JP7284213B2 - 細胞分裂遺伝子座を用いて細胞の増殖を制御するためのツール及び方法 - Google Patents
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Description
本願は、パリ条約に基づき、2015年3月9日に出願された米国仮特許出願第62/130,258号明細書、及び2015年3月9日に出願された米国仮特許出願第62/130,270号明細書に対する優先権を主張するものであり、これら文献の各々は、記載されているのと同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本明細書で使用する用語「1つの細胞分裂遺伝子座」、「複数の細胞分裂遺伝子座」及び「CDL」は、ゲノム遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現されるゲノム遺伝子座を指す。CDLが単一遺伝子座を含むとき、細胞(又はその誘導体)におけるCDL発現の非存在は、細胞がCDL発現の非存在下でアブレートされるか、又は細胞の増殖がCDL発現の非存在下で阻止若しくは障害されるかのいずれかであるため、腫瘍開始及び/又は形成が妨げられることを意味する。CDLが複数の遺伝子座を含む場合、細胞(又はその誘導体)における遺伝子座の全部又はサブセットによる発現の非存在は、細胞がCDL発現の非存在下でアブレートされるか、又は細胞の増殖がCDL発現の非存在下で阻止若しくは障害されるかのいずれかであるため、腫瘍開始及び/又は形成が妨げられることを意味する。CDLは、非分裂及び/又は非増殖細胞において発現されても、発現されなくてもよい。CDLは、宿主細胞に対して内在性であってもよく、又はトランスジーンであってもよい。CDLがトランスジーンである場合、これは、宿主細胞と同じ若しくは異なる種に由来するものでもよく、又は合成起源のものでもよい。一実施形態では、CDLは、細胞分裂中に転写される単一遺伝子座である。例えば、一実施形態では、単一遺伝子座CDLは、CDK1である。一実施形態では、CDLは、細胞分裂中に転写される2つ以上の遺伝子座を含む。例えば、一実施形態では、多遺伝子座CDLは、2つのMYC遺伝子(c-Myc及びN-myc)を含む(Scognamiglio et al.,2016)。一実施形態では、多遺伝子座CDLは、AURORA B及びCキナーゼを含み、これらは重複する機能を有し得る(Fernandez-Miranda et al.,2011)。細胞分裂及び細胞増殖は、本明細書では置き換え可能に使用され得る用語である。
本明細書に記載するように、本発明者らは、動物細胞における1つ又は複数の細胞分裂遺伝子座(CDL)を用いて遺伝子修飾細胞を作製するための分子ツール、方法及びキットを提供しており、こうした細胞において、細胞分裂及び/又は増殖は、ユーザにより1つ又は複数のiNEPを介して制御することができる(図1A)。例えば、本明細書に記載する1つ又は複数のツール及び/又は方法を用いて作製された細胞の分裂は、細胞の分裂速度が腫瘍形成に寄与するほど十分早くならないように、ユーザによって停止、阻止若しくは阻害することができる。例えば、本明細書に記載する1つ又は複数のツール及び/若しくは方法を用いて作製された細胞の増殖は、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷又は停止することにより、ユーザによって停止、阻止若しくは阻害することができ、これにより、細胞増殖速度又は量は、それぞれユーザが所望する速度又はサイズで維持され得る。
本明細書に記載するシステム、方法及び組成物は、例えば、表2に示すCDLなどの1つ又は複数のCDLの同定に基づく。本明細書では、本明細書に記載する方法を用いて様々なCDLをターゲティングすることができると考えられる。
一態様では、本開示は、CDLの発現を、陰性選択マーカをコードするDNA配列の発現と連結することにより、結果的にCDLと陰性選択マーカを発現する有糸分裂活性細胞の薬物誘導性アブレーションを可能にするための分子ツール、方法及びキットを提供する。増殖細胞のアブレーションは、例えば、細胞増殖が制御不良であり、及び/又は細胞の正常分裂速度に対して加速している(例えば、癌細胞により呈示される制御不良の細胞分裂)場合に望ましいであろう。増幅細胞のアブレーションは、陰性選択マーカをコードするDNA配列の発現をCDLの発現と連結することにより、結果としてCDL遺伝子座を発現するALINK修飾増幅細胞の排除又は十分な阻害(腫瘍形成に寄与するには低すぎる速度までの細胞増殖速度の阻害である十分な阻害)を可能にする、本明細書で「アブレーションリンク」(ALINK)と呼ばれる細胞に対する遺伝子修飾により達成することができる。陰性選択系のプロドラッグ又は他の誘導物質の存在下で陰性選択マーカを発現する細胞は、選択マーカの作用機構に応じて増殖を停止するか、又は死滅するであろう。細胞は、同型接合性、異型接合性、半接合性又は化合物異型接合性ALINKを含むように修飾してよい。一実施形態では、アブレーションの忠実性を向上させるために、CDLの全ての機能性対立遺伝子に陰性選択マーカを導入してもよい。1つの好ましい実施形態では、CDLの全ての機能性対立遺伝子に陰性選択マーカを導入してもよい。
一態様では、本開示は、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系などのEARCとCDLとを作動可能に連結することにより、CDLを外因的に制御するための分子ツール、方法及びキットを提供する。これらの条件下では、CDLは、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の存在下でのみ発現され、その存在下でのみ細胞は分裂することができる。これらの条件下で、EARC修飾細胞は、誘導物質が存在しなければ、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の作用機構及びCDL機能に応じて分裂を停止するか、大幅に減速するか、又は死滅する。細胞は、同型接合性若しくは化合物異型接合性EARCを含むように修飾してもよく、又はEARC修飾対立遺伝子のみが機能性CDLを産生することができるように改変してもよい。一実施形態では、例えば、細胞分裂制御のための機構を提供するために、EARC修飾をCDLの全ての対立遺伝子に導入してもよい。
一態様では、動物細胞の分裂を制御する方法が本明細書において提供される。
一態様では、細胞分裂及び/又は増殖並びにその集団を制御するための少なくとも1つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞が本明細書において提供される。例えば、哺乳動物細胞は、多能性(例えば、胚性肝細胞若しくはiPS細胞)、複能性、単能性前駆、又は最終分化細胞である、単離されたヒト又は非ヒト細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、多能性、複能性、単能性前駆、又は最終分化細胞に由来するものであってもよい。哺乳動物細胞は、体幹細胞、複能性、単能性前駆、前駆細胞若しくは体細胞、又は体幹細胞、複能性若しくは単能性前駆細胞又は体細胞に由来する細胞であってもよい。好ましくは、動物細胞は、遺伝子修飾を受けやすい。好ましくは、動物細胞は、治療価値を有するとユーザによりみなされ、これは、細胞を用いて、治療を必要とする対象の疾患、障害、欠損又は傷害を治療し得ることを意味する。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞である。
一態様では、CDLの発現を修飾するための様々なDNAベクターが本明細書において提供される。
本開示は、本明細書に開示する方法を実施するためのキットを考慮する。このようなキットは、典型的に、CDL及び/又はCDLを用いて、細胞増殖を制御するのに必要な2つ以上の構成要素を含む。キットの構成要素は、限定はしないが、1つ又は複数の化合物、試薬、容器、装置、並びにキットの使用指示書を含む。従って、本明細書に記載する方法は、本明細書において提供されるプレパッケージキットを使用することにより実施することができる。一実施形態では、キットは、1つ又は複数のDNAベクター及び指示書を含む。一部の実施形態では、指示書は、1つ又は複数のDNAベクターを宿主細胞に導入するための1つ又は複数のプロトコルを含む。一部の実施形態では、キットは、1つ又は複数の対照を含む。
実施例1では、Cdk1/CDK1をターゲティングするALINK(HSV-TK)ベクターの構築、並びに増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することにより、マウス及びヒトES細胞における細胞増殖を制御するためのそのベクターの使用を記載する。この実施例では、Cdk1/CDK1はCDLであり、HSV-TKは陰性選択マーカである。
標的ベクターの作製
マウス標的ベクター1:
マウスCdk1ゲノム遺伝子座を図2Aに示す。図2Bを参照すると、pUC57ベクター(GenScript)での遺伝子合成により、2つのDNA断片:5TK(配列番号1)及び3TK(配列番号2)(SalI-F2A-5’TK.007-PB 5’LTR-NotI-SacII及びSalI-SacII-3’TK.007-PB 3’LTR-3’TK.007-T2A-XhoI-mCherry-NheI)を取得した。断片5TKをSaII+SacIIで消化し、同じ消化で3TKにクローニングしてpUC57-5TK-3TKを作製した。プラスミドpBluescript-M214(配列番号3)をNotI+HindIIIで切断することにより、PGK-ネオマイシンカセットを取得し、これをpUC57-5TK-3TKのNotI+SacII部位に連結して、Cdk1(すなわち、CDL)の3’末端に挿入するためのALINKカセットを作製した。
The Center for Applied Genomics(TCAG)から購入したCdk1のゲノム配列(配列番号4)で、細菌人工染色体(BAC)を含有するDH10B大腸菌(E.coli)細胞株を組み換えることにより、Cdk1DNAコード配列をクローニングした。組換えプロセスは、プラスミドpSC101-BAD-γβα Red/ET(pRET)(GeneBridges,Heidelberg Germany)により媒介した。初めに、pRETをBAC含有DH10B大腸菌(E.coli)に1.8kV、25μF、400オームでエレクトロポレーションした(BioRad GenePulserI/II system,BioRad,ON,CA)後、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン耐性について選択した。ALINK挿入点(Cdk1終止コドンの5’及び3’)にわたる短い相同性アーム(50bp)(それぞれ配列番号5及び6)をPCRにより、カセット、F2A-5’TK-PB-PGKneo-PB-3’TK-T2A-cherryに付加した。このPCR産物を前述の条件下でBac+pRETDH10B大腸菌(E.coli)にエレクトロポレーションした後、カナマイシン耐性について選択した。755bp及び842塩基対(bp)相同性アーム(それぞれ配列番号7及び8)から構成される最終ターゲティングカセットを、プライマー(それぞれ配列番号9及び10)を含むPCRにより回収してpGemT-Easyベクターにクローニングすることにより、マウス標的ベクターIを作製した。ベクターの重要な結合領域をTCAGで配列決定し、確認した。
