で増加させるための方法において使用される。
一態様は、コラーゲンまたはコラーゲンを含む組成物を対象の皮膚に塗布する方法を提供する。
本明細書で論じられているように、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているポリペプチドは、天然（例えば、ヒトまたはクラゲ（ヒドロ虫））コラーゲンと比べて短縮型アミノ酸配列であるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、そのようなポリペプチドは、短縮型コラーゲンである（例えば、天然コラーゲンと比べて１つまたは複数の短縮型アミノ酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、短縮型コラーゲンは、クラゲコラーゲンまたはヒトコラーゲンである。様々な実施形態では、コラーゲンは、（例えば、天然コラーゲンに比べて）Ｃ末端、Ｎ末端で短縮されるか、内部で短縮されるか、またはＣ末端およびＮ末端の両方で短縮される。一実施形態では、コラーゲンは、Ｃ末端およびＮ末端の両方で（例えば、天然コラーゲンに比べて）短縮されている。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されているポリペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端での短縮化、および／または１つもしくは複数の内部短縮化を含むような、任意の適切な短縮化の短縮型コラーゲンであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンの短縮化は、有利な結果（例えば、天然コラーゲンと比べて改善された結果、および／または天然コラーゲンと比べて追加された利点）を達成するため、ならびに／あるいはコラーゲンの１つまたは複数の有利な態様を保持しながら、コラーゲンの長さを短くするために適切である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているポリペプチドは、コラーゲンの１つまたは複数の局所的な利点を保持するような方法で短縮されたコラーゲンであるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、短縮型コラーゲン（そのアミノ酸配列）（例えば、本明細書で提供されているポリペプチドの）は、Ｃ末端で、任意の適切な数のアミノ酸残基、例えば最大１０、１０～８００、１０～７００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００などのアミノ酸残基が短縮される。ある特定の実施形態では、短縮型コラーゲン（そのアミノ酸配列）（例えば、本明細書で提供されているポリペプチドの）は、Ｎ末端で、任意の適切な数のアミノ酸残基、例えば最大１０、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００などのアミノ酸残基が短縮される。いくつかの実施形態では、短縮型コラーゲン（そのアミノ酸配列）（例えば、本明細書で提供されているポリペプチドの）は、任意の適切な数のアミノ酸残基、例えば最大１０、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～５００、１０～４００、１０～３００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００などのアミノ酸残基が内部で短縮される。特定の実施形態では、短縮型コラーゲン（そのアミノ酸配列）（例えば、本明細書で提供されているポリペプチドの）は、Ｃ末端で、１０アミノ酸から８００アミノ酸が短縮され、および／またはＮ末端で、１０アミノ酸から８００アミノ酸が短縮される。別の実施形態では、短縮型コラーゲン（そのアミノ酸配列）（例えば、本明細書で提供されているポリペプチドの）は、１０アミノ酸から９００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から８００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から７００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から６００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から５００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から４００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から３００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から２００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から１００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から５０アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から８００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から７００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から６００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から５００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から４００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から３００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から２００アミノ酸の間の長さ、または５０アミノ酸から１００アミノ酸の間の長さである。
ある特定の実施形態では、本明細書では、ヒト（例えば、ヒト２１型）コラーゲンのアミノ酸配列であるか、またはそれを含むポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、短縮型ヒトコラーゲンは、短縮型ヒト２１型コラーゲンである。様々な実施形態では、短縮化は、本明細書で提供されている任意の開示によるものである。特定の実施形態では、開示されている短縮型ヒト２１型コラーゲンは、配列番号１６（または、例えば、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または本明細書で提供されている他の配列同一性を有するような、その相同体）である。様々な実施形態では、そのようなポリペプチドは、本明細書で提供されている任意の組成物、製剤、または方法で提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書では、クラゲ（ヒドロ虫）コラーゲンのアミノ酸配列であるか、またはそれを含むポリペプチドが提供される。様々な実施形態では、短縮化は、本明細書で提供されている任意の開示によるものである。特定の実施形態では、開示されている短縮型クラゲコラーゲンは、配列番号５（または、例えば、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または本明細書で提供されている他の配列同一性を有するような、その相同体）である。様々な実施形態では、そのようなポリペプチドは、本明細書で提供されている任意の組成物、製剤、または方法で提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書では、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている短縮型コラーゲンであるか、またはそれを含むポリペプチド）を個体の皮膚に投与して、例えば、個体に、またはその皮膚に利点を提供することを含む方法が提供される。いくつかの事例では、皮膚に提供される利点は、皮膚の堅さの改善、皮膚の弾力性の改善、皮膚の水分保持の改善、皮膚のテクスチャーの改善、皮膚の明るさの改善、皮膚の皺の低減、皮膚の紅斑の低減、皮膚におけるコラーゲン産生の改善、皮膚におけるエラスチン産生の改善または増加、皮膚に対する抗酸化保護、皮膚の赤みの低減、もしくは他の利点、または本明細書で記載されているような利点の組合せである。様々な事例では、皮膚特性の改善、または本明細書で提供されている方法によって提供される利点は、任意の適切な方法で、例えば、計測手段の使用によって、または臨床医による評価によって決定される。一態様では、皮膚の堅さを増加させる方法が提供され、皮膚の堅さが少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％増加される。一実施形態では、皮膚の堅さは、キュートメーター（cutometer）を使用して測定される。
別の態様は、皮膚の弾力性を増加させる方法であって、皮膚の堅さが少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％増加される、方法を提供する。一実施形態では、皮膚の弾力性は、キュートメーターを使用して測定される。
別の態様では、皮膚の水分保持を増加させる方法であって、皮膚の水分保持が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％増加する、方法が提供される。一実施形態では、皮膚の水分保持はコルネオメーター（corneometer）で測定される。
一態様では、皮膚の堅さが増加される、皮膚の堅さを増加させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚の堅さは、専門の臨床的評点者によって判定される。
一態様では、皮膚の弾力性が増加される、皮膚の弾力性を増加させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚の弾力性は、専門の臨床的評点者によって決定される。
一態様では、皮膚の明るさが増加される、皮膚の明るさを増加させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚の明るさは、専門の臨床的評点者によって決定される。
別の態様では、皮膚の触覚テクスチャーが増加される、皮膚の触覚テクスチャーを増加させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚の触覚テクスチャーは、専門の臨床的評点者によって決定される。
一態様では、皮膚の視覚テクスチャーが増加される、皮膚の視覚テクスチャーを増加させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚の視覚テクスチャーは、専門の臨床的評点者によって決定される。
一態様では、皮膚上に存在する線または皺が低減される、皮膚上に存在する線または皺を減少させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚上に存在する線または皺の量は、専門の臨床的評点者によって決定される。
一態様では、皮膚の紅斑が低減される、皮膚の紅斑を減少させる方法が提供される。一実施形態では、皮膚の紅斑は専門の臨床的評点者によって決定される。
別の態様は、皮膚細胞のコラーゲン産生を刺激する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、天然に存在しない短縮型コラーゲン、または天然に存在しない短縮型コラーゲンを含む製剤を皮膚に塗布することを含む。一実施形態では、短縮型クラゲコラーゲンまたは短縮型ヒトコラーゲンは、コラーゲン産生を刺激する。特定の実施形態では、短縮型ヒトコラーゲンは、配列番号１６の短縮型ヒト２１型コラーゲンである。別の特定の実施形態では、短縮型クラゲコラーゲンは、配列番号５の短縮型クラゲコラーゲンである。
さらに別の態様は、皮膚のコラーゲンが、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％増加する、皮膚細胞におけるコラーゲン産生を刺激する方法を提供する。
短縮型コラーゲンと、水、油グリセレス－８エステルズ、グリセリン、ココナッツアルカン、ヒドロキシエチルアクリレート／アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、ペンチレングリコール、ＥＤＴＡ二ナトリウム、カプリリルグリコール、クロルフェネシン、およびフェノキシエタノールからなる群から選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む局所製剤が開示されている。一実施形態では、短縮型コラーゲンは、短縮型クラゲコラーゲンまたは短縮型ヒトコラーゲンである。別の実施形態では、短縮型コラーゲンは、短縮型ヒト２１型コラーゲンである。本明細書で開示されているさらに別の実施形態は、コラーゲンを含み、さらに植物油を含む局所製剤である。一実施形態では、植物油はオリーブ油である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャー、コラーゲン含有量、エラスチン含有量を増加させ、赤みまたは視覚テクスチャーを低減する方法であって、天然に存在しない短縮型コラーゲンを前記皮膚に局所的に塗布することを含む（例えば、前記短縮型コラーゲンが、天然に存在するコラーゲン、例えば天然に存在するヒトまたはクラゲコラーゲンのアミノ酸配列と比べて短縮されたアミノ酸配列であるか、またはそれを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドである）、方法。
（項目２）
皮膚に存在する線もしくは皺を減少させるか、または皮膚の紅斑を減少させる方法であって、天然に存在しない短縮型コラーゲンを前記皮膚に局所的に塗布することを含む（例えば、前記短縮型コラーゲンが、天然に存在するコラーゲン、例えば天然に存在するヒトまたはクラゲコラーゲンのアミノ酸配列と比べて短縮されたアミノ酸配列であるか、またはそれを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドである）、方法。
（項目３）
前記天然に存在しない短縮型コラーゲンがヒトコラーゲンまたはクラゲコラーゲンである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記短縮型コラーゲンがヒトコラーゲンである、項目１または３に記載の方法。
（項目５）
前記ヒトコラーゲンが、Ｃ末端、Ｎ末端で短縮されるか、内部で短縮されるか、または前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記ヒトコラーゲンが前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記コラーゲンが、前記Ｃ末端で１０アミノ酸から８００アミノ酸の間で短縮され、および／または前記Ｎ末端で１０アミノ酸から８００アミノ酸の間で短縮される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記短縮型コラーゲンが、１０アミノ酸から９００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から８００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から７００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から６００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から５００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から４００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から３００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から２００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から１００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から５０アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から８００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から７００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から６００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から５００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から４００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から３００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から２００アミノ酸の間の長さ、または５０アミノ酸から１００アミノ酸の間の長さである、項目３から項目７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記コラーゲンが短縮型ヒト２１型コラーゲンである、項目１から項目８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記短縮型ヒト２１型コラーゲンが配列番号１６である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記皮膚の前記堅さが、キュートメーターを使用して測定した場合に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％増加する、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記皮膚の前記弾力性が、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％増加する、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記皮膚の前記弾力性が、１週間処置した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも８％増加する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記皮膚の前記弾力性が、２週間処置した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも２５％増加する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記皮膚の前記弾力性が、２週間処置した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも３０％増加する、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記皮膚の前記弾力性が、４週間処置した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも１００％増加する、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記天然に存在しない短縮型コラーゲンが、前記皮膚に対して、０．１％ｗ／ｗの前記天然に存在しない短縮型コラーゲンを含むフェイシャルセラムとして塗布される、項目１３または１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記皮膚の前記水分保持が、コルネオメーターで測定した場合に、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、または７５％増加する、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記皮膚の前記堅さが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記皮膚の前記弾力性が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記皮膚の前記明るさが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記皮膚の前記コラーゲン含有量が、ＳＩＡｓｃｏｐｅで測定した場合に、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％増加する、項目１から項目１０に記載のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記皮膚の前記コラーゲン含有量が２週間後に少なくとも５％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記皮膚の前記コラーゲン含有量が２週間後に少なくとも７％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記皮膚の前記コラーゲン含有量が４週間後に少なくとも９％増加する、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記皮膚の前記触覚テクスチャーが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記皮膚の前記視覚テクスチャーが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
皮膚に存在する前記線または皺が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に減少する、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
皮膚に存在する前記線または皺が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に少なくとも１０％減少する、項目２８に記載の方法。前記皮膚の前記紅斑が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に減少する、項目１から項目１０のいずれかに記載の方法。
（項目３０）
前記皮膚の前記紅斑が、２週間局所塗布した後、専門の臨床的評点者によって判定される場合に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または４５％減少する、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記皮膚の前記紅斑が、４週間局所塗布した後、専門の臨床的評点者によって判定される場合に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、または５５％減少する、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
皮膚細胞におけるコラーゲン産生を刺激する方法であって、天然に存在しない短縮型コラーゲンを前記皮膚に局所的に塗布することを含む、方法。
（項目３３）
