JP7308468B2 - 凝集の少ないpprタンパク質及びその利用 - Google Patents
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Description
[1] 下記のいずれか1つの、PPRモチーフ:
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(A-1)配列番号:8の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-1)配列番号:9の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(U-1)配列番号:10の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ。
[2] 下記のいずれか1つの、PPRモチーフ:
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(A-1)配列番号:8の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したPPRモチーフ;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-1)配列番号:9の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるPPRモチーフ;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(U-1)配列番号:10の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるPPRモチーフ;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ。
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がリジンである組み合わせ
・位置6のアミノ酸アスパラギン酸であり、かつ位置9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
[3] 下記のいずれか1つである、1又は2に記載のPPRモチーフ:
(C-4)配列番号:4の配列からなるPPRモチーフ;
(A-4)配列番号:58の配列からなるPPRモチーフ;
(G-4)配列番号:59の配列からなるPPRモチーフ;
(U-4)配列番号:60の配列からなるPPRモチーフ。
[4] 1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフの、PPRタンパク質におけるN末端から1番目のPPRモチーフとしての使用。
[5] PPRタンパク質の凝集性を減少させるための、4に記載の使用。
[6] 下記の式1で表されるPPRモチーフを1~30個含む、特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なタンパク質において、N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)のA6アミノ酸が、親水性アミノ酸である、タンパク質。
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii~Lviiは存在しない場合がある。)
[7] M1のA9アミノ酸が、親水性アミノ酸又はグリシンである、6に記載のタンパク質。
[8] M1のA6アミノ酸が、アスパラギン又はアスパラギン酸である、6又は7に記載のタンパク質。
[9] M1のA9アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、リジン、又はグリシンである、6~8のいずれか1項に記載のタンパク質。
[10] M1のA6アミノ酸、及びM1のA9アミノ酸が、下記のいずれかの組み合わせである、6~9のいずれか1項に記載のタンパク質。
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がリジンである組み合わせ
・A6アミノ酸アスパラギン酸であり、かつA9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
[11] 蛍光タンパク質、核移行シグナルペプチド、及びタグタンパク質からなる群より選択される少なくとも一つと、1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は6~10のいずれか1項に記載のタンパク質との、融合タンパク質。
[12] 6に定義したPPRモチーフを含む、特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なPPRタンパク質の、改質方法であって、N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)のA6アミノ酸をより親水性とする、方法。
[13] 1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、6~10のいずれか1項に記載のタンパク質、又は11に記載の融合タンパク質を用いることを特徴とする、核酸の検出方法。
[14] 1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフ、1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は6~10のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
[15] 14に記載の核酸を含む、ベクター。
[16] 15に記載のベクターを含む、細胞(ヒト個体は除く。)。
[17] 1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフ、1~3のいずれか1項に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は6~10のいずれか1項に記載のタンパク質、又は15に記載のベクターを用いる、核酸の操作方法(ヒト個体での実施を除く。)。
[18] 17に記載の操作方法を含む、生物の生産方法。
[1] 下記のいずれか1つの、PPRモチーフ:
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(A-1)配列番号:8の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-1)配列番号:9の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(U-1)配列番号:10の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ。
[2] 下記のいずれか1つの、PPRモチーフ:
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(A-1)配列番号:8の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したPPRモチーフ;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-1)配列番号:9の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるPPRモチーフ;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(U-1)配列番号:10の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるPPRモチーフ;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ。
