CN109998112B - 红蝽杆菌纲促进肠道健康的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及红蝽杆菌纲的微生物用于促进健康受试者的肠道健康的用途。还提供了一种用于生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法和一种用于生产石胆酸(LCA)的方法。

Description

红蝽杆菌纲促进肠道健康的用途
本发明的技术领域
本发明涉及红蝽杆菌纲的微生物用于促进健康受试者的肠道(gut)健康的用途。还提供了一种用于生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法和一种用于生产石胆酸(LCA)的方法。
背景技术
在常见的生物医学文献中，胆汁酸或胆汁盐具有24个碳原子并且缩写为C24胆汁酸，这与具有25-27个碳原子(C27、C26、C25胆汁酸)并且存在于原始(如腔棘鱼和鲨鱼)和较不原始(如爬行动物和两栖动物)脊椎动物的胆汁酸池中的“原始”胆汁酸相对照。在高等脊椎动物中，C24胆汁酸构成胆汁的主要部分(Hofmann等，(1992)“A proposed nomenclaturefor bile acids”Lipid Res.1992Apr；33(4):599-604)。肝脏以胆固醇为代价合成胆汁酸，并从血液中回收再吸收的胆汁酸。靠着陡的浓度梯度，来自肝细胞的胆汁酸与胆固醇和磷脂一起分泌到胆汁中。因此，在两餐之间，大部分胆汁酸存在于胆囊中以备在短时间内使用。
初级胆汁酸因此是由肝脏合成的那些，并且主要包含胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)。这些胆汁酸被分泌到胆汁中并主要与甘氨酸和牛磺酸缀合，从而具有增强的水溶性。在肠道中释放的胆汁酸促进膳食脂肪和脂溶性维生素的吸收。
通过肠道细菌进行的修饰，由初级胆汁酸获得次级胆汁酸。主要的修饰为去缀合，在3、7和12位羟基的氧化和7-脱羟基。主要的次级胆汁酸为石胆酸(LCA)和去氧胆酸(DCA)。
然而，胆汁酸不仅在消化中起作用，而且还对健康和疾病具有影响。此外，胆汁酸还起信号传导分子的作用。例如，胆汁酸可以作为多种因素之一来影响肠道(gut)微生物群的组成或发挥抗微生物活性(Boesjes和Brufau(2014)“Metabolic effects of bileacids in the gut in health and disease”Current Medicinal Chemistry,21,2822-2829)。
特别地，胆汁酸介导对早期断奶仔猪的肠道完整性和性能的影响。现有证据表明，活化由胆汁酸控制的肠(intestinal)信号传导通路可以刺激内源性GLP-2的释放，由此改善肠萎缩和功能障碍实验模型中的肠道完整性(de Diego-Cabero等，(2015)“Bile acidmediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.”BMC veterinary research 11:111)。
在这种情况下，注意到肠屏障和肠道健康通常决定了可以从肠腔迁移进入到体内的病原体的数量，从而增加了对疾病的易感性。此外，肠上皮功能越好，吸收的营养物越多，这反过来又决定了动物的生长能力。因此，肠屏障的健康对动物的福祉具有显著影响。
原则上，为了加强(如断奶期的仔猪)的肠屏障，可以区分三种不同的策略：
1)改善饲料的适口性以增加采食量；
2)添加必需营养素以弥补由肠屏障受损导致的损失；
3)添加增强肠屏障的生物活性物质。
为了克服上述问题和缺陷，需要开发一种饲喂概念，所述概念一方面在断奶仔猪中有效，另一方面在实际条件下可易于应用。
此外，本领域具有开发促进健康受试者中肠道健康的方法/用途的需求。
发明内容
在下文描述了、实施例中举例说明了、在附图中阐释了并在权利要求中反映了本发明的方案。
本发明涉及红蝽杆菌纲(Coriobacteriia)的微生物用于促进健康受试者的肠道健康的用途。
此外，本发明涉及一种用于生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)接触；
由此获得鹅去氧胆酸。
还提供了一种用于生产石胆酸(LCA)的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与鹅去氧胆酸(CDCA)接触；
由此获得石胆酸。
本发明还涉及一种用于促进健康受试者的肠道健康的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与受试者接触。
附图说明
附图示出了：
图1体外实验获得的结果。
图2在断奶仔猪中BBSH 797对胆汁酸的血浆浓度的影响(平均值±标准偏差，第42天)。动物(n＝8)接受断奶饲料(A组)或添加BBSH 797的断奶饲料(2.2*109菌落形成单位/kg饲料，B组)达42天。以上标(a，b)表示两组之间的统计学显著性差异(p<0.05)。
图3在施用糖溶液后六小时的断奶仔猪中BBSH 797对乳果糖/鼠李糖比率的影响(500mg乳果糖/kg体重，100mg鼠李糖/kg体重，第43天)。动物(n＝8)接受断奶饲料(A组)或添加BBSH 797的断奶饲料(2.2*109菌落形成单位/kg饲料，B组)达44天。以上标(*)表示两组之间的统计学显著性差异(p<0.05)。
令人惊讶地发现，红蝽杆菌纲的微生物(即菌株DSM 11798)促进受试者的肠道健康。本发明人发现了一种加强受试者的肠道屏障的饲喂策略。这一策略是通过向受试者的饲料中添加细菌BBSH 797(伊格尔兹氏菌科(Eggerthellaceae)的novus属，菌株编号11798(DSM 11798))来实现的。
向饲料中添加BBSH 797使断奶幼畜中胆汁酸甘氨石胆酸和牛磺石胆酸显著增加。这些胆汁酸充当信使并启动分子级联，最终导致断奶仔猪肠道完整性的显著改善。更确切地说，BBSH 797的补充导致断奶仔猪血浆中的甘氨石胆酸和牛磺石胆酸特异性升高。这具有生物学相关性，因为这些物质在TGR5受体上充当强烈的天然激动剂(Schaap等，(2014)“Bile acid receptors as targets for drug development”Nature ReviewsGastroenterology&Hepatology11(1):55-67；Kawamata等，(2003)“A G protein-coupledreceptor responsive to bile acids*”vol.278,no.11,pp.9435-9440)。这些受体位于某些肠上皮细胞(L细胞)的细胞膜中。当这些受体被激活后，其触发级联反应，最终导致肽即胰高血糖素样肽2(GLP-2)的释放。
值得注意的是，外源GLP-2可以恢复粘膜生长，跨细胞转运和控制细胞旁路通透性的紧密连接蛋白的表达。此外，长期施用GPL-2可以增加小肠和结肠中的绒毛高度和隐窝深度。还已经表明，施用GPL-2的长效类似物可以增加肠重量和酶活性。GPL-2的这些有益作用中的一些是在早期断奶的动物中获得的(de Diego-Cabero等，(2015)“Bile acidmediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.”BMC veterinary research11:111)。类似的，Connor等，(2016)发现GPL-2引发多种肠反应，这些反应导致肠道健康增加，最显著的是加强肠道屏障(Connor等，(2016)“Glucagon-likepeptide 2and its benefcial effects on gut function and health in productionanimals”Domestic Animal Endocrinology 56,S56-S65)。