前記天然に存在しない短縮型コラーゲンがヒトコラーゲンである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ヒトコラーゲンが、Ｃ末端、Ｎ末端で短縮されるか、内部で短縮されるか、または前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ヒトコラーゲンが前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記コラーゲンが、前記Ｃ末端で１０アミノ酸から８００アミノ酸の間で短縮され、および／または前記Ｎ末端で１０アミノ酸から８００アミノ酸の間で短縮される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記短縮型コラーゲンが、１０アミノ酸から９００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から８００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から７００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から６００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から５００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から４００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から３００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から２００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から１００アミノ酸の間の長さ、１０アミノ酸から５０アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から８００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から７００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から６００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から５００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から４００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から３００アミノ酸の間の長さ、５０アミノ酸から２００アミノ酸の間の長さ、または５０アミノ酸から１００アミノ酸の間の長さである、項目３３から項目３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記コラーゲンが短縮型ヒト２１型コラーゲンである、項目３２から項目３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記短縮型ヒト２１型コラーゲンが配列番号１６である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記皮膚中の前記コラーゲンが、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％増加する、項目３２から項目３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
前記皮膚中の前記コラーゲンが、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％増加する、項目３２から項目３９のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
短縮型ヒト２１型コラーゲンと、水、油グリセレス－８エステルズ、グリセリン、ココナッツアルカン、ヒドロキシエチルアクリレート／アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、ペンチレングリコール、ＥＤＴＡ二ナトリウム、カプリリルグリコール、クロルフェネシン、およびフェノキシエタノールからなる群から選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む局所製剤。
（項目４３）
前記短縮型ヒト２１型コラーゲンが配列番号１６である、項目４２に記載の局所製剤。
（項目４４）
前記油が植物油、好ましくはオリーブ油である、項目４２または項目４３に記載の局所製剤。
（項目４５）
前記短縮型ヒト２１型コラーゲンが、海洋コラーゲンがヒト初代線維芽細胞に塗布された場合よりも、ヒト初代線維芽細胞に塗布された場合にエラスチン発現を高いレベルに上方制御する、項目４３または項目４４に記載の局所製剤。
（項目４６）
短縮型クラゲコラーゲンと、水、油グリセレス－８エステルズ、グリセリン、ココナッツアルカン、ヒドロキシエチルアクリレート／アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、ペンチレングリコール、ＥＤＴＡ二ナトリウム、カプリリルグリコール、クロルフェネシン、およびフェノキシエタノールからなる群から選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む局所製剤。
（項目４７）
前記短縮型クラゲコラーゲンが配列番号５である、項目４６に記載の局所製剤。
（項目４８）
前記油が植物油、好ましくはオリーブ油である、項目４６または項目４７に記載の局所製剤。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および長所についてのより良い理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を説明する下記の詳細な説明、およびその添付図面を参照することによって得られる。
図１は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）の線維芽細胞におけるコラーゲン１型タンパク質分泌に対する効果を示す図である。
図２Ａは、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置された線維芽細胞におけるコラーゲン１型ｍＲＮＡの発現を示す図である。
図２Ｂは、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置された線維芽細胞におけるエラスチンｍＲＮＡの発現を示す図である。
図２Ｃは、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置された線維芽細胞におけるフィブロネクチンｍＲＮＡの発現を示す図である。
図３は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置されたヒト初代ケラチノサイトにおけるＩＬ－１ａの発現を示す図である。
図４は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）の抗酸化能を示す図である。
図５は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置されたＵＶＢ照射ケラチノサイトの生存率を示す図である。
図６は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後の皮膚の弾力性を示す図である。
図７は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後の皮膚コラーゲン含有量を示す図である。
図８は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後の皮膚の赤みの定量化を示す図である。
図９は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型ヒトコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後の皮膚の皺の定量化を示す図である。
図１０は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置したヒト皮膚組織モデルによるコラーゲン１型タンパク質の分泌を示す図である。
図１１は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置したケラチノサイトにおけるＵＶＢ誘導性ＴＴ二量体を示す図である。
図１２は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した、ＵＶＢ照射後のケラチノサイト生存率を示す図である。
図１３は、都市部の粉塵と本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した場合の細胞生存率を示す図である。
図１４は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後にＵＶＢにより誘導されるＩＬ－１ａの相対的発現を示す図である。
図１５は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）の抗酸化能を示す図である。
図１６は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後の皮膚の水分保持を示す図である。
図１７は、本明細書で提供されている例示的なポリペプチド（短縮型クラゲコラーゲンアミノ酸配列を含む）で処置した後の皮膚の弾力性を示す図である。
説明
以下の説明において、ある特定の具体的な詳細が、本開示の様々な実施形態の完全な理解を提供するために示されている。しかし、当業者には、この開示がこれらの詳細を介さずに実施され得ることは理解されよう。
本明細書で使用される場合、用語の「約」とは、一般に、±１０％を意味する。
用語の「からなる」とは、「を含み、限定される」ことを意味する。一般に、「含む」の開示には、「からなる」の開示が含まれる。
用語の「から本質的になる」とは、追加の成分、ステップ、および／または部分が、特許請求の範囲の組成物、方法、または構造の基本特性および新規特性を実質的に変えない場合に限って、組成物、方法、または構造が追加の成分、ステップ、および／または部分を含み得ることを意味する。一般に、「含む」の開示には、「から本質的になる」の開示が含まれる。
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明白に他のことを示さない限り、複数の言及が含まれる。例えば、用語の「化合物」または「少なくとも１つの化合物」とは、それらの混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
この文書全体にわたって、本開示の様々な実施形態は、範囲形式で示すことができる。範囲形式での説明は、単に便宜上および簡潔性のためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されないものとすることについて理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての考えられるサブ範囲を詳細に開示していると考えるものとする。例えば、１から６のような範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などのサブ範囲と、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６などが詳細に開示されていると考えるものとする。これは、範囲の幅に関係なく塗布される。
数値の範囲が本明細書で示される場合は、常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の表示数値と第２の表示数値「の間に及ぶ／の間を範囲とする」という句と、第１の表示数値「から」第２の表示数値「まで及ぶ／までを範囲とする」という句は、本明細書では互換的に使用され、第１の表示数値および第２の表示数値、ならびにその間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合の用語「コラーゲン」または「コラーゲン様」とは、いくつかの事例では、１つまたは複数のコラーゲンまたはコラーゲン様ポリペプチドと結合して四次構造を形成することができる（例えば単量体の）ポリペプチドを意味する。コラーゲンの非限定的な例には、ヒト２１型アルファ１コラーゲン（例えば配列番号３１）、ヒト１型、アルファ２コラーゲン（例えば配列番号３２）、およびクラゲ（ヒドロ虫）コラーゲン（例えば配列番号３３）が含まれる。いくつかの事例では、コラーゲンは、酸、塩基、または熱で処理してゼラチンを調製することができる。天然コラーゲンの四次構造は、典型的には３つのポリペプチドから構成される、三重らせんであるが、本明細書で提供されている「短縮型コラーゲン」または「短縮型コラーゲン」を含むポリペプチドはそのような四次構造を有していても、有していなくてもよく、また必ずしもそのような四次構造を有しているわけではないことに留意されたい。ある特定の例では、天然コラーゲンを形成する３つのポリペプチドのうち、２つは通常同一であり、アルファ鎖と呼ばれる。第３のポリペプチドは、ベータ鎖と呼ばれる。ある特定の事例では、典型的な天然コラーゲンは、ＡＡＢとして呼ぶことができ、コラーゲンは、２つのアルファ（「Ａ」）鎖および１つのベータ（「Ｂ」）鎖から構成されている。ある特定の事例では、本明細書で提供されている「短縮型コラーゲン」を含むポリペプチドは、そのような構造エレメントを有していてもよく、有していなくてもよい。用語「コラーゲン」または「コラーゲン様」とは、アルファ鎖ポリペプチド、ベータ鎖ポリペプチド、またはアルファ鎖ポリペプチドとベータ鎖ポリペプチドの両方を意味し得る。本明細書で使用される場合の用語「プロコラーゲン」とは、一般に、天然に存在するコラーゲンにプロセシングすることができる細胞によって産生されるポリペプチドを意味する。
本明細書で使用される場合の用語「発現ベクター」または「ベクター」とは、一般に、外因性遺伝子の発現を方向づけることが可能な核酸アセンブリを意味する。発現ベクターは、外因性遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター、制限エンドヌクレアーゼ部位、１つまたは複数の選択マーカーをコードする核酸、および組換え技術の実施に有用である他の核酸を含み得る。
本明細書で使用される場合の用語「線維芽細胞」とは、一般に、プロコラーゲンおよび他の構造タンパク質を合成する細胞を意味する。線維芽細胞は、体内に広く分布しており、皮膚、結合組織、および他の組織で確認されている。
用語「蛍光タンパク質」とは、一般に、外因性ポリヌクレオチドの発現のレポーターとして使用される遺伝子工学技術において使用することができるタンパク質を意味する。このタンパク質は、紫外線または青色光に暴露された場合に蛍光を発し、明るい可視光を放出する。緑色光を放出するタンパク質には緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれ、赤色光を放出するタンパク質には赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が含まれる。
本明細書で使用される場合の用語「ゼラチン」とは、一般に、酸、塩基、または熱に曝露することによってさらに処理されたコラーゲンを意味する。いくつかの事例では、ゼラチン溶液は、食品、化粧品、医薬品、工業製品、医療品、実験室用増殖培地、および他の多くの用途において使用される可逆ゲルを形成する。
本明細書で使用される場合の用語「遺伝子」とは、一般に、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味し、またそれはコード領域単独を意味していてもよく、コード配列の前の制御配列（５’非コード配列）および後の制御配列（３’非コード配列）を含んでいてもよい。
用語「ヒスチジンタグ」とは、一般に、組換えポリペプチド上の２～３０個の連続する一連のヒスチジン残基を意味する。
用語「宿主細胞」とは、一般に、導入された外因性ポリヌクレオチドを発現するように操作された細胞を意味する。
用語「ケラチノサイト」とは、一般に、皮膚の表皮層で確認されるケラチンを産生する細胞を意味する。
本明細書で使用される場合の用語「ラクタマーゼ」とは、一般に、ラクタム（環状アミド）部分を含む抗生物質を加水分解する酵素を意味する。「ベータ－ラクタマーゼ」または「β－ラクタマーゼ」は、β－ラクタム部分を含む抗生物質を加水分解する酵素である。
本明細書で使用される場合の用語「天然に存在しない」とは、通常は自然界では見つからない、遺伝子、ポリペプチド、またはタンパク質、例えばコラーゲンを意味する。天然に存在しないコラーゲンは、組換え的に調製することができる。天然に存在しないコラーゲンは、組換えコラーゲンであり得る。天然に存在しないコラーゲンは、一実施形態では、短縮型コラーゲンである。他の天然に存在しないコラーゲンポリペプチドには、キメラコラーゲンが含まれる。キメラコラーゲンは、コラーゲンポリペプチドの一部が第２のコラーゲンポリペプチドの一部に隣接するポリペプチドである。例えば、ヒトコラーゲンの一部に隣接するクラゲコラーゲンの一部を含むコラーゲン分子は、キメラコラーゲンである。別の実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位、ＧＥＫリピート、ＧＤＫリピート、および／またはベータ－ラクタマーゼなどの追加のアミノ酸を含む融合ポリペプチドを含む。
一般に、例えば特定のアミノ酸配列を有する、本明細書で提供されているコラーゲンまたは短縮型コラーゲンの開示は、正確なアミノ酸配列およびそれらの相同体を有しているかまたは含んでいるポリペプチドを含む。いくつかの事例では、本明細書で提供されているアミノ酸配列の相同体は、より長い配列またはより短い配列を有していてもよく、またそのようなアミノ酸配列の１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換を有していてもよい。そのような相同体は、例えば本明細書で提供されている量で、列挙した配列に対して特定の配列同一性を有する。同一性パーセントを評価する目的などにおける配列同一性は、限定するものではないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.htmlで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ ａｌｉｇｎｅｒ、必要に応じてデフォルト設定、を参照）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツール、必要に応じてデフォルト設定、を参照）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.htmlで利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナー、必要に応じてデフォルト設定、を参照）を含む、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって測定することができる。最適なアラインメントは、デフォルトパラメーターを含む、選択したアルゴリズムの任意の適切なパラメーターを使用して評価することができる。いくつかの場合には、天然に存在しないコラーゲンは、本明細書に開示されている配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。
用語「プロテアーゼ切断部位」とは、一般に、特定のプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を意味する。
用語「分泌タグ」または「シグナルペプチド」とは、一般に、宿主細胞の細胞機構を動員して、発現タンパク質を宿主細胞の特定の位置または細胞オフガネラに輸送するアミノ酸配列を意味する。
用語「短縮型コラーゲン」とは、一般に、完全長コラーゲンの１つまたは複数の部分が存在しない、完全長コラーゲンよりも小さい単量体ポリペプチドを意味する。コラーゲンポリペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端で短縮されるか、完全長コラーゲンポリペプチドの内部部分（単数または複数）の除去によって短縮されるか（例えば、内部短縮化）、またはＣ末端とＮ末端の両方で短縮される。非限定的な実施形態では、短縮型ヒトコラーゲンは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、またはその相同体を含み得る。別の非限定的な例では、短縮型クラゲコラーゲンは、配列番号５に記載のアミノ酸配列またはその相同体を含み得る。一般に、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、天然コラーゲンもしくは完全長コラーゲンの機能と類似もしくは実質的に類似した機能を有し、および／または天然コラーゲンもしくは完全長コラーゲンの機能と類似もしくは実質的に類似した利点（例えば、本明細書で提供されているような）を提供し得る。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、天然コラーゲンまたは完全長コラーゲンと比較して、機能および／または利点（例えば、本明細書で提供されているような）を改善する、または増加させることができる。
アミノ酸位置に関して使用される場合、「短縮化」とは、前記アミノ酸位置を包含する。例えば、完全長タンパク質のアミノ酸１００位でのＮ末端短縮化は、完全長タンパク質のＮ末端からの１００アミノ酸の短縮化を意味する（すなわち、短縮型タンパク質は、完全長タンパク質のアミノ酸１位から１００位が欠失している）。同様に、完全長タンパク質（１０００アミノ酸完全長タンパク質を想定）のアミノ酸９０１位でのＣ末端短縮化は、Ｃ末端からの１００アミノ酸の短縮化を意味する（すなわち、短縮化タンパク質は、完全長タンパク質のアミノ酸９０１位から１０００位が欠失している）。同様に、アミノ酸１０１位および２００位での内部短縮化は、完全長タンパク質の１００アミノ酸の内部短縮化を意味する（すなわち、短縮型タンパク質は、完全長タンパク質のアミノ酸１０１位から２００位が欠失している）。
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、アミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物のうちの１つまたは複数をさらに含むことができる。
宿主細菌細胞は、バッチプロセス、フェッドバッチプロセス、または反復型フェッドバッチプロセスで、連続的にまたは非連続的に培養することができる。
一般に、シグナル配列は、発現ベクターの構成要素であってもよく、またはベクターに挿入される外因性遺伝子の一部であってもよい。選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。外因性遺伝子の天然シグナル配列を認識およびプロセシングしない細菌宿主細胞については、シグナル配列は、一般的に公知の任意の細菌シグナル配列で置換され得る。いくつかの実施形態では、組換え的に産生されたポリペプチドは、ＤｓｂＡシグナル配列を使用して、ペリプラズム空間に標的化され得る。Dinh and Bernhardt, J Bacteriol, Sept. 2011, 4984-4987。
一態様では、宿主細胞によって産生される天然に存在しないコラーゲンが提供される。天然に存在しないコラーゲンは、クラゲコラーゲンまたはヒトコラーゲンであり得る。天然に存在しないコラーゲンは、短縮型コラーゲンであり得る。短縮化は、内部短縮化（例えば、内部部分の短縮化）、コラーゲンのＮ末端部分での短縮化、コラーゲンのＣ末端部分での短縮化、またはＣ末端とＮ末端の両方での短縮化であり得る。コラーゲンは、５０アミノ酸から１０００アミノ酸の間、５０アミノ酸から９５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から９００アミノ酸の間、５０アミノ酸から８５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から８００アミノ酸の間、５０アミノ酸から８５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から８００アミノ酸の間、５０アミノ酸から７５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から７００アミノ酸の間、５０アミノ酸から６５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から６００アミノ酸の間、５０アミノ酸から６５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から５００アミノ酸の間、５０アミノ酸から４５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から４００アミノ酸の間、５０アミノ酸から３５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から３００アミノ酸の間、５０アミノ酸から２５０アミノ酸の間、５０アミノ酸から２００アミノ酸の間、５０アミノ酸から１５０アミノ酸の間、または５０アミノ酸から１００アミノ酸の間の短縮化によって短縮化され得る。別の実施形態では、コラーゲンは、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００アミノ酸が短縮化され得る。天然に存在しないコラーゲンは、本明細書に開示されているポリヌクレオチド配列の一部またはポリヌクレオチド配列全体によってコードされ得る。