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・位置6アミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・位置6アミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がリジンである組み合わせ
・位置6アミノ酸アスパラギン酸であり、かつ位置9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
[3] 1又は2に記載のPPRモチーフの、PPRタンパク質におけるN末端から1番目のPPRモチーフとしての使用。
[4] PPRタンパク質の凝集性を減少させるための、3に記載の使用。
[5] 下記の式1で表されるPPRモチーフを1~30個含む、特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なタンパク質において、N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)のA6アミノ酸が、親水性アミノ酸である、タンパク質。
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii~Lviiは存在しない場合がある。)
[6] M1のA9アミノ酸が、親水性アミノ酸又はグリシンである、5に記載のタンパク質。
[7] M1のA6アミノ酸が、アスパラギン又はアスパラギン酸である、5又は6に記載のタンパク質。
[8] M1のA9アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、リジン、又はグリシンである、5~7のいずれか1項に記載のタンパク質。
[9] M1のA6アミノ酸、及びM1のA9アミノ酸が、下記のいずれかの組み合わせである、5~8のいずれか1項に記載のタンパク質。
・A6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・A6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・A6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がリジンである組み合わせ
・A6のアミノ酸アスパラギン酸であり、かつA9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
[10] 蛍光タンパク質、核移行シグナルペプチド、及びタグタンパク質からなる群より選択される少なくとも一つと、1若しくは2に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は5~9のいずれか1項に記載のタンパク質との、融合タンパク質。
[11] 3に定義したPPRモチーフを含む、特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なPPRタンパク質の、改質方法であって、N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)のA6アミノ酸をより親水性とする、方法。
[12] 1若しくは2に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、5~9のいずれか1項に記載のタンパク質、又は10に記載の融合タンパク質を用いることを特徴とする、核酸の検出方法。
[13] 1若しくは2に記載のPPRモチーフ、1若しくは2に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は5~9のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
[14] 13に記載の核酸を含む、ベクター。
[15] 14に記載のベクターを含む、細胞(ヒト個体は除く。)。
[16] 1若しくは2に記載のPPRモチーフ、1若しくは2に記載のPPRモチーフをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は5~9のいずれか1項に記載のタンパク質、又は14に記載のベクターを用いる、核酸の操作方法(ヒト個体での実施を除く。)。
[17] 16に記載の操作方法を含む、生物の生産方法。
(定義)
本発明でPPRモチーフというときは、特に記載した場合を除き、Web上のタンパク質ドメイン検索プログラムでアミノ酸配列を解析した際に、PfamにおいてPF01535、PrositeにおいてPS51375で得られるE値が所定値以下(望ましくはE-03)のアミノ酸配列をもつ30~38アミノ酸で構成されるポリペプチドをいう。本発明で定義するPPRモチーフを構成するアミノ酸の位置番号は、PF01535とほぼ同義である一方で、PS51375のアミノ酸の場所から2引いた数(例;本発明の1番→PS51375の3番)に相当する。ただし、“ii”(-2)番のアミノ酸というときは、PPRモチーフを構成するアミノ酸の後ろ(C末端側)から2番目のアミノ酸、又は次のPPRモチーフの1番アミノ酸に対して2個N末端側、すなわち-2番目のアミノ酸とする。次のPPRモチーフが明確に同定されない場合、次のヘリックス構造の1番目のアミノ酸に対して、2コ前のアミノ酸を“ii”とする。Pfamについてはhttp://pfam.sanger.ac.uk/、Prositeについては、http://www.expasy.org/prosite/を参照することができる。
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
(3-1) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン及びアスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にCに、その次にA又はGに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-2) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にGに、その次にCに対して結合するが、Uには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-3) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にA又はUに対して結合するが、Gには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-4) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合するが、A、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-5) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にUに、その次にAに対して結合するが、Gには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-6) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合し、次にUに対して結合するが、AとCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-7) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、リジン、トレオニン、アスパラギン酸、の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合し、次にAに対して結合するが、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-8) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