由本发明人实施的进一步实验表明，甘氨石胆酸和牛磺石胆酸的胆汁酸浓度升高和/或BBSH 797的施用与改善的肠道屏障之间存在相关性。使用双糖分析评估肠道屏障的完整性。该试验的原理基于乳果糖和鼠李糖的共同施用。二糖乳果糖仅通过个体肠上皮细胞之间的狭窄间隙以细胞旁路的方式进入血流。另一方面，单糖鼠李糖通过肠细胞以细胞旁路的方式和跨细胞方式转运到体内。当肠屏障减弱时，胞间隙变得越来越多孔，结果吸收了相对更大量的二糖。因此，尿液中的乳果糖/鼠李糖比率增加。完整或加强的肠屏障与尿液中乳果糖/鼠李糖比率的降低相关(Wijtten等，(2011)“Intestinal barrier functionand absorption in pigs after weaning:a review.”Br J Nutr105:967-981)。本申请的实施例表明，施用BBSH 797数周导致了尿乳果糖/鼠李糖比率显著降低。这证明了BBSH 797应用使肠的完整性得到加强。因此，BBSH 797促进了肠道健康。
另外，在体外实验中惊讶地发现，BBSH 797能够将甘氨鹅去氧胆酸转化为鹅去氧胆酸。根据文献，后者可导致GLP-2的释放。正如de Diego-Cabero中所解释的，GLP-2的增加使肠道完整性得到改善(de Diego-Cabero等，(2015)“Bile acid mediated effects ongut integrity and performance of early-weaned piglets.”BMC veterinaryresearch 11:111)。
因此，本发明涉及红蝽杆菌纲的微生物用于促进健康受试者的肠道健康的用途。
如本文所用，“红蝽杆菌纲的微生物”可以是红蝽杆菌纲的任何微生物。本文所述的红蝽杆菌纲的分类学分类基于Gupta等，(2013)“Molecular signatures for the classCoriobacteriia and its different clades；proposal for division of the classCoriobacteriia into the emended order Coriobacteriales,containing the emendedfamily Coriobacteriaceae and Atopobiaceae fam.nov.,and Eggerthellalesord.nov.,containing the family Eggerthellaceae fam.nov.”Int.J.Syst.Evol.Microbiol.63(Pt 9),pp.3379-3397，以及基于NCBI分类浏览器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi，2017年10月15日在线提供的版本)和基于LPSN bacterioi.net在线工具(http://www.bacterio.net/eggerthella.html，2017年10月15日在线提供的版本)。
红蝽杆菌纲所包含的示例性微生物目是红蝽杆菌目(Coriobacteriales)和伊格尔兹氏菌目(Eggerthellales)。设想本发明中所采用的微生物为红蝽杆菌目或伊格尔兹氏菌目的微生物。进一步设想本发明中所采用的微生物为红蝽杆菌目的微生物。还预期本发明中所采用的微生物为伊格尔兹氏菌目的微生物。
红蝽杆菌目的微生物可以包括红蝽杆菌目内的任何微生物。包括在红蝽杆菌目内的示例性科为例如阿托波菌科(Atopobiaceae)、红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)和未分类的红蝽杆菌目菌。伊格尔兹氏菌目的微生物可以包括伊格尔兹氏菌目内的任何微生物。包括在伊格尔兹氏菌目内的示例性科为例如伊格尔兹氏菌科和未分类的伊格尔兹氏菌目菌。设想本发明中所采用的微生物为红蝽杆菌科的微生物。还预期本发明中所采用的微生物为伊格尔兹氏菌科的微生物。
包括在阿托波菌科内的示例性属为例如阿托波菌属(Atopobium)、Libaniococcus、欧陆森菌属(Olsenella)和未分类的阿托波菌科菌。包括在伊格尔兹氏菌科内的示例性属为例如Adlercreutzia、Arabia、非消化糖杆菌属(Asaccharobacter)、神秘杆菌属(Cryptobacterium)、反硝化杆菌属(Denitrobacterium)、伊格尔兹氏菌属(Eggerthella)、肠杆菌属(Enterorhabdus)、戈登氏杆菌属(Gordonibacter)、类伊格尔兹氏菌属(Paraeggerthella)、Phonicibacter、Raoultibacter、斯莱克氏菌属(Slackia)和未分类的伊格尔兹氏菌科菌。本发明预期本发明中所采用的微生物为未分类的伊格尔兹氏菌科属的。包括在红蝽杆菌科内的示例性属为例如扣林氏菌属(Collinsella)、红蝽杆菌属(Coriobacterium)和未分类的红蝽杆菌科菌。设想本发明中所采用的微生物为伊格尔兹氏菌科的微生物。设想本发明中所采用的微生物为DSM11798属的微生物。
进一步设想本发明中采用的微生物可以是菌株DSM11798(本文中也称为BBSH797)的微生物。DSM11798于1997年9月17日保藏在DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig,Germany。
预期本发明中采用的微生物可包含与SEQ ID NO:1(DSM11798的16S-RNA序列)和/或SEQ ID NO:2的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸分子。
如本文所用，术语“核酸分子”或“核酸”涵盖任意核酸分子，其具有包含嘌呤和嘧啶碱基的碱基的核苷酸序列，所述碱基由所述核酸分子包含，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构。如本领域技术人员将容易理解的，核酸序列可包括有义和反义链的DNA、cDNA、基因组DNA、RNA，或者可以含有非天然或者衍生的核苷酸碱基。多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。术语“RNA”可包括任意RNA分子。示例性RNA分子包括信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA。所述核酸分子可以是16S rRNA。
可以对DNA和RNA做出多种修饰；从而术语“核酸分子”可包括化学、酶促或者代谢修饰的形式。“经修饰的”碱基包括例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基(如次黄嘌呤)。可以将经修饰的核酸分子例如用在用于检测本文所述的核酸分子的方法中。
根据本发明，在两个或更多个核酸分子上下文中的术语“同一的”或者“同一性百分比”是指当使用本领域中已知的序列比对算法或通过手工比对和目测进行测量时，在对比窗口内或指定区域内以最大对应进行比较和比对，相同的两个或更多个序列或子序列，或者具有指定相同核苷酸百分比(如至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性)的两个或更多个序列或子序列。具有例如80％至95％或更高序列同一性的多个序列被认为是实质上相同的。此类定义也适用于测试序列的补体。使用例如诸如本领域中已知的基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(BrutlagComp.App.Biosci.6(1990),237-245)的算法，本领域技术人员将了解如何确定序列之间的百分比同一性。