本明細書で開示されている短縮型コラーゲンは、完全長コラーゲンに対する短縮化を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている短縮型コラーゲンは、完全長ヒト２１型アルファ１コラーゲンに対する短縮化を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている短縮型コラーゲンは、完全長ヒト１型アルファ２コラーゲンに対する短縮化を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている短縮型コラーゲンは、完全長クラゲ（ヒドロ虫）コラーゲンに対する短縮化を含む。完全長コラーゲンの非限定的な例を下記の表１で提供する。
Figure 0007317964000001
Figure 0007317964000002
いくつかの場合には、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、配列番号３１のアミノ酸１位から５４８位の間、アミノ酸１位から５５３位の間；アミノ酸１位から５５８位の間；アミノ酸１位から５６３位の間；アミノ酸１位から５６８位の間；またはアミノ酸１位から５７３位の間の任意のアミノ酸位置でのＮ末端短縮化を含み得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、配列番号３１のアミノ酸７２６位から９５７位の間；アミノ酸７３１位から９５７位の間；アミノ酸７３６位から９５７位の間；アミノ酸７４１位から９５７位の間；アミノ酸７４６位から９５７位の間；アミノ酸７５１位から９５７位の間；またはアミノ酸７５６位から９５７位の間の任意のアミノ酸位置でのＣ末端短縮化を含み得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、Ｎ末端短縮化とＣ末端短縮化の両方を含み得る。例えば、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、配列番号３１のアミノ酸１位から５４８の間；アミノ酸１位から５５３位の間；アミノ酸１位から５５８位の間；アミノ酸１位から５６３位の間；アミノ酸１位から５６８位の間；またはアミノ酸１位から５７３位の間の任意のアミノ酸位置でのＮ末端短縮化と；アミノ酸７２６位から９５７位の間；アミノ酸７３１位から９５７位の間；アミノ酸７３６位から９５７位の間；アミノ酸７４１位から９５７位の間；アミノ酸７４６位から９５７位の間；アミノ酸７５１位から９５７位の間；またはアミノ酸７５６位から９５７位の間の任意のアミノ酸位置でのＣ末端短縮化を含み得る。特定の実施形態では、本明細書で開示されている短縮型コラーゲンは、配列番号３１のアミノ酸５５８位でのＮ末端短縮化と、配列番号３１のアミノ酸７４６位でのＣ末端短縮化を含み得る。
いくつかの場合には、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸１位から４０１位の間；アミノ酸１位から４０６位の間；アミノ酸１位から４１１位の間；アミノ酸１位から４１６位の間；アミノ酸１位から４２１位の間；アミノ酸１位から４２６位の間；またはアミノ酸１位から４３１位の間の任意のアミノ酸位置でのＮ末端短縮化を含み得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸５８５位から１３６６位の間；アミノ酸５９０位から１３６６位の間；アミノ酸５９５位から１３６６位の間；アミノ酸６００位から１３６６位の間；アミノ酸６０５位から１３６６位の間；アミノ酸６１０位から１３６６位の間；アミノ酸６１５位から１３６６位の間；またはアミノ酸６２０位から１３６６位の間の任意のアミノ酸位置でのＣ末端短縮化を含み得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、Ｎ末端短縮化とＣ末端短縮化の両方を含み得る。例えば、本明細書で記載されているような短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸１位から４０１位の間；アミノ酸１位から４０６位の間；アミノ酸１位から４１１位の間；アミノ酸１位から４１６位の間；アミノ酸１位から４２１位の間；アミノ酸１位から４２６位の間；またはアミノ酸１位から４３１位の間の任意のアミノ酸位置でのＮ末端短縮化と；配列番号３２のアミノ酸５８５位から１３６６位の間；アミノ酸５９０位から１３６６位の間；アミノ酸５９５位から１３６６位の間；アミノ酸６００位から１３６６位の間；アミノ酸６０５位から１３６６位の間；アミノ酸６１０位から１３６６位の間；アミノ酸６１５位から１３６６位の間；またはアミノ酸６２０位から１３６６位の間の任意のアミノ酸位置でのＣ末端短縮化を含み得る。特定の実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸４１６位でのＮ末端短縮化と；配列番号３２のアミノ酸６０５位でのＣ末端短縮化を含み得る。
いくつかの場合には、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸１位から１０１位の間；アミノ酸１位から１０６位の間；アミノ酸１位から１１１位の間；アミノ酸１位から１１６位の間；アミノ酸１位から１２１位の間；またはアミノ酸１位から１２６位の間の任意のアミノ酸位置でのＮ末端短縮化を含み得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸２７６位から１３６６位の間；アミノ酸２８１位から１３６６位の間；アミノ酸２８６位から１３６６位の間；アミノ酸２９１位から１３６６位の間；アミノ酸２９６位から１３６６位の間；アミノ酸３０１位から１３６６位の間；またはアミノ酸３０６位から１３６６位の間の任意のアミノ酸位置でのＣ末端短縮化を含み得る。いくつかの場合には、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、Ｎ末端短縮化とＣ末端短縮化の両方を含み得る。例えば、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸１位から１０１位の間；アミノ酸１位から１０６位の間；アミノ酸１位から１１１位の間；アミノ酸１位から１１６位の間；アミノ酸１位から１２１位の間；またはアミノ酸１位から１２６位の間の任意のアミノ酸位置でのＮ末端短縮化と；配列番号３２のアミノ酸２７６位から１３６６位の間；アミノ酸２８１位から１３６６位の間；アミノ酸２８６位から１３６６位の間；アミノ酸２９１位から１３６６位の間；アミノ酸２９６位から１３６６位の間；アミノ酸３０１位から１３６６位の間；またはアミノ酸３０６位から１３６６位の間の任意のアミノ酸位置でのＣ末端短縮化を含み得る。特定の実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、配列番号３２のアミノ酸１１１位でのＮ末端短縮化と；配列番号３２のアミノ酸２９１位でのＣ末端短縮化を含み得る。
いくつかの場合には、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、配列番号３３のアミノ酸１６位から２４０位の間；アミノ酸１６位から２４５位の間；アミノ酸１６位から２５０位の間；アミノ酸１６位から２５５位の間；アミノ酸１６位から２６０位の間；アミノ酸１６位から２６５位の間；アミノ酸６位から２５５位の間；アミノ酸１１位から２５５位の間；アミノ酸２１位から２５５位の間；アミノ酸２６位から２５５位の間；アミノ酸３１位から２５５位の間；アミノ酸２１位から２５０位の間；アミノ酸２１位から２４５位の間；アミノ酸２６位から２５０位の間；アミノ酸２６位から２４５位の間；アミノ酸３１位から２５０位の間；またはアミノ酸３１位から２４５位の間の任意のアミノ酸位置での内部短縮化を含み得る。特定の実施形態では、本明細書で記載されている短縮型コラーゲンは、配列番号３３のアミノ酸１６位と２５５位での内部短縮化を含み得る。
いくつかの場合には、短縮型コラーゲンは、下記の表２で提供されている任意のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合には、短縮型コラーゲンは、下記の表２で提供されている任意のアミノ酸配列からなり得る。場合によっては、切断されたコラーゲンは、本質的に、以下の表２に提供される任意のアミノ酸配列からなり得る。特定の実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のいずれか１つのアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、短縮型コラーゲンは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、および配列番号２９のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Figure 0007317964000003
Figure 0007317964000004
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いくつかの場合には、短縮型コラーゲンは、１００アミノ酸から３００アミノ酸の間、１５０アミノ酸から２５０アミノ酸の間、１６０アミノ酸から２５０アミノ酸の間、１６０アミノ酸から２２０アミノ酸の間、１７０アミノ酸から２００アミノ酸の間、１８０アミノ酸から１９０アミノ酸の間、または１８５アミノ酸から１９０アミノ酸の間の長さであり得る。
天然に存在しないコラーゲンは、いくつかの実施形態では、分泌タグを含むアミノ酸配列をさらに含むことができる。分泌タグは、コラーゲンを宿主細胞のペリプラズム空間に方向づけることができる。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＤｓｂＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡ、Ｈｙ１Ａ、ＤｅｇＰ、または第２の分泌タグの一部に融合されている１つの分泌タグの一部を含むハイブリッド分泌タグに由来する。一態様では、分泌タグは、天然に存在しないコラーゲンに結合し得る。別の態様では、分泌タグは、天然に存在しないコラーゲンから切断され得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、ヒスチジン（またはポリヒスチジン）タグを含む。特定の実施形態では、ヒスチジンタグまたはポリヒスチジンタグは、コラーゲンに結合されている２ヒスチジン残基から２０ヒスチジン残基の配列であるか、またはそれを含む。様々な実施形態では、ヒスチジンタグは、２ヒスチジン残基から２０ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１５ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１８ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１６ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１５ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１４ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１３ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１２ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１１ヒスチジン残基、５ヒスチジン残基から１０ヒスチジン残基、６ヒスチジン残基から１２ヒスチジン残基、６ヒスチジン残基から１１ヒスチジン残基、または７ヒスチジン残基から１０ヒスチジン残基を含む。ヒスチジンタグは、ニッケルベースのクロマトグラフィー媒体を利用するクロマトグラフィー法によるタンパク質の精製において有用であり得る。例示的な蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。蛍光タンパク質は、当技術分野では周知である。一実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、ＧＦＰおよび／またはＲＦＰを含む。一実施形態では、スーパーフォルダーＧＦＰ（superfolder GFP）は、天然に存在しないコラーゲンに融合される。スーパーフォルダーＧＦＰは、折り畳みが不十分なポリペプチドに融合されている場合であっても適切に折り畳まれるＧＦＰであり得る。一態様では、ヒスチジンタグは、天然に存在しないコラーゲンに結合させることができる。別の態様では、ヒスチジンタグは、天然に存在しないコラーゲンから切断され得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、プロテアーゼ切断部位をさらに含む。プロテアーゼ切断部位は、組換えにより産生されたコラーゲンを切断してポリペプチドの１つまたは複数の部分を除去するのに有用であり得る。除去され得るポリペプチドの部分には、分泌タグ、ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質タグ、および／またはベータ－ラクタマーゼが含まれる。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含み得る。例示的なプロテアーゼ切断部位には、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロペプチダーゼ、およびライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって切断されるアミノ酸が含まれる。一態様では、切断タグは、天然に存在しないコラーゲンに結合されている。別の態様では、切断タグは、天然に存在しないコラーゲンから適切なプロテアーゼによって除去される。
いくつかの実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、ベータ－ラクタマーゼである酵素をさらに含む。ベータ－ラクタマーゼは、選択マーカーとして有用であり得る。一態様では、ベータ－ラクタマーゼは、天然に存在しないコラーゲンに結合される。別の態様では、ベータ－ラクタマーゼは、天然に存在しないコラーゲンから切断される。
本明細書の特定の実施形態では、本明細書で提供されている１つまたは複数のポリペプチドを含む（例えば、局所用の）組成物または製剤が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、任意の適切な量（例えば、個体または細胞に投薬または投与された場合に利点を提供するのに適した量）などの、任意の適切な量の本明細書で提供されるポリペプチドを提供する。いくつかの特定の実施形態では、組成物は、個体の皮膚に（例えば、局所的に）投与された場合に、個体の皮膚に有利な効果を提供するのに適した量を含む。特定の実施形態では、組成物は、０．００１％から３０％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されているようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）を含む。より特定の実施形態では、組成物は、０．００１％から２０％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）、０．００１％から１０％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）、０．００１％から５％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）、０．００１％から２％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）、０．００１％から１％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）、０．００１％から０．５％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）、および０．００１％から０．２％ｗ／ｗの間の本明細書で提供されるようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）を含む。
一態様では、天然に存在しないコラーゲンを含む組成物は、パーソナルケア製品（例えば化粧品）であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与用に製剤化される。組成物は、ヒトが使用するのに適した他の化粧品成分を含むことが可能である。パーソナルケア製品は、ヒトの皮膚または毛髪への紫外線による損傷を予防または処置するのに有用であり得る。パーソナルケア製品は、皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャーもしくは視覚テクスチャーを増加させ、および／またはコラーゲン産生を刺激するのに有用であり得る。パーソナルケア製品は、皮膚の赤みを軽減するのに有用であり得る。パーソナルケア製品は、皮膚または毛髪に塗布され得る。組成物には、例えば、マスク、皮膚洗浄剤、例えば石鹸、クレンジングクリーム、クレンジングローション、顔用洗浄剤（facial cleanser）、クレンジング乳液、クレンジングパッド、洗顔料（facial wash）、フェイシャルクリームおよびボディクリームならびに保湿剤、フェイシャルセラム、フェイシャルマスクおよびボディマスク、フェイシャルトナーおよびミスト、アイクリームおよびアイトリートメント、角質除去剤（exfoliator formula）、リップバームおよびリップスティック、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナーおよびボディシャンプー、ヘアセラムおよびスカルプセラム、ヘアミストおよびヘアスプレー、アイシャドー、コンシーラー、マスカラ、ならびに他のカラー化粧品が含まれる。
天然に存在しないコラーゲンを含む組成物は、局所用担体または防腐剤を含む少なくとも１つの追加の成分をさらに含むことができる。局所用担体は、リポソーム、生分解性マイクロカプセル、ローション、スプレー、エアロゾル、ダスティングパウダー、生分解性ポリマー、鉱油、トリグリセリド油、シリコーン油、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、アルコール、乳化剤、液化石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ワックス、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、シクロメチコン、シクロペンタシロキサンおよび水からなる群から選択される局所用担体を含み得る。防腐剤は、トコフェロール、ジヨードメチル－ｐ－トリルスルホン、２－ブロモ－２－ニトロプロパン－１，３－ジオール、シス異性体１－（３－クロロアリル）－３，５，７－トリアザ－１－アゾニアアダマンタンクロリド、グルタルアルデヒド、４，４－ジメチルオキサゾリジン、７－エチルビシクロオキサゾリジン、フェノキシエタノール、ブチレングリコール、１，２ヘキサンジオール、メチルパラベン、ソルビン酸、ゲルマベンＩＩ、ローズマリー抽出物、およびＥＤＴＡからなる群から選択される防腐剤を含み得る。
また本明細書のある特定の実施形態では、皮膚損傷を低減し、損傷した皮膚の修復を促進し、ＵＶ損傷に対して皮膚を保護し、および／または都市部の粉塵への曝露の影響に対して皮膚細胞を保護する方法が提供される。別の実施形態では、皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャー、または視覚テクスチャーを増加させる、および／またはコラーゲン産生を刺激する方法が提供される。本方法は、天然に存在しないコラーゲンを含む組成物を対象の皮膚に塗布するステップを含み得る。特定の理論またはメカニズムに拘束されるものではないが、組成物中のコラーゲンは、ＵＶ損傷に対して保護することによって皮膚損傷を軽減することができる。いくつかの場合には、組成物中のコラーゲンは、細胞の生存率を増加させることによって、損傷した皮膚の修復を促進することができる。いくつかの場合には、組成物中のコラーゲンは、皮膚に塗布された場合にプロコラーゲン合成を増加させることによって、および／または皮膚細胞の生存率を促進することによって、皮膚損傷を軽減し、および／または細胞の修復を促進することができる。いくつかの場合には、コラーゲンは、チミン－チミン（ＴＴ）二量体の形成を減少させる。