合し、次にCに、その次にG及びUに対して結合するという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-9) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、セリンの場合、そのPPRモチーフは、Cに強く結合し、次にUに対して結合するが、A及びGには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-10) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合するが、G、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-11) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にAに対して結合するが、G及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-12) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、トレオニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのPPRモチーフは、Aに強く結合するが、G、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-13) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合し、次にCに対して結合するが、A及びGには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-14) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸の場合PPR、そのモチーフは、Uに強く結合し、次にCに対して結合するが、A及びGには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-15) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Uに強く結合するが、A、G及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(3-16) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのPPRモチーフは、Gに強く結合するが、A、U及びCには結合しないという、選択的なRNA塩基結合能を有する。
(2-1) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-2) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-3) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-4) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-5) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、グリシン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-6) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、T及びCに選択的に結合する;
(2-7) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、イソロイシン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-8) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、T及びCに選択的に結合する;
(2-9) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-10) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、ロイシン、リシンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-11) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-12) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-13) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-14) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、C及びTに選択的に結合する;
(2-15) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-16) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-17) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-18) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-19) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-20) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-21) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、チロシン、アスパラギン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-22) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-23) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-24) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、セリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-25) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-26) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-27) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、セリンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-28) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-29) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-30) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にTに対して結合する;
(2-31) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、トリプトファンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合し、次にCに対して結合する;
