JP7281769B2 - 心筋細胞新生におけるhippo及びジストロフィン複合体シグナル伝達 - Google Patents
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Description
出生男児3500人当たり1人に生じる致死的な遺伝性X染色体連鎖障害(Emery、2002年)であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、骨格及び心筋線維の急速な進行性変性によって特徴づけられる。重要なことに、DMD患者は、心筋壊死、線維症及び拡張型心筋症を特徴とする心疾患を発症する。DMDは、骨格、心臓及び平滑筋細胞に存在する427kdの細胞骨格タンパクをコードするジストロフィン遺伝子の突然変異により生じる(Hoffmanら、1987年;Hoffmanら、1988年)。DMD患者では、ジストロフィン発現が無効化され、骨格及び心筋において必須の膜局在性構造であるジストロフィン結合糖タンパク質複合体(DGC)の崩壊に至る(Ohlendieck及びCampbell、1991年;Ohlendieckら、1993年)。DMDに有用なマウスモデルは、ヒトDMDと類似性がある疾患表現型を呈するジストロフィン-null株のmdxマウスである(Bulfieldら、1984年)。ヒトDMDほど重度ではないが、mdxマウスは、老化後の骨格筋変性/再生及び心筋症などヒト疾患の特徴を有する。
哺乳動物の中心的なHippoシグナル伝達成分には、ショウジョウバエHippoキナーゼに対してオーソロガスなSte20キナーゼMst1及びMst2がある。Mstキナーゼは、Salvador(Salv)足場タンパク質と複合体形成すると、ラージ腫瘍抑制遺伝子ホモログ(Lats)(Large Tumor Suppressor Homolog)キナーゼをリン酸化する。哺乳動物のLats1及びLats2は、NDRファミリーキナーゼであり、ショウジョウバエWartsに対してオーソロガスである。Latsキナーゼは、次に、Hippoシグナル伝達の最下流の成分でありTeadなどの転写因子とパートナーである関連する2つの転写活性化補助因子Yap及びTazをリン酸化して遺伝子発現を調節する。Yapは、また、標準的なWntシグナル伝達のエフェクターであるβカテニンと相互作用して遺伝子発現を調節する。リン酸化されると、Yap及びTazは、核から除かれ、転写的に不活性になる(図1)。
本明細書において明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、本発明に記載の内容において(特に以下の請求の範囲の内容において)、用語「a」及び「an」及び「the」並びに類似の指示対象の使用は、単数と複数の両方に及ぶものと解釈される。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」は、特に明記しない限り、制限のない用語(即ち、「を含むがこれに限定されない」という意味)として解釈される。本明細書における数値範囲の説明は、単にその範囲内に該当する各数値を個別に指す略記法としての役割しか意図しておらず、本明細書において別段の指示がない限り、各数値は、本明細書において個別に列挙されるように、明細書に組み込まれる。本明細書において特に明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、本明細書に記載される全ての方法は任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で使用される任意の及びあらゆる例又は例示的な言い回し(例えば、「など」)の使用は、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、特に主張しない限り、本発明の範囲に制限を加えるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠ないずれの請求項にも記載されていない要素を示すとは解釈されないものとする。
本開示の実施形態は、心筋細胞が新生される必要があるものを含めた、心臓の病状の治療の方法及び組成物に関する。心筋細胞は、例えば、疾患、根本的な遺伝子状態、及び/又は外傷を含めた何らかの理由のために新生の必要がある場合がある。特定の実施形態において、個体は、例えば、心筋細胞損傷、壊死、及び/又はデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)など心臓の線維症を有する。