本明細書で提供されている方法は、例えば本明細書で提供されているステップによって、本方法で示されている処置のための組成物の使用を包含する。実施形態では、本開示は、（例えば対象の皮膚に本明細書で提供されている組成物を投与することによって、）皮膚損傷を軽減し、損傷した皮膚の修復を促進し、ＵＶ損傷に対して皮膚を保護し、および／または、都市部の粉塵への曝露の影響から皮膚細胞を保護する方法における、本明細書で提供されている組成物（例えば、短縮型コラーゲンまたは短縮型コラーゲンを含む製剤）の使用を提供する。実施形態では、本開示は、皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャー、もしくは視覚的テクスチャーを増加させる、および／またはコラーゲン産生を刺激する方法における、本明細書で提供されている組成物（例えば、短縮型コラーゲンまたは短縮型コラーゲンを含む製剤）の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンの線維芽細胞および／またはケラチノサイト産生を刺激することができる（例えば、実施例４および実施例６を参照）。いくつかの場合には、プロコラーゲンＩ型Ｃペプチド（コラーゲン産生に関する読み出し情報）のレベルが測定され得る。いくつかの場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭａｔＴｅｋ完全厚さヒト皮膚組織モデルを使用して（例えば実施例６を参照）、プロコラーゲンＩ型Ｃペプチドのレベルを評価することができる。いくつかの場合には、コラーゲンＩ型のレベルは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定または決定され得る。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、未処置の細胞、レチノールで処置した細胞、および／またはビタミンＢ３で処置した細胞よりも高いレベルでコラーゲンＩ型の産生を刺激し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、細胞外マトリックス遺伝子の線維芽細胞過剰発現を刺激し得る（例えば、実施例４を参照）。いくつかの場合には、細胞外マトリックス遺伝子のレベルは、ＲＮＡシーケンシングによって測定することができる。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、コラーゲンＩ型遺伝子（ＣＯＬ１Ａ）、エラスチン遺伝子（ＥＬＮ）、およびフィブロネクチン遺伝子（ＦＮ１）のうちの１つまたは複数の線維芽細胞過剰発現を刺激し得る。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンで処置された線維芽細胞によって産生される細胞外マトリックス遺伝子のレベルは、未処置の線維芽細胞、またはレチノールで処置した線維芽細胞よりも高くなり得る。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンで処置された線維芽細胞によって産生される細胞外マトリックス遺伝子のレベルは、ビタミンＣで処置された線維芽細胞と類似し得るか、またはそれよりも高くなり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、ＵＶＢ光で照射されたケラチノサイトの炎症を軽減することができる（例えば、実施例４および実施例６を参照）。いくつかの場合には、ケラチノサイトにＵＶＢ光を照射し、次いで、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンで処置することができる。いくつかの場合には、炎症は、ＵＶＢを照射したケラチノサイトによって産生されるＩＬ－１αのレベルを測定することによって（例えばＥＬＩＳＡによって）測定することができる。いくつかの場合には、ＵＶＢ照射したケラチノサイトは、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンで処置した場合、未処置のケラチノサイトよりも低レベルのＩＬ－１αを産生し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、ＵＶＢ光で照射されたケラチノサイトの生存率を増加させ得る（例えば実施例４を参照）。いくつかの場合には、ケラチノサイトは、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンを用いて前処理（ＵＶＢ照射の前）および後処理（ＵＶＢ照射の後）することができる。いくつかの場合には、細胞の生存率は、ＭＴＴ代謝比色測定法を使用して測定され得る。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンで処置されたケラチノサイトは、未処置のケラチノサイトよりもＵＶＢ照射後の高い細胞生存率を示し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、ＵＶＢ光へ曝露した後のケラチノサイトにおけるＤＮＡ損傷を軽減し得る（例えば実施例６を参照）。いくつかの場合には、ＤＮＡ損傷は、チミン二量体（ＴＴ二量体）のレベルを測定することによって評価することができる。非限定的な例では、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ ＵＶ誘発性ＤＮＡ損傷ＥＬＩＳＡキットを使用してＴＴ二量体レベルを測定することができる。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンを用いて処置されたＵＶＢ照射ケラチノサイトは、未処置のケラチノサイトよりもＴＴ二量体のレベルが低いことを示し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、抗酸化能力を有し得る（例えば実施例４および実施例６を参照）。いくつかの場合には、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイを使用して短縮型コラーゲンの酸化能力を測定することができる。非限定的な例では、０．１％溶液の形態の短縮型コラーゲンは、少なくとも１０μＭのトロロクス（ビタミンＥ）当量（ＴＥ）、少なくとも５０μＭのＴＥ、少なくとも１００μＭのＴＥ、少なくとも１５０μＭのＴＥ、少なくとも１６０μＭのＴＥ、少なくとも１７０μＭのＴＥ、少なくとも１８０μＭのＴＥ、少なくとも１９０μＭのＴＥ、または少なくとも２００μＭのＴＥの抗酸化特性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンは、未処置の細胞と比較して、都市部の粉塵汚染に曝露されたケラチノサイトの細胞生存率を増加させ得る（例えば実施例６を参照）。いくつかの場合には、細胞生存率は、ＭＴＴ代謝比色測定法によって測定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンの対象の顔への局所投与は、ベースラインと比較して、処置後１週間、２週間、４週間、８週間で、またはそれより長い期間で、顔の皮膚の弾力性を増加させることができる（例えば実施例５および実施例７を参照）。いくつかの場合には、顔の皮膚の弾力性は、キュートメーターで測定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンの対象の顔への局所投与は、ベースラインと比較して、処置後１週間、２週間、４週間、８週間で、またはそれより長い期間で、顔の皮膚コラーゲン含有量を増加させることができる（例えば実施例５を参照）。いくつかの場合には、顔の皮膚コラーゲン含有量は、ＳＩＡｓｃｏｐｅによって測定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンの局所投与は、ベースラインと比較して、処置後１週間、２週間、４週間、８週間で、またはそれより長い期間で、顔面の皮膚の赤み（紅斑）を軽減することができる（例えば実施例５を参照）。いくつかの場合には、顔の皮膚の赤み（紅斑）は、盲検の臨床的評点者によって、（例えば表４で提供されている５点順序尺度を使用して）スコア化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンの局所投与は、ベースラインと比較して、処置後１週間、２週間、４週間、８週間で、またはそれより長い期間で、顔の皺を減少させることができる（例えば実施例５を参照）。いくつかの場合には、顔の皺は、盲目化された臨床的評点者によってスコア化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンの局所投与は、ベースラインと比較して、処置後１週間、２週間、４週間、８週間で、またはそれより長い期間で、顔の皮膚の水分を増加させることができる（例えば、実施例７を参照）。いくつかの場合には、本明細書で提供されている短縮型コラーゲンの局所投与は、海洋コラーゲンの局所投与と比較して、顔の皮膚の水分を増加させることができる。いくつかの場合には、皮膚の水分保持は、コルネオメーターで測定することができる。
本開示の一態様は、天然に存在しないコラーゲンをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、クラゲまたはヒト由来のコラーゲンをコードし得る。ポリヌクレオチドは、完全長または短縮型のコラーゲンをコードし得る。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２８、または配列番号３０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または（例えば、それらに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する）それらの相同体を含み得る。いくつかの場合には、ポリヌクレオチドは、（例えば、宿主細胞における発現のために）コドン最適化され得る。
別の態様では、本開示は、コラーゲン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。コラーゲン融合タンパク質は、分泌タグ、ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質タグ、プロテアーゼ切断部位、ベータ－ラクタマーゼおよび／またはＧＥＫアミノ酸トリマーリピートおよび／またはＧＤＫアミノ酸トリマーリピートをコラーゲンと一緒に含み得る。
一態様では、ポリヌクレオチドをコードするコラーゲンを含むベクターを使用して宿主細胞を形質転換し、ポリヌクレオチドを発現させることができる。ポリヌクレオチドは、宿主生物が選択剤の存在下で増殖することを許可する酵素をコードする核酸をさらに含み得る。選択剤は、ガラクトースを含有する糖を含むある特定の糖、またはアンピシリン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８などを含む抗生物質を含み得る。選択剤に対する耐性を付与するために使用することができる酵素には、β－ガラクトシダーゼまたはβ－ラクタマーゼが含まれる。
一態様では、本発明のポリヌクレオチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞は、グラム陰性菌細胞、グラム陽性菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または外因性ポリヌクレオチドを発現するために使用される任意の他の細胞を含む任意の宿主細胞であり得る。例示的なグラム陰性宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
炭素源、窒素源、および無機リン酸塩源以外の任意の望ましいまたは必要な補充物もまた、単独で、または別の補充物もしくは培地、例えば複合窒素源との混合物として導入される適切な濃度で含まれ得る。ある特定の実施形態では、培地は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、カザミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および酵母抽出物から選択される１つまたは複数の成分をさらに含む。
ベータ－ラクタマーゼは、原核細胞においてラクタム系抗生物質に対する耐性を付与する酵素である。典型的には、ベータ－ラクタマーゼが細菌宿主細胞で発現される場合、発現されたベータ－ラクタマーゼタンパク質には、ベータ－ラクタマーゼタンパク質をペリプラズム空間に方向づける標的配列（分泌タグ）も含まれる。ベータ－ラクタマーゼは、ペリプラズム空間に輸送されなければ機能しない。酵素をペリプラズム空間に標的化する独立した分泌タグを使用することなくペリプラズム空間に標的化されるベータ－ラクタマーゼが提供される。ペリプラズム分泌タグがＧＦＰ、コラーゲンまたはＧＦＰ／コラーゲンキメラなどのタンパク質のＮ末端に付加される融合タンパク質を作製することによって、天然の分泌タグを欠失するベータ－ラクタマーゼの機能性を使用して、Ｎ末端融合タンパク質の完全な翻訳および分泌を選択することができる。このアプローチを使用すると、ＤｓｂＡ－ＧＦＰ－コラーゲン－ベータ－ラクタマーゼ融合を使用して、翻訳および分泌を促進する標的コラーゲンの短縮化産物を選択することができる。
別の実施形態は、本明細書で提供されているようなポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ポリペプチドまたは「コラーゲン」をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養培地に接種するステップと、宿主細胞を培養するステップと、ポリペプチド（または天然に存在しないコラーゲン）を宿主細胞から単離するステップを含む。
ポリペプチド（またはタンパク質）の発酵調製のためのプロセスが提供される。このプロセスは、
（ａ）マグネシウム塩を含む培地中で組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップであって、培地中のマグネシウムイオンの濃度が少なくとも約６ｍＭであり、細菌細胞がタンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、ステップと；
（ｂ）タンパク質を培地から回収するステップ
を含む。
細菌は、標的タンパク質を生成する目的における任意の適切な方法で、例えば、連続的に－例えばＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように－、またはバッチプロセス（バッチ培養）で、またはフェッドバッチプロセスまたは反復型フェッドバッチプロセスで、培養することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質の生成はラージスケールで行われる。組換えタンパク質を生成するための様々なラージスケールの発酵手順が利用可能である。ラージスケールの発酵は、少なくとも１，０００リットルの能力、好ましくは約１，０００～１００，０００リットルの能力を有する。いくつかの場合には、発酵槽は攪拌機羽根車を使用して酸素および栄養素、特にグルコース（好ましいのは炭素／エネルギー源）を分散させる。スモールスケールの発酵とは、一般に、容量的能力が約２０リットル以下の発酵槽での発酵を意味する。
標的タンパク質の蓄積については、宿主細胞を、標的タンパク質の蓄積に十分な条件下で培養することができる。そのような条件には、例えば、タンパク質の発現および細胞による蓄積を可能にする、温度、栄養素、および細胞密度の条件が含まれる。さらに、そのような条件は、当業者には公知であるように、分泌されたタンパク質について、転写、翻訳、およびある細胞区画から別の細胞区画へのタンパク質の通過の基本的な細胞機能を細胞が実施することができるものであり得る。
任意の適切な細菌細胞が、必要に応じて、本明細書で提供されている方法で利用される。細菌細胞は、任意の適切な温度で培養され得る。特定の実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。Ｅ．ｃｏｌｉの増殖については、例えば、典型的な温度は、約２０℃～約３９℃の範囲である。一実施形態では、温度は、約２０℃～約３７℃である。別の実施形態では、温度は約３０℃である。一実施形態では、宿主細胞は、スイッチされていない状態またはスチッチされた状態において、ある温度で培養され、異なる温度に切り替えてタンパク質の生成が誘導され得る。宿主細胞を、最初に、ある温度で培養して細胞を増殖させ、次いで、タンパク質の生成を誘導するために、細胞をより低い温度で培養することができる。第１の温度は、約２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃であり得る。第２の温度は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃または３６℃であり得る。第２の温度での培養は、１時間から１００時間の間、５時間から９０時間の間、５時間から８０時間の間、５時間から８０時間の間、５時間から７０時間の間、１０時間から７０時間の間、１５時間から７０時間の間、１５時間から６５時間の間、１５時間から６０時間の間、２０時間から６０時間の間、２０時間から５５時間の間、２０時間および５０時間の間、２４時間から５０時間の間、２４時間から４８時間の間、３０時間から５０時間の間、３０時間から４５時間の間、または３０時間から４０時間の間で行われ得る。
培養培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５～９の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉについては、ｐＨは、約６．０～約７．４、約６．２～約７．２、約６．２～約７．０、約６．２～約６．８、約６．２～約６．６、約６．４または約６．５であり得る。
遺伝子発現の誘導については、典型的には、細胞は、ある特定の光学密度が達成されるまで、例えば、約１．１のＯＤ６００まで培養することができ、その時点で、（例えば、誘導物質の添加により、リプレッサー、サプレッサーまたは培地成分などの枯渇により）誘導が開始され、標的タンパク質をコードする外因性遺伝子の発現が誘導される。いくつかの実施形態では、外因性遺伝子の発現は、例えば、イソプロピル－β－ｄ－１－チオガラクトピラノシド、ラクトース、アラビノース、マルトース、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、バブリシン、キシロース、銅、亜鉛などから選択される誘導物質によって誘導され得る。遺伝子発現の誘導はまた、発酵中の溶存酸素レベルを低下させることによって達成することができる。細胞増殖中の発酵の溶存酸素レベルは、１０％から３０％の間であり得る。遺伝子発現を誘導するために、溶存酸素レベルは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満、または０％に低下され得る。宿主細胞では、生理学的状態またはスイッチされた状態のいずれかにおいて、タンパク質の生成は、本明細書に開示されているように発酵温度を低下させることによって誘導され得る。
（実施例１）
短縮型コラーゲンの生成
Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化され、２４０内部アミノ酸が（完全長クラゲコラーゲン（配列番号３３）と比べて）短縮化されたクラゲコラーゲンをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列が合成され、発現された。ＤＮＡ配列を下記の配列番号１に示す。配列番号１では、ＤｓｂＡ分泌タグがヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号２のアミノ酸１～２４をコードする。９ヒスチジン残基を含むヒスチジンタグは、配列番号１のヌクレオチド７３～９９によってコードされており、配列番号２のアミノ酸２５～３３をコードする。リンカーは、配列番号１のヌクレオチド１００～１１１によってコードされており、配列番号２のアミノ酸３４～３７をコードする。トロンビン切断部位は、配列番号１のヌクレオチド１１２～１３５によってコードされており、配列番号２のアミノ酸３８～４５をコードする。切断されたコラーゲンは、配列番号１のヌクレオチド１３６～８２２によってコードされており、配列番号２のアミノ酸４６～２７４をコードする。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATCACCATCACCACCACCACCATCACCACTCTGGCTCGAGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTGAAAAAGGAGAACAGGGACGTACAGGTGCAGCAGGTAAACAGGGCAGCCCGGGTGCCGATGGTGCCCGTGGCCCGCTGGGTAGCATTGGTCAGCAGGGTGCAAGAGGCGAACCGGGCGATCCGGGTAGTCCGGGCCTGCGTGGTGATACGGGTCTGGCCGGTGTTAAAGGCGTTGCAGGTCCTTCAGGTCGTCCAGGTCAACCGGGTGCAAATGGTCTGCCGGGTGTTAATGGTCGTGGCGGTCTGGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTTAA（配列番号１）
短縮型コラーゲンは、完全長クラゲコラーゲン（配列番号３３）の約５４％であり、下記の配列番号２に開示されている。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDHHHHHHHHHSGSSLVPRGSHMGPQGVVGADGKDGTPGEKGEQGRTGAAGKQGSPGADGARGPLGSIGQQGARGEPGDPGSPGLRGDTGLAGVKGVAGPSGRPGQPGANGLPGVNGRGGLERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR（配列番号２）
ＤｓｂＡ分泌タグ、ヒスチジンタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有していない短縮型クラゲコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に開示されている。
GTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTGAAAAAGGAGAACAGGGACGTACAGGTGCAGCAGGTAAACAGGGCAGCCCGGGTGCCGATGGTGCCCGTGGCCCGCTGGGTAGCATTGGTCAGCAGGGTGCAAGAGGCGAACCGGGCGATCCGGGTAGTCCGGGCCTGCGTGGTGATACGGGTCTGGCCGGTGTTAAAGGCGTTGCAGGTCCTTCAGGTCGTCCAGGTCAACCGGGTGCAAATGGTCTGCCGGGTGTTAATGGTCGTGGCGGTCTGGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTTAA（配列番号３）
ＤｓｂＡ分泌タグ、ヒスチジンタグ、リンカーおよびトロンビン切断部位を有していない短縮型クラゲコラーゲンのアミノ酸配列は、配列番号４に開示されている。
GPQGVVGADGKDGTPGEKGEQGRTGAAGKQGSPGADGARGPLGSIGQQGARGEPGDPGSPGLRGDTGLAGVKGVAGPSGRPGQPGANGLPGVNGRGGLERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR（配列番号４）
配列番号１のポリヌクレオチドをコドン最適化し、Ｇｅｎ９ ＤＮＡ（現Ｇｉｎｋｇｏ Ｂｉｏｗｏｒｋｓ）内部合成によって合成した。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号１の間のオーバーラップを３０～４０ｂｐの長さになるように設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ（www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich /PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US）によるＰＣＲを使用して付加した。次いで、開環されたｐＥＴ２８ａベクターとインサートＤＮＡ（配列番号１）を、ＳＧＩ ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc）を使用して最終プラスミドに共にアセンブルした。次いで、プラスミド配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（www.eurofinsgenomics.com）によりサンガーシーケンシングによって検証した。
形質転換された細胞を最小培地で培養し、細胞のグリセロールに対する比が５０：５０でグリセロールを含む１．５ｍｌのアリコート中で凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中で、３７℃、２００ｒｐｍにて一晩復活させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６～９時間増殖させ、ＯＤ６００を５～１０に到達させた。
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースを用いて調製し、ＯＤ６００が５～１０の培養物３００ｍｌを加え、開始容量を３Ｌにした。細胞を２８℃、ｐＨ７で、攪拌、空気、および酸素を含むカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持しながら増殖させた。ｐＨは、２８％ｗ／ｗの水酸化アンモニウム溶液を使用して調節した。発酵は、４０ｇ／Ｌの初期ボーラスが約１３時間枯渇されたなら、ＤＯ－ｓｔａｔをベースとした供給アルゴリズムを使用して、フェッドバッチモードで実行した。初期増殖の２４～２６時間後、ＯＤ６００は１００を超えた。この時点で、５００ｇ／Ｌのスクロース３００ｍＬを加え、温度を２５℃に低下させた。タンパク質生成のために高密度培養は１ｍＭのＩＰＴＧを使用して誘導した。発酵をさらに２０～２４時間継続し、ベンチトップ遠心分離機を使用し、９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間、細胞を回収した。遠心分離機から回収した細胞ペレットをｐＨ８の０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍ ＫＨ２ＰО４を含むバッファー中に、２×バッファーを１×細胞に対する重量比で再懸濁した。
回収した細胞は、ホモジナイザーで圧力１４，０００ｐｓｉにて２回破砕した。得られたスラリーは、コラーゲンタンパク質を他のタンパク質と一緒に含んでいた。
発酵は、２５℃～２８℃の様々な温度の範囲で実施した。いくつかの発酵については、発酵の温度を一定温度に維持し、発酵が完了したら（ＯＤ６００が５～１０）直ちにコラーゲンを精製した。他の発酵については、発酵の温度を所望の期間維持し、細胞密度が５～１０のＯＤ６００に達した場合、温度を低下させてタンパク質の生成を誘導した。典型的には、温度は、２８℃から２５℃に低下させた。２５℃での発酵を４０～６０時間継続した後、コラーゲンを単離した。