(2-32) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、プロリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-33) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-34) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-35) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;
(2-36) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、セリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A及びGに選択的に結合する;
(2-37) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-38) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-39) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、セリン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-40) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A及びGに選択的に結合する;
(2-41) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-42) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Gに選択的に結合する;
(2-43) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-44) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-45) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-46) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンであるとき、そのPPRモチーフは、Aに選択的に結合する;
(2-47) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、バリン、任意のアミノ酸であるとき、そのPPRモチーフは、A、C及びTに結合するが、Gには結合しない;
(2-48) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸であるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合し、次にAに対して結合する;
(2-49) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、バリン、グリシンであるとき、そのPPRモチーフは、Cに選択的に結合する;
(2-50) A1、A4、及びLiiの3つのアミノ酸の組み合わせが、順に、任意のアミノ酸、バリン、トレオニンであるとき、そのPPRモチーフは、Tに選択的に結合する;に基づいて決定される、タンパク質であって、選択的なDNA塩基結合能を有する。
RNA結合性のPPRモチーフにおいては、各塩基を認識して特異的に結合可能な、代表的な1番目、4番目、ii番目のアミノ酸の組み合わせがある。具体的には、アデニンを認識する組み合わせは、1番目がバリン、4番目がトレオニン、ii番目がアスパラギン、シトシンを認識する組み合わせは、1番目がバリン、4番目がアスパラギン、ii番目がセリン、グアニンを認識する組み合わせは、1番目がバリン、4番目がトレオニン、ii番目がアスパラギン酸、ウラシルを認識する組み合わせは、1番目がバリン、4番目がアスパラギン、ii番目がアスパラギン酸である(前掲非特許文献1~5)。本発明の好ましい態様の一つでは、これらの組み合わせが用いられる。
本発明者らは、天然に存在する既存のPPRモチーフのアミノ酸情報から、PPRモチーフの6番目の位置のアミノ酸は疎水性(特にロイシン)、9番目の位置のアミノ酸は非親水性のアミノ酸(特にグリシン)である場合が非常に多いことを見出した。すでに結晶構造が得られているPPRタンパク質の構造(非特許文献6:Coquille et al., 2014 Nat. Commun.; PDB ID: 4PJQ, 4WN4, 4WSL, 4PJR; 非特許文献7:Shen et al., 2015 Nat. Commun., PDB ID: 5I9D, 5I9F, 5I9G, 5I9H)から、1モチーフ目(N末側)のそれら6番目、9番目は外側に露出するため、その露出した疎水性アミノ酸が原因で凝集性を示すと想像した(図1A)。一方で、2モチーフ目以降においては、6番目、9番目のアミノ酸は、タンパク質内に埋もれ、疎水性コアを形成するため、すべてのモチーフの6番目、9番目に親水性残基を入れるとタンパク質構造が崩壊する可能性があると考えた。そこで1モチーフ目のみ、6番目、好ましくは6番目及び9番目のアミノ酸を親水性のアミノ酸(アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、セリン、トレオニン)にすることでPPRの凝集性を減少させることとした。
特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なタンパク質において、N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)において:
(1)A6アミノ酸を、親水性アミノ酸、好ましくはA6アミノ酸を、アスパラギン又はアスパラギン酸とする。
(2)さらに、A9アミノ酸を、親水性アミノ酸又はグリシン、好ましくはグルタミン、グルタミン酸、リジン、又はグリシンとする。
(3)あるいは、A6アミノ酸及びA9アミノ酸を、下記のいずれかの組み合わせとする。
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がリジンである組み合わせ
・A6アミノ酸アスパラギン酸であり、かつA9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
本発明は、上記により見出された、凝集性の改善された新規なPPRモチーフ、及びそれを含む新規なPPRタンパク質を提供する。
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(A-1)配列番号:8の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-1)配列番号:9の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(U-1)配列番号:10の配列からなるPPRモチーフにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したPPRモチーフ;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ。
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性であるPPRモチーフ;
(A-1)配列番号:8の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したPPRモチーフ;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-1)配列番号:9の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるPPRモチーフ;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性であるPPRモチーフ;
