JP7307953B2 - 繊維の集合体及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、繊維の集合体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、繊維の集合体、繊維の集合体の製造方法、繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法、繊維の集合体を移動させる方法、人工筋肉、人工筋肉の収縮方法に関する。本願は、２０１８年１月１７日に、米国に仮出願された仮出願第６２／６１８，０８２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
キネシンは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解により得られる化学エネルギーを運動エネルギーへ変換し、細胞骨格である微小管上を運動するモータータンパク質である。このキネシン－微小管系を生体外で観察する手法として、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙが広く用いられている。
このアッセイ法は、ガラス基板上にキネシンを固定し、蛍光色素で標識した微小管を結合させ、ＡＴＰを添加するものである。その結果、生体内とは逆に微小管がキネシン被覆基材上を滑り運動する様子を蛍光顕微鏡で観察することができる。
例えば、非特許文献１には、グアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）の存在下でチューブリンを重合させて得られた微小管を、キネシン被覆基材上で滑り運動させ、リガンド－レセプター相互作用により架橋させると、微小管が集合し、環を形成して円運動したことが記載されている。
Kawamura R., et al., Ring-shaped assembly of microtubules shows preferential counterclockwisemotion, Biomacromolecules, 9 (9), 2277-2282, 2008.
しかしながら、非特許文献１に記載された方法では、一度架橋した微小管を解離させることが困難であり、微小管の運動を限定的にしか制御することができない。本発明は、繊維の集合を制御する新たな技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］複数の繊維と、前記複数の繊維を架橋する核酸断片と、を備え、前記繊維が微小管又はアクチン繊維である、繊維の集合体。
［２］前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている、［１］に記載の繊維の集合体。
［３］繊維の集合体の製造方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを接触させることを含む、製造方法。
［４］繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、前記第３の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第４の一本鎖核酸断片を接触させることを含む、方法。
［５］繊維の集合体を移動させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、モータータンパク質で表面が被覆された基材上で、前記繊維の集合体と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とを接触させること、を含む、方法。
［６］前記繊維が微小管であり、前記モータータンパク質がキネシン又はダイニンである、［５］に記載の方法。
［７］前記微小管はグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）の存在下で重合されており、前記繊維の集合体は弧を描くように移動する、［６］に記載の方法。
［８］前記微小管の少なくとも一部はグアノシン－５’－［α，β－メチレン］三リン酸（ＧＭＰＣＰＰ）の存在下で重合されており、前記繊維の集合体は直線的に移動する、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］前記繊維がアクチン繊維であり、前記モータータンパク質がミオシンである、［５］に記載の方法。
［１０］複数の微小管と、前記複数の微小管を架橋する、キネシン又はダイニンの多量体と、を備える、人工筋肉。
［１１］前記キネシン又は前記ダイニンの多量体は、ビオチン化キネシン又はビオチン化ダイニンと、アビジンとの複合体である、［１０］に記載の人工筋肉。
［１２］前記複数の微小管が第１の微小管及び第２の微小管を含み、前記第１の微小管には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の微小管には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の微小管及び前記第２の微小管が架橋されている、［１０］又は［１１］に記載の人工筋肉。
［１３］［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の人工筋肉にＡＴＰを接触させることを含む、前記人工筋肉の収縮方法。
［１］複数の繊維と、前記複数の繊維を架橋する核酸断片と、を備え、前記繊維が微小管又はアクチン繊維である、繊維の集合体。
［２］前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている、［１］に記載の繊維の集合体。
［３］繊維の集合体の製造方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを接触させることを含む、製造方法。
［４］繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、前記第３の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第４の一本鎖核酸断片を接触させることを含む、方法。
［５］繊維の集合体を移動させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、モータータンパク質で表面が被覆された基材上で、前記繊維の集合体と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とを接触させること、を含む、方法。
［６］前記繊維が微小管であり、前記モータータンパク質がキネシン又はダイニンである、［５］に記載の方法。
［７］前記微小管はグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）の存在下で重合されており、前記繊維の集合体は弧を描くように移動する、［６］に記載の方法。
［８］前記微小管の少なくとも一部はグアノシン－５’－［α，β－メチレン］三リン酸（ＧＭＰＣＰＰ）の存在下で重合されており、前記繊維の集合体は直線的に移動する、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］前記繊維がアクチン繊維であり、前記モータータンパク質がミオシンである、［５］に記載の方法。
［１０］複数の微小管と、前記複数の微小管を架橋する、キネシン又はダイニンの多量体と、を備える、人工筋肉。