コラーゲンは、ホモジナイズした細胞ブロスを酸処理することによって精製した。さらに、酸処理はまた、遠心分離および上記のバッファーへの再懸濁の後にバイオリアクターから回収されたハモジナイズされていない全細胞に対しても実施した。ホモジナイズされたスラリーまたは再懸濁された全細胞のいずれかのｐＨは、６Ｍの塩酸を使用してｐＨ３まで低下させた。酸性化した細胞スラリーは、混合しながら一晩４℃でインキュベートし、続いて遠心分離を行った。酸性化されたスラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験し、出発ペレットと比較して、比較的多量の豊富なコラーゲンが含まれていることを確認した。このようにして得られたコラーゲンスラリーは、塩が高かった。体積および塩を減らすため、０．１ｍ２の限外濾過カセットをそれぞれ備えたＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステムを使用して、濃縮ステップとダイアフィルトレーションステップを実施した。２つのカセットを並行して使用した濾過の総面積は、０．２ｍ２であった。５×の体積低下と１９×の塩の低下は、ＴＦＦ段階において達成された。最終のコラーゲンスラリーをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させ、コラーゲンの存在を確認した。このスラリーは、多重トレイ凍結乾燥装置を使用して３日間乾燥させ、白色のふかふかしたコラーゲン粉末を得た。
ホモジナイズした細胞ブロスまたはホモジナイズされていない細胞から得られた、精製短縮型コラーゲンをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析し、太くて透明なバンドが２７キロダルトンの予想されたサイズで観察された。精製コラーゲンはまた質量分析によって分析し、２７キロダルトンのタンパク質がクラゲコラーゲンであったことを確認した。
完全長コラーゲンおよび短縮型コラーゲンの代替の精製方法を以下に提供する。
発酵ブロスを０．３～０．５％ｗ／ｖのポリエチルイミン（ＰＥＩ）と混合した。ＰＥＩと１５分間インキュベーションした後、発酵ブロスを９０００ｒｃｆで１５分間遠心分離を行い、上清を回収したが、これはコラーゲンタンパク質を含んでいた。細胞を含むペレットを廃棄し、ＰＥＩ処理したコラーゲン含有上清をベントナイトナトリウム（最終０．２％ｗ／ｖ）（Ｗｙｏｐｕｒｅ（登録商標）、Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）と混合し、遠心分離を行った。ベントナイト含有ペレットを廃棄し、上清を回収した。
ベントナイト処理した上清は、５ｋＤａカセットを使用し、タンジェンシャルフロー濾過システム（ＴＦＦ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３～６倍に濃縮した。コラーゲンは、透過流でほとんど損失することなく保持された。塩を除去するため、濃縮ステップからの保持液を同じＴＦＦの設定を使用し、ダイアフィルトレーションを行った。タンパク質溶液の最終導電率は、＜１０ミリシーメンスであった。典型的な導電率は、４００マイクロシーメンスから１．５ミリシーメンスの間であった。高濃度のコラーゲン溶液は、４ミリシーメンスに近い高導電率を有していた。当業者には、１０ミリシーメンスよりも高い導電率はコラーゲンの濃度に応じて観察され得ることが理解されよう。次に、脱塩および濃縮したタンパク質を、Ｗ－Ｌ９０００ １０×４０粒状樹脂（Ｃａｒｂｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して活性炭で処理した。５％ｗ／ｖの炭素樹脂をコラーゲン含有タンパク質供給材料と混合し、穏やかに攪拌しながら４５～５０℃で混合した。炭素処理したスラリーは、濾過助剤、例えば珪藻土（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下または非存在下で、Ｅｒｔｅｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｒｅｓｓ Ｐａｄ Ｍ－９５３（Ｅｒｔｅｌ Ａｌｓｏｐ）を敷いたブフナー漏斗を使用して濾過した。濾過した後、コラーゲン溶液を、０．２ミクロンフィルターを通して濾過し、続いてベントナイトナトリウム（最終０．２％ｗ／ｖ）（Ｗｙｏｐｕｒｅ（登録商標）、Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）を用いて１時間～数時間処理し、９０００ｒｃｆ、１５～３０分間で遠心分離を行い、高純度で透明な、粒子を含まないコラーゲン溶液を得た。エンドトキシンタンパク質の除去が望ましい場合、タンパク質を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ－Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ－Ｓｔｅｄｉｍ）のようなクロマトグラフィーフィルターを通過させてエンドトキシンタンパク質を特異的に除去する。
精製したコラーゲンはＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析し、太く透明なバンドが３０キロダルトンで観察され。サイズのシフトアップは、コラーゲン分子の構造およびグリシン／プロリンアミノ酸の高含有量による。精製したコラーゲンはまた、質量分析によって分析し、３０キロダルトンのタンパク質が短縮型コラーゲンであることを確認した。
短縮型コラーゲンは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズのＨＰＬＣを使用するＨＰＬＣによってさらに分析した。カラムは、５０ｍｍのＡｇｉｌｅｎｔ ＰＬＲＰ－Ｓ逆相カラムであり、内径４．６ｍｍ、粒子サイズμＭ、細孔径１０００オングストロームであった。
試料は、ＨＰＬＣグレード水の０．０４％アジ化ナトリウム溶液で１：１に希釈することにより調製した。希釈後、得られた混合物を、０．４５μｍフィルターを通過させて濾過し、ＨＰＬＣカラムを詰まらせ得るすべての大きな粒子を除去した。分析のため、試料を、ｐＨ約４．５のＨＰＬＣグレード水の２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーで適切に希釈する。試料を混合した後、それを３００μＬのマイクロバイアルに移し、次いでオートサンプラーに置いた。ＨＰＬＣを操作するソフトウェアのＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用し、分析パラメーター、例えば、試料流量、カラム温度、移動相流速、移動相組成などを変更することができる。一例ではあるが非限定的な分析では、パラメーターは、１ｍＬ／分の試料流速、８０℃のカラム温度、６０～７０ｂａｒのカラム圧力、９７．９％水／１．９％アセトニトリルと０．２％トリフルオロ酢酸の移動相組成；２１４．４ｎｍの分析用ＵＶ波長、１０μＬの注入量、および１０分の試料分析時間であった。
これらの条件下で、配列番号５の短縮型クラゲの照合は、約５．４分の溶出時間を有する。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎは、溶出ピークのピーク面積を定量化し、ピーク面積をタンパク質濃度に直接的に関連づける検量線を使用して、タンパク質濃度を計算する。検量線は、０．０６ｍｇ／ｍＬ～１．００ｍｇ／ｍＬのコラーゲン濃度範囲を含むように段階希釈される公知のコラーゲン溶液を使用して作製される。
Ｈｉｓタグ－リンカー－トロンビン切断部位を有していない短縮型コラーゲン
Ｈｉｓタグ、リンカー、およびトロンビン切断部位を有していない短縮型クラゲコラーゲンを下記に開示する。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号６に提供されている。アミノ酸配列は、配列番号７に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号６のヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号７のアミノ酸１～２４をコードする。短縮型コラーゲン配列は、配列番号６のヌクレオチド７３～６３９によってコードされており、配列番号７のアミノ酸２５～２１３をコードする。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATGGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCAGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGTGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGTAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTTAA（配列番号６）
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDGPQGVVGADGKDGTPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR（配列番号７）
Ｈｉｓタグ、リンカー、およびトロンビン切断部位を有していない短縮型クラゲコラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に開示されている。
GGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCAGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGTGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGTAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTTAA（配列番号８）
Ｈｉｓタグ、リンカー、およびトロンビン切断部位を有していない短縮型クラゲコラーゲンは、配列番号５に開示されている。
GPQGVVGADGKDGTPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR（配列番号５）
ＤｓｂＡ分泌タグ－Ｈｉｓタグ－リンカー－トロンビン切断部位を有する短縮型コラーゲンとＧＦＰベータ－ラクタマーゼの融合（バージョン１）：
ＤｓｂＡ分泌タグ－Ｈｉｓタグ－リンカー－トロンビン切断部位を有するクラゲコラーゲンとＧＦＰベータラクタマーゼの融合を下記に開示する。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号９に提供されている。アミノ酸配列は、配列番号１０に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号９のヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸１～２４をコードする。Ｈｉｓタグは、配列番号９のヌクレオチド７３～９９によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸２５～３３の９ヒスチジンタグをコードする。リンカーは、配列番号９のヌクレオチド１００～１１１によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸３４～３７をコードする。トロンビン切断部位は、配列番号９のヌクレオチド１１２～１３５によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸３８～４５をコードする。リンカーを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、配列番号９のヌクレオチド１３６～８７３によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸４６～２９１をコードする。短縮型コラーゲン配列は、配列番号９のヌクレオチド８７４～１４４０によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸２９２～４８０をコードする。リンカーを有するベータ－ラクタマーゼは、配列番号９のヌクレオチド１４４１～２２３２によってコードされており、配列番号１０のアミノ酸４８１～７４４をコードする。ベータ－ラクタマーゼは、ポリペプチドが独立の分泌タグを有していなかったとしても、ペリプラズム空間を適切に標的にした。ＤｓｂＡ分泌タグは、転写物全体（ＤｓｂＡ分泌タグ－Ｈｉｓタグ－リンカー－トロンビン切断部位を有する短縮型コラーゲンとＧＦＰベータラクタマーゼの融合タンパク質）をペリプラズム空間に方向づけ、ベータ－ラクタマーゼは適切に機能した。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATCACCATCACCACCACCACCATCACCACTCTGGCTCGAGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTGGCTCGAGCAGTAAAGGTGAAGAACTGTTCACCGGTGTTGTTCCGATCCTGGTTGAACTGGATGGTGATGTTAACGGCCACAAATTCTCTGTTCGTGGTGAAGGTGAAGGTGATGCAACCAACGGTAAACTGACCCTGAAATTCATCTGCACTACCGGTAAACTGCCGGTTCCATGGCCGACTCTGGTGACTACCCTGACCTATGGTGTTCAGTGTTTTTCTCGTTACCCGGATCACATGAAGCAGCATGATTTCTTCAAATCTGCAATGCCGGAAGGTTATGTACAGGAGCGCACCATTTCTTTCAAAGACGATGGCACCTACAAAACCCGTGCAGAGGTTAAATTTGAAGGTGATACTCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTCAAAGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAACTGGAATATAACTTCAACTCCCATAACGTTTACATCACCGCAGACAAACAGAAGAACGGTATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCATAACGTTGAAGACGGTAGCGTACAGCTGGCGGACCACTACCAGCAGAACACTCCGATCGGTGATGGTCCGGTTCTGCTGCCGGATAACCACTACCTGTCCACCCAGTCTAAACTGTCCAAAGACCCGAACGAAAAGCGCGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCGTTACTGCAGCAGGTATCACGCACGGCATGGATGAACTCTACAAATCTGGCGCGCCGGGCGGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCAGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGTGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGTAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAA（配列番号９）
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDHHHHHHHHHSGSSLVPRGSHMSGSSSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSGAPGGPQGVVGADGKDGTPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLRHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW（配列番号１０）
配列番号９のポリヌクレオチドは、いくつかのＤＮＡ断片をアセンブルすることによって構築された。コラーゲン含有配列は、Ｇｅｎ９ ＤＮＡ（現Ｇｉｎｋｇｏ Ｂｉｏｗｏｒｋｓ）内部合成によってコドン最適化および合成された。ＧＦＰもまた、Ｇｅｎ９によって合成された。ベータ－ラクタマーゼは、プラスミドｐＫＤ４６（cgsc2.biology.yale.edu/Strain.php?ID=68099）から酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ（www.clontech.com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US）を用いるＰＣＲを使用することによりクローニングした。ｐＥＴ２８ベクター、ＧＦＰ、コラーゲン、およびベータ－ラクタマーゼの間のオーバーラップは、３０～４０ｂｐの長さになるように設計され、酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼを用いるＰＣＲを使用して付加した。次いで、開環されたｐＥＴ２８ａベクターおよび挿入物を、ＳＧＩ ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-l-step-kit-synthetic-genomics-inc）を使用して、最終プラスミドへ一緒にアセンブルした。次いで、プラスミド配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（www.eurofinsgenomics.com）によるサンガーシーケンシングによって検証した。
形質転換された細胞を最小培地で培養し、細胞のグリセロールに対する比が５０：５０でグリセロールを含む１．５ｍｌのアリコート中で凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中で、３７℃、２００ｒｐｍにて一晩復活させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、６～９時間増殖させ、ＯＤ６００を５～１０に到達させた。
バイオリアクターを２．７Ｌの最小培地＋グルコースを用いて調製し、ＯＤ６００が５～１０の培養物３００ｍｌを加え、開始容量を３Ｌにした。細胞を２８℃、ｐＨ７で、攪拌、空気、および酸素を含むカスケードを使用して溶存酸素を２０％飽和に維持しながら増殖させた。ｐＨは、２８％ｗ／ｗの水酸化アンモニウム溶液を使用して調節した。発酵は、４０ｇ／Ｌの初期ボーラスが約１３時間枯渇されたなら、ＤＯ－ｓｔａｔをベースとした供給アルゴリズムを使用して、フェッドバッチモードで実行した。初期増殖の２４～２６時間後、ＯＤ６００は１００を超えた。この時点で、５００ｇ／Ｌのスクロース３００ｍＬを加え、温度を２５℃に低下させた。タンパク質生成のために高密度培養は１ｍＭのＩＰＴＧを使用して誘導した。発酵をさらに２０～２４時間継続し、ベンチトップ遠心分離機を使用し９０００ｒｃｆ、１５℃で６０分間、細胞を回収した。遠心分離機から回収した細胞ペレットをｐＨ８の０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍ ＫＨ２ＰО４を含むバッファー中に、２×バッファーを１×細胞に対する重量比で再懸濁した。
回収した細胞は、ホモジナイザーで圧力１４，０００ｐｓｉで２回破砕した。得られたスラリーは、コラーゲンタンパク質を他のタンパク質と一緒に含んでいた。
コラーゲンは、遠心分離および上記のバッファーへの再懸濁の後にバイオリアクターから回収された、ホモジナイズされていない全細胞を酸処理することによって精製した。再懸濁した懸濁液のｐＨは、６Ｍの塩酸を使用して３まで下げた。酸性化した細胞スラリーは、混合しながら一晩４℃でインキュベートし、続いて遠心分離を行った。次いで、１０ＮのＮａＯＨを使用してｐＨを９まで上げ、スラリーの上清をポリアクリルアミドゲルで試験し、出発ペレットと比較して、比較的多量の豊富なコラーゲンが含まれていることを確認した。このようにして得られたコラーゲンスラリーは、塩が高かった。体積および塩を減らすため、０．１ｍ２の限外濾過カセットをそれぞれ備えたＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステムを使用して、濃縮ステップとダイアフィルトレーションステップを実施した。２つのカセットを並行して使用した濾過の総面積は、０．２ｍ２であった。５×の体積低下と１９×の塩の低下は、ＴＦＦ段階において達成された。最終のコラーゲンスラリーをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させ、コラーゲンの存在を確認した。このスラリーは、多重トレイ凍結乾燥装置を使用して３日間乾燥させ、白色のふかふかしたコラーゲン粉末を得た。
精製コラーゲン－ＧＦＰ－ベータ－ラクタマーゼ融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析し、９０キロダルトンの見かけの分子量で泳動することが観察された。融合タンパク質の予想されるサイズは、８５ｋＤａである。９０ｋＤａのバンドは、質量分析により、正確なコラーゲン融合タンパク質であることが確認された。
ＤｓｂＡ分泌タグ－Ｈｉｓタグ－リンカー－トロンビン切断部位を有する短縮型コラーゲンとＧＦＰベータ－ラクタマーゼの融合（バージョン２）：
ＤｓｂＡ分泌タグ－Ｈｉｓタグ－リンカー－トロンビン切断部位を有するクラゲコラーゲンとＧＦＰベータ－ラクタマーゼの融合を下記に開示する。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１１に提供されている。アミノ酸配列は、配列番号１２に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号１１のヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号１２のアミノ酸１～２４をコードする。Ｈｉｓタグは、配列番号１１のヌクレオチド７３～９９によってコードされており、配列番号１２のアミノ酸２５～３３の９ヒスチジンタグをコードする。リンカーは、配列番号１１のヌクレオチド１００～１１１によってコードされており、配列番号１２のアミノ酸３４～３７をコードする。トロンビン切断部位は、配列番号１１の１１２～１３５のヌクレオチドによってコードされており、配列番号１２のアミノ酸３８～４５をコードする。リンカーを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、配列番号１１のヌクレオチド１３６～８７３によってコードされており、配列番号１２のアミノ酸４６～２９１をコードする。短縮型コラーゲンの配列は、配列番号１１のヌクレオチド８７４～１４４０によってコードされており、配列番号１２のアミノ酸２９２～４８０をコードする。リンカーを有するベータ－ラクタマーゼは、配列番号１１のヌクレオチド１４４１～２２３２によってコードされており、配列番号１２のアミノ酸４８１～７４４をコードする。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATCACCATCACCACCACCACCATCACCACTCTGGCTCGAGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTGGCTCGAGCAGTAAAGGTGAAGAACTGTTCACCGGTGTTGTTCCGATCCTGGTTGAACTGGATGGTGATGTTAACGGCCACAAATTCTCTGTTCGTGGTGAAGGTGAAGGTGATGCAACCAACGGTAAACTGACCCTGAAATTCATCTGCACTACCGGTAAACTGCCGGTTCCATGGCCGACTCTGGTGACTACCCTGACCTATGGTGTTCAGTGTTTTTCTCGTTACCCGGATCACATGAAGCAGCATGATTTCTTCAAATCTGCAATGCCGGAAGGTTATGTACAGGAGCGCACCATTTCTTTCAAAGACGATGGCACCTACAAAACCCGTGCAGAGGTTAAATTTGAAGGTGATACTCTGGTGAACCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTCAAAGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAACTGGAATATAACTTCAACTCCCATAACGTTTACATCACCGCAGACAAACAGAAGAACGGTATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCATAACGTTGAAGACGGTAGCGTACAGCTGGCGGACCACTACCAGCAGAACACTCCGATCGGTGATGGTCCGGTTCTGCTGCCGGATAACCACTACCTGTCCACCCAGTCTaaaCTGTCCAAAGACCCGAACGAAAAGCGCGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCGTTACTGCAGCAGGTATCACGCACGGCATGGATGAACTCTACAAATCTGGCGCGCCGGGCGGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCAGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGTGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGTAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAA（配列番号１１）