特別な実施形態において、Hippo経路メンバーであるSalvador(salvadorファミリーWWドメイン含有タンパク質1)は、心臓の病状の治療においてshRNAにより標的化される。遺伝子は、salvadorホモログ1、Salv、SAV1、SAV、WW45又はWWP4と称される場合がある。代表的な核酸は、GenBank(登録商標)アクセッション番号CR457297.1で提供され、代表的なタンパク質配列は、GenBank(登録商標)アクセッション番号Q9H4B6で提供される。
本開示の実施形態において、Sav1遺伝子を標的とする核酸を使用して個体の心臓状態を治療する方法がある。特定の実施形態において、心臓状態は、例えば疾患(例えば罹患した若しくは遺伝的な)又は外傷いずれかの理由により新生の必要がある心筋細胞を含む。特定の実施形態において、個体において疾患のある心臓がある。個体は、なんらかの理由により新生の必要がある心筋細胞を有することができる。例えば、個体における心筋細胞は、アポトーシス性、自己貪食性であっても、又は組織は壊死性であってもよい。
特別な実施形態において、Sav1の発現が検出可能に減少するような、Sav1を標的とする1つ以上の核酸がある。核酸は、DNA又はRNAであってもよいが、特定の実施形態において、核酸はshRNAなどのRNAである。
一般に当業者に公知であるように、一般的に使用されるオリゴヌクレオチドは、天然に存在するプリン及びピリミジン塩基の組合せ、糖、並びにホスホジエステル結合におけるリン酸基を含むヌクレオシド間の共有結合を有する、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーである。しかしながら、下記の通り、用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在するオリゴヌクレオチドの天然には存在しない様々な模倣体及び派生体、即ち修飾形態も包含することに留意されたい。
本開示は、ポリマー又は賦形剤及び1つ以上のshRNA分子をコードしている1つ以上のベクターの組成物を提供する。ベクターは、適切な担体と共に医薬組成物に製剤化し、任意の適切な投与経路を使用して哺乳動物に投与することができる。
本発明のshRNAコード核酸は、医薬組成物に製剤化することができ、従来通りの医薬品調剤技術に従って調製される。例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(1990年、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.)を参照のこと。本発明の医薬組成物は、shRNAをコードしているベクターの治療上有効な量を含む。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含むことができる。そのような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力に干渉するべきでない。担体は、例えば、静脈、経口、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、神経弓突起又は非経口投与のために所望される調製形態によって多種多様な形態をとることができる。
例えば小ヘアピン形態(shRNA)のsiRNA化合物が直接転写され得るDNAベクターを使用する遺伝子療法手法によって、siRNAを哺乳動物細胞、特にヒト細胞に送達することもできる。最近の研究により、二本鎖siRNAが、RNAiを媒介するのに非常に効果的であることが示されたが、短い一本鎖ヘアピン形状RNAも、恐らく、細胞内酵素によって二本鎖siRNAにプロセシングされる分子内二本鎖に折りたたまれるので、RNAiを媒介することができる。そのような小ヘアピンRNAの転写を導く、少数個(例えば、3、4、5、6、7、8、9個)のヌクレオチドによって隔てられた短い逆位反復を保有するDNAベクターを細胞又は組織にトランスフェクトすることによってそのようなshRNAの産生をin vivoで容易に達成できるので、この発見は、重要且つ広範囲の意味を有する。加えて、宿主細胞ゲノムへのベクター若しくはベクターセグメントの組み込みを導く、又は転写ベクターの安定性を確実にするための機序が含まれている場合、コードされているshRNAにより生じるRNAiを、安定で、且つ受け継がれ得るようにすることができる。そのような技術は、哺乳動物細胞において特定の遺伝子の発現を「ノックダウンする」ために使用されてきただけでなく、現在、外生的に発現している導入遺伝子、並びに生きているマウスの脳及び肝臓における内在性遺伝子の発現をノックダウンするために利用され、成功を収めている。
Hippoシグナル伝達は、成体の心筋細胞新生を促進する
他の器官が再生能を有する一方で、心筋細胞は、損傷した心臓を修復するのに十分に新生又は再生することができない(Kikuchi及びPoss、2012年)。Hippoシグナル伝達が、出生後の心筋細胞新生の負の調節因子であるという仮説を検討するために、成体心筋細胞においてSalv及び両方のLats遺伝子を不活性化した。