［１１］前記キネシン又は前記ダイニンの多量体は、ビオチン化キネシン又はビオチン化ダイニンと、アビジンとの複合体である、［１０］に記載の人工筋肉。
［１２］前記複数の微小管が第１の微小管及び第２の微小管を含み、前記第１の微小管には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の微小管には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の微小管及び前記第２の微小管が架橋されている、［１０］又は［１１］に記載の人工筋肉。
［１３］［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の人工筋肉にＡＴＰを接触させることを含む、前記人工筋肉の収縮方法。
本発明によれば、繊維の集合を制御する新たな技術を提供することができる。
［繊維の集合体］
１実施形態において、本発明は、複数の繊維と、前記複数の繊維を架橋する核酸断片と、を備え、前記繊維が微小管又はアクチン繊維である、繊維の集合体を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の繊維の集合体によれば、繊維の集合を制御することができる。核酸断片は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡ及びＲＮＡが混在したものであってもよい。また、核酸断片は、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の核酸アナログを一部又は全部に含んでいてもよい。また、核酸断片は、後述するように光応答性基を有していてもよい。光応答性基としては、例えばアゾベンゼン基等が挙げられる。
１実施形態において、本発明は、複数の繊維と、前記複数の繊維を架橋する核酸断片と、を備え、前記繊維が微小管又はアクチン繊維である、繊維の集合体を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の繊維の集合体によれば、繊維の集合を制御することができる。核酸断片は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡ及びＲＮＡが混在したものであってもよい。また、核酸断片は、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の核酸アナログを一部又は全部に含んでいてもよい。また、核酸断片は、後述するように光応答性基を有していてもよい。光応答性基としては、例えばアゾベンゼン基等が挙げられる。
（第１実施形態）
第１実施形態の繊維の集合体では、前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている。
第１実施形態の繊維の集合体では、前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている。
図６を用いて、第１実施形態の繊維の集合体を説明する。第１実施形態の繊維の集合体６００は、第１の繊維６１０及び第２の繊維６２０を含む。第１の繊維６１０には第１の一本鎖核酸断片６１１が結合している。第２の繊維６２０には第２の一本鎖核酸断片６２１が結合している。
そして、第１の一本鎖核酸断片６１１に相補的な領域及び第２の一本鎖核酸断片６２１に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片６３０が、第１の一本鎖核酸断片６１１及び第２の一本鎖核酸断片６２１とハイブリダイズすることにより、第１の繊維６１０及び第２の繊維６２０が架橋されている。第１の一本鎖核酸断片６１１及び第２の一本鎖核酸断片６２１は、後述するレセプターＤＮＡ（ｒ－ＤＮＡ）に対応する。また、第３の一本鎖核酸断片６３０は、後述するリンカーＤＮＡ（ｌ－ＤＮＡ）に対応する。
実施例において後述するように、第１実施形態の繊維の集合体は、解離ＤＮＡ（ｄ－ＤＮＡ）６４０を接触させることにより、第１の繊維６１０及び第２の繊維６２０を解離させることができる。
（第２実施形態）
第２実施形態の繊維の集合体では、前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記アゾベンゼン基はトランス型であり、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている。
第２実施形態の繊維の集合体では、前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記アゾベンゼン基はトランス型であり、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている。
図１７を用いて、アゾベンゼン基が導入された一本鎖核酸について説明する。図１７に示すように、第２実施形態の繊維の集合体で使用する一本鎖核酸には一部の塩基の代わりにアゾベンゼン基が導入されている。アゾベンゼン基は、紫外線（ＵＶ）を照射するとトランス型に変化し、融解温度（Ｔｍ）を上昇させることができる。また、可視光を照射するとシス型に変化し、Ｔｍが低下する。この変化は可逆的であり、繰り返し行うことができる。
そこで、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片に、アゾベンゼン基が導入されていると、紫外線（ＵＶ）又は可視光を照射することにより、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片のハイブリダイゼーション及び解離を制御することができる。
図１８に示すように、第２実施形態の繊維の集合体は、紫外線（ＵＶ）又は可視光を照射することにより、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片に導入されたアゾベンゼン基のシス－トランス異性化を制御し、集合体の形成及び解離を制御することができる。
［繊維の集合体の製造方法］
（第１実施形態）
第１実施形態の繊維の集合体の製造方法は、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを接触させることを含む、製造方法である。本実施形態の製造方法により、上述した第１実施形態の繊維の集合体を製造することができる。
（第１実施形態）
第１実施形態の繊維の集合体の製造方法は、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを接触させることを含む、製造方法である。本実施形態の製造方法により、上述した第１実施形態の繊維の集合体を製造することができる。
図６を用いて、第１実施形態の繊維の集合体の製造方法を説明する。第１の一本鎖核酸断片６１１が結合した第１の繊維６１０と、第２の一本鎖核酸断片６２１が結合した第２の繊維６２０と、第１の一本鎖核酸断片６１１に相補的な領域及び第２の一本鎖核酸断片６２０に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片６３０とを接触させることにより、
第１の一本鎖核酸断片、第２の一本鎖核酸断片、第３の一本鎖核酸断片がそれぞれハイブリダイズする。その結果、第１の繊維６１０及び第２の繊維６２０が架橋され、繊維の集合体を製造することができる。
（第２実施形態）