(U-1)配列番号:10の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるPPRモチーフ;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも80%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性であるPPRモチーフ。
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がリジンである組み合わせ
・位置6のアミノ酸アスパラギン酸であり、かつ位置9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
(C-4)配列番号:4の配列からなるPPRモチーフ;
(A-4)配列番号:58の配列からなるPPRモチーフ;
(G-4)配列番号:59の配列からなるPPRモチーフ;
(U-4)配列番号:60の配列からなるPPRモチーフ。
配列番号:58の配列 VTYTTNIDQLCKAGKVDEALELFKEMRSKGVKPNV
配列番号:59の配列 VTYTTNIDQLCKAGKVDEALELFDEMKERGIKPDV
配列番号:60の配列 VTYNTNIDQLCKAGRLDEAEELLEEMEEKGIKPDV
本発明はまた、上記により見出された、凝集性が改善されたPPRタンパク質を提供する。
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がリジンである組み合わせ
・A6アミノ酸アスパラギン酸であり、かつA9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
・結合する塩基がシトシンである場合は、A1がバリンであり、A4がアスパラギンであり、かつAiiがセリンである
・結合する塩基がアデニンである場合は、A1がバリンであり、A4がトレオニンであり、かつAiiがアスパラギンである
・結合する塩基がグアニンである場合は、A1がバリンであり、A4がトレオニンであり、Aiiがアスパラギン酸である
・結合する塩基がウラシル又はチミンである場合は、A1がバリンであり、A4がアスパラギンであり、Aiiがアスパラギン酸である
・結合する塩基がシトシンである場合は、SEQ ID NOs:4-7のいずれか1の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がアデニンである場合は、SEQ ID NO:8の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、次の段落に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したポリペプチド
・結合する塩基がグアニンである場合は、SEQ ID NO:9の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、次の段落に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したポリペプチド
・結合する塩基がウラシルである場合は、SEQ ID NO:10の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、次の段落に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したポリペプチド
M1以外のPPRモチーフの少なくとも一つが、下記のいずれか1つのポリペプチドからなるPPRモチーフである:
・結合する塩基がシトシンである場合は、SEQ ID NO:2の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がアデニンである場合は、SEQ ID NO:8の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がグアニンである場合は、SEQ ID NO:9の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がウラシルである場合は、SEQ ID NO:10の配列からなるポリペプチド
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がリジンである組み合わせ
・A6アミノ酸アスパラギン酸であり、かつA9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
・結合する塩基がシトシンである場合は、SEQ ID NOs:4の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がアデニンである場合は、SEQ ID NO:58の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がグアニンである場合は、SEQ ID NO:59の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がウラシルである場合は、SEQ ID NO:60の配列からなるポリペプチド
M1以外のPPRモチーフの少なくとも一つが、下記のいずれか1つのポリペプチドからなるPPRモチーフである:
・結合する塩基がシトシンである場合は、SEQ ID NO:2の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がアデニンである場合は、SEQ ID NO:8の配列において、位置15のアミノ酸のリジンへの置換を行った配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がグアニンである場合は、SEQ ID NO:9の配列からなるポリペプチド
・結合する塩基がウラシルである場合は、SEQ ID NO:10の配列からなるポリペプチド
本発明の好ましい態様の一つでは、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル(又はチミン)それぞれに対するPPRモチーフにおいて、1、4、6、9、ii番目以外のアミノ酸を、特定のアミノ酸とすることができる。詳細には、シロイヌナズナのPPRモチーフ配列のうち、位置1、4、及びiiのアミノ酸の組み合わせがアデニンを認識するPPRモチーフのためにはVTN、シトシンを認識するPPRモチーフのためにはVSN、グアニンを認識するPPRモチーフのためにはVTD、ウラシルを認識するPPRモチーフのためにはVNDであるものを収集し、各位置に出現するアミノ酸の種類及びその数をまとめたときに、各位置において高頻度で出現するアミノ酸を選択することで、PPRモチーフの性能を高めることができる。
シトシンに対応するPPRモチーフとしては、SEQ ID NOs:4-7のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
アデニンに対応するPPRモチーフとしては、SEQ ID NO:8のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
グアニンに対応するPPRモチーフとしては、SEQ ID NO:9のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ;
ウラシルに対応するPPRモチーフとしては、SEQ ID NO:10のいずれか1の配列からなるPPRモチーフ。
本発明で塩基配列(ヌクレオチド配列ということもある。)又はアミノ酸配列に関し「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致した塩基又はアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性=(一致した位置の数/位置の全数)×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J.Mol.Biol. 215(1990) 403-410に記載されるNBLAST及びXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列又はアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム(例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