本领域技术人员还可以获得的是BLAST和BLAST 2.4算法(Altschul Nucl.AcidsRes.25(1977),3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序使用字长(W)28、期望值10和两条链的比较作为默认值。此外，可以采用BLOSUM62评分矩阵(HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.,USA,89,(1989),10915)。
例如，代表基本局部比对搜索工具(Altschul,Nucl.Acids Res.25(1997),3389-3402；Altschul,J.Mol.Evol.36(1993),290-300；Altschul,J.Mol.Biol.215(1990),403-410)的BLAST2.4可以用于搜索局部序列比对。
获得本发明中采用的微生物的方法是本领域技术人员已知的。通常，这需要自来源(例如DSM11799)中分离本发明中使用的微生物。然后可以使该微生物在培养物或发酵液中生长。可选地，可以使包含微生物的来源直接在培养物或发酵液中生长。生长后，可以将微生物纯化。还设想使用其中已经生长了微生物的培养物或发酵液。
例如，可以按照WO 99/35240中所述获得此类微生物。如其中所述，可以自DSM11799的共培养物中获得所述菌株DSM 11798。特别地，菌株DSM 11799也已于1997年9月17日保藏于DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig,Germany。
使用靶向革兰氏阴性细菌的抗生素，在标准厌氧条件下最初(并重复地)自若干牛瘤胃内容物中分离出了活性革兰氏阳性细菌BBSH 797(DSM 11798)。技术人员已知分离和获得目标微生物的方法。
进一步预期本发明中采用的微生物可以是厌氧革兰氏阳性细菌。另外地或可选地，本发明中采用的微生物可具有杆状外观。另外地或可选地，本发明中采用的微生物可以是不形成芽胞的。另外地或可选地，本发明中采用的微生物可以是0.1至3μm长。所述微生物可以单独地、成对地或以长链形式出现，特别是长达约150μm。本领域技术人员已知如何测量这些参数。
另外地或可选地，同样如本文其它地方所述，本发明中采用的微生物可能够将G-CDCA转化为CDCA。另外地或可选地，同样如本文其它地方所述，本发明中采用的微生物可能够将CDCA转化为LCA。
本发明中采用的微生物可用作“整个的”单细胞微生物，因此可用作可见完整的微生物。还预期本发明中采用的微生物可以是存活(viable)或活的(living)微生物。
还设想可以使用所述微生物的制剂。这意味着微生物可以不作为整体存在，而是以细胞片段存在或者存在所述微生物的DNA和/或16SrRNA或特定酶。
例如，为了检测组合物中存在BBSH 797或者本发明中是否采用了BBSH 797，可以实施采用DNA提取标准方法的16SrRNA序列分析、编码16SrRNA的DNA的PCR扩增和PCR扩增子的DNA测序。
另外地或可选地，尤其对于诸如饲料的组合物，可将实时聚合酶链反应(qPCR)用于检测和识别BBSH 797。因此，可以用标准方法从样品/组合物中提取并纯化DNA。qPCR检测可以基于标记基因的检测，所述标记基因如SEQ ID NO:1所示的BBSH 797 16SrRNA基因序列(另外地或可选地，所述标记基因还有如SEQ ID NO:2所示的cpn60基因)。由于16SrRNA基因含有保守区和可变区，因此对于BBSH 797的特异性检测，可以如Matsuki等2004所述使引物靶向可变区，从而允许从样品如饲料中的BBSH 797RNA序列的特异性扩增(Matsuki等，(2004)“Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCRAnalysis of Predominant Bacteria in Human Feces.”Applied and EnvironmentalMicrobiology 70(12):7220-7228)。在qPCR反应中，获得的荧光信号与PCR产物的量成比例，并给出关于样品中靶序列存在的信息。解链曲线分析提供了关于扩增子特异性的进一步信息，显示了序列依赖性的解链行为。
因此，术语微生物也包括微生物的制剂。本发明还考虑将该微生物用作微生物的制剂。这种制剂还可以进一步包含分子和/或蛋白质和/或物质，例如分离和/或生长本发明中采用的微生物时使用的缓冲液的残留物。
在本发明中采用的微生物可以在组合物中提供。原则上，所述微生物可以在适合于本发明的用途和方法的任何组合物中提供。
因此，本发明还涉及一种包含红蝽杆菌纲的微生物的组合物用于促进健康受试者的肠道健康的用途。示例性组合物包括食品组合物、饲料组合物、如用于饮用目的的液体组合物。设想用于本发明的微生物可以在食品和/或饲料组合物中提供。本发明中采用的微生物也可以作为饲料添加剂或饲料添加剂的制剂提供。
因此，本发明还涉及红蝽杆菌纲的微生物在制备用于促进健康受试者的肠道健康的组合物中的用途。
制备此类食品和/或饲料组合物的方法是本领域技术人员已知的并在WO 99/35240中特别描述。
通过例如离心或过滤和/或稳定化，特别是通过冷冻干燥或喷雾干燥或包封，可以浓缩包含本发明中采用的微生物的培养物或发酵液。在这方面，例如，通过离心或过滤移除液体和/或直接从发酵液中进行稳定化而在第一步中可以浓缩包含本发明中采用的微生物的培养物或发酵液。还设想本文描述的组合物中存在填料、脱模剂(release agent)和/或载体材料，比如硅酸铝、硅藻土、碳水化合物、糖醇、淀粉、牛奶和乳清粉、蛋白质水解产物、酵母菌、海藻粉(seaweed meal)和/或聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。还设想加入酵母菌和/或海藻粉作为载体。还设想加入硅藻土作为脱模剂。通过加入这些载体或填料，例如，可以在接下来的稳定化步骤(比如冷冻干燥、喷雾干燥、封装成球步骤)中获得固体产物，在该固体产物中，本发明采用的微生物的培养物可以直接沉积在载体上。所述微生物或其混合培养物可以沉积在具有大的内表面积的物质上，此类物质诸如粘土(argillaceous earth)、硅酸铝、沸石等。特别地，所述微生物可以沉积在酵母菌和/或海藻粉上。
另外地或可选地，所述组合物可以包含载体材料和/或填料和/或脱模剂。通过添加载体材料和/或填料，(如果需要)可以使饲料中可能含有的待降解的有害物质物理地结合到这些物质上，从而使这些物质不再可用于代谢。在这种情况下，特别是可将硅酸铝、硅藻土、碳水化合物、糖醇、淀粉、牛奶和乳清粉、蛋白质水解产物、酵母菌和/或聚乙烯聚吡咯烷酮用作载体材料和/或填料。
在本发明中采用的组合物可包含载体材料和/或填料的1至99重量％、优选0.5至1重量％和/或99至1重量％的喷雾或冷冻干燥的红蝽杆菌纲的微生物。
所述组合物可以是饲料添加剂。该饲料添加剂可以以0.1至8.0kg/1000kg组合物(比如饲料/食品组合物)的量应用，特别是以0.5至2.0kg/1000kg组合物(比如饲料/食品组合物)的量应用。
另外地或可选地，所述组合物可包含一种或多种益生菌。如本文所用的“益生菌”是被认为在食用时提供健康益处的微生物。在施用时，益生菌必须是存活的。原则上可以使用任何益生菌。本领域技术人员已知适用于本发明的益生菌。
因此，所述组合物可包含一种或多种与本发明中采用的微生物不同的微生物。原则上，可将任何合适的微生物添加至所述组合物。示例性微生物包括脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通类杆菌(B.vulgates)、产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和乳酸菌和双歧杆菌比如两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)或其生物功能等同物、梭菌(Clostridium)比如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和真细菌(Eubacteria)的菌种。