Hippoシグナル伝達は、急性傷害モデルにおける成体心臓再生を促進する
生存の最初の6日目における心尖部切除は、心臓再生をもたらすが、生後(P)7日目以降に実行された切除は、線維形成及び瘢痕をもたらす(Porrelloら、2011年)。
HIPPO欠損性心筋細胞は、再生中に大規模に増殖し、移動特性を獲得する
4dpr(P12)Hippo欠損性心臓を、更に詳細に評価した。採取の4時間前に、細胞周期に入った細胞を可視化するために、心臓にEdUをパルスした。対照心臓において、EdU陽性細胞は、切除した区域の近くのGFP陰性、非心筋細胞系統において主に見られ、浸潤性炎症細胞及び増殖性心臓線維芽細胞である可能性が最も高い。類似の増殖性GFP陰性細胞が、Salv CKO心臓においても観察された。対照とは対照的に、Salv CKO切除心臓は、境界区域及び遠位心臓領域の両方の中にEdU/GFP二重陽性心筋細胞を有していた(Heallenら、2013年;Morikawaら、2014年)。
Yapは、細胞周期の進行及び細胞骨格再形成を促進する遺伝子を直接調節する
心臓再生におけるHippoシグナル伝達の直接標的化に対する更なる洞察を得るために、クロマチン免疫沈降塩基配列決定(ChIP-seq)実験を、HippoエフェクターYapに対する抗体を使用して実行した。マイクロアレイ実験のmRNA発現データを使用して、ChIP-seqデータセットに対し、Nkx2.5cre Salv変異体心臓において上方制御される遺伝子を重ね合わせた(図2A、B)。遺伝子発現変化を、qRT-PCR実験によって確認した(図2B)。遺伝子存在論分析は、Yapが細胞周期の進行及び細胞骨格力学に関係する遺伝子を直接調節することを示した(図2A及び[Morikawaら、2014年])。Yapにより調節される細胞周期遺伝子の中には、Cdk6、及びこれまでに確認されているYap標的、CyclinE2などのサイクリン依存性キナーゼも含まれる。別のYap標的、細胞周期遺伝子Lin9は、MuvB複合体のメンバーであり、G2/M遷移を強化する(Kleinschmidtら、2009年;Sadasivamら、2012年)(図2A、B)。
Yapは、心臓再生の間に細胞骨格再形成及び細胞運動性を促進する遺伝子を直接調節する
細胞形態学における劇的な変化と整合して、Yapが、アクチン細胞骨格を調節する遺伝子に直接結合することも発見した(図2A、B)。マウスにおいて欠損していると心機能不全が引き起こされるEnah、Ena/VASPアクチン調節因子など、Yapにより調節される標的のいくつかは、葉状仮足及び糸状仮足に局所化することが公知である(Mejillanoら、2004年;Morikawaら、2014年)。
Hippo除去は、MDX変異体心臓において心臓再生異常を救済する。
Hippo経路の機能喪失が、mdx再生不全表現型を抑制できるかどうか決定するために、Salv;mdx二重変異体心臓を作製し、二重変異体及び対照サンプルに対し生後8日目で尖切除を実施した。図3に示すように、心筋を再生できないmdx変異体とは対照的に、Salv CKO及びSalv;mdx二重変異体は心筋を再生した(Morikawaら、2014年)。これは、Hippo除去、それによるYapの上方制御及びYap標的遺伝子の上方制御が、mdx心臓表現型を抑制できることを示す。この所見は、心筋におけるHippo除去が、DMD心筋症を治療する有望な手法であることを示す。
Hippo欠失は、確立された心不全において心筋細胞再生を促進する
心筋梗塞の3週間後にHippo経路の不活性化が、心機能の改善を伴う心筋細胞再生をなおも促進するかどうか決定した。多くの患者が、心不全及び死亡を伴う病理学的心臓リモデリングに至る慢性梗塞を患うので、これは臨床的に重要な問題である。これまで、Hippo欠失が、確立された成熟瘢痕において心臓再生を効果的に促進する可能性があるかどうかは知られていなかった。心筋梗塞を、時点0で、対照の心臓及び注射していないSalv CKO心臓に発生させた(図4)。注射していないSalv CKOマウスは、対照レベルのSalvをなお発現する。疑似対照も、時間0で確立した。梗塞の3週間後に、全てのマウスを、超音波心臓検査法によって慎重に調べ、EFの減少を伴う心不全である手術したマウスを本研究に含め、タモキシフェン注射を投与してHippo経路を不活性化した。
成体心臓においてHippo経路を不活性化する小ヘアピンRNA(SHRNA)の設計