疎水性アミノ酸;アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン
非疎水性アミノ酸;アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、トレオニン、システイン、ヒスチジン;
親水性アミノ酸;アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、トレオニン;
酸性アミノ酸:アスパラギン酸、グルタミン酸;
塩基性アミノ酸:リジン、アルギニン、ヒスチジン;
中性アミノ酸:アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン;
含硫アミノ酸:メチオニン、システイン;
含芳香環アミノ酸:チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン。
(PPRタンパク質凝集性の改善)
本発明の新規 PPRモチーフを用いて作製したPPRタンパク質は、細胞内での凝集性が減少されている。PPRタンパク質の凝集性は、当業者であれば、PPRタンパク質を細胞内で発現させ、凝集の有無を確認することにより、評価できる。確認は、PPRタンパク質を蛍光タンパク質と融合させて発現すれば、より容易である。本発明者らの検討によると、PPRタンパク質の一番目のモチーフにおけるアミノ酸の適切な改変により、PPRタンパク質の細胞内での凝集性が改善され、核への移行性が向上している。
本発明の新規 PPRモチーフを用いて作製したPPRタンパク質は、細胞内での凝集性が減少されているのみならず、同じ標的RNAに対する既存のPPRモチーフを用いて作製したPPRタンパク質と同等、又はそれより高いRNA結合性能を有しうる。同等とは、55%以上であることをいい、好ましくは75%程度であることをいう。
(複合体、融合タンパク質)
本発明により提供されるPPRモチーフ又はPPRタンパク質は、機能性領域を連結し、複合体とすることができる。また、タンパク質性の機能性領域を連結し、融合タンパク質とすることができる。機能性領域とは、生体内又は細胞内で特定の生物学的機能、例えば酵素機能、触媒機能、阻害機能、亢進機能などの機能を有する部分、又は標識としての機能を有する部分をいう。そのような領域は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、生理活性物質、薬剤からなる。なお、以下では、本発明を、複合体に関し、融合タンパク質を例に説明することがあるが、当業者であれば、その説明に準じて、融合タンパク質以外の複合体の場合についても理解することができる。
本発明は、上述の、PPRモチーフ、PPRタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベクター(例えば増幅のためのベクター、発現ベクター)も提供する。増幅のためのベクターは、大腸菌や酵母を宿主として用いうる。本明細書において、発現ベクターとは、例えば上流から、プロモーター配列を有するDNA、所望のタンパク質をコードするDNA、及びターミネーター配列を有するDNAを含むベクターを意味するが、所望の機能を発揮する限り、必ずしもこの順に配列されている必要はない。本発明においては、当業者が通常使用し得る様々なベクターを組み換えて使用することができる。
本発明のPPRタンパク質、又は融合タンパク質は、生体内又は細胞内に、核酸配列特異的に機能性領域をデリバリーし、機能させることができる可能性がある。GFP等の標識部分を連結した複合体は、所望のRNAを生体内で可視化するために用いうる。
・特定の疾患に関連した特定のRNAを認識し、結合するPPRタンパク質を作製する。また、特定のRNAに関し、標的配列を解析し、及び付随するタンパク質を解析する。それらの解析結果は、疾患の治療のための化合物の探索に用いうる。
・農作物、林産物、水産物等において、収量や品質を改善する。
・耐病性の向上、環境耐性の向上、向上された又は新たな機能性を有した生物を育種する。
・微生物、培養細胞、植物体、動物体(例えば昆虫体)を利用した有用物質生産において、DNA、RNAの操作により、タンパク発現量を制御する。これにより、有用物質の生産性を向上することができる。有用物質の例は、抗体、ワクチン、酵素等のタンパク質性の物質のほか、医薬品の中間体、香料、色素等の比較的低分子の化合物である。
(モチーフの設計)
標的配列は、CAG配列が6回繰り返したCAGCAGCAGCAGCAGCAG(SEQ ID NO:1)とした。PPRモチーフは、1番目、4番目、ii番目のアミノ酸配列によって認識される塩基が決定される。シトシンを認識するPPRモチーフには、1番目にバリン、4番目にアスパラギン、ii番目にセリン、アデニンを認識するPPRモチーフには、1番目にバリン、4番目にトレオニン、ii番目にアスパラギン、グアニンを認識するPPRモチーフには、1番目にバリン、4番目にトレオニン、ii番目にアスパラギン酸をそれぞれ配置した。なお、ウラシルを認識するPPRモチーフには、1番目はバリン、4番目はアスパラギン、ii番目はアスパラギン酸をそれぞれ配置すればよい。
PPR遺伝子を含むプラスミドは、Golden Gate法を利用して構築した。より詳細には、順番にシームレスで連結されるように設計された10種類の中間ベクターDest-a,b,c,d,e,f,g,h,i,jを準備し、1モチーフ及び2モチーフ(A、C、G、Uに対応するPPRモチーフ、AA、AC、AG、AU、CA、CC、CG、CU、GA、GC、GG、GU、UA、UC、UG、UUそれぞれの塩基組み合わせを認識する2つのPPRモチーフ)の20種類のモチーフ各々を、10種類のベクターに挿入することにより、200種類のパーツを作製した。
Dest-bは、gaagacatATACagagaccaaggtctcaGTGGtgacataatgtcttc(SEQ ID NO:44)、
Dest-cは、gaagacatcATACagagaccaaggtctcaGTGGttacatatgtcttc(SEQ ID NO:45)、
Dest-dは、gaagacatacATACagagaccaaggtctcaGTGGttacaatgtcttc(SEQ ID NO:46)、
Dest-eは、gaagacattacATACagagaccaaggtctcaGTGGtgacatgtcttc(SEQ ID NO:47)、
Dest-fは、gaagacattgacATACagagaccaaggtctcaGTGGttaatgtcttc(SEQ ID NO:48)、
Dest-gは、gaagacatgttacATACagagaccaaggtctcaGTGGtcatgtcttc(SEQ ID NO:49)、
Dest-hは、gaagacatggtcacATACagagaccaaggtctcaGTGGtatgtcttc(SEQ ID NO:50)、
Dest-iは、gaagacattggttacATACagagaccaaggtctcaGTGGatgtcttc(SEQ ID NO:51)、
Dest-jは、gaagacatgtggtgacATACagagaccaaggtctcaGTGGtcttc(SEQ ID NO:52)
を、遺伝子合成技術により作製し、pUC57-kanへクローニングすることにより準備した。