第２実施形態の繊維の集合体の製造方法は、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維とを、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズする条件下で接触させることを含み、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記ハイブリダイズする条件が、前記アゾベンゼン基をトランス型にする条件である、製造方法である。本実施形態の製造方法により、上述した第２実施形態の繊維の集合体を製造することができる。
第２実施形態の繊維の集合体の製造方法は、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維とを、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズする条件下で接触させることを含み、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記ハイブリダイズする条件が、前記アゾベンゼン基をトランス型にする条件である、製造方法である。本実施形態の製造方法により、上述した第２実施形態の繊維の集合体を製造することができる。
図１８に示すように、第２実施形態の製造方法では、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片に導入されたアゾベンゼン基をトランス型にすることにより、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片をハイブリダイズさせる。その結果、第１の繊維及び第２の繊維が架橋され、繊維の集合体を製造することができる。
［繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法］
（第１実施形態）
第１実施形態の方法は、繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、前記第３の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第４の一本鎖核酸断片を接触させることを含む方法である。
（第１実施形態）
第１実施形態の方法は、繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、前記第３の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第４の一本鎖核酸断片を接触させることを含む方法である。
第１実施形態の方法は、上述した第１実施形態の繊維の集合体を解離させる方法である。図６を用いて、第１実施形態の方法を説明する。上述したように、第１実施形態の繊維の集合体６００は、第１の一本鎖核酸断片６１１が結合された第１の繊維６１０と、第２の一本鎖核酸断片６２１が結合された第２の繊維６２０と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含む。
第１実施形態の繊維の集合体６００に、第３の一本鎖核酸断片６３０に相補的な領域を有する第４の一本鎖核酸断片６４０を接触させると、第４の一本鎖核酸断片６４０が、第１の一本鎖核酸断片６１１及び第２の一本鎖核酸断片６２１と鎖交換反応を行い、第３の一本鎖核酸断片６３０とハイブリダイズする。その結果、第１の繊維６１０と、第２の繊維６２０が解離する。
（第２実施形態）
第２実施形態の方法は、繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維とを含み、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記アゾベンゼン基はトランス型であり、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズすることにより、前記繊維が集合したものであり、前記繊維の集合体に紫外線を照射し、前記アゾベンゼン基をシス型に変換させることにより、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片を解離させることを含む方法である。
第２実施形態の方法は、繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維とを含み、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記アゾベンゼン基はトランス型であり、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズすることにより、前記繊維が集合したものであり、前記繊維の集合体に紫外線を照射し、前記アゾベンゼン基をシス型に変換させることにより、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片を解離させることを含む方法である。
第２実施形態の方法は、上述した第２実施形態の繊維の集合体を解離させる方法である。上述したように、第２実施形態の繊維の集合体は、前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含んでいる。そして、第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合している。そして、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記アゾベンゼン基はトランス型であり、第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズすることにより、第１の繊維及び第２の繊維が架橋されている。
図１８に示すように、第２実施形態の方法では、上述した第２実施形態の繊維の集合体のアゾベンゼン基をシス型に変換させることにより、ハイブリダイズしていた第１の一本鎖核酸断片及び第２の一本鎖核酸断片を解離させる。その結果、第１の繊維及び第２の繊維を解離させることができる。
アゾベンゼン基をシス型に変換させる方法としては、紫外線（ＵＶ）を照射することが挙げられる。
［繊維の集合体を移動させる方法］
１実施形態において、本発明は、繊維の集合体を移動させる方法を提供する。本実施形態の方法は、モータータンパク質で表面が被覆された基材上で、前記繊維の集合体と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とを接触させることを含む方法である。本実施形態の方法において、繊維の集合体は、上述した第１実施形態の繊維の集合体であってもよいし、上述した第２実施形態の繊維の集合体であってもよい。
１実施形態において、本発明は、繊維の集合体を移動させる方法を提供する。本実施形態の方法は、モータータンパク質で表面が被覆された基材上で、前記繊維の集合体と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とを接触させることを含む方法である。本実施形態の方法において、繊維の集合体は、上述した第１実施形態の繊維の集合体であってもよいし、上述した第２実施形態の繊維の集合体であってもよい。
本実施形態の方法において、前記繊維が微小管であり、前記モータータンパク質がキネシン又はダイニンであってもよい。
ここで、微小管はグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）の存在下でチューブリンを重合したものであってもよい。ＧＴＰの存在下で重合して得られた微小管は軟質微小管であり、剛性が低い微小管である。実施例において後述するように、本実施形態の方法により軟質微小管の集合体を移動させた場合、弧を描くように移動する。
