JP7275163B2 - 消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱(Coriobacteriia)の微生物の使用に関する。ケノデオキシコール酸(CDCA)の産生のための方法およびリトコール酸(LCA)の産生のための方法も提供する。
一般的な生物医学の文献では、胆汁酸または胆汁酸塩は24個の炭素原子を有し、これは、25~27個の炭素原子を有し原始的な脊椎動物(例えばシーラカンスおよびサメ)ならびにより原始的でない脊椎動物(例えば爬虫類および両生類)の胆汁酸プールに存在する「原始的な」胆汁酸(C27、C26、C25胆汁酸)に対置されて、C24胆汁酸と略記される。高等脊椎動物では、C24胆汁酸は胆汁の大部分を占めている(Hofmann et al. (1992) 「A proposed nomenclature for bile acids」 Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604(非特許文献1))。肝臓は、コレステロールを消費して胆汁酸を合成し、また、再吸収された胆汁酸を血液から回収する。それらは、肝細胞から、コレステロールおよびリン脂質とともに、急な濃度勾配に逆らって胆汁内へ分泌される。したがって、食間には、胆汁酸のプールのほとんどが、すぐに使用できる準備のできた状態で胆嚢内に存在している。
1) 飼料摂取量を増やすための飼料の嗜好性の改善;
2) 腸管バリアの損傷によって生じる損失を補うための必須栄養分の追加;
3) 腸管バリアを強化する生物学的活性物質の追加。
a)コリオバクテリウム綱の微生物をグリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
a)コリオバクテリウム綱の微生物をケノデオキシコール酸(CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってリトコール酸が得られる。
a)コリオバクテリウム綱の微生物を健常対象と接触させる工程
を含む、健常対象の消化管の健康を促進するための方法に関する。
[本発明1001]
健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱(Coriobacteriia)の微生物の使用。
[本発明1002]
微生物が、組成物内に、好ましくは食品組成物および/または飼料組成物内に提供される、本発明1001の使用。
[本発明1003]
微生物が、1日超、2日超、3日超、4日超、5日超、6日超、7日超、8日超、9日超、10日超、11日超、12日超、13日超、14日超、15日超、16日超、17日超、18日超、19日超、20日超、21日超、22日超、23日超、24日超、25日超、26日超、27日超、28日超、29日超、30日超、31日超、32日超、33日超、34日超、35日超、36日超、37日超、38日超、39日超、40日超、41日超、42日超、43日超、44日超、45日超、46日超、47日超、48日超、49日超、50日超、60日超、70日超、またはそれより多い日数にわたり提供され、好ましくは該微生物が42日間または44日間提供される、本発明1001または1002の使用。
[本発明1004]
微生物が、組成物1kgあたり0.25*10 9 コロニー形成単位(CFU)、0.5*10 9 CFU、0.75*10 9 CFU、1.0*10 9 CFU、1.25*10 9 CFU、1.5*10 9 CFU、1.75*10 9 CFU、2.0*10 9 CFU、2.25*10 9 CFU、2.5*10 9 CFU、2.75*10 9 CFU、3.0*10 9 CFU、3.25*10 9 CFU、3.5*10 9 CFU、3.75*10 9 CFU、1.0*10 9 CFU、1.25*10 9 CFU、1.5*10 9 CFU、1.75*10 9 CFU、4.0*10 9 CFU、またはそれより多いCFUの用量で提供され、好ましくは該微生物が組成物1kgあたり少なくとも2.2*10 9 コロニー形成単位の用量で提供される、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1005]
微生物が、エガセラ目(Eggerthellales)の微生物である、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1006]
微生物が、エガセラ科(Eggerthellaceae)の微生物である、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1007]
微生物が、DSM11798株の微生物である、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1008]
微生物が、グリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)をケノデオキシコール酸(CDCA)に変換する、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1009]