動物培養細胞での発現プラスミドpcDNA3.1は、CMVプロモーターとSV40 poly Aシグナル配列を含み、それらの間に発現させたい遺伝子を挿入することができる。細胞内でのPPRタンパク質の発現を検出するため、蛍光タンパク質を融合したPPRタンパク質を発現させ、その蛍光画像から細胞内での凝集性及び核への移行性を解析することとした。N末側から、EGFP、核移行シグナル配列、PPRタンパク質、FLAGエピトープタグの順番で融合したタンパク質遺伝子をpcDNA3.1へ挿入した(SEQ ID NOs:17-22)。また、N末側からmClover3、PPRタンパク質、核移行シグナル配列、FLAGエピトープタグの順番で融合したタンパク質遺伝子をpcDNA3.1へ挿入した(SEQ ID NOs:23-28)。コントロールとしてPPRを含まないプラスミドも作製した(SEQ ID NOs:35-36)。
PPRcag 1、PPRcag 2、PPRcag 3、PPRcag 4、PPRcag 5、PPRcag 6について、標的RNAとの結合を確認するため、組み換えタンパク質を作製し、結合実験を行った。
V2モチーフを用いたPPRタンパク質(塩基配列はSEQ ID NO:61、アミノ酸配列はSEQ ID NO:62)と、v3.2モチーフを用いたPPRタンパク質(塩基配列はSEQ ID NO:63、アミノ酸配列はSEQ ID NO:64)それぞれを大腸菌発現系で作成し精製し、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離した。なお、v2モチーフとは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NOs:8~10の配列を有するPPRモチーフを指し、v3.2モチーフとは、N末端から1番目の場合はSEQ ID NO:4、SEQ ID NOs:58~60のいずれかの配列を有するPPRモチーフであり、それ以外の場合はアデニンに対してはSEQ ID NO:8において15番目のアスパラギン酸をリジンに置換したものであり、アデニン以外の塩基に対してはSEQ ID NOs:2, 9, 10から選択した配列を有するPPRモチーフを指す。
目的のPPRをコードしたDNA配列を含むpE-SUMOpro Kanプラスミドを用いて、大腸菌Rosetta株を形質転換し、37度で培養後、OD600が0.6に達した時に20度に温度を下げ、終濃度0.5mMになるようにIPTGを加え、目的PPRタンパク質をSUMO融合タンパクつとして、大腸菌内で発現させた。1晩、培養後、菌体を遠心よって集菌し、Lysis Buffer (50mM Tris-HCl pH8.0, 500mM NaCl)で再懸濁した。超音波破砕によって、大腸菌を破砕し、17000g, 30minの遠心後、上清画分をNi-Agaroseカラムに供与し、20mM imidazoleを含むLysis Bufferでカラム洗浄後、400mM imidazoleを含むLysis Bufferで、SUMO融合目的PPRタンパク質を溶出させた。溶出後、Ulp1によるSUMOタンパク質を目的PPRタンパク質から切り離すと同時に、透析により、イオン交換Buffer(50mM Tris-Hcl pH8.0, 200mM NaCl)にタンパク溶液を置換した。その後、SPカラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。カラム供与後、NaCl濃度を200mMから1Mまで徐々に上げることによって、タンパク質を溶出させた。目的PPRタンパク質を含む画分をSuperdex200カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって最終精製を行った。 ゲルろ過Buffer(25mM HEPES pH7.5, 200mM NaCl, 0.5mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP))で平衡化したゲルろ過カラムに、イオン交換から溶出した目的PPRタンパク質を供与した。最後に目的PPRタンパク質を含む画分を濃縮し、液体窒素で凍結し、次の分析に使用するまで-80度で保存した。
精製したリコンビナントPPRタンパク質を濃度1mg/mlに調整した。ゲルろ過クロマトグラフィーは、Superdex 200 increase 10/300 GL (GE Helthcare)を用いた。25mM HEPES pH7.5, 200mM NaCl, 0.5mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)で平衡化したゲルろ過カラムに、調整したタンパク質を供与し、ゲルろ過カラムより溶出してくる溶液を280nmの吸光度を測定することにより、タンパク質の性質を分析した。
結果を図4に示す。溶出画分(Elution vol.)が少ないほど分子サイズが大きい。V2では、8から10mLの溶出画分で溶出された一方で、v3.2では、12から14mLの溶出画分にピークが見られた。このことから、v2では、タンパク質サイズが大きくなっていることから凝集している可能性が示唆され、その凝集はv3.2において改善されていることが分かった。
Claims (18)
- 下記のいずれか1つの、ポリペプチド:
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるポリペプチド;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(A-1)配列番号:8の配列からなるポリペプチドにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したポリペプチド;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(G-1)配列番号:9の配列からなるポリペプチドにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したポリペプチド;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(U-1)配列番号:10の配列からなるポリペプチドにおいて、位置6のアミノ酸をアスパラギン又はアスパラギン酸に置換したポリペプチド;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド。
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii~Lviiは存在しない場合がある。) - 下記のいずれか1つの、ポリペプチド:
(C-1)配列番号:4~7のいずれか1の配列からなるポリペプチド;
(C-2)配列番号:4~7のいずれか1の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつシトシン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(C-3)配列番号:4~7のいずれか1の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつシトシン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(A-1)配列番号:8の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換したポリペプチド;
(A-2)(A-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつアデニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(A-3)(A-1)の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつアデニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(G-1)配列番号:9の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるポリペプチド;