図2Dを参照すると、F2A-loxP-PGK-neo-pA-loxP-AscI(配列番号11)をpLoxPNeo1ベクターからPCR増幅した後、TAをpDriveベクター(Qiagen)にクローニングした。AscI-TK-T2A-mCherry-EcoRI(配列番号12)を、切除したTC対立遺伝子IからPCR増幅した後、TAをpDriveベクターにクローニングした。次に、後者の断片をBamHI+AscI制限部位により前者のベクターにクローニングした。このF2A-loxP-PGK-neo-pA-loxP-TK-T2A-mCherryカセットを、GeneArt(登録商標)Seamless Cloning and Assembly Kit(Life Technologies)によってマウスCdk1相同性アーム間に挿入した。プルマイシン(puro)バージョンベクターを作製するために、PGK-puro-pA断片(配列番号13)をBamHI+NotIでpNewDockZから切断し、T4平滑化した。ネオバージョンベクターをAscI+ClaIで切断し、T4平滑化した後、PGK-puro-pAと連結した。
マウス標的ベクターIと同様に、ヒトCDK1終止コドン(配列番号14)の上流847bp+F2A-5’TK-PB-PGKneo-PB-3’TK-T2A-cherry(配列番号15)+ヒトCDK1終止コドン(配列番号16)の下流831bpを組換え技術により作製した。選択のためのプロマイシン耐性カセットを含むベクターの別のバージョンを作製して、同型接合性ターゲティングの一度での生成を促進した。AgeI-PGK-puro-pA-FseI(配列番号17)をpNewDockZベクターから増幅し、消化して、AgeI+FseIにより切断されたネオバージョンベクターにクローニングした。
BamHI-F2A-loxP-PGK-neo-pA-loxP-TK-T2A-mCherry(配列番号18)及びBamHI-F2A-loxP-PGK-puro-pA-loxP-TK-T2A-mCherry(配列番号19)を対応するマウス標的ベクターIIから増幅した後、BamHI+SgrAIで消化した。mCherry(3’30bp)-hCDK13’HA-pGemEasy-hCDK15’HA-BamHI(配列番号20)をPCR増幅し、これもBamHI+SgrAIで消化した。ヒト標的ベクターIIのネオ及びプロマイシンバージョンを、相同性アームバックボーンとネオ又はプロマイシンバージョンALINKカセットとの連結によって作製した。
FACSにより、また選択カセットの切除ステップは回避して、蛍光マーカ(mCherry又はeGFP)でターゲティングするために、選択カセットを含まない標的ベクターを作製した。BamHI-F2A-TK-T2A-mCherry-SgrAI(配列番号58)を、切除したTC対立遺伝子IからPCR増幅し、BamHI+SgrAIで消化し、消化されたmCherry(3’30bp)-hCDK13’HA-pGemEasy-hCDK15’HA-BamHI(配列番号20)で連結した。部位指定PCR突然変異誘発プロトコルを用いて、標的ベクター内のCRISPR PAM部位をプライマーPAM_fwd(配列番号59)及びPAM_rev(配列番号60)で突然変異させた。NEBuiler HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New England Biolabs Inc.)を用いて、PCR増幅XhoI-GFP(配列番号61)及びpGemT-hCdk1-TK-PAMmut(配列番号62)の融合により、GFPバージョンベクターを作製した。
高度のターゲティング効率を達成するためにCRISPR/Cas9支援遺伝子ターゲティングを使用した(Cong et al.,2013)。オンラインCRISPR設計ツール(http://crispr.mit.edu)(Hsu et al.,2013)を用いて、CRISPR/Cas9のガイド配列を分析した。
マウスES細胞培養:
15%ウシ胎児血清(Invitrogen)、1mMピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)、0.1mM MEM非必須アミノ酸(Invitrogen)、2mM GluraMAX(Invitrogen)、0.1mM 2-mEARCaproetano-l(Sigma)、各々50U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)及び1000U/mlの白血病阻害因子(LIF)(Chemicon)を添加したダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)(高グロース、4500mg/リットル)(Invitrogen)中でマウスES細胞を培養する。マウスES細胞を0.25%トリプシン及び0.1%EDTAで継代させた。
5×105個のマウスC57BL/6 C2ES細胞(Gertsenstein et al.,2010)をJetPrimeトランスフェクション(Polyplus)により、2ugのDNA(標的ベクター:0.5μg、CRISPRベクター:1.5μg)でトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞をG418及び/又はプロマイシン耐性について選択した。独立に耐性クローンを採取し、96ウェルプレートに移した。凍結及び遺伝子型決定(配列番号27、28、29及び30)のために96ウェルプレートを複製した。PCR陽性クローンを拡大し、複数のバイアルに凍結し、サザンブロッティングにより遺伝子型決定した。
正しくターゲティングしたESクローンをEpisomal-hyPBase(標的ベクターI用)(配列番号34)又はpCAGGs-NLS-Cre-Ires-Puromycin(標的ベクターII用)(配列番号35)でトランスフェクトした。トランスフェクションから2~3日後、細胞をトリプシン処理した後、クローン性に平板培養した(10cmプレート当たり1000~2000細胞)。mCherry陽性クローンを採取し、独立して96ウェルプレートに移した後、PCRにより遺伝子型決定し(配列番号31及び36)、サザンブロットにより切除イベントを確認した。除去領域の結合をPCR増幅し、配列決定して、インタクトで、しかもフレームシフトのないシームレスであることを確認した。
ネオバージョン標的ベクターで既に正しくターゲティングされ、選択カセットから切除されたESクローンを標的ベクターのプロマイシン耐性バージョンで再度トランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、プロマイシンの選択を追加し、次に、前述した通りにコロニーを採取し、分析した(配列番号31及び32)。独立のプロ(puro)-耐性クローンをゼラチン上に増殖させ、PCRのためにDNAを抽出して、野生型対立遺伝子バンド(配列番号31、33)が存在しないことを確認した。
ヒトES細胞培養:
ヒトCA1又はH1(Adewumi et al.,2007)ES細胞を、Geltrex(Life Technologies)フィーダフリー条件でペニシリン-ストレプトマイシン(Life Technologies製Gibco)を含むmTeSR1培地(STEMCELL Technologies)で培養した。TryplE Express(Life Technologies)又は Accutase(STEMCELL Technologies)により細胞を継代させ、最初の24時間にわたり、ROCK阻害物質(STEMCELL Technologies)を含むmTeSR培地上で平板培養した後、mTeSR培地に変えた。完全に密集状態の6ウェルプレートからの細胞の半分を1mlの90%FBS(Life Technologies)+10%DMSO(Sigma)中で凍結させた。
6×106個のCA1hES細胞を24ugのDNA(標的ベクター:pX330-hCdkTK-A=18ug:6ug)でNeonプロトコル14によりトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を4つの10cmプレート上で平板培養した。トランスフェクションから48時間後、G418及び/又はプロマイシン選択を開始し、独立したコロニーを採取して96ウェルプレートに移した。さらなる増殖及び遺伝子型決定(配列番号37、38、39及び40)のために各プレートを2つずつ作製した。PCR陽性クローンを拡大し、複数のバイアルに凍結してサザンブロッティングにより遺伝子型決定した。
ALINK標的ESクローンをhyPBase又はpCAGGs-NLS-Cre-IRES-プロマイシンでトランスフェクトした後、6ウェルプレートで平板培養した。細胞が6ウェルプレート中で密集に達したら、細胞をハンクス平衡塩溶液(HBSS)(Ca2+/Mg2+Free)(25 mM HEPES pH7.0、1%ウシ胎児血清)中に懸濁させ、ASTRIOS EQセルソータ(Beckman Coulter)を用いて、mCherry陽性細胞を選別して96ウェルプレートに移した。
同型接合性ターゲティングは、マウス系と同じ方法、又はmCherry及びeGFPヒト標的ベクターIII及びpX330-hCdkTK-A若しくはpX459-hCdkTK-Aをトランスフェクトした後、mCherry及びeGFP二重陽性細胞のFACSソーティングを実施することによって達成することができる。
Matrigel Matrix High Concentration(Corning)を氷上の低温DMEM培地で1:3希釈した。5~10×106個の細胞を100ulの66%DMEM+33%Matrigel培地に懸濁させた後、B6Nマウス(マウスC2ES細胞の場合)及びNOD-SCIDマウス(ヒトES細胞の場合)の片方若しくは両方の脇腹に皮下注射した。注射の2~4週間後、奇形腫が形成した。奇形腫のサイズをカリパスで測定し、奇形腫体積は、式V=(L×W×H)π/6を用いて算出した。様々な処置時間で、腹腔内への50mg/kgの毎日の注射により、GCV/PBS処置を実施した。処置の終了時にマウスを犠牲にして、腫瘍を切除し、組織学分析のために4%パラホルムアルデヒド中で固定化した。
Cdk1+/+,+/loxp-alinkマウスC2 ES及びCD-1バックグラウンドのキメラを二倍体凝集によって作製した後、B6N WTマウスと交配させ、生殖細胞系伝達によりCdk1+/+,+/loxp-alinkマウスを作製した。Cdk1+/+,+/loxp-alinkマウスをElla-Creマウスと交配させてCdk1+/+,+/alinkマウスを作製した。次に、Cdk1+/+,+/alinkマウスをMMTV-PyMTマウス(Guy et al.,1992)と交配させて、乳腺腫瘍とALINK修飾とを有する二重陽性子ネズミを取得した。フェイルセーフ修飾を有する乳腺腫瘍を単離し、1mm3の切片に切断し、野生型B6N雌の第4乳腺に移植した。GCV/PBS処置剤を腹腔内に1日おきに50mg/kgの用量で様々な処置時間を用いて注射した。乳腺腫瘍サイズをカリパスで測定して、式V=長さ×幅×高さ×π/6を用いて計算した。
Cdk1+/+,+/alinkヒトCA1 ES細胞を神経上皮前駆細胞(NEP)に分化させた。続いて、ニューロンへの分化のための条件下でNEPを培養することにより、非分化ニューロン及び分化NEPの混合培養物を作製し、これらをDAPI、Ki67及びSox2の免疫染色により特性決定した。GCV(10uM)を混合培養物に1日おきに20日間添加した。次に、培養物からGCVを4日かけて回収した後、4%PFAにより細胞を固定化した。残る全ての細胞が細胞周期から脱したかどうかを確認するための増殖マーカKi67、並びに成熟ニューロンマーカβ-TublinIIIについて固定化細胞を免疫染色した。
マウスCdk1ゲノム遺伝子座を図2aに示す。マウスCdk1をターゲティングする2つのベクターを作製したが(図2B及びD)、各々は、最後のエキソンの終止コドンをF2A(Szymczak et al.,2004)配列で置換し、次に、mCherryリポータに結合した増強HSV-TK(TK.007(Preuss et al.,2010))遺伝子をT2A(Szymczak et al.,2004)配列で置換することにより、Cdk1遺伝子(図2A)の3’UTRを修飾するように立体配置されている。