Salvに対するshRNAの3つの例は、Salv分子の、マウス、ヒト及びブタの間で保存されている領域に対するものであり、それにより、標準的な方法を使用してこれらの3つの種の間で互換的に使用することができる([Tafer、2014年];図6、7及び8)。新生児心筋細胞において内在性Salv発現を抑制する各shRNAの機能効率を、siRNAノックダウン実験を使用して確認した(図5)。3つ全てのshRNAが、Salv発現をおよそ70%効果的にノックダウンし、shRNA#3が最大のノックダウン効率をもたらした。
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Claims (16)
- (1)配列番号10に対して少なくとも95%の同一性を含む第1の核酸を含むshRNA、
(2)配列番号11に対して少なくとも95%の同一性を含む第2の核酸を含むshRNA、及び、
(3)配列番号12に対して少なくとも95%の同一性を含む第3の核酸を含むshRNAを含有し、
前記(1)乃至(3)のshRNAは、Salvadorの発現を抑制することが可能である、Salvadorの発現を抑制するための単離された合成核酸組成物。 - 前記核酸が、
(i)配列番号10の配列を含み、配列番号10のアンチセンス配列を更に含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、及び/又は、
(ii)配列番号11の配列を含み、配列番号11のアンチセンス配列を更に含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、及び/又は、
(iii)配列番号12の配列を含み、配列番号12のアンチセンス配列を更に含み、該配列及び該アンチセンス配列が互いにハイブリダイズして二本鎖構造を形成する場合に、該配列及び該アンチセンス配列が、ループ構造によって隔てられている、
ことを含む、請求項1に記載の組成物。 - 前記第1の核酸、第2の核酸、及び、第3の核酸のそれぞれが、少なくとも43ヌクレオチドの長さである、及び/又は、前記第1の核酸、第2の核酸、及び、第3の核酸のそれぞれが、137ヌクレオチド以下の長さである、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ループ構造が、長さ5~19ヌクレオチドである、請求項2に記載の組成物。
- 前記第1の核酸、第2の核酸、及び、第3の核酸が、同じ調節配列によって調節される、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- (i)配列番号10の配列を含むshRNA、(ii)配列番号11の配列を含むshRNA、及び、(iii)配列番号12の配列を含むshRNAを含有し、
前記(1)乃至(3)のshRNAは、Salvadorの発現を抑制することが可能である、Salvadorの発現を抑制するための単離された合成核酸組成物。 - 前記単離された合成核酸が、ベクターに含まれる、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項7に記載の組成物。
- 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項8に記載の組成物。
- 前記単離された合成核酸が、心筋細胞特異的プロモーターを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記心筋細胞特異的プロモーターが、ラット心室特異的心筋ミオシン軽鎖2(MLC-2v)プロモーター;心筋特異的αミオシン重鎖(MHC)遺伝子プロモーター;NCX1プロモーターの-137~+85の心臓細胞特異的最小プロモーター;鶏の心臓トロポニンT(cTNT)、又はその組合せである、請求項10に記載の組成物。
- 個体における心臓状態、又は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためである、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記心臓状態が、心筋細胞アポトーシス、壊死、自食、心血管疾患、心筋症、心不全、心筋梗塞、虚血、線維症又は糖尿病性心筋症、及び、老人性心筋症からなる群より選択される、請求項12に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記個体に2回以上与えられる、請求項12又は13に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記個体に全身的に、又は、局所的に与えられる、請求項12~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の組成物、及び、薬学的に許容できる担体を含有する医薬組成物。
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