あるいは、微小管は、少なくとも一部がグアノシン－５’－［α，β－メチレン］三リン酸（ＧＭＰＣＰＰ）の存在下でチューブリンを重合したものであってもよい。ＧＭＰＣＰＰの存在下で重合して得られた微小管は硬質微小管であり、剛性が高い微小管である。実施例において後述するように、本実施形態の方法により硬質微小管の集合体を移動させた場合、直線的に移動する。
また、本実施形態の方法において、前記繊維がアクチン繊維であり、前記モータータンパク質がミオシンであってもよい。
［人工筋肉］
１実施形態において、本発明は、複数の微小管と、前記複数の微小管を架橋する、キネシン又はダイニンの多量体と、を備える、人工筋肉を提供する。
１実施形態において、本発明は、複数の微小管と、前記複数の微小管を架橋する、キネシン又はダイニンの多量体と、を備える、人工筋肉を提供する。
本実施形態の人工筋肉において、キネシン又はダイニンの多量体は、ビオチン化キネシン又はビオチン化ダイニンと、アビジンとの複合体であってもよい。
本実施形態の人工筋肉において、前記複数の微小管は、第１の微小管及び第２の微小管を含み、前記第１の微小管には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の微小管には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の微小管及び前記第２の微小管が架橋されていてもよい。すなわち、本実施形態の人工筋肉において、複数の微小管は、上述した第１実施形態の繊維の集合体であってもよい。
あるいは、本実施形態の人工筋肉において、前記複数の微小管は、第１の微小管及び第２の微小管を含み、前記第１の微小管には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第２の微小管には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片には、アゾベンゼン基が導入されており、前記アゾベンゼン基はトランス型であり、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片がハイブリダイズすることにより、前記第１の微小管及び前記第２の微小管が架橋されていてもよい。すなわち、本実施形態の人工筋肉において、複数の微小管は、上述した第２実施形態の繊維の集合体であってもよい。
本実施形態の人工筋肉にＡＴＰを接触させることにより、人工筋肉を収縮させることができる。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（チューブリンの調製）
チューブリンはブタの脳から精製した。精製にはＰＩＰＥＳバッファー（１Ｍ ＰＩＰＥＳ、２０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いた。精製後のチューブリンはＢＲＢ８０バッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．８）中で保存した。
（チューブリンの調製）
チューブリンはブタの脳から精製した。精製にはＰＩＰＥＳバッファー（１Ｍ ＰＩＰＥＳ、２０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いた。精製後のチューブリンはＢＲＢ８０バッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．８）中で保存した。
続いて、Ｎ３－ＰＥＧ４－ＮＨＳを用いてアジド化チューブリンを調製した。チューブリン濃度はＵＶスペクトロメーター（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ｃ）を用いて２８０ｎｍの吸光を測定することにより測定した。
（キネシンの調製）
ヒトキネシン－１の第１～５７３番目のアミノ酸のＮ末端側に、Ｈｉｓ×６タグ、トロンビン切断部位、Ｓエピトープタグ、ＤＤＤＤＫタグをこの順に連結した組換えキネシン－１を調製した。調製した組換えキネシン－１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
ヒトキネシン－１の第１～５７３番目のアミノ酸のＮ末端側に、Ｈｉｓ×６タグ、トロンビン切断部位、Ｓエピトープタグ、ＤＤＤＤＫタグをこの順に連結した組換えキネシン－１を調製した。調製した組換えキネシン－１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
（ＤＮＡ断片の設計）
レセプターＤＮＡ（ｒ－ＤＮＡ）、リンカーＤＮＡ（ｌ－ＤＮＡ）及び解離ＤＮＡ（ｄ－ＤＮＡ）の塩基配列を設計した。設計は融解温度（Ｔｍ）のシミュレーションに基づいて行った。Ｔｍのシミュレーションは、ソフトウエア（「ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１」、https://sg.idtdna.com/calc/analyzer）を用いて行った。Ｔｍの範囲を０～５０℃に設定してシミュレーションを行った。論理ゲート実験用のＤＮＡについては、Ｔｍ条件を満たすだけでなく、更にＤＮＡ鎖間で望ましくない相互作用が生じないように塩基配列を設計した。
レセプターＤＮＡ（ｒ－ＤＮＡ）、リンカーＤＮＡ（ｌ－ＤＮＡ）及び解離ＤＮＡ（ｄ－ＤＮＡ）の塩基配列を設計した。設計は融解温度（Ｔｍ）のシミュレーションに基づいて行った。Ｔｍのシミュレーションは、ソフトウエア（「ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１」、https://sg.idtdna.com/calc/analyzer）を用いて行った。Ｔｍの範囲を０～５０℃に設定してシミュレーションを行った。論理ゲート実験用のＤＮＡについては、Ｔｍ条件を満たすだけでなく、更にＤＮＡ鎖間で望ましくない相互作用が生じないように塩基配列を設計した。
図１（ａ）～（ｉ）は設計したＤＮＡの塩基配列及びＴｍを示す図である。図１（ａ）～（ｉ）中、「ＭＴ」は微小管を示す。図１（ａ）は、ｒ－ＤＮＡ１（Ｔ１６、配列番号２）、ｒ－ＤＮＡ２（（ＴＴＧ）５、配列番号３）及びＣＡＡＡ１６（配列番号８）のＴｍを示す図である。図１（ｂ）は、ｒ－ＤＮＡ１（Ｔ１６、配列番号２）、ｒ－ＤＮＡ２（（ＴＴＧ）５、配列番号３）及び（ＣＡＡ）２Ａ１６（配列番号９）のＴｍを示す図である。図１（ｃ）は、ｒ－ＤＮＡ１（Ｔ１６、配列番号２）、ｒ－ＤＮＡ２（（ＴＴＧ）５、配列番号３）及び（ＣＡＡ）３Ａ１６（配列番号１０）のＴｍを示す図である。
図１（ｄ）は、ｒ－ＤＮＡ１（Ｔ１６、配列番号２）、ｒ－ＤＮＡ２（（ＴＴＧ）５、配列番号３）及び（ＣＡＡ）４Ａ１６（配列番号１１）のＴｍを示す図である。図１（ｅ）は、ｒ－ＤＮＡ１（Ｔ１６、配列番号２）、ｒ－ＤＮＡ２（（ＴＴＧ）５、配列番号３）及び（ＣＡＡ）５Ａ１６（配列番号１２）のＴｍを示す図である。図１（ｆ）は、ｌ－ＤＮＡ１（（ＣＡＡ）５Ａ１６、配列番号１３）及びｄ－ＤＮＡ（Ｔ１６（ＧＴＴ）５、配列番号１８）のＴｍを示す図である。ｄ－ＤＮＡはＤＮＡ鎖置換反応に使用したＤＮＡである。
図１（ｇ）は、ｒ－ＤＮＡ１（Ｔ１６、配列番号２）、ｒ－ＤＮＡ２（（ＴＴＧ）５、配列番号３）、ｌ－ＤＮＡ２（ＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡ１６、配列番号１４）及びｌ－ＤＮＡ３（ＣＴＧＣＡＣＧＡＧＴ（ＣＡＡ）５、配列番号１５）のＴｍを示す図である。これらのＤＮＡはＡＮＤゲートの演算に使用した。