另外地或可选地，所述组合物包含一种或多种益生元。本文所用的“益生元”为诱导有益微生物(如细菌和真菌)的生长或活性的食物成分。更准确地说，益生元可能是一种选择性发酵的成分，它允许胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，从而带来益处。原则上可以采用任何益生元。本领域技术人员已知适用于本发明的益生元。
益生元可以是不可消化的纤维的化合物，其未消化地通过胃肠道上部并刺激有益细菌的生长或活性，这些有益细菌定殖于作为其基底的大肠。包含益生元并可以加入到组合物中的食物包括未加工阿拉伯胶(Gum Arabic,Raw)、干的未加工菊苣根(Dry ChicoryRoot Raw)、干的未加工菊芋(Dry Jerusalem Artichoke Raw)、干的未加工蒲公英嫩叶(Dry Dandelion Greens Raw)、干的未加工大蒜(Dry Garlic Raw)、干的未加工韭菜(DryLeek Raw)、干的未加工洋葱(Dry Onion Raw)、未加工芦笋(Asparagus Raw)、麦麸(Wheatbran)、全麦面粉(Whole Wheat flour)和熟化未加工香蕉(Cooked Raw Banana)。所述益生元还可包括如Slavin(2013)“Fiber and Prebiotics:Mechanisms and Health Benefits”Nutrients.5(4):1417–1435”中所述的纤维。所述益生元还可以是低聚半乳糖(galactooligosaccharid)。
因此，另外地或可选地，所述组合物可包含一种或多种低聚半乳糖来源。例如，所述组合物可进一步包含以下中的一种或多种：液态奶、干奶粉比如全脂奶粉、脱脂奶粉、富含脂肪的奶粉、乳清粉、发酵奶制品、饮料、谷类、面包、食品和饲料补充剂、膳食补充剂、动物饲料、家禽饲料或其它任何食品或饮料。在例如Torres等，(2010)“Galacto-Oligosaccharides:Production,Properties,Applications,and Significance asPrebiotics”Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,Volume 9,Issue 5,p.438-454中描述了其它的低聚半乳糖及可如何获得低聚半乳糖。
另外地或可选地，所述组合物可包含至少一个选自以下的组分：维生素、矿物质、酶和用于使霉菌毒素解毒的组分。所述酶可选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶或葡聚糖酶、水解酶、脂肪水解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、植酸酶和木聚糖酶和/或它们的组合。霉菌毒素解毒组分可选自霉菌毒素解毒酶，比如黄曲霉毒素氧化酶、麦角胺水解酶、麦角胺酰胺酶、赭曲霉素酰胺酶、伏马菌素羧酸酯酶、伏马菌素氨基转移酶(fumonisinaminotransferase)、氨基多醇氨基氧化酶(aminopolyol aminoxidase)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇环氧化物水解酶(deoxynivalenol epoxide hydrolase)、玉米烯酮水解酶；或霉菌毒素解毒微生物；或霉菌毒素结合组分，比如微生物细胞壁或比如皂土(bentonite)的无机材料。还设想所述组合物可包含皂土和/或伏马菌素氨基转移酶(如EC 3.1.1.87)。
进一步设想，可以提供本发明中采用的微生物或组合物达多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70或更多天。例如，可以提供本发明中采用的微生物达42或44天。还可以提供本发明中采用的微生物达少于70、60、50、45、40或更少天。
还预期可以以每kg 0.25*109、0.5*109、0.75*109、1.0*109、1.25*109、1.5*109、1.75*109、2.0*109、2.25*109、2.5*109、2.75*109、3.0*109、3.25*109、3.5*109、3.75*109、4.0*109、4.25*109、4.5*109、4.75*109、5.0*109或更多菌落形成单位的剂量提供本发明中采用的微生物。可以在如作为食品和/或饲料(组合物)的组合物中以该种剂量提供所述微生物，所述组合物可以由所述受试者摄入。例如，可以以每kg至少2.0*108、5.0*108、7.0*108、1.0*109、2.0*109或至少2.2*109菌落形成单位的剂量提供本发明中采用的微生物。可以在如食品和/或饲料(组合物)的组合物中以该种剂量提供所述微生物，所述组合物可以由所述受试者摄入。可以以每kg低于5.0*109、4.5*109、4.0*109、3.5*109、3.0*109、2.5*109、2.0*109、1.5*109或更少的菌落形成单位的剂量提供本发明中采用的微生物。可以在如食品和/或饲料(组合物)的组合物中以该种剂量提供所述微生物，所述组合物可以由所述受试者摄入。可以以每kg低于5.0*109、4.5*109、4.0*109、3.5*109、3.0*109、2.5*109、2.0*109、1.5*109、1.0*109、9.0*108、8.0*108、7.0*108、6.0*108、5.0*108、4.0*108、3.0*108、2.0*108、1.0*108或更少的菌落形成单位的剂量提供本发明中采用的微生物。可以在如食品和/或饲料(组合物)的组合物中以该种剂量提供所述微生物，所述组合物可以由所述受试者摄入。可以以每kg 7.0*109-1.0*108、6.0*109-2.0*108、5.0*109-3.0*108、4.0*109-5.0*108、3.0*109-6.0*108或2.5*109-8.5*108的菌落形成单位的剂量提供本发明中采用的微生物。可以在如食品和/或饲料(组合物)的组合物中以该种剂量提供所述微生物，所述组合物可以由所述受试者摄入。
显然，当在本发明中采用的微生物作为饲料添加剂提供时，在该饲料中菌落形成单位的数量可以比在最终组合物(final composition)中使用的菌落形成单位的数量高得多，所述最终组合物比如本文所述的(最终或饲喂)饲料/食品组合物。
如本文所用，术语“菌落形成单位”或“CFU”是评估样品中存活细菌数量的量度。将存活定义为在受控条件下通过二进制裂变倍增的能力。技术人员已知测定CFU的方法。
本发明还预期本发明中采用的微生物能够将甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)转化成鹅去氧胆酸(CDCA)。
另外，本发明设想，如与施用所述微生物之前的GLCA和/或TLCA的水平/浓度相比或与适当的对照相比，本发明中采用的所述微生物能够增加受试者中的胆汁酸甘氨石胆酸(GLCA)和/或牛磺石胆酸(TLCA)。例如，可以在比如已经自受试者获得的血液样品(比如血浆样品)的样品中测量所述胆汁酸甘氨石胆酸(GLCA)和/或牛磺石胆酸(TLCA)。技术人员已知测量GLCA和TLCA存在的方法。例如，可以采用HPLC或商购可获得的ELISA试剂盒测量这些胆汁酸。
本文所述的微生物用于促进健康受试者的肠道健康。
本文所述的术语“肠道健康”意指肠道的健康状态。可以使用任何标记/特征/形态方面等来确定肠道健康。此类标记/特征/形态方面是技术人员已知的。尤其在Derikx等，(2010)“Non-invasive markers of gut wall integrity in health and disease”WorldJournal of Gastrology 16(42):5272-5279中描述了示例性方法。