微生物が、対象において胆汁酸のグリコリトコール酸(GLCA)および/またはタウロリトコール酸(TLCA)を増加させる、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1010]
消化管の健康を促進することが、腸の完全性を促進することを含む、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1011]
対象にラクツロースおよびラムノースを与えてから6時間後の尿中ラクツロース/ラムノース比が、ラクツロースおよびラムノースを与えた時点での尿中ラクツロース/ラムノース比よりも低い場合に、腸の完全性が促進されている、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1012]
健常対象が、疾患も障害も患っていない対象である、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1013]
健常対象が、該対象から得られた血漿試料中で測定されたある濃度の胆汁酸を有し、胆汁酸の該濃度が、対照試料中に存在する胆汁酸の濃度と同等である、前記本発明のいずれかの使用。
[本発明1014]
ケノデオキシコール酸(CDCA)の産生のための方法であって、
(a)コリオバクテリウム綱の微生物をグリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる、方法。
[本発明1015]
(a)前記本発明のいずれかの微生物、および
(b)プレバイオティクス、および/または
(c)プロバイオティクス
を含む、キット。
a)コリオバクテリウム綱の微生物をグリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
a)コリオバクテリウム綱の微生物をタウロケノデオキシコール酸(T-CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
a)コリオバクテリウム綱の微生物をケノデオキシコール酸(CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってリトコール酸が得られる。
a)健常対象をコリオバクテリウム綱の微生物と接触させる工程
を含む、健常対象の消化管の健康を促進するための方法に関する。
a)コリオバクテリウム綱の微生物をタウロケノデオキシコール酸および/またはグリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
a)健常対象をコリオバクテリウム綱の微生物と接触させる工程
を含む、健常対象の消化管の健康を促進するための方法に関する。
実施例1:BBSH 797によるG-CDCAの脱抱合
本実施例で使用する緩衝溶液:
ミネラル溶液I:K2HPO4(6g/L)、KH2PO4(6g/L)、(NH4)2SO4(6g/L)、NaCl(12g/L)、蒸留水を加えて1Lにする。
ミネラル溶液II:MgSO4 x 7H2O(2.5g/L)、蒸留水を加えて1Lにする。
ミネラル溶液III:CaCl2 x 2H2O(3g/L)、蒸留水を加えて1Lにする。
ビタミン溶液:ビオチン(ビタミンH、2mg/L)、葉酸(2mg/L)、ピリドキシンHCl(ビタミンB6、10mg/L)、チアミンHCl(ビタミンB1、5mg/L)、リボフラビン(ビタミンB2、5mg/L)、ニコチンアミド(5mg/L)、D,L-パントテナート(Pantotheinate)(5mg/L)、シアノコバラミン(ビタミンB12、0.1mg/L)、メナジオン(100mg/L)、フィロキノン(Phyllochinon)(ビタミンK1、22mg/L)、p-アミノ安息香酸(5mg/L)、チオクト酸(5mg/L)、蒸留水を加えて1Lにする;4℃で保存。
微量元素溶液(TE):ZnSO4 x 7H2O(0.10g/L)、MnCl2 x 7H2O(0.03g/L)、H3BO3(0.30g/L)、CuCl2 x 2H2O(0.01g/L)、CoCl2 x 6H2O(0.20g/L)、NiCl2 x 6H2O(0.02g/L)、Na2MoO4 x 2H2O(0.03g/L)、蒸留水を加えて1Lにする;4℃で保存。
ヘミン溶液(10000ppm):ヘミン1gを1M NaOH溶液50mlに溶解した。その後EtOH(92.7% v/v)50mlを加えた。4℃で保存。
リン酸緩衝液:0.5M KH2PO4パッファー(Puffer)+0.5M Na2HPO4 x 2H2O、pH=6.9、ろ過滅菌。
システイン-Na 2 S溶液(還元剤):この溶液は、セプタムキャップ付きのSchottフラスコ中でN2雰囲気下にて作製する。システインHCl 0.5gを、加熱したN2曝気蒸留水18.2mlに溶解した。4M NaOH(pH 10)1.8mlおよびNa2S 0.5gを加えた。新しく調製し、ろ過滅菌し、4℃で保存。
希釈緩衝液:75mlのミネラル溶液I、II、およびIIIそれぞれを、ビタミン溶液10ml、微量元素溶液0.5ml、ヘミン溶液0.5mlおよびシステインHCl 0.5gと合わせ、蒸留水を加えて1Lにする。pH=6.8~6.9(4M NaOH溶液で調整)、121℃で15分間オートクレーブし、新しく調製!