図１（ｈ）は、ｒ－ＤＮＡ３（（ＴＴＣ）５、配列番号４）、ｒ－ＤＮＡ４（（ＴＡＧ）５、配列番号５）及びｌ－ＤＮＡ４（（ＣＴＡ）５（ＧＡＡ）５、配列番号１６）のＴｍを示す図である。これらのＤＮＡは図１（ｅ）に示すＤＮＡと共にＯＲゲートの演算に使用した。
図１（ｉ）は、ｒ－ＤＮＡ５（ＧＣＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＡＣＣＡ、配列番号６）、ｒ－ＤＮＡ６（ＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＧＴＴＡ、配列番号７）及びｌ－ＤＮＡ５（ＴＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＧＣＴＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＧ、配列番号１７）のＴｍを示す図である。これらのＤＮＡは緑色蛍光で標識した硬質微小管に使用し、赤色蛍光で標識した軟質微小管に使用した、図１（ｅ）に示すＤＮＡと共に、論理ゲートの演算に使用した。
ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）及び蛍光色素で標識されたＤＮＡは、ＣＰＧカラム及びホスホアミダイト（グレンリサーチ社）を用いた化学合成により合成した。化学合成にはＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ３９００）を用いた。化学合成したＤＮＡは、逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（ブルカーマイクロフレックスＬＲＦ）により構造確認した。
ｒ－ＤＮＡは３’末端を５（６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）又は５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識した。また、５’末端をＤＢＣＯで標識した。光応答性ＤＮＡ（ｐ－ＤＮＡ）は研究室内で合成した。具体的には、アゾベンゼン基を導入したＤ－トレオニノールのホスホロアミダイト体を用いて、ＤＮＡ合成機（製品名「ＡＢＩ ３４００ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」、アプライドバイオシステムズ社）でｐ－ＤＮＡを合成した。続いて、合成したｐ－ＤＮＡをＰｏｌｙ－Ｐａｋ ｃａｒｔｒｉｇｅ（グレンリサーチ社）及び逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで配列確認を行った。また、ｌ－ＤＮＡ及びｄ－ＤＮＡは、ユーロフィンジェノミクス株式会社より購入した。
（微小管の調製）
微小管は、ポリメライゼーションバッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ポリメライゼーション試薬、ｐＨ６．８）にアジド化チューブリンを終濃度５６μＭとなるように添加し、３７℃で３０分インキュベートすることにより調製した。
微小管は、ポリメライゼーションバッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ポリメライゼーション試薬、ｐＨ６．８）にアジド化チューブリンを終濃度５６μＭとなるように添加し、３７℃で３０分インキュベートすることにより調製した。
軟質微小管を調製する場合には、ポリメライゼーション試薬として、グアノシン三リン酸（グアノシン－５’－三リン酸、ＧＴＰ）を使用した。硬質微小管を調製する場合には、ポリメライゼーション試薬として、グアノシン－５’－［α，β－メチレン］三リン酸（ＧＭＰＣＰＰ）を使用した。ＧＭＰＣＰＰはＧＴＰよりもゆっくりと加水分解されるＧＴＰのアナログである。軟質微小管を調製する場合には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を終濃度５％となるように添加した。
３．５μＬのＤＢＣＯ修飾されたｒ－ＤＮＡ（５００μＭ）を５μＬのアジド化微小管（５６μＭ）に添加することにより、銅を含まないクリック反応を開始し、３７℃で６時間インキュベートしてアジド－アルキン付加環化反応を進行させた。
続いて、１００μＬのクッションバッファー（ＢＲＢ８０バッファーに６０％グリセロールを添加したもの）を用い、２０１，０００×ｇ（Ｓ５５Ａ２－０１５６ローター、工機ホールディングス社製）で１時間、３７℃で遠心分離することにより微小管を沈殿させた。上清を除いた後、ｒ－ＤＮＡが結合した微小管を、１００μＬのＢＲＢ８０Ｐバッファー（ＢＲＢ８０バッファーに１ｍＭタキソールを添加したもの）で１回洗浄し、１５μＬのＢＲＢ８０Ｐバッファーに懸濁した。ｐ－ＤＮＡが結合した微小管も同様の手順により調製した。
（微小管の集合体の形成）
２枚のカバーガラス（マツナミ社製）を用いて、９×２．５×０．４５ｍｍ３（長さ×幅×高さ）のフローセルを組み立てた。両面テープをスペーサーとして用いた。
２枚のカバーガラス（マツナミ社製）を用いて、９×２．５×０．４５ｍｍ３（長さ×幅×高さ）のフローセルを組み立てた。両面テープをスペーサーとして用いた。
フローセルを５μＬのカゼインバッファー（ＢＲＢ８０バッファーに０．５ｍｇ／ｍＬのカゼインを添加したもの）で満たし、３分間インキュベートした。続いて、フローセルに０．３μＭのキネシン溶液を導入し、５分間インキュベートした。この結果、４，０００分子／μｍ２のキネシン密度でフローセルの表面が被覆された。
続いて、フローセルを５μＬの洗浄バッファー（ＢＲＢ８０バッファーに１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び１０μＭタキソールを添加したもの）で洗浄した後、５μＬの赤色蛍光で標識した微小管（ＴＡＭＲＡ標識したｒ－ＤＮＡが結合した微小管）溶液を導入して２分間インキュベートし、１０μＬの洗浄バッファーで洗浄した。
続いて、５μＬの緑色蛍光で標識した微小管（ＦＡＭ標識したｒ－ＤＮＡが結合した微小管）溶液を導入して２分間インキュベートし、１０μＬのモーティリティーバッファー（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍＬカゼイン、４．５ｍｇ／ｍＬグルコース、５０Ｕ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、５０Ｕ／ｍＬカタラーゼ、１０μＭタキソール、０．２％メチルセルロース、５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭトロロックス）で洗浄した。緑色蛍光で標識した微小管は、フローセルに導入する前に室温で１５分間、ｌ－ＤＮＡと混合してインキュベートした。
微小管の運動は５μＬのＡＴＰバッファー（洗浄バッファーに５ｍＭ ＡＴＰ、４．５ｍｇ／ｍＬ Ｄ－グルコース、５０Ｕ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、５０Ｕ／ｍＬカタラーゼ及び０．２％（ｗ／ｖ）メチルセルロースを添加したもの）を添加することにより開始させた。ＡＴＰを添加した時刻を０時間とした。
ＡＴＰバッファーの添加の直後にフローセルをイナートチャンバーシステム（ＩＣＳ）中に置き、顕微鏡を用いて室温で微小管を観察した。実験は、各条件それぞれについて少なくとも１０分間行った。