(G-2)(G-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつグアニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(G-3)(G-1)の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつグアニン結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(U-1)配列番号:10の配列において、位置6及び9のアミノ酸を、下記に定義した組み合わせのいずれか1つを満たすように置換した配列からなるポリペプチド;
(U-2)(U-1)の配列において、位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸以外のアミノ酸の1~9個を置換、欠失、又は付加した配列からなり、かつウラシル結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド;
(U-3)(U-1)の配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、ただし位置1、4、6、9、及び34のアミノ酸は同一であり、かつウラシル結合性である、下記の式1で表されるPPRモチーフである、ポリペプチド。
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・位置6のアミノ酸がアスパラギンであり、かつ位置9のアミノ酸がリジンである組み合わせ
・位置6のアミノ酸アスパラギン酸であり、かつ位置9アミノ酸がグリシンである組み合わせ
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii~Lviiは存在しない場合がある。) - 下記のいずれか1つである、請求項1又は2に記載のポリペプチド:
(C-4)配列番号:4の配列からなるポリペプチド;
(A-4)配列番号:58の配列からなるポリペプチド;
(G-4)配列番号:59の配列からなるポリペプチド;
(U-4)配列番号:60の配列からなるポリペプチド。 - 請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチドの、PPRタンパク質におけるN末端から1番目のPPRモチーフとしての使用。
- PPRタンパク質の凝集性を減少させるための、請求項4に記載の使用。
- 下記の式1で表されるPPRモチーフを1~30個含む、特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なタンパク質において、
N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)が:
A6アミノ酸が、親水性アミノ酸であるポリペプチド;又は
請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチド
である、タンパク質。
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii~Lviiは存在しない場合がある。) - M1のA9アミノ酸が、親水性アミノ酸又はグリシンである、請求項6に記載のタンパク質。
- M1のA6アミノ酸が、アスパラギン又はアスパラギン酸である、請求項6又は7に記載のタンパク質。
- M1のA9アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸、リジン、又はグリシンである、請求項6~8のいずれか1項に記載のタンパク質。
- M1のA6アミノ酸、及びM1のA9アミノ酸が、下記のいずれかの組み合わせである、請求項6~9のいずれか1項に記載のタンパク質。
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミン酸である組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がグルタミンである組み合わせ
・A6アミノ酸がアスパラギンであり、かつA9アミノ酸がリジンである組み合わせ
・A6アミノ酸アスパラギン酸であり、かつA9アミノ酸がグリシンである組み合わせ - 蛍光タンパク質、核移行シグナルペプチド、及びタグタンパク質からなる群より選択される少なくとも一つと、請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチドをN末端から1番目のPPRモチーフとして含むPPRタンパク質、又は請求項6~10のいずれか1項に記載のタンパク質との、融合タンパク質。
- 下記の式1で表されるPPRモチーフを含む、特定の塩基配列を有する標的核酸と結合可能なPPRタンパク質の、凝集性の改善方法であって、N末端から1番目のPPRモチーフ(M1)のA6アミノ酸を親水性アミノ酸とする、方法。
Helix Aは、12アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式2で表され、
Xは、存在しないか又は1~9アミノ酸長からなる部分であり;
Helix Bは、11~13アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり;
Lは、2~7アミノ酸長の、式3で表される部分であり;
ただし、Liii~Lviiは存在しない場合がある。) - 請求項6~10のいずれか1項に記載のタンパク質、又は請求項11に記載の融合タンパク質を用いることを特徴とする、核酸の検出方法。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項6~10のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項15に記載のベクターを含む、細胞(ヒト個体は除く。)。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項6~10のいずれか1項に記載のタンパク質、又は請求項15に記載のベクターを用いる、核酸の操作方法(ヒト個体での実施を除く。)。
- 請求項17に記載の操作方法を含む、生物の生産方法。
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C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
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C876 | Explanation why request for accelerated appeal examination is justified |
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A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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C305 | Report on accelerated appeal examination |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C13 | Notice of reasons for refusal |
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C302 | Record of communication |
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A521 | Request for written amendment filed |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
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