GCDCAおよびBBSH 797(4.09E+6 CFU/mL)を含有する、バッチT
BBSH 797なしでGCDCAのみを含有する、バッチC1
不活性化BBSH 797(4.09E+6 CFU/mL)とともにGCDCAを含有する、バッチC2。
不活性化BBSH 797とは、BBSH 797が生存可能でないことを意味する。
t=0およびインキュベーションの48時間後にサンプリングを行った。
希釈緩衝液をろ過滅菌し、2.5%(v/v)リン酸緩衝液および1%(v/v)還元剤を加えて最終希釈緩衝液を得た。すべての処理実験(Tバッチ)および不活性化対照(C2バッチ)については、最終希釈緩衝液18mlを無菌の25ml Schottフラスコに入れた。陰性対照(C1バッチ)については、最終希釈緩衝液20mLを無菌の25mL Schottフラスコに入れた。GCDCA溶液200μLをすべてのバッチに加えて、最終濃度5μMを得た。
実験設定:
合計16匹の子ブタ(O-HYB、4~5週齢、約10kg)を、離乳後に2つの異なる群に分けた。A群には、その構成成分が動物の年齢に適合されている飼料組成物(完全離乳飼料)を与えた。B群においては、同じ離乳飼料にBBSH 797を加えた(2.2*109コロニー形成単位/tkg離乳飼料組成物のBBSH 797の最終飼料中濃度)。44日間の試験期間にわたって、飼料を1日2回給与した。子ブタは、飲料水を自由に飲み、制御された条件(空間、温度、湿度、および照明)下で保たれ、エンリッチメントとして子ブタ用玩具を与えられた。動物は訓練された者によって毎日世話をされて、獣医師によって管理された。
42日目に、個々の血液試料を、すべての動物の頭蓋大静脈から採取した(Primavette(登録商標)EDTA、Kabe Laboratory GmbH、ニュームブレヒト-エルゼンロート(Nuembrecht-Elsenroth)、ドイツ)。遠心分離(2.300×g、10分)した後、2つのアリコート(それぞれ100μL)をドライアイス上に載せてBiocrates Life Sciences AG(インスブルック、オーストリア)へ輸送した。試料はそこで、胆汁酸濃度が測定されるまで-80℃で保存された。
胆汁酸の測定のため、市販の胆汁酸試験キット(Biocrates Life Sciences AG、インスブルック、オーストリア)を使用した。この目的のために、試料を乾燥フィルタースポット技術により抽出し、次いで液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(Thermo Fisher Scientific TSQ、ネガティブエレクトロスプレーイオン化、多重反応モニタリングモード)により分析した。合計20種類の一次および二次胆汁酸を、外部標準(7点の較正曲線)および内部標準(10個の同位体標識標準)を使用して定量化した。次いでデータを、Thermo Fisher Scientific Xcalibur(商標)およびBiocrates MetIDQソフトウェアを使用して評価した。
42日目に、B群で、胆汁酸のグリコリトコール酸およびタウロリトコール酸の有意な増加が観察された(図2)。それらは、アミノ酸(グリシンまたはタウリン)が結合した二次胆汁酸である。一般に、一次胆汁酸(コール酸、ケノデオキシコール酸)の二次胆汁酸(デオキシコール酸、リトコール酸)への変換は腸管微生物を介して生じる。それゆえ、さまざまな細菌の属、例えばバクテロイデス属(Bacteroides)、ビフィドバクテリウム属、またはクロストリジウム属における必須の酵素的代謝プロセス(脱抱合、7-ヒドロキシル化)が記載されている(Gerard, 2014)。BBSH 797(コリオバクテリウム科の新属、株番号DSM 11798)については、そのような報告は今のところ入手可能でない。
実験設定:
約4~10週齢の雌雄混合の離乳子ブタ(遺伝子型:O-HYB FI [(ランドレース×ラージホワイト)×ピエトレン])に耳標を付け、それぞれ重さを計り、対照群(CG)、試験群(TG)、または高濃度試験群(hTG)のいずれかに割り当てた。動物は、健常群から選択した。対照群(CG)の動物には、抗生物質、抗コクシジウム薬、プロバイオティクス、植物性添加物、および有機酸のいずれも含有しない基礎食を与えた。1日目~14日目は、基礎食の飼料には以下の成分が%(w/w)単位で含有されていた:トウモロコシ、30;オオムギ、32.9;サンフラワー油、0.6;ポテトタンパク質、7;加圧調理したトウモロコシ、6;ダイズタンパク質濃縮物、5.7;加圧調理したコムギ、4;デキストロース、4;ラクトース、3;パーム核、ココヤシ脂肪、2.5;第一リン酸カルシウム、1.23;リン酸マグネシウム、0.1;塩化ナトリウム、0.43;ビタミンプレミックス、0.1;微量元素プレミックス、0.15;L-リジン、0.56;DL-メチオニン、0.17;L-スレオニン、0.16;L-トリプトファン、0.08;甘味料、0.02。