（蛍光顕微鏡観察）
試料は１００Ｗの水銀ランプで照らし、油浸対物レンズ（「Ｐｌａｎ Ａｐｏ ６０× Ｎ．Ａ．１．４」、ニコン）を用いて落射蛍光顕微鏡（「Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ」、ニコン）で観察した。
試料は１００Ｗの水銀ランプで照らし、油浸対物レンズ（「Ｐｌａｎ Ａｐｏ ６０× Ｎ．Ａ．１．４」、ニコン）を用いて落射蛍光顕微鏡（「Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ」、ニコン）で観察した。
ＵＶカットオフフィルターブロック（ＴＲＩＴＣ：ＥＸ５４０／２５、ＤＭ５６５、ＢＡ６０５／５５、ＧＦＰ－Ｂ：ＥＸ４６０－５００、ＤＭ５０５、ＢＡ５１０－５６０、ニコン）を顕微鏡の光路中で使用した。コンピュータに接続された冷却ＣＭＯＳカメラ（「ＮＥＯ ｓＣＭＯＳ」、アンドール社）を用いて画像を撮影した。
試料の光退色を減らすために、２つのＮＤフィルター（ＮＤ４：ＴＲＩＴＣに対して２５％の透過率、及び、ＮＤ１：ＧＦＰ－Ｂに対して１００％の透過率）を蛍光顕微鏡の照明光路に挿入した。
アゾベンゼン単位を異性化する場合には、ＵＶ－１Ａフィルターブロック（ＵＶ－１Ａ：ＥＸ３６５－４１０、ＤＭ４００、ＢＡ４００、ニコン）を通過した光をフローセルに照射した。
［実験例１］
（ＤＮＡを結合した微小管の移動）
銅を含まないクリック反応により、チューブリン二量体あたり１個の一本鎖ＤＮＡの割合で、微小管を一本鎖ＤＮＡと結合させた。蛍光顕微鏡による微小管の観察を可能にするために、ＤＮＡ又は微小管のいずれかを蛍光色素で標識した。
（ＤＮＡを結合した微小管の移動）
銅を含まないクリック反応により、チューブリン二量体あたり１個の一本鎖ＤＮＡの割合で、微小管を一本鎖ＤＮＡと結合させた。蛍光顕微鏡による微小管の観察を可能にするために、ＤＮＡ又は微小管のいずれかを蛍光色素で標識した。
図２はｒ－ＤＮＡとアジド化微小管をクリック反応により結合する過程を説明した模式図である。図２中、「ＭＴ」は微小管を示す。融解温度（Ｔｍ）シミュレーションの結果に基づいて、ＤＮＡ鎖中の塩基数を１６に固定して、生体分子モーターシステムの作動温度（２５℃）より高いＴｍとなるようにした。
図３（ａ）はＴＡＭＲＡで標識したｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）と結合した微小管の蛍光顕微鏡写真である。また、図３（ｂ）はＦＡＭで標識したｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）と結合した微小管の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５μｍである。微小管は、外径２５ｎｍ、長さ２～１０μｍの円筒形の物体である。
ＤＮＡを結合した微小管は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の化学エネルギーを用いて基材表面に付着したキネシンによって推進された。図４は、キネシンで表面が被覆された基材上を、赤色蛍光又は緑色蛍光で標識された微小管が滑り運動する様子を示す模式図である。図４中、「Ｒｅｄ－ＭＴ」は赤色蛍光で標識された微小管を示し、「Ｇｒｅｅｎ－ＭＴ」は緑色蛍光で標識された微小管を示す。
図５は、赤色蛍光又は緑色蛍光で標識された硬質微小管の滑り運動を示すタイムラプス画像である。スケールバーは１０μｍを示す。その結果、ＤＮＡを結合した微小管は滑らかに滑り運動することが明らかとなった。この結果は、ＤＮＡの結合が微小管とキネシンとの相互作用を妨げないことを示す。
［実験例２］
（ＤＮＡによる微小管の集合及び解離）
ＴＡＭＲＡ（赤色）で標識したｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）と結合した微小管（以下、「赤色標識微小管」という場合がある。）及びＦＡＭ（緑色）で標識したｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）と結合した微小管（以下、「緑色標識微小管」という場合がある。）を用意した。
（ＤＮＡによる微小管の集合及び解離）
ＴＡＭＲＡ（赤色）で標識したｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）と結合した微小管（以下、「赤色標識微小管」という場合がある。）及びＦＡＭ（緑色）で標識したｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）と結合した微小管（以下、「緑色標識微小管」という場合がある。）を用意した。
続いて、０．３μＭのキネシンをコートした基板上に、同数の赤色標識微小管及び緑色標識微小管を、合計で５０，０００個／ｍｍ２の密度で配置した。その結果、図５に示すように、ＡＴＰの存在下では、各微小管は相互作用することなく移動した。
続いて、リンカーＤＮＡによる微小管の集合及び解離ＤＮＡによる集合した微小管の解離を検討した。リンカーＤＮＡ（ｌ－ＤＮＡ１、配列番号１３）は、これらの微小管を架橋することができるように、ｒ－ＤＮＡと部分的に相補的であるように設計した。図６はｌ－ＤＮＡ１により、赤色標識微小管及び緑色標識微小管を架橋して集合させる様子、及び、ｄ－ＤＮＡ（配列番号１８）による鎖交換反応により、ｌ－ＤＮＡ１を解離させ、集合した赤色標識微小管及び緑色標識微小管を解離させる様子を示す模式図である。図７は、ＤＮＡの塩基対の相互作用による微小管の集合及び解離の様子を説明する模式図である。
図８は、入力シグナルとして０．６μＭのｌ－ＤＮＡ１を導入した後に微小管が集合する様子を示すタイムラプス画像である。スケールバーは２０μｍを示す。図８に示すように、滑り運動している間、赤色標識微小管及び緑色標識微小管は互いに接近し、集合体になって動き続けた。微小管の集合体のサイズは、集合体の合併によって大きくなり、時間の経過とともに集合体の密度が減少した。サイズの増加にもかかわらず、微小管の集合体は、個々の微小管の移動速度（０．６０±０．０５μｍ／秒）に近い速度（０．５１±０．０２μｍ／秒）で直線的に移動した。
異なる時点で微小管の数を数え、初期の微小管の数に対する集合体に組み込まれた微小管の割合を計算することによって、微小管の集合割合を算出した。図９は集合割合（％）の推移を示すグラフである。その結果、集合割合は時間とともに増加し、ｌ－ＤＮＡ１の添加後６０分以内にプラトー（９０～９５％）に達することが明らかとなった。
図１０（ａ）～（ｃ）は、微小管の集合におけるキネシン及びＡＴＰの役割を検討した結果を示すタイムラプス画像である。図１０（ａ）は、キネシンの非存在下で、同様の実験を行った結果を示す。その結果、自由に拡散する微小管が非構造化凝集体を形成したが、微小管の集合体は形成されなかった。
図１０（ｂ）は、ＡＴＰの非存在下で同様の実験を行った結果を示す。その結果、ＡＴＰの非存在下では、キネシンコートされた基材上の微小管は動かず、微小管の集合体も形成されなかった。
図１０（ｃ）は、ＡＴＰ（５ｍＭ）の存在下で同様の実験を行った結果を示す。その結果、ＡＴＰ及びキネシンの存在下において、微小管の集合体が形成されることが明らかとなった。
図１０（ａ）～（ｃ）において、赤色標識微小管及び緑色標識微小管はそれぞれ０．６μＭずつ使用した。また、ｌ－ＤＮＡの濃度は０．６μＭであった。また、図１０（ａ）ではキネシンの濃度は０μＭであり、図１０（ｂ）及び（ｃ）では０．３μＭであった。スケールバーは５０μｍを示す。