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDHHHHHHHHHSGSSLVPRGSHMSGSSSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKSGAPGGPQGVVGADGKDGTPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLRHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW（配列番号１２）
（実施例２）
ヒトコラーゲン
短縮型ヒトコラーゲン２１型アルファ１
Ｈｉｓタグ、リンカー、およびトロンビン切断部位を有していない、短縮型ヒトコラーゲン２１型アルファ１（完全長ヒト２１型アルファ１コラーゲン（配列番号３１）と比べた短縮型）を下記に開示する。このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を下記に開示する。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号１３のヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号１４のアミノ酸１～２４をコードする。短縮型コラーゲン配列は、配列番号１３のヌクレオチド７３～６３３によってコードされており、配列番号１４のアミノ酸２５～２１１をコードする。
このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１３に提供されている。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATGCAGGTTTTCCGGGTCTGCCTGGTCCGGCAGGCGAACCGGGTCGTCATGGTAAAGATGGTCTGATGGGTAGTCCGGGTTTTAAAGGTGAAGCAGGTTCACCGGGTGCACCTGGTCAGGATGGCACCCGTGGTGAACCGGGTATTCCGGGATTTCCGGGTAATCGTGGCCTGATGGGTCAGAAAGGTGAAATTGGTCCGCCTGGTCAGCAGGGTAAAAAAGGCGCACCGGGTATGCCAGGACTGATGGGTTCAAATGGCAGTCCGGGTCAGCCAGGCACACCGGGTTCAAAAGGTAGCAAAGGCGAACCTGGTATTCAGGGTATGCCTGGTGCAAGCGGTCTGAAAGGCGAGCCAGGTGCCACCGGTTCTCCGGGTGAACCAGGTTATATGGGTCTGCCAGGTATCCAAGGCAAAAAAGGTGATAAAGGTAATCAGGGCGAAAAAGGCATTCAGGGCCAGAAAGGCGAAAATGGCCGTCAGGGTATTCCAGGCCAGCAGGGCATCCAGGGTCATCATGGTGCAAAAGGTGAACGTGGTGAAAAGGGCGAACCAGGTGTTCGTTTA（配列番号１３）
アミノ酸配列は、配列番号１４に開示されている。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDAGFPGLPGPAGEPGRHGKDGLMGSPGFKGEAGSPGAPGQDGTRGEPGIPGFPGNRGLMGQKGEIGPPGQQGKKGAPGMPGLMGSNGSPGQPGTPGSKGSKGEPGIQGMPGASGLKGEPGATGSPGEPGYMGLPGIQGKKGDKGNQGEKGIQGQKGENGRQGIPGQQGIQGHHGAKGERGEKGEPGVR（配列番号１４）
ＤｓｂＡ分泌タグを有していない短縮型ヒトコラーゲン２１型アルファ１をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１５に提供されている。
TGCAGGTTTTCCGGGTCTGCCTGGTCCGGCAGGCGAACCGGGTCGTCATGGTAAAGATGGTCTGATGGGTAGTCCGGGTTTTAAAGGTGAAGCAGGTTCACCGGGTGCACCTGGTCAGGATGGCACCCGTGGTGAACCGGGTATTCCGGGATTTCCGGGTAATCGTGGCCTGATGGGTCAGAAAGGTGAAATTGGTCCGCCTGGTCAGCAGGGTAAAAAAGGCGCACCGGGTATGCCAGGACTGATGGGTTCAAATGGCAGTCCGGGTCAGCCAGGCACACCGGGTTCAAAAGGTAGCAAAGGCGAACCTGGTATTCAGGGTATGCCTGGTGCAAGCGGTCTGAAAGGCGAGCCAGGTGCCACCGGTTCTCCGGGTGAACCAGGTTATATGGGTCTGCCAGGTATCCAAGGCAAAAAAGGTGATAAAGGTAATCAGGGCGAAAAAGGCATTCAGGGCCAGAAAGGCGAAAATGGCCGTCAGGGTATTCCAGGCCAGCAGGGCATCCAGGGTCATCATGGTGCAAAAGGTGAACGTGGTGAAAAGGGCGAACCAGGTGTTCGTtaa（配列番号１５）
ＤｓｂＡ分泌タグを有していない短縮型ヒトコラーゲン２１型アルファ１のアミノ酸配列は、配列番号１６に開示されている。
AGFPGLPGPAGEPGRHGKDGLMGSPGFKGEAGSPGAPGQDGTRGEPGIPGFPGNRGLMGQKGEIGPPGQQGKKGAPGMPGLMGSNGSPGQPGTPGSKGSKGEPGIQGMPGASGLKGEPGATGSPGEPGYMGLPGIQGKKGDKGNQGEKGIQGQKGENGRQGIPGQQGIQGHHGAKGERGEKGEPGVR（配列番号１６）
配列番号１３のポリヌクレオチドは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された。ｐＥＴ２８ベクターと配列番号１５および配列番号１６の間のオーバーラップは、２０～３０ｂｐの長さになるように設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬポリメラーゼ（www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase）によるＰＣＲを使用して付加した。次いで、開環されたｐＥＴ２８ａベクターとインサートＤＮＡ（配列番号１３）を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ（www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning）を使用して最終プラスミドに共にアセンブルした。次に、プラスミド配列を、Ｇｅｎｅｗｉｚ（www.genewiz.com/en）によりサンガーシーケンシングによって検証した。
形質転換された細胞を最小培地で培養し、細胞のグリセリンに対する比が５０：５０で植物性グリセリンを含む１．５ｍｌアリコート中で凍結した。この凍結培養物の１つのバイアルを５０ｍｌの最小培地中で、３７℃、２００ｒｐｍにて一晩復活させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、ＯＤ６００が５～１０に到達するように６～９時間増殖させた。
この実施例で、および本出願を通して使用されている最小培地は、以下のように調製する：
１）ＤＩ水中の濃度５５０ｇ／ｋｇのグルコースシロップのオートクレーブ５Ｌ。（ＶＷＲ、製品番号９７０６１－１７０）。
２）３９４６ｍＬのＤＩ水中のオートクレーブ：
２０ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４。（ＶＷＲ、製品番号９７０６１－９３２）；
６６．５ｇのＫＨ２ＰＯ４。（ＶＷＲ、製品番号９７０６２－３４８）；
２２．５ｇのＨ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７。（ＶＷＲ、製品番号ＢＤＨ９２２８－２．５ＫＧ）；
８．８５ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ。（ＶＷＲ、製品番号９７０６２－１３４）；
１０００×微量金属配合物（表３）の１０ｍＬ。
オートクレーブ後に、（２）に（１）の１１８ｇを添加；
２５ｍｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン（ＶＷＲ－Ｖ０４０８）の５ｍＬ；
２８％のＮＨ４ＯＨ（ＶＷＲ、製品番号ＢＤＨ３０２２）を使用してｐＨを６．１に調整。
Figure 0007317964000006
発酵は、２５℃～２８℃の範囲の様々な温度で実施した。いくつかの発酵については、発酵の温度を一定の温度に維持し、発酵が完了したら直ちにコラーゲンを精製した。他の発酵については、発酵の温度を所望の期間維持し、ＯＤ６００の細胞密度が１０～２０に達した場合、温度を下げてタンパク質の生成を誘導した。典型的には、温度は、２８℃から２５℃に下げた。２５℃での発酵後、４０～６０時間継続した。
コラーゲンは以下のように精製した：発酵ブロスのｐＨを、５～５０％硫酸を使用して３～３．５の間に下げた。次いで、遠心分離を使用して細胞を分離した。酸性化されたブロスの上清をポリアクリルアミドゲルで試験し、出発ペレットと比較して、比較的多量の豊富なコラーゲンが含まれていることを確認した。このようにして得られたコラーゲンスラリーは、塩が高かった。体積および塩を減らすため、０．１ｍ２の限外濾過カセットをそれぞれ備えたＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステムを使用して、濃縮ステップとダイアフィルトレーションステップを実施した。２つのカセットを並行して使用した濾過の総面積は、０．２ｍ２であった。５×の体積低下と１９×の塩の低下は、ＴＦＦ段階において達成された。最終のコラーゲンスラリーをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させ、コラーゲンの存在を確認した。
精製コラーゲンをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析し、太くて透明なバンドが２５キロダルトンの予想されたサイズで観察された。コラーゲンの力価および純度の定量化は、逆相およびサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用して実施した。力価は、通常、１リットル当たり３～８グラムである。精製コラーゲンはまた質量分析によってさらに分析し、公表されたヒト２１型コラーゲンの配列と一致することが確認された。
短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（１）
Ｈｉｓタグ、リンカー、およびトロンビン切断部位を有していない短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（完全長ヒトコラーゲン１型アルファ２（配列番号３２）と比べた短縮型）を下記に開示している。コドン最適化ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を下記に開示している。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号１７のヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号１８のアミノ酸１～２４をコードする。短縮型コラーゲン配列は、配列番号１７のヌクレオチド７３～６３６によってコードされており、配列番号１８のアミノ酸２５～２１２をコードする。
このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１７に提供されている。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATATGGGTCCGCCTGGTAGCCGTGGTGCAAGTGGTCCGGCAGGCGTTCGTGGTCCGAATGGTGATGCAGGTCGTCCGGGTGAACCGGGTCTGATGGGTCCTCGTGGTCTGCCTGGTTCACCGGGTAATATTGGTCCTGCAGGTAAAGAAGGTCCGGTTGGTCTGCCAGGTATTGATGGCCGTCCGGGTCCGATTGGTCCAGCCGGTGCACGTGGTGAACCTGGCAATATTGGTTTTCCGGGTCCTAAAGGTCCGACCGGTGATCCGGGTAAAAATGGTGATAAAGGTCATGCAGGTCTGGCAGGCGCACGCGGTGCACCTGGTCCGGATGGTAATAATGGTGCACAGGGTCCACCGGGTCCGCAGGGTGTTCAAGGTGGTAAAGGCGAACAGGGTCCTGCCGGTCCTCCGGGTTTTCAGGGACTGCCTGGTCCGAGCGGTCCTGCGGGTGAAGTTGGTAAACCTGGTGAACGCGGTCTGCATGGTGAATTTGGCCTGCCTGGGCCTGCAGGTCCGCGTGGCGAACGTGGTCCGCCAGGTGAAAGCGGTGCAGCAGGTCCGACAGGTTAA（配列番号１７）
アミノ酸配列は、配列番号１８に開示されている。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDMGPPGSRGASGPAGVRGPNGDAGRPGEPGLMGPRGLPGSPGNIGPAGKEGPVGLPGIDGRPGPIGPAGARGEPGNIGFPGPKGPTGDPGKNGDKGHAGLAGARGAPGPDGNNGAQGPPGPQGVQGGKGEQGPAGPPGFQGLPGPSGPAGEVGKPGERGLHGEFGLPGPAGPRGERGPPGESGAAGPTG（配列番号１８）
ＤｓｂＡ分泌タグを有していない短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（１）の核酸配列は、配列番号１９に開示されている。
ATGGGTCCGCCTGGTAGCCGTGGTGCAAGTGGTCCGGCAGGCGTTCGTGGTCCGAATGGTGATGCAGGTCGTCCGGGTGAACCGGGTCTGATGGGTCCTCGTGGTCTGCCTGGTTCACCGGGTAATATTGGTCCTGCAGGTAAAGAAGGTCCGGTTGGTCTGCCAGGTATTGATGGCCGTCCGGGTCCGATTGGTCCAGCCGGTGCACGTGGTGAACCTGGCAATATTGGTTTTCCGGGTCCTAAAGGTCCGACCGGTGATCCGGGTAAAAATGGTGATAAAGGTCATGCAGGTCTGGCAGGCGCACGCGGTGCACCTGGTCCGGATGGTAATAATGGTGCACAGGGTCCACCGGGTCCGCAGGGTGTTCAAGGTGGTAAAGGCGAACAGGGTCCTGCCGGTCCTCCGGGTTTTCAGGGACTGCCTGGTCCGAGCGGTCCTGCGGGTGAAGTTGGTAAACCTGGTGAACGCGGTCTGCATGGTGAATTTGGCCTGCCTGGGCCTGCAGGTCCGCGTGGCGAACGTGGTCCGCCAGGTGAAAGCGGTGCAGCAGGTCCGACAGGTTAA（配列番号１９）
ＤｓｂＡ分泌タグを有していない短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（１）のアミノ酸配列は、配列番号２０に開示されている。
MGPPGSRGASGPAGVRGPNGDAGRPGEPGLMGPRGLPGSPGNIGPAGKEGPVGLPGIDGRPGPIGPAGARGEPGNIGFPGPKGPTGDPGKNGDKGHAGLAGARGAPGPDGNNGAQGPPGPQGVQGGKGEQGPAGPPGFQGLPGPSGPAGEVGKPGERGLHGEFGLPGPAGPRGERGPPGESGAAGPTG（配列番号２０）
短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（２）
Ｈｉｓタグ、リンカー、およびトロンビン切断部位を有していない短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（完全長ヒトコラーゲン１型アルファ２（配列番号３２）と比べた短縮型）は下記に開示されている。コドン最適化ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は下記に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号２１のヌクレオチド１～７２によってコードされており、配列番号２２のアミノ酸１～２４をコードする。短縮型コラーゲン配列は、配列番号２１のヌクレオチド７３～６０９によってコードされており、配列番号２２のアミノ酸２５～２０３をコードする。
このコラーゲンをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号２１に提供されている。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATGGTTTTCAGGGTCCTGCCGGTGAACCGGGTGAACCTGGTCAGACAGGTCCGGCAGGCGCACGTGGTCCTGCAGGTCCTCCTGGTAAAGCCGGTGAAGATGGTCATCCGGGTAAACCGGGTCGTCCTGGTGAACGTGGTGTTGTTGGTCCGCAGGGTGCCCGTGGTTTTCCGGGTACTCCGGGTCTGCCAGGTTTTAAAGGTATTCGTGGTCATAATGGTCTGGATGGTCTGAAAGGTCAGCCTGGTGCACCGGGTGTTAAAGGTGAACCAGGTGCTCCGGGTGAAAATGGCACACCGGGTCAGACCGGTGCGCGTGGTCTGCCTGGCGAACGCGGTCGTGTTGGTGCACCTGGTCCAGCCGGTGCACGCGGTAGTGATGGTAGCGTTGGTCCGGTTGGTCCAGCGGGTCCGATTGGTAGCGCAGGTCCACCGGGTTTTCCAGGCGCACCGGGTCCGAAAGGTGAAATTGGTGCAGTTGGTAATGCAGGCCCTGCCGGTCCAGCAGGACCGCGTGGTGAAGTTGGCCTGCCTGGTCTGTAA（配列番号２１）
アミノ酸配列は、配列番号２２に開示されている。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDGFQGPAGEPGEPGQTGPAGARGPAGPPGKAGEDGHPGKPGRPGERGVVGPQGARGFPGTPGLPGFKGIRGHNGLDGLKGQPGAPGVKGEPGAPGENGTPGQTGARGLPGERGRVGAPGPAGARGSDGSVGPVGPAGPIGSAGPPGFPGAPGPKGEIGAVGNAGPAGPAGPRGEVGLPGL（配列番号２２）
ＤｓｂＡ分泌タグを有していない短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（２）の核酸配列は、配列番号２３に開示されている。
GGTTTTCAGGGTCCTGCCGGTGAACCGGGTGAACCTGGTCAGACAGGTCCGGCAGGCGCACGTGGTCCTGCAGGTCCTCCTGGTAAAGCCGGTGAAGATGGTCATCCGGGTAAACCGGGTCGTCCTGGTGAACGTGGTGTTGTTGGTCCGCAGGGTGCCCGTGGTTTTCCGGGTACTCCGGGTCTGCCAGGTTTTAAAGGTATTCGTGGTCATAATGGTCTGGATGGTCTGAAAGGTCAGCCTGGTGCACCGGGTGTTAAAGGTGAACCAGGTGCTCCGGGTGAAAATGGCACACCGGGTCAGACCGGTGCGCGTGGTCTGCCTGGCGAACGCGGTCGTGTTGGTGCACCTGGTCCAGCCGGTGCACGCGGTAGTGATGGTAGCGTTGGTCCGGTTGGTCCAGCGGGTCCGATTGGTAGCGCAGGTCCACCGGGTTTTCCAGGCGCACCGGGTCCGAAAGGTGAAATTGGTGCAGTTGGTAATGCAGGCCCTGCCGGTCCAGCAGGACCGCGTGGTGAAGTTGGCCTGCCTGGTCTGTAA（配列番号２３）
ＤｓｂＡ分泌タグを有していない短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２（２）のアミノ酸配列は、配列番号２４に開示されている。
GFQGPAGEPGEPGQTGPAGARGPAGPPGKAGEDGHPGKPGRPGERGVVGPQGARGFPGTPGLPGFKGIRGHNGLDGLKGQPGAPGVKGEPGAPGENGTPGQTGARGLPGERGRVGAPGPAGARGSDGSVGPVGPAGPIGSAGPPGFPGAPGPKGEIGAVGNAGPAGPAGPRGEVGLPGL（配列番号２４）
配列番号１３、１７、または２１のポリヌクレオチドを、本明細書に記載されているようにベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、形質転換ベクターを調製した。宿主細胞をベクターで形質転換し、ポリヌクレオチドを実施例１に記載されているように発現させた。
発酵が完了した後、短縮型ヒトコラーゲンを、実施例２に開示されている手順を使用し、発酵ブロスから精製した。精製した短縮型ヒトコラーゲンを、実施例２に開示されているようにＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣを使用して分析した。
３つの短縮型ヒトコラーゲンすべてを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析において予想される分子量で実行した。ＨＰＬＣを使用する短縮型ヒトコラーゲンの分析において、実施例１のクラゲコラーゲンを使用した標準曲線を利用した。ヒトコラーゲンの保持時間は、クラゲコラーゲンとはわずかに異なっていた。配列番号１６の保持時間は５．６４５分であり、配列番号２０の保持時間は５．６３１分であり、配列番号２４は２つのピークで実行され、保持時間は５．５３１分および５．７分であった。
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化５