15日目~42日目は、基礎食の飼料に以下の成分が%(w/w)単位で含有されていた:トウモロコシ、40.7;オオムギ、35;ダイズ48%、20;サンフラワー油、0.5;第一リン酸カルシウム、0.94;炭酸カルシウム、1.31;リン酸マグネシウム、0.2;塩化ナトリウム、0.46;ビタミンプレミックス、0.1;微量元素プレミックス、0.15;L-リジン、0.4;DL-メチオニン、0.12;L-スレオニン、0.12。試験群(TG)の動物には対照群と同じ基礎食を与えたが、飼料には、BBSH 797(DSM 11798)を、飼料1kgあたり2.2*109CFUの最終濃度まで追加的に補充した。高濃度試験群(hTG)の動物にもCGと同じ基礎食を与えたが、飼料には、BBSH 797(DSM 11798)を、飼料1kgあたり2.2*1011CFUの最終濃度まで追加的に補充した。処置期間は42日間であった。全試験期間中、動物は不断給餌とした。新鮮な飲料水を、同じく自由に供給した。気候条件はコンピュータ操作し、離乳子ブタのための標準的な推奨に従って自動調節し、毎日記録した。午前中および午後に、農場のスタッフが動物の全体健康状態をチェックし、飼料および水の一定供給、適正な温度、ならびに換気を確実にするよう飼育設備を制御した。加えて、試験の間の動物の良好な健康状態を確認するため、獣医師が動物を定期的に調べた。試験中、檻ごとに飼料摂取量を正確に測定した。体重は、1日目、14日目、および42日目に個々に測定した。檻ごとの1日平均飼料摂取量は、1日目~42日目の間、ならびに15日目~42日目の間で測定した。檻ごとの平均飼料摂取量および平均体重を使用して、体重増加に対する給餌量の比(飼料要求率、FCR)の平均値を算出した。
全試験期間を通して、すべての動物は、いかなる認知可能な健康問題もいかなる臨床疾患症状もないままであり、減量も生じなかった。体重増加に対する、BBSH 797による飼料補充の有益な効果を以下の表1に示す。
Claims (12)
- 健常対象の腸の完全性を促進するための、DSM11798株の微生物を含む組成物。
- 食品組成物または飼料組成物である、請求項1記載の組成物。
- 微生物が、1日超、2日超、3日超、4日超、5日超、6日超、7日超、8日超、9日超、10日超、11日超、12日超、13日超、14日超、15日超、16日超、17日超、18日超、19日超、20日超、21日超、22日超、23日超、24日超、25日超、26日超、27日超、28日超、29日超、30日超、31日超、32日超、33日超、34日超、35日超、36日超、37日超、38日超、39日超、40日超、41日超、42日超、43日超、44日超、45日超、46日超、47日超、48日超、49日超、50日超、60日超、70日超、またはそれより多い日数にわたり提供される、請求項1または2記載の組成物。
- 微生物が、42日間または44日間提供される、請求項3記載の組成物。
- 微生物が、組成物1kgあたり0.25*109コロニー形成単位(CFU)、0.5*109CFU、0.75*109CFU、1.0*109CFU、1.25*109CFU、1.5*109CFU、1.75*109CFU、2.0*109CFU、2.25*109CFU、2.5*109CFU、2.75*109CFU、3.0*109CFU、3.25*109CFU、3.5*109CFU、3.75*109CFU、4.0*109CFU、またはそれより多いCFUの用量で提供される、請求項1~4のいずれか一項記載の組成物。
- 微生物が、組成物1kgあたり少なくとも2.2*10 9 コロニー形成単位の用量で提供される、請求項5記載の組成物。
- 微生物が、グリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)をケノデオキシコール酸(CDCA)に変換する、請求項1~6のいずれか一項記載の組成物。
- 微生物が、該微生物の投与前に存在するグリコリトコール酸(GLCA)および/またはタウロリトコール酸(TLCA)と比較して、対象において胆汁酸のGLCAおよび/またはTLCAを増加させる、請求項1~7のいずれか一項記載の組成物。
- 対象にラクツロースおよびラムノースを与えてから6時間後の尿中ラクツロース/ラムノース比が、ラクツロースおよびラムノースを与えた時点での尿中ラクツロース/ラムノース比よりも低い場合に、腸の完全性が促進されている、請求項1~8のいずれか一項記載の組成物。
- 健常対象が、疾患も障害も患っていない対象である、請求項1~9のいずれか一項記載の組成物。
- 健常対象が、該対象から得られた血漿試料中で測定されたある濃度の胆汁酸を有し、胆汁酸の該濃度が、対照試料中に存在する胆汁酸の濃度と同等である、請求項1~10のいずれか一項記載の組成物。
- ケノデオキシコール酸(CDCA)の産生のためのインビトロの方法であって、
(a)DSM11798株の微生物をグリコケノデオキシコール酸(G-CDCA)と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる、方法。
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