続いて、０．６μＭの解離ＤＮＡ（ｄ－ＤＮＡ）を導入し、ＤＮＡ鎖交換反応によってｌ－ＤＮＡ１を解離させ、微小管の集合体を解離させた。図１１はｄ－ＤＮＡを導入した後に微小管の集合体が解離する様子を示すタイムラプス画像である。スケールバーは２０μｍを示す。図１１に示すように、ｄ－ＤＮＡの導入により、微小管の集合体が解離することが実証された。微小管の集合体は、ｄ－ＤＮＡの導入後に赤色標識微小管及び緑色標識微小管に解離した。解離後に存在する微小管を数えることによって、微小管の集合体は約１００個の微小管からなると推定された。図９は集合割合（％）の推移を示すグラフである。
［実験例３］
（ＤＮＡに基づく論理ゲート）
分子コンピューティングの演算子としてのＤＮＡの有用性に基づいて、微小管の集合体がＤＮＡ入力によって制御される出力である、従来とは異なる論理演算を実証した。
（ＤＮＡに基づく論理ゲート）
分子コンピューティングの演算子としてのＤＮＡの有用性に基づいて、微小管の集合体がＤＮＡ入力によって制御される出力である、従来とは異なる論理演算を実証した。
図１２は、微小管で構成した論理ゲートの設計及び実証結果を示す表である。赤色標識微小管及び緑色標識微小管の濃度は０．６μＭであり、キネシンの濃度は０．３μＭであり、ｌ－ＤＮＡの濃度は０．６μＭであった。図１２中、スケールバーは２０μｍを示す。
図１２に示すように、ＹＥＳ論理ゲートは、入力１としてｌ－ＤＮＡ１（配列番号１３）を使用し、出力１として赤色標識微小管及び緑色標識微小管の集合体を使用することにより実現することができた。
また、ＡＮＤ論理ゲートは、２つの異なるリンカーＤＮＡシグナルとして、ｌ－ＤＮＡ２（配列番号１４）及びｌ－ＤＮＡ３（配列番号１５）を使用することにより実現することができた。ｌ－ＤＮＡ２（配列番号１４）は部分的にｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）に相補的であり、ｌ－ＤＮＡ３（配列番号１５）は部分的にｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）に相補的であり、ｌ－ＤＮＡ２（配列番号１４）及びｌ－ＤＮＡ３（配列番号１５）も互いに部分的に相補的である。ＡＮＤ論理ゲートでは、微小管を集合させるために、ｌ－ＤＮＡ２（配列番号１４）及びｌ－ＤＮＡ３（配列番号１５）の双方が必要であった。
また、ＯＲ論理ゲートは、ｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）及びｒ－ＤＮＡ３（配列番号４）をＴＡＭＲＡで標識して微小管に結合させたものと、ｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）及びｒ－ＤＮＡ４（配列番号５）をＦＡＭで標識して微小管に結合させたものを使用し、ｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）及びｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）に相補的なｌ－ＤＮＡ１（配列番号１３）、並びに、ｒ－ＤＮＡ３（配列番号４）及びｒ－ＤＮＡ４（配列番号５）に相補的なｌ－ＤＮＡ４（配列番号１６）を２つの入力シグナルとして使用することにより実現することができた。ＯＲ論理ゲートでは、ｌ－ＤＮＡ１（配列番号１３）及びｌ－ＤＮＡ４（配列番号１６）のいずれかが存在すれば微小管を集合させることができた。
図１２に示すように、１を表す出力が期待される全ての演算で８５～１００％の集合割合が得られた。また、０を表す出力が期待される全ての演算で＜５％の集合割合が得られた。これらの集合割合には有意な差が認められた。
［実験例４］
（微小管の集合体のモード）
ＧＭＰＣＰＰで微小管を重合することにより硬質微小管（高い剛性の微小管）を調製した。また、ＧＭＰＣＰＰの代わりにＧＴＰで微小管を重合することにより軟質微小管（低い剛性の微小管）を調製した。続いて、硬質微小管及び軟質微小管をキネシン被覆基材上で滑り運動させた。
（微小管の集合体のモード）
ＧＭＰＣＰＰで微小管を重合することにより硬質微小管（高い剛性の微小管）を調製した。また、ＧＭＰＣＰＰの代わりにＧＴＰで微小管を重合することにより軟質微小管（低い剛性の微小管）を調製した。続いて、硬質微小管及び軟質微小管をキネシン被覆基材上で滑り運動させた。
図１３（ａ）は硬質微小管をキネシン被覆基材上で滑り運動させた結果を示す蛍光顕微鏡写真及び模式図である。スケールバーは２０μｍである。また、図１３（ｂ）は、軟質微小管をキネシン被覆基材上で滑り運動させた結果を示す蛍光顕微鏡写真及び模式図である。スケールバーは２０μｍである。その結果、硬質微小管は直線的に移動するのに対し、軟質微小管は、硬質微小管と比較してより湾曲した経路で動くことが明らかとなった。軟質微小管の経路持続長は２４５±３２μｍであり、硬質微小管の経路持続長は５８２±９７μｍであった。この結果は、剛性の差の２倍以上の差を反映していた。
図１４は、軟質微小管をｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）及びｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）と結合させてキネシン被覆基材上で滑り運動させ、０．６μＭのｌ－ＤＮＡ１を加えた様子を示すタイムラプス画像である。スケールバーは２０μｍである。その結果、微小管の集合体が環を形成して円運動を行うことが明らかとなった。
図１５は、円運動を行っている微小管の集合体に０．６μＭのｄ－ＤＮＡを加えた様子を示すタイムラプス画像である。スケールバーは２０μｍである。その結果、微小管の集合体が解離した。１つの集合体は３００個程度の微小管から形成されていた。また、解離した単一の微小管は、キネシン被覆基材上で滑り運動する機能を維持していた。
［実験例５］
（微小管の集合体の直交制御）
ＤＮＡの選択的なハイブリダイゼーション特性により、軟質微小管及び硬質微小管の集合をクロストークすることなく制御する検討を行った。長さ及び剛性が異なる２種類の微小管を２つの異なるＤＮＡ論理ゲートと共役させた。
（微小管の集合体の直交制御）
ＤＮＡの選択的なハイブリダイゼーション特性により、軟質微小管及び硬質微小管の集合をクロストークすることなく制御する検討を行った。長さ及び剛性が異なる２種類の微小管を２つの異なるＤＮＡ論理ゲートと共役させた。
軟質微小管をｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）及びｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）と結合させた。また、硬質微小管をｒ－ＤＮＡ５（配列番号６）及びｒ－ＤＮＡ６（配列番号７）と結合させた。
図１６（ａ）は、剛性が異なる微小管の模式図及び蛍光顕微鏡写真である。図１６（ｂ）に示すように、ｌ－ＤＮＡ１（配列番号１３）を入力すると、軟質微小管はｒ－ＤＮＡ１（配列番号２）及びｒ－ＤＮＡ２（配列番号３）とのハイブリダイゼーションによって環状の集合体が形成された。
また、図１６（ｃ）に示すように、ｌ－ＤＮＡ５（配列番号１７）を入力すると、硬質微小管がｒ－ＤＮＡ５（配列番号６）及びｒ－ＤＮＡ６（配列番号７）とのハイブリダイゼーションによって直線的に運動した。
また、図１６（ｄ）に示すように、ｌ－ＤＮＡ１（配列番号１３）及びｌ－ＤＮＡ５（配列番号１７）の双方を入力すると、直線的な運動と管状の運動の双方が同時に形成された。