进一步预期当使肠道完整性增加/促进时，则认为促进了肠道健康。因此，本发明还涉及红蝽杆菌纲的微生物用于促进健康受试者的肠道完整性的用途。
如本文所用，“肠道完整性”是指肠(上皮)屏障的完整性。肠(上皮)屏障维持生理肠道功能，并且可以作为宿主防御来自环境的潜在有害应激源(比如细菌和病毒以及食品中存在的天然抗原和毒素)的第一线。物理肠屏障主要由通过紧密的接合点(junction)连接的上皮细胞形成，所述接合点形成密封靠近腔表面的邻近上皮细胞的网络，从而防止腔内抗原的细胞旁路转运。肠正常的无懈可击的上皮屏障的破坏将导致肠道“渗漏”发生或肠道完整性受损。解离的肠紧密接合点可以允许腔内抗原的细胞旁路浸润，并且被认为是慢性肠炎症(比如炎性肠病(IBD))的发作和发展中的关键致病因子。可如何评估肠道完整性(肠屏障功能)是技术人员已知的并在例如Wang等，(2015)“Methods to determineintestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.”JImmunol Methods；421:44–53或Grootjans等，(2010)“Non-invasive assessment ofbarrier integrity and function of the human gut”World J Gastrointest Surg；2(3):61–69中描述。
例如，当受试者被饲喂乳果糖和鼠李糖后6小时尿液中乳果糖/鼠李糖比率低于饲喂乳果糖和鼠李糖时尿液中乳果糖/鼠李糖比率，则可认为促进了肠道完整性。正如本文在其它地方所述，所述受试者可以是健康受试者。
当与对照相比，胆汁酸甘氨石胆酸和/或牛磺石胆酸增加到一定程度时，则也可以认为促进了肠道健康/肠道完整性。例如，此类增加可以是与这样的增加类似的增加，所述增加为当与未接受本发明中采用的微生物的受试者相比，接受本发明中采用的微生物的受试者的胆汁酸甘氨石胆酸和/或牛磺石胆酸显示的增加。在此类比较中，接受了本发明中采用的微生物的受试者的甘氨石胆酸和/或牛磺石胆酸的浓度增加。可选地或另外地，与接受本发明中采用的微生物之前的受试者相比，接受了本发明中采用的微生物的受试者的胆汁酸甘氨石胆酸和/或牛磺石胆酸也可以增加。因此，还可以将与后一检测到的甘氨石胆酸和/或牛磺石胆酸浓度的增加类似的增加看作促进肠道健康。
术语“受试者”是指适用于本发明目的的任何受试者。所述受试者可以是脊椎动物。因此，所述受试者可以是哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物或鱼类。哺乳动物包括、但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、人类、小鼠和大鼠。所述哺乳动物可以是人、狗、猫、小鼠、大鼠等。所述受试者还可以是马、牛、猪、山羊、鸡、绵羊、驴、兔、羊驼、美洲驼、鹅、公牛、火鸡等等。所述受试者也可以是人。所述受试者可以是动物，优选地所述受试者可以是哺乳动物。例如，所述受试者可以是猪，优选地为仔猪，更优选地为断奶仔猪。
所述受试者可以是“健康受试者”。健康受试者可以是未受疾病或病症影响的受试者。优选地，“健康受试者”的定义包括未受由于毒素引起的中毒影响的受试者，所述毒素例如存在于食品或饲料中。优选地，“健康受试者”的定义包括未受有害肠道菌群影响的受试者。更优选地，所述有害肠道菌群包括有害细菌菌群。例如，健康受试者可以具有与对照水平或对照值相当的胆汁酸浓度。另外，所述健康受试者可以具有在血浆样品中测量的一种或多种胆汁酸浓度，所述血浆样品已经自所述受试者获得，所述胆汁酸浓度与存在于对照样品中的胆汁酸浓度相当。特别地，当在已经自(健康)受试者获得的血浆样品中测量时，所述胆汁酸GLCA和/或TLCA的浓度与在对照样品中测量的GLCA和/或TLCA的浓度相当(约相同)。可以在已经自受试者获得的血浆样品中测量该胆汁酸。如何测量此类胆汁酸是技术人员已知的并也在本文中进行了描述。
所述受试者还可以是患有疾病或病症的受试者。此类病症或疾病可以包括例如影响肠道的疾病或病症。所述健康受试者还可以是断奶的动物。
如本文所用，“对照”是指适用于本发明的方法/用途的任何对照。例如，对照可以是生物标志物/标志物的浓度，如在对照样品中测定的如本文所述的某种胆汁酸的浓度。可选地或另外地，所述对照还可以是通过技术人员已知的手段和方法测定的对照值。
例如，生物标志物/标志物(如胆汁酸)的对照水平/浓度可以是自健康受试者获得的样品中的标志物的浓度，所述健康受试者如未患有肠道疾病或本文所述的疾病的动物。因此，所述对照样品可以如自健康受试者获得，所述健康受试者如未患有任何疾病或病症、特别是未患有任何影响肠道的疾病或病症的受试者(比如动物)。然后，可以在此对照样品中测量本文所述的标志物(如胆汁酸)的浓度以提供用于比较的对照值。可以自其获得对照样品的受试者可以与自其获得样品的受试者或待测受试者具有例如相同的年龄和/或体重等。例如，所述对照或对照样品可以与自所述受试者获得的样品具有相同的类型。
用于本发明目的的对照还可以包括健康(对照)受试者，优选没有疾病或病症、特别是没有影响肠道的疾病或病症的受试者，或者甚至是代表健康对照组的标准对照或一般的本领域已知的用于肠道疾病的标准。理想情况下，对照组的受试者没有并发的疾病或病症，特别是没有任何肠道疾病。对照组可以是若干健康的，例如3个或更多个，优选5个或更多个，更优选10、20、30、40或50个人的组，并且可以用已知方法检查健康，本文中也提及了这些方法中的一些。
所述对照还可以是断奶的受试者。所述对照还可以是未接受本发明中采用的微生物的受试者。
本发明还涉及一种用于生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)接触；
由此获得鹅去氧胆酸。
另外地或可选地，本发明还涉及一种用于生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与牛磺鹅去氧胆酸(T-CDCA)接触；
由此获得鹅去氧胆酸。
本发明中采用的微生物能够进行将T-CDCA/G-CDA转化为CDCA所必需的该去缀合步骤，这可以从本文所述的实施例中看出。
如本文所用的“鹅去氧胆酸”(也称为鹅脱氧胆酸、鹅胆酸(chenocholic acid)和3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸或CDCA)作为胆汁酸存在。将该羧酸的盐称为鹅去氧胆酸盐。鹅去氧胆酸是由肝脏产生的主要胆汁酸之一。鹅去氧胆酸不溶于水，但溶于乙醇和乙酸，熔点为165-167℃。鹅去氧胆酸可以通过涉及若干酶促步骤的过程在肝脏中由胆固醇合成。与其它胆汁酸一样，鹅去氧胆酸可以在肝脏中与牛磺酸或甘氨酸缀合，形成牛磺鹅去氧胆酸(T-CDCA)或甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)。特别地，此类缀合物由C-24N-酰基酰胺键形成，该键将胆汁酸与其氨基缀合物(甘氨酸和牛磺酸)连接。然而，根据物种的不同，该键也可以是C-25N-酰基酰胺键、C-26N-酰基酰胺键或C-27N-酰基酰胺键。
通常，缀合的胆汁酸的C-24N-酰基酰胺键的水解由胆汁盐水解酶(BSH)催化。大多数BSH水解甘氨酸和牛磺酸缀合的胆汁酸，而少数显示出强的特异性。已经在肠道微生物群的主要细菌属中检测到BSH基因，并且该酶可以自如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通类杆菌(B.vulgates)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)和乳酸菌和双歧杆菌的若干种中纯化。