実施例2では、Cdk1をターゲティングするEARC(dox-架橋)ベクターの構築及びマウスES細胞の細胞分裂を制御するためのその使用について記載する。この実施例では、Cdk1/CDK1はCDLであり、これは誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされ、ここで、dox-架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがCDLの発現を誘導する。
dox-架橋を含むEARCターゲティングベクターの構築
rTTAコード配列(配列番号41)を含有する断片、それに続く3×SV40pAシグナルを、rTTAの5’に付加されたlox71部位を含有するプライマー(rtta3xpaFrw1(配列番号63)、rtta3xpaRev1(配列番号64))を用いて、PB-CAGG-rttaプラスミドからPCRにより増幅した。この断片をpGemTプラスミドにサブクローニングしてpGem-bridge-step1を作製した。続いて、TetOプロモータ(配列番号42)(pPB-TetO-IRES-mCherry由来)を含有するSacII断片をpGem-bridge-step1のSacII部位にクローニングしてpGem-bridge-step2を作製した。BamHI IRES-プロマイシン断片(配列番号43)をpGem-bridge-step2のBamHI部位に挿入することにより、架橋の最終エレメントをクローニングしてpGem-bridge-step3を作製した。C57/B6ゲノムDNAから900bp断片(配列番号44)をPCR増幅し(プライマーcdk5FrwPst(配列番号45)及びcdk5RevSpe(配列番号46)、これをpGem-bridge-step3のSbfI及びSpeIにクローニングすることにより、5’相同性アームをクローニングした。同様に、プライマーdke3_5’FSpe(配列番号48)、cdkex3_3lox(配列番号49)を用いたPCRにより、3’相同性アーム(900bp)(配列番号47)を増幅し、SphI及びNcoIにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをpBridge(配列番号148)と呼ぶ。
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。ガイドRNA配列(配列番号50、51、52及び53)をpX335(Addgeneから取得し、提案されたプロトコルに従う)(Ran et al.,2013)にクローニングした。
マウスES細胞培養物:
事前に特性決定したC57BL/6NマウスES細胞株(C2)について全ての遺伝子操作を実施した(Gertsenstein et al.,2010)。15%ES細胞-グレードFBS(Gibco)、0.1mM 2-mEARCaptophenol、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、及び2,000単位/ml白血病阻止因子(LIF)を補充した、高グルコースDMEM(Invitrogen)を基材とする培地中でマウスES細胞を増殖させた。マイトマイシンC処理マウス胚性線維芽細胞(MEF)上で5%CO2中37℃において細胞を維持した。
CRISPR/Cas9成分(pX335-cdk-ex3A(配列番号151)及びpX335-cdk-ex3B(配列番号152))を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド(pBridge;配列番号148)とを、8:2のFuGENE:DNA比(2μgの総DNA:各pX330については250ng、またpBridgeについては1500ng)を使用し、製造者の指示に従い、FuGENE HD(Clontech)を用いてマウスES細胞に同時トランスフェクトした。典型的トランスフェクションを3×105細胞に実施し、35mmプレート上で平板培養した。トランスフェクション時、ドキシサイクリンを1μg/mlの最終濃度まで培地に添加した。トランスフェクションから2日後、細胞を100mmプレート上に平板培養し、1μg/mlのプロマイシンを用いて選択を適用した。選択の開始から8~10日後、プロマイシン耐性コロニーを採取し、PCRスクリーニングまで96ウェルプレート内で維持した。
(Nagy et al.,2003)に従って96ウェルプレート内のES細胞から直接DNAを抽出した。Cdk1遺伝子の5’におけるpBridgeの相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、5’及び3’相同性アームにわたるプライマー(5’アームについてはプライマーrttaRev(配列番号54)、ex3_5scr(配列番号55)、3’アームについてはプライマーCMVforw(配列番号56)、ex3_3scr(配列番号57))を用いたPCRによりスクリーニングした。
F3-ブリッジ標的細胞をトリプシン処理した後、1ウェル当たり5×104細胞の密度においてゼラチン化24ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後1日目から、それぞれの条件について3ウェルをトリプシン処理した後、Countess自動化細胞計数器(Life Technologies)を用いて生存細胞を計数することにより、細胞計数を実施した。平板培養から2日後にドキシサイクリンを除去するか又は0.05ng/mlまで低減し、様々な条件で18日後まで毎日生存細胞を計数した。
F3-ブリッジ細胞(Dox+培地中で増殖)をトリプシン処理した後、2μgのプラスミド発現Cre(pCAGG-NLS-Cre)でトランスフェクトした。トランスフェクションは、JetPrime(Polyplus)を用いて、製造者のプロトコルに従って実施した。トランスフェクション後、ドキシサイクリンを除去し、コロニーをトリプシン処理した後、プールとして拡大した。
製造者の指示に従い、GeneElute全RNAミニプレップキット(Sigma)を用いて、1μg/ml及び0μg/mlのDoxで2日間処理した細胞から全RNAを抽出した。製造者の指示に従い、QuantiTect逆転写キット(Qiagen)を用いて、1μgのRNAの逆転写によりcDNAを作製した。SensiFast-SYBR qPCRミックス(Bioline)を用いて、BioRadCFXサーモサイクラ内でリアルタイムqPCRを設定した。使用したプライマーは、以下のものであった:qpcrcdk1_F(配列番号65)、qpcrcdk1_R(配列番号66)及びactBf(配列番号67)、actBr(配列番号68)。結果はΔΔCT法で分析し、βアクチンについて正規化した。
図9を参照すると、図9Aに示すdox-架橋標的ベクターを用いて3つの標的C2ESマウスES細胞株を作製した(図9B)。これらの細胞株の1つは、Cdk1の両対立遺伝子の5’UTRへの相同組換えにより挿入されたdox-架橋を含む同型接合性標的株(図9Bの3F)であることが判明した。
実施例3では、CDK1をターゲティングするEARC(dox-架橋)ベクターの構築、並びにマウス及びヒトALINK修飾ES細胞の両方の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Cdk1/CDK1はCDLであり、dox-架橋はEARCであり、HSV-TKはALINKである。CDL Cdk1は、同型接合形態のEARC及びALINK系の両方で修飾されており、ここで、ドキシサイクリンは、CDLの発現を誘導するために必要であり、ドキシサイクリンとGCVとは一緒に、修飾増幅細胞を傷害する方法を提供する。
マウスEARCターゲティングベクター、マウスターゲティングのためのCRISPR/Cas9プラスミドの構築は、実施例2と同じである。ターゲティング及び遺伝子型決定方法も、C2WT細胞の代わりに、実施例1(図3A~3G)で作製したCdk1(TK/TK)細胞をトランスフェクションに使用した以外には実施例2に記載したものと同じである。
CA1ゲノムDNA(プライマーhcdk5’F(配列番号70)及びhcdk5’R(配列番号71)から981bp断片をPCR増幅した後、これをpGem-bridge-step3のSbfIにクローニングすることにより、5’相同性アーム(配列番号69)をクローニングした。同様に、プライマーhcdk3’F(配列番号73)及びhcdk3’R(配列番号74)を用いたPCRにより3’相同性アーム(943bp;配列番号72)を増幅し、これをSphI及びNcoIにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをpBridge-hCdk1(配列番号75)と呼ぶ。
ガイドRNA(hCdk1A_up(配列番号76)、hCdk1A_low(配列番号77)、hCdk1B_up(配列番号78)、hCdk1B_low(配列番号79)をpX335(配列番号149)及びpX330(配列番号150)にクローニングすることにより、pX335-1A(配列番号80)、pX335-1B(配列番号81)及びpX330-1B(配列番号82)を作製した。
ターゲティング:
2×106CA1(TK/TK)(すなわち、図4A~4Fで説明した細胞生成物)hES細胞を8ugのDNA(標的ベクター:pX330-hCdTK-A=5ug:2ug)でNeonプロトコル14によりトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を4つの10cmプレート上で平板培養した。トランスフェクション後、ドキシサイクリンを最終濃度1μg/mlまで培地に添加した。トランスフェクションから2日後、0.75μg/mlのプロマイシンを用いて選択を適用した。プロマイシン耐性コロニーを採取して96ウェルプレートに移し、さらなる増殖並びにプライマー(hCdk1Br-5HAgen_F1(配列番号83)、rtTA_rev_1(配列番号84)、mCMV_F(配列番号85)、hCdk1Br-3HAgen_R1(配列番号86))を用いた遺伝子型決定のためにこれを2回繰り返した。
図16Aを参照すると、マウスdox-架橋標的ベクター、pBridgeを用いて実施例1で作製したマウス細胞産物、マウスCdk1earc/earc,alink/alink細胞を産生するCdk1(TK/TK)をターゲティングした。1回のトランスフェクションにより、9つのCdk1earc/earc,alink/alinkクローンが産生された(図16B)。
実施例4では、Top2aをターゲティングするEARC(dox-架橋)ベクターの構築、並びにマウスES細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Top2a/Top2AはCDLであり、これは、dox-架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがCDLの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
Top2aのためのdox-架橋を含むEARCターゲティングベクターの構築
C57/B6ゲノムDNA(プライマーTop5F(配列番号88)及びTop5R(配列番号89)から870bp断片をPCR増幅した後、これをpGem-bridge-step3のSbfI及びSpeIにクローニングすることにより、5’相同性アーム(配列番号87)をクローニングした。同様に、プライマーTop3F(配列番号91)、Top3R(配列番号92)を用いたPCRにより3’相同性アーム(818bp;配列番号90)を増幅し、これをSphI及びNcoIにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをpBridge-Top2a(配列番号93)と称する。
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴ:TOP2A1BF(配列番号94)、TOP2A1BR(配列番号95)、TOP2A1AF(配列番号96)、TOP2A1AR(配列番号97)を用いて、提案されたプロトコル(Ran et al.,2013)に従い、ガイドRNA配列をpX335(Addgene)にクローニングしてCRISPRベクターpX335-Top2aA(配列番号98)及びpx335-Top2aB(配列番号99)を作製した。