図１６（ｂ）～（ｄ）中、軟質微小管及び硬質微小管の濃度はそれぞれ０．６μＭであり、キネシンの濃度は０．３μＭであり、それぞれのｌ－ＤＮＡの濃度は０．６μＭであった。スケールバーは２０μｍを示す。
［実験例６］
（光による微小管の集合の制御）
ＤＮＡ入力を変える可逆的で非侵襲的な迅速な方法を得るために、発明者らは、光応答性ＤＮＡ（ｐ－ＤＮＡ）を組み込むことを検討した。
（光による微小管の集合の制御）
ＤＮＡ入力を変える可逆的で非侵襲的な迅速な方法を得るために、発明者らは、光応答性ＤＮＡ（ｐ－ＤＮＡ）を組み込むことを検討した。
具体的には、光応答性分子であるアゾベンゼンを２つのＤＮＡ鎖に導入した。これにより、２つのＤＮＡ鎖間におけるハイブリダイゼーションのオン／オフ切り替えを行うことが可能になる。切り替えは、紫外線（ＵＶ）又は可視光の照射によるアゾベンゼン部分のシス－トランス異性化によって引き起こされるＤＮＡハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）変化から生じる。
図１７は、２つの光応答性ＤＮＡのアゾベンゼン部分のシス－トランス異性化によって、ＤＮＡハイブリダイゼーションのオン／オフが可逆的に切り替えられる様子を説明する模式図である。また、図１８は、ｐ－ＤＮＡを結合した微小管がＵＶ又は可視光の照射により集合体の形成及び解離を示す様子を説明する模式図である。
光応答性ＤＮＡであるｐ－ＤＮＡ１（配列番号１９）及びｐ－ＤＮＡ２（配列番号２０）を、シス状態ではＴｍが＜２０℃となり、トランス状態では６０℃となるように設計した。続いて、ｐ－ＤＮＡ１（配列番号１９）及びｐ－ＤＮＡ２（配列番号２０）を、すでにＴＡＭＲＡ及びＦＡＭで蛍光標識した微小管にそれぞれ結合させた（以下、「赤色標識微小管」及び「緑色標識微小管」という場合がある。）。また、ｐ－ＤＮＡを結合した微小管が、運動性を喪失することなくキネシン被覆基材上を移動することを確認した。
図１９は、赤色標識微小管及び緑色標識微小管に、ＵＶ又は可視光を照射した様子を示す蛍光顕微鏡写真である。微小管の濃度は赤色標識微小管及び緑色標識微小管それぞれ０．６μＭであり、キネシンの濃度は０．８μＭであった。スケールバーは２０μｍを示す。
まず、微小管にＵＶ照射（波長３６５ｎｍ）を照射してアゾベンゼン基をシス型に初期化した。続いて、微小管に可視光（波長４８０ｎｍ）を照射したところ、アゾベンゼンのシス型からトランス型への異性化が引き起こされ、ｐ－ＤＮＡ１とｐ－ＤＮＡ２のハイブリダイゼーションが可能になり、微小管の集合体が形成された。続いて、微小管にＵＶを照射すると、微小管の集合体が個々の微小管に解離した。
図１９には、光スイッチによる集合及び解離を３サイクル繰り返した様子を示す。図１９に示すように、硬質微小管を用いると光応答性微小管の集合体のモードが直線的な運動になり、軟質微小管を用いると、光応答性微小管の集合体のモードが円運動になった。
このように、ＤＮＡに光応答性部分を導入することにより、光により微小管の集合を反復的かつ可逆的に切り替えることができることが明らかとなった。
本発明によれば、繊維の集合を制御する新たな技術を提供することができる。
６００…繊維の集合体、６１０…第１の繊維、６２０…第２の繊維、６１１…第１の一本鎖核酸断片（レセプターＤＮＡ、ｒ－ＤＮＡ）、６２１…第２の一本鎖核酸断片（レセプターＤＮＡ、ｒ－ＤＮＡ）、６３０…第３の一本鎖核酸断片（リンカーＤＮＡ、ｌ－ＤＮＡ）、６４０…解離ＤＮＡ（ｄ－ＤＮＡ）。
Claims (11)
- 複数の繊維と、
前記複数の繊維を架橋する核酸断片と、
を備え、前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、
前記繊維が第１の繊維及び第２の繊維を含み、
前記第１の繊維には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、
前記第２の繊維には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、
前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の繊維及び前記第２の繊維が架橋されている、繊維の集合体。 - 繊維の集合体の製造方法であって、
前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、
第１の一本鎖核酸断片が結合した第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合した第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを接触させることを含む、製造方法。 - 繊維の集合体を単一の繊維に解離させる方法であって、
前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、
前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、
前記第３の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第４の一本鎖核酸断片を接触させることを含む、方法。 - 繊維の集合体を移動させる方法であって、
前記繊維が微小管又はアクチン繊維であり、
前記繊維の集合体は、第１の一本鎖核酸断片が結合された第１の繊維と、第２の一本鎖核酸断片が結合された第２の繊維と、前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片とを含むものであり、
モータータンパク質で表面が被覆された基材上で、前記繊維の集合体と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とを接触させること、を含む、方法。 - 前記繊維が微小管であり、前記モータータンパク質がキネシン又はダイニンである、請求項４に記載の方法。
- 前記微小管はグアノシン－５’－三リン酸（ＧＴＰ）の存在下で重合されており、前記繊維の集合体は弧を描くように移動する、請求項５に記載の方法。
- 前記微小管の少なくとも一部はグアノシン－５’－［α，β－メチレン］三リン酸（ＧＭＰＣＰＰ）の存在下で重合されており、前記繊維の集合体は直線的に移動する、請求項５又は６に記載の方法。
- 前記繊維がアクチン繊維であり、前記モータータンパク質がミオシンである、請求項４に記載の方法。
- 複数の微小管と、
前記複数の微小管を架橋する、キネシン又はダイニンの多量体と、
を備え、
前記複数の微小管が第１の微小管及び第２の微小管を含み、
前記第１の微小管には第１の一本鎖核酸断片が結合しており、
前記第２の微小管には第２の一本鎖核酸断片が結合しており、
前記第１の一本鎖核酸断片に相補的な領域及び前記第２の一本鎖核酸断片に相補的な領域を有する第３の一本鎖核酸断片が、前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片とハイブリダイズすることにより、前記第１の微小管及び前記第２の微小管が架橋されている、人工筋肉。 - 前記キネシン又は前記ダイニンの多量体は、ビオチン化キネシン又はビオチン化ダイニンと、アビジンとの複合体である、請求項９に記載の人工筋肉。
- 請求項９又は１０に記載の人工筋肉にＡＴＰを接触させることを含む、前記人工筋肉の収縮方法。
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