因此，为了确认本发明的方法有效，可以进行以下测试。使本发明中采用的微生物的培养物和包含能够用于该转化的细菌之一(如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens))的培养物分别与T-CDCA和/或G-CDCA接触。一段时间后，对培养上清液取样并分析CDCA的存在。如果CDCA存在于两种培养物中，则显示本发明的方法有效。
所述方法可包括使T-CDCA和/或G-CDCA与包含本发明中采用的微生物的制剂接触。例如，所述制剂可仅包含本发明中采用的微生物的细胞质组分。
所述方法可进一步包括纯化鹅去氧胆酸的步骤。
另外，实施这种反应的方法以及合适的缓冲液等是本领域技术人员已知的，并且也在本文的实施例中进行了描述。进一步预期所述方法在生物反应器(如大规模生物反应器)中实施。
可以将由本发明的方法获得的鹅去氧胆酸用于任何目的。例如，它可以用于溶解胆结石的方法中。另外地或可选地，可以将由本发明的方法获得的鹅去氧胆酸用于治疗脑腱性黄瘤病(cerebrotendineous xanthomatosis)、丙型肝炎感染和/或便秘。
本发明还涉及一种用于生产石胆酸(LCA)的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与鹅去氧胆酸(CDCA)接触；
由此获得石胆酸。
如本文所用，术语“石胆酸”(也称为“3α-羟基-5β-胆甾烷-24-酸”或“LCA”)是一种作为洗涤剂溶解脂肪以吸收的胆汁酸。已知通过例如细菌7α-脱羟基酶自CDCA产生LCA。已知梭菌(Clostridium)和真细菌(Eubacteria)的菌株可以进行这种7-脱羟基。
例如，在肝细胞中，初级和次级胆汁酸均在侧链上的C-24(或C-25、C-26或C-27)羧酸上进行氨基酸缀合，并且胆管中几乎所有胆汁酸都因此以甘氨酸缀合的形式存在。结肠中的细菌作用可通过还原类固醇骨架的“B”环中的碳-7处的羟基官能团而由鹅去氧胆酸产生LCA。一旦产生，LCA可以与甘氨酸缀合以形成G-LCA(或如本文所用的GLCA)。一旦产生，LCA也可以与牛磺酸缀合以形成T-LCA(或如本文所用的TLCA)。
值得注意的是，在本文所述的体内实施例中，已发现了甘氨石胆酸和牛磺石胆酸的增加。由于如在肝细胞中，石胆酸与甘氨酸或牛磺酸缀合，因此显然也必须存在石胆酸本身的增加。值得注意的是，在本文所述的实施例中(如在图2中)，测量了石胆酸，并且与A组(未接受本发明中采用的微生物)相比，B组(接受本发明中采用的微生物)中石胆酸在数字上(numerally)增加。因此，尽管不显著，但是在B组中检测到了LCA从128.7增加到155.9nM(在实施例中未示出数据)。由于LCA由CDCA产生，因此必须存在CDCA转化的增加。因此，本发明的微生物同样能够进行自CDCA至LCA的转化也是合理的。
所述方法可包括使CDCA与如本文所述的包含本发明中采用的微生物的制剂接触。例如，所述制剂可仅包含本发明中采用的微生物的细胞质组分。
本发明可进一步包括纯化LCA的步骤。
另外，实施这种反应的方法以及合适的缓冲液等是本领域技术人员已知的，并且也在本文的实施例中进行了描述。进一步预期所述方法在生物反应器(如大规模生物反应器)中实施。
可以将由本发明的方法获得的LCA用于任何目的。例如，所述LCA可以用于治疗癌症，比如结肠癌，或用于活化维生素D受体的方法中。
确认由本发明中采用的微生物产生了鹅去氧胆酸/石胆酸的方法或确认T-CDCA和/或G-CDCA或LCA确实被用作物质的方法是技术人员已知的。例如，可获得用于此目的的商购ELISA试剂盒。此外，在本文的实施例中还描述了一种方法。可选地，技术人员已知还可以通过色谱方法测定鹅去氧胆酸/LCA的存在。
本发明还涉及一种用于促进健康受试者的肠道健康的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者与红蝽杆菌纲的微生物接触。
对于本发明的方法，已经在本发明的用途中说明的内容经必要修改后适用。
本发明还涉及红蝽杆菌纲的微生物用于促进受试者的肠道健康，优选地所述受试者患有疾病或病症。所述红蝽杆菌纲的微生物还可用于治疗患有如本文所述的疾病或病症的受试者。
所述红蝽杆菌纲的微生物还可用于制备用于治疗患有如本文所述的疾病或病症的受试者的组合物。所述组合物可包含如本文所述的用于促进健康受试者的肠道健康的组合物的其它成分。
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”可以包括如向患有影响肠道的疾病的受试者优选以药物形式施用本发明中使用的微生物，用于缓解或改善症状的目的。
所述受试者可能受任何疾病，如肠道疾病的影响。示例性疾病包括败血症、腹泻、炎性肠病、肠易激病、肥胖症、糖尿病、肝病、慢性心脏病、乳糜泻和癌症。
所述受试者可受免疫系统的疾病的影响。
本发明还涉及一种用于生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法，所述方法包括：
a)使红蝽杆菌纲的微生物与牛磺鹅去氧胆酸和/或甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)接触；
由此获得鹅去氧胆酸。
本发明还涉及一种用于促进健康受试者的肠道健康的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者与红蝽杆菌纲的微生物接触。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明中采用的微生物。所述试剂盒还可包含益生元和/或益生菌。例如，所述试剂盒可包含至少一种与本发明中采用的微生物不同的微生物。例如，所述与本发明中采用的微生物不同的微生物可选自如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的梭菌(Clostridium)、真细菌(Eubacteria)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通类杆菌(B.vulgates)、产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、乳酸菌和双歧杆菌。
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应当注意的是，如本文所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数指代，除非上下文另有清楚说明。因此，例如，提到的“试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，而提到的“该方法”包括提到的本领域普通技术人员已知的可以改进或替代本文所述方法的等同的步骤和方法。
除非另有说明，在一系列要素前面的术语“至少”应当理解为是指系列中的每个要素。本领域技术人员将会意识到或者能够使用不超过常规实验而确定，许多与本文描述的本发明的具体实施方案的等同物。预期这类等同物被本发明涵盖。
术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”以及“所述术语所连接的元素的全部或任何其它组合”。
术语“小于”或其反义词“大于”不包括具体数字。
例如，小于20意为小于所指定的数字。同样地，多于或大于意为多于或大于所指定的数字，例如大于80％意为大于或多于所指定的数字80％。
贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够被术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代，或有时本文使用时会以术语“具有”替代。本文使用的“由……组成”排除任何未规定的元素、步骤或成分。
术语“包括(including)”意为“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文所使用的术语只用于描述特定实施方案的目的而并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