マウスES細胞培養物:
事前に特性決定したC57BL/B6マウスES細胞株(C2)について全ての遺伝子操作を実施した(Gertsenstein et al.,2010)。15%ES細胞-グレードFBS(Gibco)、0.1mM 2-mEARCaptophenol、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、及び2,000単位/ml白血病阻止因子(LIF)を補充した、高グルコースDMEM(Invitrogen)を基材とする培地中でマウスES細胞を増殖させた。マイトマイシンC処理マウス胚性線維芽細胞(MEF)上で5%CO2中37℃において細胞を維持した。
CRISPR/Cas9成分(pX335-Top2aA(配列番号98)及びpX335-Top2aB(配列番号99))を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド(pBridge-Top2a(配列番号93))とを、8:2のFuGENE:DNA比(2μgの総DNA:各pX335については250ng及びpBridge-Top2aについては1500ng)で、製造者の指示に従い、FuGENE HD(Clontech)を用いてマウスES細胞に同時トランスフェクトした。典型的トランスフェクションを3×105細胞で実施し、35mmプレート上で平板培養した。トランスフェクション時、ドキシサイクリンを1μg/mlの最終濃度まで培地に添加した。トランスフェクションから2日後、細胞を100mmプレート上に平板培養し、1μg/mlのプロマイシンを用いて選択を適用した。選択の開始から8~10日後、プロマイシン耐性コロニーを採取し、PCRスクリーニングまで96ウェルプレート内で維持した。
(Nagy et al.,2003)に従って96ウェルプレート内のES細胞から直接DNAを抽出した。Top2a遺伝子の5’におけるpBridge-Top2aの相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、5’及び3’相同性アームにわたるプライマー(5’アームについてはプライマーrttaRev(配列番号54)、top2a_5scr(配列番号55)、3’アームについてはプライマーCMVforw(配列番号56)、top2a_3scr(配列番号57))を用いたPCRによりスクリーニングした。
Top2a同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、1ウェル当たり5×104細胞の密度においてゼラチン化24ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の1日目から、様々なDox濃度(1μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml及び0μg/ml)に細胞を曝露し、3~4日にわたって2時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、IncucyteZoom system(Essen Bioscience)でプレートを分析した。
図18を参照すると、図18Aに示すdox-架橋ベクターを用いていくつかの標的C2マウスES細胞株を作製した(図18B)。これらの細胞株のうちの9つは、同型接合性ターゲティングされており(図18B)、Top2aの両対立遺伝子の5’UTRへの相同組換えによって挿入されたdox-架橋を含むことが判明した。
実施例5では、CenpaをターゲティングするEARC(dox-架橋)ベクターの構築、並びにマウスES細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Cenpa/CENPAはCDLであり、これは、dox-架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがCDLの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
dox-架橋を含むEARCターゲティングベクターの構築
C57/B6ゲノムDNA(プライマーCenpa5F(配列番号101)及びCenpa5R(配列番号102)から874bp断片をPCR増幅した後、これをpGem-bridge-step3のSbfI及びSpeIにクローニングすることにより、5’相同性アーム(配列番号100)をクローニングした。同様に、プライマーCenpa3F(配列番号104)、Cenpa3R(配列番号105)を用いたPCRにより3’相同性アーム(825bp;配列番号103)を増幅し、これをSphI及びNcoIにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをpBridge-Cenpa(配列番号106)と呼んだ。
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴCenpaAF(配列番号107)、CenpaAR(配列番号108)、CenpaBF(配列番号109)、CenpaBR(配列番号110)を用いて、提案されたプロトコル(Ran et al.,2013)に従い、ガイドRNA配列をpX335(Addgene)にクローニングしてCRISPRベクターpX335-CenpaA(配列番号111)及びpX335-CenpaB(配列番号112)を作製した。
マウスES細胞培養物:
実施例4に記載の通り。
ターゲティング:
CRISPR/Cas9成分(pX335-CenpaA;配列番号111、及びpX335-CenpaB;配列番号112)を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド(pBridge-Cenpa;配列番号106)とを、実施例4に記載のように、FuGENE HD(Clontech)を用いてマウスES細胞に同時トランスフェクトした。
実施例4に記載のようにDNAを抽出した。Cenpa遺伝子の5’におけるpBridge-Cenpaの相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、5’及び3’相同性アームにわたるプライマー(5’アームについてはプライマーrttaRev(配列番号54)、Cenpa_5scr(配列番号113)、3’アームについてはプライマーCMVforw(配列番号114)、Cenpa_3scr(配列番号115))を用いたPCRによりスクリーニングした。
Cenpa同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、1ウェル当たり5×104細胞の密度においてゼラチン化24ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の1日目から、様々なDox濃度(1μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml及び0μg/ml)に細胞を曝露し、3~4日にわたって2時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、IncucyteZoom system(Essen Bioscience)でプレートを分析した。
製造者のプロトコルに従い、GeneElute全RNAミニプレップキット(Sigma)を用いて、1μg/ml及び0μg/mlのDoxで2日間処理した細胞から全RNAを抽出した。製造者のプロトコルに従い、QuantiTect逆転写キット(Qiagen)を用いて、1μgのRNAの逆転写によりcDNAを作製した。SensiFast-SYBR qPCRミックス(Bioline)を用いて、BioRadCFXサーモサイクラ内でリアルタイムqPCRを設定した。使用したプライマーは、以下のものであった:qpcrcenpa_F(配列番号116)、qpcrcenpa_R(配列番号117)及びactBf(配列番号67)、actBr(配列番号68)。結果はΔΔCT法で分析し、βアクチンについて正規化した。
図20を参照すると、図20Aに示すdox-架橋標的ベクターを用いていくつかの標的C2マウスES細胞株を作製した(図20B)。これらの細胞株の6つは、5’及び3’に正しい挿入を有することが判明し、少なくとも1つのクローン(Cenpa#4)は、Cenpaの両対立遺伝子の5’UTRへの相同組換えにより挿入されたdox-架橋を含む同型接合標的株(図20B)であることが判明した。
実施例6では、Birc5をターゲティングするEARC(dox-架橋)ベクターの構築、並びにマウスES細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Birc5/BIRC5は、CDLであり、これは、dox-架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがCDLの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
dox-架橋を含むEARCターゲティングベクターの構築
C57/B6ゲノムDNA(プライマーBirc3F(配列番号119)及びBirc3R(配列番号120)から775bp断片をPCR増幅した後、これをpGem-bridge-step3のSbfI及びNcoIにクローニングすることにより、3’相同性アーム(配列番号118)をクローニングした。同様に、プライマーBirc5F(配列番号122)及びBirc5R PstI(配列番号123)及びSpeIを用いたPCRにより5’相同性アーム(617bp;配列番号121)を増幅し、これをSpelにクローニングして最終ターゲティングベクターを作製し、これをpBridge-Birc5(配列番号124)と称する。
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴBirc5AF(配列番号125)、Birc5AR(配列番号126)、Birc5BF(配列番号127)、Birc5BR(配列番号128)を用いて、提案されたプロトコル(Ran et al.,2013)に従い、ガイドRNA配列をpX335(Addgene)にクローニングしてCRISPRベクターpX335-Birc5A(配列番号129)及びpX335-Birc5B(配列番号130)を作製した。
マウスES細胞培養物:
実施例4に記載の通り。
ターゲティング:
CRISPR/Cas9成分(pX335-Birc5A及びpX335-Birc5B)を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド(pBridge-Birc5)とを、実施例4に記載のように、FuGENE HD(Clontech)を用いて、マウスES細胞に同時トランスフェクトした。
実施例4に記載のように、DNAを抽出した。Birc5遺伝子の5’におけるpBridge-Birc5の相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、5’相同性アームにわたるプライマー(プライマーrttaRev(配列番号54)、Birc_5scrF(配列番号131))を用いたPCRによりスクリーニングした。
Birc5同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、1ウェル当たり5×104細胞の密度で、ゼラチン化24ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の1日目から、様々なDox濃度(1μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml及び0μg/ml)に細胞を曝露し、3~4日にわたって2時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、IncucyteZoom system(Essen Bioscience)でプレートを分析した。