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化５のアミノ酸配列は、配列番号２５に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号２６のヌクレオチド１～５７によってコードされており、アミノ酸配列は、配列番号２５のアミノ酸１～１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド５８～６５７であり、アミノ酸配列は、配列番号２５のアミノ酸２０～２１９である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は、配列番号２６のヌクレオチド６５８～６８４であり、アミノ酸配列は、配列番号２５のアミノ酸２２０～２２８である。
MKKIWLALAGLVLAFSASAGDQGPVGRTGEVGAVGPPGFAGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGLLGAPGILGLPGSRGERGLPGVAGAVGEPGPLGIAGPPGARGPPGAVGSPGVNGAPGEAGRDGNPGNDGPPGRDGQPGHKGERGYPGNIGPVGAAGAPGPHGPVGPAGKHGNRGETGPSGPVGPAGAVGPRGPSGPQGIRGDKGEPGEKGPRGLPGLGDYKDDDDK（配列番号２５）
ＤｓｂＡ分泌およびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化５の核酸配列は、配列番号２６に開示されている。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGGTGATCAGGGTCCGGTTGGTCGTACCGGTGAAGTTGGTGCAGTCGGGCCGCCGGGTTTTGCGGGTGAAAAAGGCCCGTCAGGTGAAGCAGGCACCGCTGGCCCTCCTGGCACGCCTGGCCCACAGGGTTTACTGGGCGCACCTGGAATTCTGGGACTGCCGGGCAGCCGTGGAGAACGCGGTTTACCAGGTGTTGCCGGTGCCGTTGGTGAACCTGGTCCACTGGGCATTGCAGGGCCGCCTGGCGCACGGGGACCGCCTGGTGCTGTTGGTAGTCCGGGTGTGAATGGTGCTCCGGGTGAAGCCGGTCGTGACGGTAATCCGGGAAATGACGGCCCGCCAGGCCGCGATGGTCAGCCGGGTCATAAAGGTGAGCGTGGTTACCCAGGTAATATTGGTCCAGTCGGTGCCGCCGGTGCGCCGGGTCCTCATGGCCCTGTCGGTCCAGCCGGTAAACATGGTAATCGCGGTGAGACAGGTCCGTCAGGACCAGTGGGCCCTGCTGGCGCAGTCGGTCCGCGCGGGCCGAGTGGCCCTCAGGGTATTCGTGGCGATAAAGGGGAACCGGGCGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTGCCAGGCCTGGGTGACTACAAAGACGACGACGACAAATAA（配列番号２６）
配列番号２６のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主のＥ．ｃｏｌｉ細胞において発現させ、短縮型コラーゲンを本明細書に記載されているように精製した。精製したコラーゲンはＳＤＳ－ＰＡＧＥでクリアなバンドを生じ、抗ＦＬＡＧウエスタンは約１００キロダルトンで観察された。ゲル上のその位置に出現する既存のバンドは、このタンパク質の発現が存在しない場合にはなかった。
ＤｓｂＡ分泌タグおよびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化６
ＤｓｂＡ分泌タグおよびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化６のアミノ酸配列は、配列番号２７に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号２８のヌクレオチド１～５７によってコードされており、アミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸１～１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド５８～６５７であり、アミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸２０～２１９である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は、配列番号２８のヌクレオチド６５８～６８４であり、アミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸２２０～２２８である。
MKKIWLALAGLVLAFSASAKGHNGLQGLPGIAGHHGDQGAPGSVGPAGPRGPAGPSGPAGKDGRTGHPGTVGPAGIRGPQGHQGPAGPPGPPGPPGPPGVSGGGYDFGYDGDFYRADQPRSAPSLRPKDYEVDATLKSLNNQIETLLTPEGSRKNPARTCRDLRLSHPEWSSGYYWIDPNQGCTMDAIKVYCDFSTGETCIRAQPENIPAKNWYRSSKDGDYKDDDDK（配列番号２７）
ＤｓｂＡ分泌タグおよびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化６の核酸配列は、配列番号２８に開示されている。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGAAAGGTCACAATGGACTGCAAGGCCTGCCAGGTATTGCAGGTCATCATGGTGATCAAGGTGCCCCGGGAAGCGTTGGTCCGGCGGGGCCGAGAGGCCCTGCGGGACCTTCAGGTCCGGCAGGCAAAGATGGTCGGACAGGCCATCCGGGCACCGTTGGCCCTGCAGGAATTCGTGGACCGCAGGGTCATCAGGGACCTGCTGGTCCGCCAGGTCCCCCGGGCCCTCCGGGACCACCGGGTGTTAGTGGTGGTGGTTATGATTTTGGCTATGATGGTGATTTTTATCGTGCAGATCAGCCGCGTAGCGCACCGAGCCTGCGTCCTAAAGATTATGAAGTTGATGCAACCCTGAAAAGCCTGAATAATCAGATTGAAACACTGCTGACACCGGAAGGTAGCCGTAAAAATCCGGCCCGTACCTGTCGTGATCTGCGTCTGAGCCACCCGGAATGGAGCAGCGGTTATTATTGGATTGATCCGAATCAAGGTTGTACCATGGATGCAATTAAAGTTTATTGTGATTTTAGCACAGGTGAAACATGTATCCGTGCACAGCCGGAAAATATTCCGGCCAAAAATTGGTATCGTAGTAGCAAAGATGGTGACTACAAAGACGACGACGACAAATAA（配列番号２８）
配列番号２８のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主のＥ．ｃｏｌｉ細胞において発現させ、短縮型コラーゲンを本明細書に記載されているように精製した。精製したコラーゲンはＳＤＳ－ＰＡＧＥでクリアなバンドを生じ、抗ＦＬＡＧウエスタンは約２５キロダルトンで観察された。ゲル上のその位置に出現する既存のバンドは、このタンパク質の発現が存在しない場合にはなかった。
ＤｓｂＡ分泌タグおよびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化７
ＤｓｂＡ分泌タグおよびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化７のアミノ酸配列は、配列番号２９に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号３０のヌクレオチド１～５７によってコードされており、アミノ酸配列は、配列番号２９のアミノ酸１～１９である。コラーゲンヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド５８～７５９であり、アミノ酸配列は、配列番号２９のアミノ酸２０～２５３である。ＦＬＡＧヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド７６０～７８６であり、アミノ酸配列は、配列番号２９のアミノ酸２５４～２６２である。
MKKIWLALAGLVLAFSASAYEVDATLKSLNNQIETLLTPEGSRKNPARTCRDLRLSHPEWSSGYYWIDPNQGCTMDAIKVYCDFSTGETCIRAQPENIPAKNWYRSSKDKKHVWLGETINAGSQFEYNVEGVTSKEMATQLAFMRLLANYASQNITYHCKNSIAYMDEETGNLKKAVILQGSNDVELVAEGNSRFTYTVLVDGCSKKTNEWGKTIIEYKTNKPSRLPFLDIAPLDIGGADQEFFVDIGPVCFKGDYKDDDDK（配列番号２９）
ＤｓｂＡ分泌タグおよびＦＬＡＧタグを有する短縮型ヒトコラーゲン１型アルファ２短縮化７の核酸配列は、配列番号３０に開示されている。
TGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGTATGAAGTTGATGCAACCCTGAAAAGCCTGAATAATCAGATTGAAACACTGCTGACACCGGAAGGTAGCCGTAAAAATCCGGCCCGTACCTGTCGTGATCTGCGTCTGAGCCACCCGGAATGGAGCAGCGGTTATTATTGGATTGATCCGAATCAAGGTTGTACCATGGATGCAATTAAAGTTTATTGTGATTTTAGCACAGGTGAAACATGTATCCGTGCACAGCCGGAAAATATTCCGGCCAAAAATTGGTATCGTAGTAGCAAAGATAAAAAACATGTGTGGCTGGGTGAAACCATTAATGCAGGTAGCCAGTTTGAATACAATGTTGAAGGTGTTACCAGCAAAGAAATGGCAACACAGCTGGCATTTATGCGTCTGCTGGCAAATTATGCAAGCCAGAATATTACATATCATTGTAAAAATAGCATTGCATATATGGATGAAGAAACCGGTAATCTGAAAAAAGCAGTTATTCTGCAGGGTAGCAATGATGTTGAACTGGTTGCCGAAGGTAATAGCCGTTTTACATATACCGTTCTGGTTGATGGTTGTAGCAAAAAAACCAATGAATGGGGTAAAACCATCATTGAATATAAAACCAACAAACCGAGCCGTCTGCCGTTTCTGGATATCGCTCCGCTGGATATTGGTGGTGCCGATCAGGAATTTTTTGTCGATATCGGTCCTGTGTGTTTTAAAGGTGACTACAAAGACGACGACGACAAATAA（配列番号３０）
配列番号３０のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主のＥ．ｃｏｌｉ細胞において発現させ、短縮型コラーゲンを本明細書に記載されているように精製した。精製したコラーゲンはＳＤＳ－ＰＡＧＥでクリアなバンドを生じ、抗ＦＬＡＧウエスタンは約３０キロダルトンで観察された。ゲル上のその位置に出現する既存のバンドは、このタンパク質の発現が存在しない場合にはなかった。
（実施例３）
短縮型ヒト２１型コラーゲンのヒト臨床試験
短縮型ヒト２１型コラーゲン（配列番号１６）を含む局所スキンケア製品の効果を判定するためにヒト対象を使用する臨床試験を実施する。本研究は、米国および国際的な臨床試験の実施に関する基準（ＦＤＡおよびＩＣＨガイドライン）ならびに塗布される政府規制に従って実施される。
水、オリーブ油グリセレス－８エステルズ、グリセリン、ココナッツアルカン、ヒドロキシエチルアクリレート／ナトリウムアクリロイルジメチルタウレートコポリマー、ペンチレングリコール、ＥＤＴＡ二ナトリウム、カプリリルグリコール、クロルフェネシン、フェノキシエタノールから作られる基本製剤（対照製剤）を調製する。短縮型ヒト２１型コラーゲンを含む製剤は、０．１％ｗ／ｗコラーゲンを含む局所製剤の調製に十分なコラーゲンを添加することによって調製される。
検証および有効性に関する専門評点評価
視覚的評価尺度（Visual Analog Scales）（ＶＡＳ）は、臨床研究において、直接測定できない様々な症状、主観的な特性、または態度の強度または頻度を測定するために一般的に用いられている。ＶＡＳは信頼性の高い尺度であり、単純な順序尺度よりも小さな変化に敏感である。（A. Paul-Dauphin, F. Guillemin, J. Virion and S. Briancon, "Bias and precision in visual analog scales: A randomized controlled trial," American Journal of Epidemiology, vol. 150, no. 10, pp. 1117-27, 1999）。ＶＡＳ項目に回答する場合、専門評点者は、２つの評価項目回答またはアンカー回答の間の線（１０ｃｍ）に沿った位置を示すことによって、提示に対する同意のレベルを指定する。シンプルなＶＡＳが、１０ｃｍの水平線の両端が、左（最良）から右（最悪）に向かう極限として定義される有効性パラメーターを評価するために使用される。光老化の兆候は以下のように分類することができる：軽度＝１～３．９ｃｍ、中程度＝４～６．９ｃｍ、重度＝７～１０ｃｍ。
以下のＶＡＳを使用した：
Figure 0007317964000007
Figure 0007317964000008
順序尺度により、所定の属性の品質に直接的にかつ客観的に数値を付けることが可能になる。順序尺度の項目に回答する場合、専門評点者は、設定された評点またはレベルを選択することによって、提示への同意のレベルを明示する。
各対象の顔の皮膚の赤み（紅斑）の外観は、専門評点者によって、ベースラインでの検証のために以下の５点順序尺度を使用して評価する（表４）。検証される場合、各対象は、２週目、４週目、６週目、および８週目にさらに紅斑の評価を受ける。
Figure 0007317964000009
コルネオメーターＣＭ８２０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、間隔の狭い一対の電極で皮膚に交流電流を流し、静電容量を測定することによって皮膚表面の相対的な水分保持の程度を測定する。皮膚の水分含有量に変化があると、電気容量性回路のコンダクタンスが変化する。
コルネオメーターは、水分保持レベルのわずかな変化をほんの約１秒の測定時間で再現性よく検出することができる。測定の深さは浅く（角質層の約１０～２０μｍ）、より深い皮膚層の影響を評価が受けないことを確実にする。
すべての対象は、ベースライン時、最初の塗布の直後、ならびに２週目、４週目、および８週目に顔のコルネオメーターによる測定を受ける。測定は３回に分けて行われ、各時点での平均値を得る。測定位置はフェイスマップに記録され、各時点での評価の一貫性が保たれる。
キュートメーターＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、皮膚表面に吸引を加え、プローブの開口部に皮膚を引き込み、光学測定システムを使用して浸透深さを判定することによって、皮膚の粘弾性特性を測定する。
負圧によって吸い上げられる皮膚の抵抗（堅さ）と、元の位置に戻るその能力（弾力性）が計算され、曲線として示される。キュートメーターの出力には、Ｒ０（Ｕｆ、堅さ）、Ｒ２（Ｕａ／Ｕｆ、総弾力性）、Ｒ５（Ｕｒ／Ｕｅ、正味の弾力性）、Ｒ７（Ｕｒ／Ｕｆ、弾力性部分）およびＲ９（Ｒ３［最後の最大アンプ］－Ｒ０［Ｕｆ］、疲労）など、測定曲線の様々な部分の多くのパラメーターが含まれている。
すべての対象は、ベースライン時、最初の塗布の直後、ならびに２週目、４週目、および８週目に、左頬または右頬で（用意した無作為化コードに従って）キュートメーター測定を受ける。皮膚の弾力性は、Ｒ５（Ｕｒ／Ｕｅ）およびＲ２（Ｕａ／Ｕｆ）パラメーターを使用して報告される。肌がより弾力性を増してくると、この値は大きくなる。肌の堅さは、Ｒ０（Ｕｆ）パラメーターを使用して報告される。肌が堅くなるにつれて、この値は小さくなる。評価の位置は、各対象のフェイスマップに記録され、訪問時の測定の一貫性が保たれる。
ＣＯＳＭＥＴＲＩＣＳ（商標） ＳＩＡＳｃｏｐｅ（Ａｓｔｒｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａ、Ｔｏｆｔ、ＵＫ）は、分光光度皮内分析（Spectrophotometric Intracutaneous Analysis）（ＳＩＡ）、または発色団マッピングを使用した非侵襲的な光学式皮膚画像診断機器である。この技術は、皮膚鏡検査法と接触型レミタンス分光光度法の独自の組合せに基づいている。ハードウェアは、ラップトップコンピューターに取り付けられたハンドヘルドの撮像プローブで構成されている。ユニットを皮膚表面に接触させて配置し、高輝度ＬＥＤが４００～１０００ｎｍの可視スペクトルと近赤外スペクトルの狭い範囲にまたがる控えめな波長として皮膚を照射する。デジタル画像が波長ごとに取り込まれる。以下のパラメーター：表皮メラニン、真皮ヘモグロビン、真皮コラーゲンのそれぞれごとに、深さ２ｍｍ、円周１１ｍｍまでの３つのパラメトリック発色団マップが取得される。
この試験の目的において、皮膚コラーゲンは、ベースライン時、ならびに２週目、４週目、および８週目に、左頬または右頬で、用意した無作為化コードに従って測定が行われる。評価の位置は、各対象のフェイスマップに記録され、訪問時の測定の一貫性が保たれる。
ＤｅｒｍａＳｃａｎ Ｃ ＵＳＢ（Ｃｏｒｔｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡｐＳ、Ｈａｄｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）は、コンパクトな高解像度の超音波スキャナーである。２０ＭＨｚ、高解像度６０×１５０μｍ、１３ｍｍのペネトレーションプローブを使用し、リニアスキャン、高精度操作、および画像の鮮明さと鮮明度のための真の位置検出を提供する。
この機器は、ｃｙｂｅｒＤＥＲＭ，Ｉｎｃ．（Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ、ＵＳＡ）によって提供されている。すべての対象は、ベースライン時、ならびに２週目、４週目、および８週目に、顔の超音波評価を受ける。評価の位置は各訪問時で同じであり、フェイスマップに記録される。超音波スキャンの取得後、真皮の厚さ（密度）を分析するためにｃｙｂｅｒＤＥＲＭ，Ｉｎｃ．に送られる。
すべての臨床写真は、試験期間を通じて、高品質な画像の再現性を確保するために、ＩＲＳＩのＳＯＰに従って実施される。撮影は、マットな黒い壁で、すべての自然光を遮断した指定の撮影室で行われる。対象の臨床写真撮影に向けた準備のために、対象はイヤリング、ネックレス、およびあらゆる顔のアクセサリーを含むすべてのジュエリーを外すように求められる。訓練を受けた技術者が、明るい拡大ループの下で対象を検査し、顔、目、または唇に残留しているカラー化粧品またはスキンケア製品が見られないことを確認する。対象には黒いケープと黒いヘッドバンドが提供され、すべての髪が後ろできちんとまとめられ、カバーされていることが確実なように配置を指示される。
Ｃｌａｒｉｔｙ（商標） ２Ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｉ（Ｃｌａｒｉｔｙ）（ＢｒｉｇｈＴｅｘ Ｂｉｏ－Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ （ＢＴＢＰ）、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ、ＵＳＡ）は、高品質な顔全体の正面、左側面および右側面の画像を取り込む。システム内の３台のカメラは、１８メガピクセルのＳＬＲ画像を１６ビットで同時に取り込み、ライブフィードディスプレイを使用して、再現性のためにベースライン画像に対する自動顔合わせチェックすることができる。
マルチスペクトル照明（拡散白色光、交差偏光、青色光、平行偏光）は、皮膚の表層の上方と下方の皮膚状態を明白にする。このシステムを使用して、皮膚の特徴を認識し、自動で皮膚のセグメンテーションとゾーンマッピングに塗布し、その後の皮膚の分析を可能にする。画像は、色素沈着、表面下の色素沈着、輝き、肌の色、赤み、皺、肌テクスチャー、毛穴、にきび、および／または唇に関連する属性について分析する。
すべての対象は、ベースライン時、ならびに２週目、４週目、および８週目に、標準光および平行偏光で取り込まれた正面、左、および右の顔画像を有する。
主観的な質問票により、スポンサーは、対象の皮膚、テスト製品、およびその効果に対する意見を評価することができる。質問は、５点尺度の提示に対する対象の同意ならびに自由形式回答を求める。
１４名の女性の対象が登録されている。組み入れ基準は、フィッツパトリック・スキンタイプＩＩＩの白人女性対象であり、全身健康状態が良好で、組み入れ登録時に３５から６５歳の年齢である。また組み入れ基準には、以下のベースラインで専門評点者によって判定される顔の老化の兆候も含まれる：ａ）線／皺について１０ｃｍスケールで≧２ｃｍ≦６のスコア；ｂ）顔の赤み（紅斑）について５点順序尺度で≧１≦３のスコア。表５は、試験参加者の人口統計を記載している。
Figure 0007317964000010
２週間の処置後の線／皺、堅さ（視覚）、弾力性（触覚）、明るさ、テクスチャー／柔らかさ（触覚）、テクスチャー／滑らかさ（視覚）および紅斑に対する専門の臨床的評点者による評価結果を表６に示す。試験したすべての特性が改善された。明るさ、テクスチャー／柔らかさ（触覚）、テクスチャー／滑らかさ（視覚）、紅斑についてのスコアは、統計的に有意に改善された。
Figure 0007317964000011
コルネオメーターおよびキュートメーターを使用した機器による評価の水分保持、堅さ、弾力性を表７に示す。皮膚の水分保持、堅さ、弾力性の改善は統計的に有意であった。さらに、表７は、分光光度皮内分析（ＳＩＡ）によって示される皮膚細胞によるコラーゲン産生の刺激を示す。
Figure 0007317964000012
結果は、短縮型ヒト２１型コラーゲンが、皮膚の弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャー、または視覚テクスチャーにおいて、統計的に有意な改善を示すことを実証している。さらに、結果は、短縮型ヒト２１型コラーゲンが目に見える線または皺を統計的に有意に減少させ、また紅斑を有意に減少させることを示している。
（実施例４）
皮膚細胞に対する短縮型ヒト２１型コラーゲンのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
短縮型ヒト２１型アルファ１コラーゲンは、コラーゲンＩ型の線維芽細胞産生を刺激する
一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施して、短縮型ヒト２１型コラーゲンのヒト皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトに対する効果を評価した。第１の実験では、ヒト初代線維芽細胞のコラーゲンＩ型タンパク質の分泌について評価した。線維芽細胞を、０．０３％の配列番号１６に記載のポリペプチドと４８時間培養した。培養上清を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、分泌された総コラーゲンＩ型タンパク質の指標である、プロコラーゲンＩ型Ｃ－ペプチドを分析した。図１に示したように、配列番号１６のポリペプチドで処置した細胞は、未処置の細胞（図１；「Ａ」）またはレチノールで処置した細胞（図１；「Ｃ」）よりも高いレベルのコラーゲンＩ型（図１；「Ｂ」）を分泌した。
短縮型ヒト２１型アルファ１コラーゲンは、細胞外マトリックスタンパク質の遺伝子の線維芽細胞産生を刺激する