本说明书全文所引用的所有出版物(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、说明书等)，无论在前还是在后，其以全文并入本文。本文的任何内容均不能被解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的公开物。在通过引入方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致时，本说明书将取代任何这样的材料。
本文引用的所有文献和专利文献的内容均通过参考整体并入本文。
本申请中采用了以下序列。
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通过以下仅出于说明性目的提供的实施例可以更好的理解本发明及其优势。这些实施例并非意在以任何方式限制本发明的范围。
本发明的实施例
实施例1：通过BBSH 797的G-CDCA去缀合
该实施例中采用的缓冲溶液：
矿物溶液I：K2HPO4(6g/L)、KH2PO4(6g/L)、(NH4)2SO4(6g/L)、NaCl(12g/L)，蒸馏H2O添加至1L；
矿物溶液II：MgSO4x 7H2O(2.5g/L)，蒸馏H2O添加至1L；
矿物溶液III：CaCl2x 2H2O(3g/L)，蒸馏H2O添加至1L；
维生素溶液：生物素(维生素H，2mg/L)、叶酸(2mg/L)、吡哆醇-HCl(维生素B6，10mg/L)、硫胺-HCl(维生素B1，5mg/L)、核黄素(维生素B2，5mg/L)、烟酰胺(5mg/L)、D,L-泛酸盐(Pantotheinate)(5mg/L)、氰钴氨素(维生素B12，0.1mg/L)、甲萘醌(100mg/L)、叶绿醌(维生素K1，22mg/L)、对氨基苯甲酸(5mg/L)、硫辛酸(5mg/L)，蒸馏H2O添加至1L；储存在4℃下。
微量元素溶液(TE)：ZnSO4x 7H2O(0.10g/L)、MnCl2x 7H2O(0.03g/L)、H3BO3(0.30g/L)、CuCl2x 2H2O(0.01g/L)、CoCl2x 6H2O(0.20g/L)、NiCl2x 6H2O(0.02g/L)、Na2MoO4x 2H2O(0.03g/L)，添加蒸馏H2O至1L；储存在4℃下。
氯高铁血红素(hemin)溶液(10 000ppm)：将1g氯高铁血红素溶于50ml1M NaOH溶液中。然后加入50ml EtOH(92.7％v/v)。储存在4℃下。
磷酸盐缓冲液：0.5M KH2PO4缓冲液+0.5M Na2HPO4x 2H2O，pH＝6.9，无菌过滤。
半胱氨酸(cystein)-Na2S溶液(还原剂)：在具有隔板盖(septum cap)的Schott烧瓶中在N2气氛下制备该溶液。将0.5g半胱氨酸-HCl溶于18.2ml蒸煮的充入N2气的蒸馏水中。加入1.8ml 4M NaOH(pH 10)和0.5g Na2S。新鲜制备，无菌过滤并储存在4℃下。
稀释缓冲液：将75ml矿物溶液I、II和III分别与10ml维生素溶液、0.5ml微量元素溶液、0.5ml氯高铁血红素溶液和0.5g半胱氨酸-HCl组合；添加蒸馏H2O至1L。pH＝6.8至6.9(用4M NaOH溶液调节)，在121℃下高压蒸汽处理15分钟，新鲜制备。
为了确定BBSH 797将GCDCA去缀合为CDCA的能力，进行了温育实验。因此，一式三份地生成以下三种批次：
T批次：含有GCDCA和BBSH 797(4.09E+6CFU/mL)
C1批次：仅含有GCDCA，不含BBSH 797
C2批次：含有GCDCA和灭活的BBSH 797(4.09E+6CFU/mL)。
灭活的BBSH 797意指BBSH 797不存活。
在t＝0和温育48小时后取样。
详细地，进行以下程序：
将稀释缓冲液无菌过滤，加入2.5％(v/v)磷酸盐缓冲液和1％(v/v)还原剂，得到最终稀释缓冲液。将18ml最终稀释缓冲液置于无菌的25ml Schott烧瓶中，用于所有处理实验(T批次)和灭活对照(C2批次)。将20mL最终稀释缓冲液置于无菌的25mL Schott烧瓶中用于阴性对照(C1批次)。向所有批次中加入200μL GCDCA溶液以获得5μM的终浓度。
由冻干物(lyophilisate)培养BBSH 797培养物，并在最终稀释缓冲液中制备BBSH797接种物(4.09E+7CFU/mL)。将2mL该接种物加入T批次中以获得20mL(忽略GDCA溶液的体积)，其具有4.09E+6CFU BBSH797/mL的细胞密度。通过将BBSH 797接种物的一部分(4.09E+7CFU/mL)在90℃的水浴中温育15分钟使其灭活。将2mL该灭活接种物加入C2批次中以获得20mL(忽略GDCA溶液的体积)，其具有相当于4.09E+6CFU灭活的BBSH 797/mL的细胞密度。
在时间t＝0分钟时，通过震荡使所有批次均匀化并取出样品(t0样品，1mL)，立即加热至95℃达5分钟并储存在-20℃下。
将所有批次进一步在37℃下温育48小时。48小时后，通过震荡使所有批次均匀化并取出样品(t＝48h，1mL)，立即加热至95℃达5分钟并储存在-20℃下。在GCDCA和CDCA定量之前，将所有样品解冻并以16,600×g离心10分钟。用990μL HPLC洗脱液(20％乙腈+80％蒸馏H2O)稀释10μl澄清的样品，并进行GCDA和CDCA量的定量。
获得的结果概述于图1中。从图1中可以看出，在两个对照批次(C1和C2)中，均未鉴定出GCDCA向CDCA的转化。因此，GCDCA不通过灭活的(死的)BBSH 797微生物自发地去缀合(C1)。对于处理(T-批次)，由于与C1和C2样品相比，t＝0h样品已经显示培养基中的GCDCA浓度显著降低(1.59μM)，从而清楚地显示了活微生物非常快地摄取GCCA。此外，GCDCA通过活BBSH 797去缀合并产生CDCA(t＝0h时0.02μM CDCA和t＝48h时1.06μM CDCA)。在T-批次的温育缓冲液中未发现更多GCDCA和CDCA的原因可能是由于两种物质在微生物内的中间储存。
因此，仅活化的BBSH 797能够将GCDCA转化为CDCA。从这些数据可以得出结论，BBSH 797能够水解缀合的胆汁酸的C24N-酰基酰胺键(因此也可能水解C25N-酰基酰胺键，C26N-酰基酰胺键和C27N-酰基酰胺键)。因此，可以预期BBSH 797包含一种或多种可以实施该水解的酶。还可以预期，在BBSH 797存在下，也可以水解酶解牛磺酸缀合的CDCA。
综上，体外实验表明了甘氨鹅去氧胆酸向鹅去氧胆酸的转化。根据文献记载，鹅去氧胆酸引发GLP-2的释放并从而改善肠道完整性(Diego-Cabero等，2015)。基于体外实验，对断奶仔猪进行体内研究以评估BBSH 797对肠屏障的影响。
实施例2：饲喂实验
实验设置：
断奶后将总共16头仔猪(-HYB，4-5周龄，约10kg)分为两组。A组接受其组分适于动物年龄的饲料组合物(完全断奶饲料)。在B组中，将BBSH 797加入到相同的断奶饲料中(BBSH 797最终饲料浓度为2.2*109菌落形成单位/tkg断奶饲料组合物)。在44天的试验期间，饲料每天饲喂两次。仔猪可以自由饮用水，保持在受控条件(空间、温度、湿度和光照)下，并接收仔猪玩具作为充实(enrichment)。这些动物每天由受过训练的人照顾并由兽医指导。
取样：
第42天，从所有动物的颅腔静脉取出个体血样(EDTA,KabeLaboratory GmbH,Nuembrecht-Elsenroth,Germany)。离心(2.300xg，10分钟)后，在干冰上将两个等份试样(每份100μL)运送至Biocrates Life Sciences AG(Innsbruck,Austria)。在该处于-80℃下储存样品直至测定胆汁酸浓度。