製造者のプロトコルに従い、GeneElute全RNAミニプレップキット(Sigma)を用いて、1μg/ml及び0μg/mlのDoxで2日間処理した細胞から全RNAを抽出した。製造者のプロトコルに従い、QuantiTect逆転写キット(Qiagen)を用いて、1μgのRNAの逆転写により、cDNAを作製した。SensiFast-SYBR qPCRミックス(Bioline)を用いて、BioRadCFXサーモサイクラ内でリアルタイムqPCRを設定した。使用したプライマーは、以下のものであった:qpcrbirc_F(配列番号132)、qpcrbirc_R(配列番号133)及びactBf(配列番号67)、actBr(配列番号68)。結果は、ΔΔCT法で分析し、βアクチンについて正規化した。
図23を参照すると、図23Aに示すdox-架橋標的ベクターを用いて、標的C2マウスES細胞株を作製した(図23B)。5つのクローンは、正しくターゲティングされ(図23B)、Birc5の両対立遺伝子の5’UTRへの組換えにより挿入されたdox-架橋を含むことが判明した。これらのクローンの1つは、Birc#3であり、これは、Doxの非存在下で増殖を停止するか、又は死滅することが判明した。
実施例7では、Eef2をターゲティングするEARC(dox-架橋)ベクターの構築、並びにマウスES細胞の細胞分裂を制御するためのそのベクターの使用について説明する。この実施例では、Eef2/EEF2は、CDLであり、これは、dox-架橋が挿入されて、ドキシサイクリンがCDLの発現を誘導する誘導性遺伝子発現系によってターゲティングされる。
dox-架橋を含むEARCターゲティングベクターの構築
C57/B6ゲノムDNA(プライマーEef2_5F(配列番号135)及びEef2_5R(配列番号136)から817bp断片(配列番号134)をPCR増幅した後、これをpGem-bridge-step3のSbfI及びSpeIにクローニングすることにより、5’相同性アームをクローニングした。同様に、プライマーEef2_3F(配列番号138)、Eef2_3R(配列番号139)を用いたPCRにより3’相同性アーム(826bp;配列番号137)を増幅し、これをSphIにクローニングして、pBridge-Eef2(配列番号140)と称する最終ターゲティングベクターを作製した。
オフターゲット突然変異の可能性を最小限にするために、二重ニッカーゼ戦略を選択した。オリゴEerf2aFWD(配列番号141)、Eerf2aREV(配列番号142)、Eerf2bFWD(配列番号143)、Eerf2bREV(配列番号144)を用いて、提案されたプロトコル(Ran et al.,2013)に従い、ガイドRNA配列をpX335(Addgene)にクローニングしてCRISPRベクターpX335-Eef2A(配列番号145)及びpX335-Eef2B(配列番号146)を作製した。
マウスES細胞培養物:
実施例4に記載の通り。
ターゲティング:
CRISPR/Cas9成分(pX335-Eef2A及びpX335-Eef2B)を含有するプラスミドと、ターゲティングプラスミド(pBridge-Eef2)とを、実施例4に記載のように、FuGENE HD(Clontech)を用いてマウスES細胞に同時トランスフェクトした。
実施例4に記載のようにDNAを抽出した。Eef2遺伝子の5’におけるpBridge-Eef2の相同組換えによる正しい挿入について陽性のクローンを、5’相同性アームにわたるプライマー(プライマーrttaRev(配列番号54)、Eef2_5scrF(配列番号147))を用いたPCRによりスクリーニングした。
Eef2同型接合性標的細胞をトリプシン処理した後、1ウェル当たり5×104細胞の密度においてゼラチン化24ウェルプレート上で平板培養した。平板培養後の1日目から、様々なDox濃度(1μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml及び0μg/ml)に細胞を曝露し、3~4日にわたって2時間毎に写真を撮り、密集度を測定することにより、IncucyteZoom system(Essen Bioscience)でプレートを分析した。
図26を参照すると、図26Aに示すdox-架橋標的ベクターを用いていくつかの標的C2マウスES細胞株を作製した(図26B)。これらの細胞株のうちの9つは、正しくターゲティングされ(図26B)、少なくとも1つのクローンがDox培地中でのみ増殖することが判明した。
予測CDL(IDは、EntrezGene識別番号を指す。CSスコアは、Wang et al.,2015に記載されているCRISPRスコア平均を指し;機能は、遺伝子座の既知若しくは予測機能を指し、予測は、Gene Ontology Consortiumウェブサイトhttp://geneontology.org/に記載の通り、GO termに基づくものであり;機能カテゴリーは、GOterm予測機能に基づく細胞機能の4カテゴリーを指し;CDL(基本)は、遺伝子がCDLであることを予測するために本発明者らが用いた情報を指し、予測は、CSスコア、入手可能な遺伝子ノックアウト(KO)データ、遺伝子機能、及び本明細書に記載する実験データに基づく)。
Rossant J,Nagy A.Nature Biotechnology,Jan.,pp.23.(1999)
Thomson JA et al.Science.282(5391):1145.(1998)
Takahashi K,Yamanaka S.Cell.126(4):663.(2006)
Takahashi K et al.Cell.131(5):861.(2007)
Hussein SM et al.Nature.471(7336):58.(2011)
Laurent LC et al.Stem Cell.8(1):106.(2011)
Lister R et al.Nature.471(7336):68.(2011)
Yoshida Y,Yamanaka S.Circulation.122(1):80.(2010)
Choo AB et al.STEM CELLS.26(6):1454.(2008)
Tan HL et al.STEM CELLS.27(8):1792.(2009)
Ben-David U,Nudel N,Benvenisty N.Nature Communications.4:.(2013a)
Fong CY,Peh GSL,Gauthaman K,Bongso A.Stem Cell Rev and Rep.5(1):72.(2009)
Tang C et al.Nature Biotechnology.29(9):829.(2011)
Blum B,Bar-Nur O,Golan-Lev T,Benvenisty N.Nature Biotechnology.27(3):281.(2009)Menendez S et al.Aging Cell.11(1):41.(2012)
Chung S et al.J Neurochem.97(5):1467.(2006)
Eiges R et al.Current Biology.11(7):514.(2001)
Huber I et al.The FASEB Journal.21(10):2551.(2007)
Rong Z,Fu X,Wang M,Xu Y.Journal of Biological Chemistry.287(39):32338.(2012)
Schuldiner M,Itskovitz-Eldor J,Benvenisty N.STEM CELLS.21(3):257.(2003)
Ben-David U et al.Cell Stem Cell.12(2):167.(2013b)
Dabir DV et al.Developmental Cell.25(1):81.(2013)
Tohyama S et al.Stem Cell.12(1):127.(2013)
Ghosh Z et al.Cancer Research.71(14):5030.(2011)
Ben-David U,Benvenisty N.Nat Protoc.9(3):729.(2014)
Lim T-T et al.PLoS ONE.8(7):e70543.(2013)
Halloran PJ,Fenton RG.Cancer Research.58(17):3855.(1998)
Tomicic MT,Thust R,Kaina B.Oncogene.21(14):2141.(2002)
Di Stasi A et al.N Engl J Med.365(18):1673.(2011)
Santamaria D et al.Nature.448(7155):811.(2007)
Diril MK et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.109(10):3826.(2012)
Scognamiglio R et al.Cell.164(4):668.(2016)
Fernandez-Miranda G et al.Development.138(13):2661.(2011)
Pellettieri J,Sanchez Alvarado A.Annu.Rev.Genet.41:83.(2007)
Bianconi E et al.Ann.Hum.Biol.40(6):463.(2013)
Wang T et al.Science.350(6264):1096.(2015)
Morgan DO.(2007)
FUNG T,POON R.Seminars in Cell and Developmental Biology.16(3):335.(2005)
Peters J-M.Mol Cell.9(5):931.(2002)
Fukagawa T.Front Biosci.13(13):2705.(2007)
Cassimeris L.Current Opinion in Cell Biology.11(1):134.(1999)
Satyanarayana A et al.Development.135(20):3389.(2008)
Kittler R et al.Nature.432(7020):1036.(2004)
Harborth J et al.J.Cell.Sci.114(Pt 24):4557.(2001)
Silk AD,Holland AJ,Cleveland DW.The Journal of Cell Biology.184(5):677.(2009)
Oda H et al.Molecular and Cellular Biology.29(8):2278.(2009)
Liu Q et al.Genes&Development.14(12):1448.(2000)
Martin-McCaffrey L et al.Developmental Cell.7(5):763.(2004)
Uren AG et al.Curr.Biol.10(21):1319.(2000)
Leung CG et al.J Exp Med.204(7):1603.(2007)
Cutts SM et al.Human Molecular Genetics.8(7):1145.(1999)
Howman EV et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.97(3):1148.(2000)
Chauviere M,Kress C,Kress M.Biochem Biophys Res Commun.372(4):513.(2008)
Miura K et al.Biochem Biophys Res Commun.341(1):132.(2006)
Magnaghi P et al.Nat Chem Biol.9(9):548.(2013)
Smith ED et al.Molecular and Cellular Biology.24(3):1168.(2004)