グローバルな遺伝子発現を分析するために、ＲＮＡシーケンシングを実施した。４８時間曝露した後、線維芽細胞を０．０３％の配列番号１６に記載のポリペプチドとインキュベートした。これらの線維芽細胞は、培地単独でインキュベートした細胞よりも高いレベルのいくつかの細胞外マトリックス遺伝子を発現した。図２Ａに示したように、配列番号１６のポリペプチドで処置した線維芽細胞（図２Ａ；「Ｃ」）は、未処置の細胞（図２Ａ；「Ａ」）またはレチノールで処置した線維芽細胞（図２Ａ；「Ｂ」）と比べて、コラーゲンＩ型遺伝子（ＣＯＬ１Ａ）を上方制御した。この応答は、ビタミンＣで処置した線維芽細胞と同様であった（図２Ａ；「Ｄ」）。図２Ｂに示したように、配列番号１６のポリペプチドで処置した線維芽細胞（図２Ｂ；「Ｂ」）は、未処置の細胞（図２Ｂ；「Ａ」）および様々な海洋コラーゲン（図２Ｂ；「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」、および「Ｆ」）と比べて、エラスチン遺伝子（ＥＬＮ）を上方制御した。図２Ｃに示したように、配列番号１６のポリペプチドで処置した線維芽細胞（図２Ｃ；「Ｂ」）は、未処置の細胞（図２Ｃ；「Ａ」）、レチノール（図２Ｃ；「Ｃ」）、およびビタミンＣ（図２Ｃ；「Ｄ」）と比べて、フィブロネクチン遺伝子（ＦＮ１）を上方制御した。
短縮型ヒト２１型アルファ１コラーゲンは、ＵＶＢ光を照射したケラチノサイトの炎症を軽減する
ヒト初代ケラチノサイトに、４０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ光を照射した後、０．１％の配列番号１６のポリペプチドで２４時間処置した。炎症誘発性サイトカインＩＬ－１ａのレベルは、ＥＬＩＳＡにより判定した。図３に示したように、配列番号１６のポリペプチドで処置したＵＶＢ照射ケラチノサイト（図３；「Ｂ」）は、未処置のＵＶＢ照射ケラチノサイト（図３；「Ａ」）と比べて低レベルのＩＬ－１αを発現した。
短縮型ヒト２１型アルファ１コラーゲンは、抗酸化能力を有する。
配列番号１６のポリペプチドの抗酸化能は、酸素フリーラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイを使用して評価した。ОＲＡＣアッセイは、蛍光読み出し情報を使用して製品の抗酸化能を測定する無細胞アッセイである。データは、トロロックス（ビタミンＥ）相当量で報告されている。図４で示したように、配列番号１６のポリペプチドの０．１％溶液は、１９０μＭのトロロックスと同等の抗酸化特性を有していた。
短縮型ヒト２１型アルファ１コラーゲンは、ＵＶＢ光を照射したケラチノサイトの細胞生存率を増加させる。
配列番号１６のポリペプチドによる処置のＵＶＢ照射ケラチノサイトに対する効果をさらに評価するために、実験を照射前および照射後の処置により実施した。ヒト初代ケラチノサイトを０．１％の配列番号１６のポリペプチドで２４時間前処置し、４０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ光を照射し、次いで、０．１％の配列番号１６のポリペプチドでさらに２４時間、再度処置した。細胞生存率は、ＭＴＴ代謝比色測定法を使用して評価した。図５に示したように、配列番号１６のポリペプチドで処置したＵＶＢ照射ケラチノサイト（図５；「Ｂ」）は、そのような処置なしのＵＶＢ照射ケラチノサイト（図５；「Ａ」）よりも高い細胞生存率を示した。
（実施例５）
短縮型ヒト２１型コラーゲンのヒト臨床試験。
短縮型ヒト２１型アルファ１コラーゲンの局所塗布は、顔の皮膚の弾力性増加に関連する
臨床試験（ｎ＝１５名の対象）において、対象は、タンパク質を含まないベースのフェイシャルセラムを１週間のウォッシュアウト期間使用した後、０．１％の配列番号１６のポリペプチドを含む局所フェイシャルセラムを８週間使用した。配列番号１６のポリペプチドの局所塗布は、キュートメーターを使用して測定した場合に、皮膚の弾力性の増加と関連していた。図６に示したように、対象の１００％は、ベースライン（図６；「Ａ」）と比較した場合、２週間（図６；「Ｂ」）および４週間（図６；「Ｃ」）で、皮膚の弾力性が増加する改善を示した。
ヒト２１型アルファ１コラーゲンの局所塗布は、顔の皮膚のコラーゲン含有量の増加に関連する
臨床試験（ｎ＝１５名の対象）において、対象は、タンパク質を含まないベースのフェイシャルセラムを１週間のウォッシュアウト期間使用した後、０．１％の配列番号１６のポリペプチドを含む局所フェイシャルセラムを８週間使用した。配列番号１６のポリペプチドの局所塗布は、ＳＩＡｓｃｏｐｅによって測定した場合に、皮膚コラーゲンの含有量の増加と関連していた。図７に示したように、皮膚のコラーゲン含有量は、ベースライン（図７；「Ａ」）と比較した場合、２週間（図７；「Ｂ」）および８週間（図７；「Ｃ」）で増加した。
ヒト２１型アルファコラーゲンの局所塗布は、顔の皮膚の赤みの低減に関連する
臨床試験（ｎ＝１５名の対象）において、対象は、タンパク質を含まないベースのフェイシャルセラムを１週間のウォッシュアウト期間使用した後、０．１％の配列番号１６のポリペプチドを含む局所フェイシャルセラムを８週間使用した。図８に示したように、配列番号１６のポリペプチドの局所塗布は、ベースライン（図８；「Ａ」）と比較した場合、４週間（図８；「Ｂ」）および８週間（図８；「Ｃ」）での皮膚の赤みの減少と関連していた。
ヒト２１型アルファ１コラーゲンの局所塗布は、顔の皺の減少と関連する
臨床試験（ｎ＝１５名の対象）において、対象は、タンパク質を含まないベースのフェイシャルセラムを１週間のウォッシュアウト期間使用した後、０．１％の配列番号１６のポリペプチドを含む局所フェイシャルセラムを８週間使用した。図９に示したように、配列番号１６のポリペプチドの局所塗布は、ベースライン（図９；「Ａ」）と比較した場合、４週間（図９；「Ｂ」）および８週間（図９；「Ｃ」）での顔の皺の減少と関連していた。
（実施例６）
皮膚細胞に対する短縮型クラゲコラーゲンのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
短縮型クラゲコラーゲンは、コラーゲンＩ型タンパク質の皮膚細胞産生を刺激する
一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施して、短縮型クラゲコラーゲンのヒトの皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトに対する効果を評価した。線維芽細胞およびケラチノサイトを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ完全厚さヒト皮膚組織モデル（ＭａｔＴｅｋ）を、配列番号５のポリペプチドで４８時間処置した後のコラーゲンＩ型の分泌について評価した。次いで、組織モデルをすすぎ、新しい培地でさらに４８時間（９６時間時点）インキュベートした。培養上清を、プロコラーゲンＩ型Ｃ－ペプチド（総分泌コラーゲンＩ型タンパク質の読み出し情報）についてＥＬＩＳＡにより分析した。図１０に示したように、配列番号５のポリペプチドで処置した組織モデル（図１０；「Ａ」）は、未処置の組織モデル（図１０；「Ｂ」）または陽性対照のビタミンＢ３（図１０；「Ｃ」）で処置した組織モデルよりも高レベルのＩ型コラーゲンを分泌した。
短縮型クラゲコラーゲンは、ＵＶＢ光への曝露後のケラチノサイトにおけるＤＮＡ損傷を軽減する
さらなる試験において、ヒト初代ケラチノサイトに２５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ光を照射し、次いで、０．０３％の配列番号５のポリペプチドを含む培地で一晩インキュベートした。ＤＮＡを細胞から抽出し、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ ＵＶ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して、チミンダイマー（ＤＮＡ損傷の指標）のレベルを分析した。図１１に示したように、配列番号５のポリペプチドで処置した細胞（図１１；「Ｂ」）は、未処置の細胞（図１１；「Ａ」）よりも、低レベルのチミン二量体を示し、したがってＤＮＡ損傷がより少ないことを示した。
短縮型クラゲコラーゲンは、ＵＶＢ光を照射したケラチノサイトの細胞生存率を増加させる
ヒト初代ケラチノサイトに４０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ光を照射し、次いで、０．０３％の配列番号５のポリペプチドを含む培地で４８時間インキュベートした。細胞生存率は、ＭＴＴ代謝比色測定法を使用して評価した。図１２に示したように、配列番号５のポリペプチドで処置したＵＶＢ照射ケラチノサイト（図１２；「Ｂ」）は、未処置のＵＶＢ照射ケラチノサイト（図１２；「Ａ」）よりも高い細胞生存率を示した。
短縮型クラゲコラーゲンは、都市部の粉塵汚染に暴露されたケラチノサイトの細胞生存率を増加させる
都市部粉塵からの保護について試験するため、ヒト初代ケラチノサイトを、０．０３％の配列番号５のポリペプチドで２４時間前処置し、次に２ｍｇ／ｍｌの都市部粉塵（ＮＩＳＴ １６４９Ｂ）に２４時間曝露した。細胞生存率は、ＭＴＴ代謝比色測定法を使用して評価した。図１３に示したように、配列番号５のポリペプチドで前処置したケラチノサイト（図１３；「Ｂ」）は、都市部粉塵に曝露された未処置のケラチノサイト（図１３；「Ａ」）よりも、都市部粉塵の曝露後に高い細胞生存率を示した。
短縮型クラゲコラーゲンは、ＵＶＢ光を照射したケラチノサイトの炎症を軽減する
ｉｎ ｖｉｔｒｏ完全厚さヒト皮膚組織モデル（ＭａｔＴｅｋ）によるさらなる試験において、ＭａｔＴｅｋ組織モデルに３００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ光を照射し、次いで、０．０１％の配列番号５のポリペプチドで２４時間処置した。炎症誘発性サイトカインＩＬ－１αのレベルは、ＥＬＩＳＡにより判定した。図１４で示したように、配列番号５のポリペプチドで処置した組織モデル（図１４；「Ａ」）は、未処置のＵＶＢ照射（図１４；「Ｂ」）対照組織モデルと比較して、より低いレベルのＩＬ－１αを示した。
短縮型クラゲコラーゲンは、抗酸化能を有する
配列番号５のポリペプチドもまた、ＯＲＡＣアッセイにおいて評価した。図１５に示したように、配列番号５のポリペプチドの０．１％溶液は、１９３μＭのトロロックスと同等の抗酸化特性を有していた。
（実施例７）
短縮型クラゲコラーゲンのヒト臨床試験
短縮型クラゲコラーゲンの局所塗布は、顔の皮膚の水分増加に関連する
臨床試験（ｎ＝１８名の対象）において、対象は、０．０５％の配列番号５のポリペプチドを含む局所フェイシャルクリームを２週間使用した。図１６に示したように、配列番号５のポリペプチドの局所塗布は、ベースライン（図１６；「Ａ１」）と比較した場合、１週間（図１６；「Ａ２」）および２週間（図１６；「Ａ３」）での皮膚の水分保持の増加と関連していた。配列番号５のポリペプチドの局所塗布はまた、ベースライン（図１６；「Ｂ１」）、１週間（図１６；「Ｂ２」）、および２週間（図１６；「Ｂ３」）での海洋コラーゲンの局所塗布と比べて、皮膚の水分保持の増加を示した。
短縮型クラゲコラーゲンの局所塗布は、顔の皮膚の弾力性の増加に関連する
臨床試験（ｎ＝１８名の対象）において、対象は、０．０５％の配列番号５のポリペプチドを含む局所フェイシャルクリームを２週間使用した。図１７に示したように、配列番号５のポリペプチドの局所塗布は、ベースライン（図１７；「Ａ」）と比較した場合、１週間（図１７；「Ｂ」）および２週間（図１７；「Ｃ」）で、キュートメーターを使用して測定した皮膚の弾力性の増加と関連していた。
本明細書で開示された実施形態は、本明細書に広く記載され、以下に特許請求されているような構造、方法、または他の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化することができる。説明された実施形態は、すべての点で単なる例示として考慮されるものとし、限定的なものではないと考慮されるものとする。請求項と同等の意味および範囲内にあるすべての変更は、それらの範囲内に含まれるものとする。

Claims (38)

  1. 対象の皮膚に対して化粧品の利点を提供する方法であって、天然に存在しない短縮型コラーゲンを前記皮膚に局所的に塗布することを含み、前記天然に存在しない短縮型コラーゲンがＣ末端およびＮ末端を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記アミノ酸配列が天然に存在するヒト２１型コラーゲンのアミノ酸配列と比べて短縮されたアミノ酸配列であり、ここで、前記アミノ酸配列が配列番号１６を含み、前記化粧品の利点が（ｉ）皮膚の堅さ、弾力性、明るさ、水分保持、触覚テクスチャー、視覚テクスチャー、コラーゲン含有量、および／またはエラスチン含有量の増加；（ｉｉ）皮膚に存在する皮膚損傷、線、および／または皺、ならびに／あるいは、皮膚の紅斑または赤みの低減；（ｉｉｉ）皮膚の紫外線による損傷の予防または処置；（ｉｖ）損傷した皮膚の修復の促進；（ｖ）都市部の粉塵への曝露の影響からの皮膚細胞の保護；（ｖｉ）皮膚におけるコラーゲン産生および／またはエラスチン産生の刺激；（ｖｉｉ）上記（ｉ）～（ｖｉ）の２つ以上の任意の組み合わせ、からなる群から選択される、方法。
  2. 前記ポリペプチドが、前記天然に存在するヒト２１型コラーゲンと比べて、Ｃ末端、Ｎ末端で短縮されるか、内部で短縮されるか、または前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチドが、前記天然に存在するヒト２１型コラーゲンと比べて、前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチドが、前記天然に存在するヒト２１型コラーゲンと比べて、前記Ｃ末端で１０アミノ酸から２１２アミノ酸短縮され、および／または前記Ｎ末端で１０アミノ酸から５５８アミノ酸短縮される、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ポリペプチドが、１８７アミノ酸から９００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から８００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から７００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から６００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から５００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から４００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から３００アミノ酸の長さ、または１８７アミノ酸から２００アミノ酸の長さである、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記皮膚の前記堅さが、キュートメーターを使用して測定した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％増加する、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記皮膚の前記弾力性が、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％増加する、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記皮膚の前記弾力性が、１週間局所塗布した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも８％増加する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記皮膚の前記弾力性が、２週間局所塗布した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも２５％増加する、請求項７に記載の方法。
  10. 前記皮膚の前記弾力性が、２週間局所塗布した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも３０％増加する、請求項７に記載の方法。
  11. 前記皮膚の前記弾力性が、４週間局所塗布した後、キュートメーターで測定した場合に、少なくとも１００％増加する、請求項７に記載の方法。
  12. 前記天然に存在しない短縮型コラーゲンが、前記皮膚に対して、０．１％ｗ／ｗの前記天然に存在しない短縮型コラーゲンを含むフェイシャルセラムとして塗布される、請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記皮膚の前記水分保持が、コルネオメーターで測定した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％増加する、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記皮膚の前記堅さが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記皮膚の前記弾力性が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記皮膚の前記明るさが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記皮膚の前記コラーゲン含有量が、ＳＩＡｓｃｏｐｅで測定した場合に、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、または少なくとも１５％増加する、請求項１から請求項１６に記載のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記皮膚の前記コラーゲン含有量が、２週間局所適用した後に少なくとも５％増加する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記皮膚の前記コラーゲン含有量が、２週間局所適用した後に少なくとも７％増加する、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記皮膚の前記コラーゲン含有量が、４週間局所適用した後に少なくとも９％増加する、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記皮膚の前記触覚テクスチャーが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記皮膚の前記視覚テクスチャーが、専門の臨床的評点者によって判定される場合に改善される、請求項１から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 皮膚に存在する前記線または皺が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に減少する、請求項１から請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 皮膚に存在する前記線または皺が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に少なくとも１０％減少する、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記皮膚の前記紅斑が、専門の臨床的評点者によって判定される場合に減少する、請求項１から請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記皮膚の前記紅斑が、２週間局所塗布した後、専門の臨床的評点者によって判定される場合に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％減少する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記皮膚の前記紅斑が、４週間局所塗布した後、専門の臨床的評点者によって判定される場合に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％減少する、請求項２５に記載の方法。
  28. 皮膚細胞におけるコラーゲン産生を刺激する方法であって、天然に存在しない短縮型コラーゲンを前記皮膚細胞に局所的に塗布することを含み、前記天然に存在しない短縮型コラーゲンが、天然に存在するヒト２１型コラーゲンのアミノ酸配列と比べて短縮されたアミノ酸配列であるか、またはそれを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ここで、前記アミノ酸配列が配列番号１６を含み、前記ポリペプチドがＣ末端およびＮ末端を含み、前記天然に存在しない短縮型コラーゲンが短縮型ヒト２１型コラーゲンである、方法。
  29. 前記ポリペプチドが、前記天然に存在するヒト２１型コラーゲンと比べて、Ｃ末端、Ｎ末端で短縮されるか、内部で短縮されるか、または前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ポリペプチドが、前記天然に存在するヒト２１型コラーゲンと比べて、前記Ｃ末端と前記Ｎ末端の両方で短縮される、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ポリペプチドが、前記天然に存在するヒト２１型コラーゲンと比べて、前記Ｃ末端で１０アミノ酸から２１２アミノ酸短縮され、および／または前記Ｎ末端で１０アミノ酸から５５８アミノ酸短縮される、請求項２８から請求項３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記短縮型コラーゲンが、１８７アミノ酸から９００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から８００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から７００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から６００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から５００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から４００アミノ酸の長さ、１８７アミノ酸から３００アミノ酸の長さ、または１８７アミノ酸から２００アミノ酸の長さである、請求項２８から請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ポリペプチドが配列番号１６によるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１から請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記皮膚中の前記コラーゲンが、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％増加する、請求項２８から請求項３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ポリペプチドと、水、油グリセレス－８エステルズ、グリセリン、ココナッツアルカン、ヒドロキシエチルアクリレート／アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウムコポリマー、ペンチレングリコール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、カプリリルグリコール、クロルフェネシン、およびフェノキシエタノールからなる群から選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む局所製剤であって、前記ポリペプチドが、天然に存在するヒト２１型コラーゲンのアミノ酸配列と比べて短縮されたアミノ酸配列であるか、またはそれを含むアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１６のアミノ酸配列からなる、局所製剤。
  36. 前記油が植物油である、請求項３５に記載の局所製剤。
  37. 前記短縮型ヒト２１型コラーゲンが、海洋コラーゲンがヒト初代線維芽細胞に塗布された場合よりも、ヒト初代線維芽細胞に塗布された場合にエラスチン発現を高いレベルに上方制御する、請求項３５から請求項３６のいずれか一項に記載の局所製剤。
  38. 前記植物油がオリーブ油である、請求項３６に記載の局所製剤。
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