Morham SG,Kluckman KD,Voulomanos N,Smithies O.Molecular and Cellular Biology.16(12):6804.(1996)
Akimitsu N et al.Genes Cells.8(4):393.(2003)
Jeganathan K et al.The Journal of Cell Biology.179(2):255.(2007)
Ono T et al.Cell.115(1):109.(2003)
Bharadwaj R,Qi W,Yu H.J.Biol.Chem.279(13):13076.(2004)
Parisi G,Fornasari MS,Echave J.FEBS Lett.562(1-3):1.(2004)
Harborth J,Weber K,Osborn M.J.Biol.Chem.275(41):31979.(2000)
Krull S et al.Mol.Biol.Cell.15(9):4261.(2004)
Topper LM et al.Cell Cycle.1(4):282.(2002)
Zhang Y-W et al.J.Biol.Chem.284(27):18085.(2009)
Simmons AD et al.Human Molecular Genetics.8(12):2155.(1999)
Plate M et al.Mol Cells.29(4):355.(2010)
Franco M et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.95(17):9926.(1998)
Ohno M,Shimura Y.Genes&Development.10(8):997.(1996)
Achsel T et al.EMBO J.18(20):5789.(1999)
Shichijo S et al.J Exp Med.187(3):277.(1998)
Jurica MS et al.RNA.8(4):426.(2002)
Chari A et al.Cell.135(3):497.(2008)
Xu C et al.J.Biol.Chem.281(23):15900.(2006)
Yeh H et al.Genomics.23(2):443.(1994)
Kokkola T et al.FEBS Lett.585(17):2665.(2011)
Chan CC et al.RNA.10(2):200.(2004)
Zhou M et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.105(47):18139.(2008)
Takatsu H et al.J.Biol.Chem.273(38):24693.(1998)
Chen Y et al.Cell Research.22(2):333.(2012)
Mansfeld J et al.Nat.Cell Biol.13(10):1234.(2011)
He F,Wang C-T,Gou L-T.Genet.Mol.Res.8(4):1466.(2009)
Lieu A-S et al.Int J Oncol.37(2):429.(2010)
Preuss E et al.Human Gene Therapy.21(8):929.(2010)
Neschadim A et al.Molecular Therapy.20(5):1002.(2012)
Hedley D,Ogilvie L,Springer C.Nat Rev Cancer.7(11):870.(2007)
Nawa A et al.Anticancer Agents Med Chem.8(2):232.(2008)
Danks MK et al.Cancer Research.67(1):22.(2007)
Shah K.Adv.Drug Deliv.Rev.64(8):739.(2012)
Ramnaraine M et al.Cancer Research.63(20):6847.(2003)
Denny WA.J.Biomed.Biotechnol.2003(1):48.(2003)
Ireton GC,McDermott G,Black ME,Stoddard BL.J.Mol.Biol.315(4):687.(2002)
Humerickhouse R et al.Cancer Research.60(5):1189.(2000)
Wierdl M et al.Cancer Research.61(13):5078.(2001)
Kojima A,Hackett NR,Ohwada A,Crystal RG.J.Clin.Invest.101(8):1789.(1998)
Straathof KC et al.Blood.105(11):4247.(2005)
Soucek L et al.Cancer Research.62(12):3507.(2002)
Oricchio E et al.CellReports,pp.1.(2014)
Olive M et al.J.Biol.Chem.272(30):18586.(1997)
Urlinger S et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.97(14):7963.(2000)
Agha-Mohammadi S et al.J Gene Med.6(7):817.(2004)
Gossen M et al.Science.268(5218):1766.(1995)
Banaszynski LA et al.Cell.126(5):995.(2006)
Maeder ML et al.Nature Methods.10(3):243.(2013)
Pollock R,Clackson T.Current Opinion in Biotechnology.13(5):459.(2002)
Mullick A et al.BMC Biotechnology.6(1):43.(2006)
No D,Yao TP,Evans RM.Proceedings of the National Academy of Sciences.93(8):3346.(1996)
Stanley SA et al.Nature Medicine.21(1):92.(2015)
Rollins CT et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.97(13):7096.(2000)
Cong L et al.Science.339(6121):819.(2013)
Hsu PD et al.Nature Biotechnology.31(9):827.(2013)
Ran FA et al.Nat Protoc.8(11):2281.(2013)
Gertsenstein M et al.PLoS ONE.5(6):e11260.(2010)
Adewumi O et al.Nature Biotechnology.25(7):803.(2007)
Guy CT,Cardiff RD,Muller WJ.Molecular and Cellular Biology.12(3):954.(1992)
Szymczak AL et al.Nature Biotechnology.22(5):589.(2004)
本開示は以下の実施形態を包含する。
[1] 動物細胞の増殖を制御する方法であって、
- 動物細胞を用意するステップ;
- 前記動物細胞において、細胞分裂遺伝子座(CDL)を遺伝子修飾するステップであって、前記CDLは、1つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される1つ又は複数の遺伝子座であり、前記CDLの前記遺伝子修飾は、
a)アブレーションリンク(ALINK)系であって、前記CDLをコードするDNA配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするDNA配列を含む、アブレーションリンク(ALINK)系と;
b)CDLの調節の誘導性外性活性化因子(EARC)系であって、前記CDLに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、CDLの調節の誘導性外性活性化因子(EARC)系と
の1つ又は複数を含む、ステップ;
- 前記陰性選択マーカの誘導物質を用いて、前記ALINK系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を制御するステップ;及び/又は
- 前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質を用いて、前記EARC系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を制御するステップ
を含む方法。
[2] 前記ALINK修飾動物細胞の前記制御は、
- 前記陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で、前記ALINK系を含む前記遺伝子修飾動物細胞を維持することにより、前記ALINK系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にするステップ;及び
- 前記ALINK系を含む前記動物細胞を前記陰性選択マーカの前記誘導物質に曝露することにより、前記ALINK系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖をアブレート又は阻害するステップ
の1つ又は複数を含む、実施形態1に記載の方法。
[3] 前記EARC修飾動物細胞の前記制御は、
- 前記EARC系を含む前記遺伝子修飾動物細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露することにより、前記EARC系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にするステップ;及び
- 前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の前記誘導物質の非存在下で、前記EARC系を含む前記動物細胞を維持することにより、前記EARC系を含む前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を阻止又は阻害するステップ
の1つ又は複数を含む、実施形態1又は2に記載の方法。
[4] 前記CDLの前記遺伝子修飾は、
a)前記ALINK系を含むDNAベクター;
b)前記EARC系を含むDNAベクター;及び
c)前記ALINK系及び前記EARC系を含むDNAベクター
の1つ又は複数による前記CDLの標的置換を実施するステップを含む、実施形態1~3のいずれかに記載の方法。
[5] 前記CDLの前記ALINK遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは化合物異型接合性であり、及び/又は前記EARC遺伝子修飾は、機能性CDL修飾がEARC修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[6] 前記CDLは、表2に列挙される1つ又は複数の遺伝子座である、実施形態1~5のいずれかに記載の方法。
[7] 前記CDLは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、DNA複製、RNA転写、タンパク質翻訳、及び代謝の1つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、実施形態6に記載の方法。
[8] 前記CDLは、Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5、及びEef2/EEF2の1つ又は複数であり、好ましくは、前記CDLはCdk1又はCDK1である、実施形態7に記載の方法。
[9] 前記ALINK系は、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ/5-フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ/イリノテカン系、又はiCasp9/AP1903系を含み、好ましくは、前記ALINK系は単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系である、実施形態1~8のいずれかに記載の方法。
[10] 前記EARC系は、dox-架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド-可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記EARC系はdox-架橋系である、実施形態1~8のいずれかに記載の方法。
[11] 前記動物細胞は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞である、実施形態1~10のいずれかに記載の方法。
[12] 前記哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞であり、好ましくは、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、実施形態11に記載の方法。
[13] 前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞である、実施形態1~12のいずれかに記載の方法。
[14] 前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞に由来する、実施形態1~12のいずれかに記載の方法。
[15] 実施形態1~14のいずれかに記載の方法に従って動物細胞集団の増殖を制御する方法。
[16] 細胞増殖を制御するための少なくとも1つの機構を含むように遺伝子修飾された動物細胞であって、
- 1つ又は複数の細胞分裂遺伝子座(CDL)の遺伝子修飾
を含み、前記CDLは、1つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される1つ又は複数の遺伝子座であり、前記遺伝子修飾は、
a)アブレーションリンク(ALINK)系であって、前記CDLをコードするDNA配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするDNA配列を含む、アブレーションリンク(ALINK)系と;
b)CEDLの調節の外性活性化因子(EARC)系であって、前記CDLに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、CEDLの調節の外性活性化因子(EARC)系と
の1つ又は複数である、動物細胞。
[17] 前記CDLの前記遺伝子修飾は、
a)前記ALINK系を含むDNAベクター;
b)前記EARC系を含むDNAベクター;
c)前記ALINK系及び前記EARC系を含むDNAベクター
の1つ又は複数による前記CDLの標的置換を実施するステップを含む、実施形態16に記載の遺伝子修飾動物細胞。
[18] 前記CDLの前記ALINK遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは化合物異型接合性であり、及び/又は前記EARC遺伝子修飾は、機能性CDL修飾がEARC修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする、実施形態16又は17に記載の遺伝子修飾動物細胞。
[19] 前記CDLは、表2に列挙される遺伝子座の1つ又は複数である、実施形態16~18のいずれかに記載の遺伝子修飾動物細胞。
[20] 前記CDLは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、DNA複製、RNA転写、タンパク質翻訳、及び代謝の1つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、実施形態19に記載の遺伝子修飾動物細胞。
[21] 前記CDLは、Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5、及びEef2/EEF2の1つ又は複数であり、好ましくは、前記CDLはCdk1又はCDK1である、実施形態20に記載の遺伝子修飾動物細胞。
[22] 前記ALINK系は、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ/5-フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ/イリノテカン系、又はiCasp9/AP1903系を含み、好ましくは、前記ALINK系は単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系である、実施形態16~21のいずれかに記載の遺伝子修飾動物細胞。
[23] 前記EARC系は、dox-架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド-可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記EARC系はdox-架橋系である、実施形態16~21のいずれかに記載の遺伝子修飾動物細胞。
[24] 前記動物細胞は、哺乳動物細胞又は鳥類細胞である、実施形態16~23のいずれかに記載の遺伝子修飾動物細胞。
[25] 前記哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長類細胞であり、好ましくは、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、実施形態24に記載の遺伝子修飾動物細胞。
[26] 前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞である、実施形態16~25のいずれかに記載の遺伝子修飾動物細胞。
[27] 前記動物細胞は、多能性幹細胞、複能性細胞、単能性前駆細胞、又は最終分化細胞に由来する、実施形態16~25のいずれかに記載の遺伝子修飾動物細胞。
[28] 実施形態16~27のいずれかに記載の細胞による遺伝子修飾動物細胞の集団。
[29] 細胞分裂遺伝子座(CDL)の発現を修飾するためのDNAベクターであって、前記CDLは、1つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される1つ又は複数の遺伝子座であり、前記DNAベクターは、
- アブレーションリンク(ALINK)系
を含み、前記ALINK系は、前記CDLに転写によって連結される陰性選択マーカをコードするDNA配列を含み、
前記DNAベクターが1つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、前記DNAベクターを含む増殖宿主細胞は、前記DNAベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記陰性選択マーカの誘導物質に曝露されると殺傷されることになる、DNAベクター。
[30] 細胞分裂必須遺伝子座(CDL)の発現を修飾するためのDNAベクターであって、前記CDLは、1つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される1つ又は複数の遺伝子座であり、前記DNAベクターは、
- CDLの調節の外性活性化因子(EARC)系
を含み、前記EARC系は、前記CDLに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含み、
前記DNAベクターが1つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、前記DNAベクターを含む増殖宿主細胞は、前記DNAベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露されなければ殺傷されることになる、DNAベクター。
[31] 細胞分裂必須遺伝子座(CDL)の発現を修飾するためのDNAベクターであって、前記CDLは、1つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される1つ又は複数の遺伝子座であり、前記DNAベクターは、
- アブレーションリンク(ALINK)系であって、前記CDLに転写によって連結される陰性選択マーカをコードするDNA配列である、アブレーションリンク(ALINK)系と;
- CDLの調節の外性活性化因子(EARC)系であって、前記CDLに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、CDLの調節の外性活性化因子(EARC)系と
を含み、
前記DNAベクターが1つ又は複数の宿主細胞に挿入される場合、前記DNAベクターを含む増殖宿主細胞は、前記DNAベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記陰性選択マーカの誘導物質に曝露され、且つ前記DNAベクターを含む前記増殖宿主細胞が前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露されなければ殺傷されることになる、DNAベクター。
[32] 前記CDLは、表2に列挙される遺伝子座の1つ又は複数である、実施形態29~31のいずれかに記載のDNAベクター。
[33] 前記CDLは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、DNA複製、RNA転写、タンパク質翻訳、及び代謝の1つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、実施形態32に記載のDNAベクター。
[34] 前記CDLは、Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5、及びEef2/EEF2の1つ又は複数であり、好ましくは、前記CDLはCdk1又はCDK1である、実施形態33に記載のDNAベクター。
[35] 前記ALINK系は、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ/5-フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ/イリノテカン系、又はiCasp9/AP1903系を含み、好ましくは、前記ALINK系は単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系である、実施形態29又は31に記載のDNAベクター。
[36] 前記EARC系は、dox-架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド-可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記EARC系はdox-架橋系である、実施形態30又は31に記載のDNAベクター。
[37] 1つ又は複数の細胞分裂必須遺伝子座(CDL)を遺伝子修飾することにより、動物細胞の増殖を制御するためのキットであって、前記CDLは、1つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物が分裂細胞によって発現される1つ又は複数の遺伝子座であり、前記キットは、
- アブレーションリンク(ALINK)系であって、前記CDLをコードするDNA配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするDNA配列を含む、アブレーションリンク(ALINK)系を含むDNAベクター;及び/又は
- CDLの調節の外性活性化因子(EARC)系であって、前記CDLに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、CDLの調節の外性活性化因子(EARC)系を含むDNAベクター;及び/又は
- ALINK系とEARC系とを含むDNAベクターであって、前記ALINK系及び前記EARC系は、それぞれ前記CDLに作動可能に連結されている、DNAベクター;並びに
- 前記DNAベクターの1つ又は複数を用いた動物細胞における前記CDLの標的置換の指示
を含むキット。
[38] 前記CDLは、表2に列挙される1つ又は複数の遺伝子座である、実施形態37に記載のキット。
[39] 前記CDLは、遺伝子産物であって、その機能が細胞周期、DNA複製、RNA転写、タンパク質翻訳、及び代謝の1つ又は複数に関与している遺伝子産物をコードする、実施形態38に記載のキット。
[40] 前記CDLは、Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5、及びEef2/EEF2の1つ又は複数であり、好ましくは、前記CDLはCdk1又はCDK1である、実施形態39に記載のキット。
[41] 前記ALINK系は、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ/5-フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ/イリノテカン系、又はiCasp9/AP1903系を含み、好ましくは、前記ALINK系は単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系である、実施形態37~40のいずれかに記載のキット。
[42] 前記EARC系は、dox-架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系、又はリガンド-可逆的二量体化系であり、好ましくは、前記EARC系はdox-架橋系である、実施形態37~40のいずれかに記載のキット。
Claims (33)
- 細胞増殖を制御するための機構を含む単離された遺伝子修飾動物細胞であって、前記遺伝子修飾動物細胞は、CDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5、およびEEF2からなる群より選択される内在性の遺伝子の遺伝子修飾を含み、前記細胞は、前記内在性の遺伝子に作動可能に連結された外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムを含み、前記内在性の遺伝子の発現が、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質の存在下でのみ活性化される、前記細胞。
- 前記内在性の遺伝子の遺伝子修飾が、外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムをコードするDNA配列を含むDNAベクターでの前記内在性の遺伝子の標的化された修飾による遺伝子修飾である、請求項1に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 内在性の遺伝子がCDK1である、請求項1又は2に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 前記遺伝子修飾がCDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5、及びEEF2の2以上への修飾である、請求項1又は2に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 前記遺伝子修飾がCDK1及びTOP2Aについて行われるか、又は、CDK1及びEEF2について行われる、請求項4に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムが、dox-架橋システム、クメートスイッチ誘導性システム、エクジソン誘導性システム、電波誘導性システム、又はリガンド可逆的二量体化システムである、請求項1から5のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムがdox-架橋システムである、請求項6に記載の遺伝子修飾動物細胞。
- 動物細胞が、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、および非ヒト霊長類の細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞または鳥類細胞である、請求項1~7のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
- 動物細胞が、多能性幹細胞、複能性細胞、若しくは単能性前駆細胞であるか、又はそれらに由来するか、或いは、最終分化細胞である、請求項1~8のいずれか一項に記載の遺伝子修飾動物細胞。
- 対象の治療に使用するための、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 医療に使用するための、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 細胞療法に用いるための、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞。
- 複数の、請求項1~9のいずれか一項に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞を含む、集団。
- 対象の治療に使用するための、請求項13に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞の集団。
- 医療に使用するための、請求項13に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞の集団。
- 細胞療法に用いるための、請求項13に記載の単離された遺伝子修飾動物細胞の集団。
- 動物細胞におけるCDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5、およびEEF2からなる群より選択される内在性の遺伝子の発現を修飾するためのDNAベクターであって、前記ベクターは外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムをコードする核酸配列を含むDNA分子を含むものであり、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムは、前記内在性の遺伝子の遺伝子座に、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムを挿入し、それにより前記内在性の遺伝子を該外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムに作動可能に連結するよう構成されており、それにより、該内在性の遺伝子の発現が、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質の存在下でのみ活性化される、前記DNAベクター。
- 前記内在性の遺伝子がCDK1である、請求項17に記載のDNAベクター。
- 前記DNAベクターが前記内在性の遺伝子の2以上の発現を修飾するよう構成されている、請求項17に記載のDNAベクター。
- 前記DNAベクターがCDK1及びTOP2Aの発現を修飾するよう構成されている、又は、CDK1及びEEF2の発現を修飾するよう構成されている、請求項19に記載のDNAベクター。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムが、dox-架橋システム、クメートスイッチ誘導システム、エクジソン誘導システム、電波誘導システム、又はリガンド-可逆的二量体化システムである、請求項17~20のいずれか1項に記載のDNAベクター。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムがdox-架橋システムである、請求項21に記載のDNAベクター。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの、増殖している宿主細胞への組込みが、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質への暴露による該宿主細胞の増殖を可能にする、請求項17~22のいずれか1項に記載のDNAベクター。
- 動物細胞の増殖の制御に使用するための請求項1~9のいずれか1項に記載の単離された、遺伝子修飾動物細胞であって、前記使用が、前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質により制御することを含む、前記細胞。
- 前記使用が、
(a)前記遺伝子修飾動物細胞を、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質に暴露することにより、前記遺伝子修飾動物細胞の増殖を可能にすること、又は、
(b)前記遺伝子修飾動物細胞を、前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質の不在下に維持することにより、前記動物細胞の増殖を予防又は阻害すること、
を含む、請求項24に記載の単離された、遺伝子修飾動物細胞。 - 遺伝子修飾動物細胞を製造するための生体外の方法であって、1つまたは複数のCDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5、およびEEF2からなる群より選択される内在性の遺伝子を修飾することを含み、該遺伝子の修飾は1以上の該内在性の遺伝子のそれぞれに外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムを作動可能に連結することにより行い、該1以上の内在性の遺伝子の発現が前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムの誘導物質の存在下でのみ活性化される、前記方法。
- 前記1以上の内在性の遺伝子がCDK1である、請求項26に記載の生体外の方法。
- 前記1以上の内在性の遺伝子がCDK1、TOP2A、CENPA、BIRC5、及びEEF2の2以上である、請求項26に記載の生体外の方法。
- 前記1以上の内在性の遺伝子がCDK1及びTOP2Aであるか、又は、CDK1及びEEF2である、請求項28に記載の生体外の方法。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムが、dox-架橋システム、クメートスイッチ誘導システム、エクジソン誘導システム、電波誘導システム、又はリガンド-可逆的二量体化システムである、請求項26から29のいずれか一項に記載の生体外の方法。
- 前記外性誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現システムがdox-架橋システムである、請求項30に記載の生体外の方法。
- 動物細胞が、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、シカ、エルク、スイギュウ、雄牛、ラクダ、ラマ、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、および非ヒト霊長類の細胞、または鳥類細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、請求項26~31のいずれか一項に記載の生体外の方法。
- 動物細胞が、多能性幹細胞、複能性細胞、若しくは単能性前駆細胞であるか、又はそれらに由来するか、或いは、最終分化細胞である、請求項26~32のいずれか一項に記載の生体外の方法。
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