第42天和43天，将仔猪置于代谢笼中。在这两天中，约上午9点时，给动物饲喂约15ml含有乳果糖(500mg/kg体重)和鼠李糖(100mg/kg体重)的琼脂。随后，在施用糖溶液后的三个不同时间段的每一个收集尿液：0-2、2-4和4-6小时。另外，在第一次给糖之前直接收集尿样(空白样品)。将尿液样品储存在-20℃下直至分析乳果糖/鼠李糖比率。
样品分析：
对于胆汁酸的测量，采用商购可获得的胆汁酸测试试剂盒(Biocrates LifeSciences AG,Innsbruck,Austria)。对于这一目的，将样品通过干燥的过滤膜斑(driedfilter spot)技术提取，然后通过液相色谱串联质谱法分析(Thermo Fisher ScientificTSQ，负电喷雾电离，多反应监测模式)。使用外标(7-点校准曲线)和内标(10种同位素标记的标准品)定量总共20种初级和次级胆汁酸。然后使用Thermo Fischer ScienticXcaliburTM和Biocrates MetIDQ软件评估数据。
结果与讨论
在第42天，在B组中观察到胆汁酸甘氨石胆酸和牛磺石胆酸显著增加(图2)。它们代表次级胆汁酸，氨基酸(甘氨酸或牛磺酸)与之结合。通常，经由肠微生物将初级胆汁酸(胆酸、鹅去氧胆酸(cenodeoxyholic acid))转化为次级胆汁酸(脱氧胆酸、石胆酸)。因此，已经描述了各种细菌属比如拟杆菌(Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacterium)或梭菌(Clostridium)中必需的酶促代谢过程(去缀合，7-脱羟基)(Gerard,2014)。而对于BBSH797(来自红蝽杆菌科的novus属，菌株编号DSM 11798)，到目前为止还没有此类报道。
对于乳果糖和鼠李糖的测量，用甲醇在几个中间步骤中将尿液稀释1.6*106倍。然后采用LC-MS方法测定乳果糖和鼠李糖。对于该测量，采用与Triple Quad 5500质谱仪(ABSciex,Canada)联接的Agilent 1290Infinity I仪器(Agilent Technologies,UnitedStates)。将分析物在Luna NH2 150x 2.0mm柱上分离(Phenomenex,United Kingdom，30℃，0.250mL/min，乙腈梯度洗脱10min)。质谱仪采用负电喷雾电离和多反应监测模式操作(乳果糖m/z 341→m/z 161和m/z 341→m/z 101；鼠李糖m/z 163→m/z59和m/z 163→m/z103)。采用Analyst软件(AB Sciex,Canada)分析数据并在MS-Excel(Microsoft,USA)中计算乳果糖/鼠李糖比率。
在该实验中，可以证明升高的胆汁酸浓度与改善的肠屏障之间的相关性。使用双糖分析评估肠屏障的完整性。该试验的原理基于乳果糖和鼠李糖的共同施用。二糖乳果糖仅通过个体肠上皮细胞之间的狭窄间隙以细胞旁路的方式进入血流。另一方面，单糖鼠李糖通过肠细胞以细胞旁路的方式和跨细胞的方式转运到体内。当肠屏障减弱时，胞间隙变得越来越多孔，结果吸收了相对更大量的二糖。因此，尿液中的乳果糖/鼠李糖比率增加。完整或加强的肠屏障与尿中乳果糖/鼠李糖比率的降低相关(Wijtten等，2011，本文中引用)。在所实施的实验中，施用BBSH 797数周导致了尿乳果糖/鼠李糖比率显著降低(p＝0.0173，图3)。
实施例3：在健康受试者中BBSH 797对体重增加和饲料转化率(FCR)的影响
实验设置：
将约4-10周龄的、性别混合的断奶仔猪(遗传类型：O-HYB Fl[(长白x大白)x皮特兰])进行耳标记，分别称重并分为对照组(CG)、试验组(TG)或高浓度试验组(hTG)。所述动物选自健康的畜群。对照组(CG)的动物饲喂不含抗生素、抗球虫药、益生菌、植物添加剂或有机酸的基础日粮。对于第1-14天，基础日粮饲料包含以下以％(w/w)计的成分：玉米，30；大麦，32.9；葵花籽油，0.6；马铃薯蛋白，7；压熟玉米(maize pressure cooked)，6；大豆浓缩蛋白，5.7；压熟小麦(wheat pressure cooked)，4；葡萄糖，4；乳糖，3；棕榈仁，椰子油脂，2.5；磷酸二氢钙，1.23；磷酸镁，0.1；氯化钠，0.43；维生素预混物，0.1；微量元素预混物，0.15；L-赖氨酸，0.56；DL-蛋氨酸，0.17；L-苏氨酸，0.16；L-色氨酸，0.08；甜味剂，0.02。对于第15-42天，基础日粮饲料包含以下以％(w/w)计的成分：玉米，40.7；大麦，35；大豆，48％、20；葵花籽油，0.5；磷酸二氢钙，0.94；碳酸钙，1.31；磷酸镁，0.2；氯化钠，0.46；维生素预混物，0.1；微量元素预混物，0.15；L-赖氨酸，0.4；DL-蛋氨酸，0.12；L-苏氨酸，0.12。向试验组(TG)的动物饲喂与对照组相同的基础日粮，但是所述饲料中另外补充了BBSH797(DSM 11798)至终浓度2.2*109CFU/kg饲料。同样向高浓度试验组(hTG)的动物饲喂与CG相同的基础日粮，但是所述饲料中另外补充了BBSH 797(DSM 11798)至终浓度2.2*1011CFU/kg饲料。处理时间为42天。在整个试验期间，随意饲喂所述动物。同样随意提供新鲜的饮用水。根据用于断奶仔猪的推荐标准，采用计算机控制、自动调节气候条件并每天记录。在早上和下午，农场工作人员检查所述动物的一般健康状况，并对住房设施进行控制，以确保恒定供应的饲料和水，正确的温度和通风。此外，由兽医定期检查动物以确认整个试验期间动物的健康状况良好。在试验期间，精确测量每栏(per pen)的采食量。在第1天、第14天和第42天测定个体体重。在第1天至第42天以及第15天至第42天之间测定每栏的平均每日采食量。将每栏的平均采食量和平均体重用于计算平均饲料与体重增加的比率(饲料转化率，FCR)。
结果：
在整个试验期间，所有动物均未发现任何可察觉的健康问题或临床疾病的任何症状，也未发生遗失。下表1示出了补充BBSH 797的饲料对体重增加的有益效果。
表1：在健康动物中补充BBSH 797的饲料对体重增加的影响。
此外，发现饲喂补充了BBSH 797的基础日粮的动物比饲喂仅基础日粮而未补充BBSH 797的动物，采食与体重增加比率(也称为饲料转化率(FCR))提高。在第1-42天期间，所述FCR由饲喂仅基础日粮的动物的1.63kg/kg提高到饲喂补充BBSH 797的基础日粮的动物的1.54kg/kg。在第15-42天期间，所述FCR由饲喂仅基础日粮的动物的1.69kg/kg提高到饲喂补充BBSH 797的基础日粮的动物的1.59kg/kg。如本文的实施例所示，补充了BBSH 797的饲料促进了健康动物的肠道健康，从而使饲喂补充BBSH 797的饲料的动物的体重增加和饲料转化率均得到改善，而未见不良反应。
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<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1477
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> DSM11798的16S-RNA序列
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cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggataacccg 60
cctccgggcg gttatagagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgaccaacc tacctcccac 120
tccgggataa cccagggaaa cctgcgctaa taccggatac tccggggccc ccgcatgggg 180
gcgccgggaa agccccgacg gtgggagatg gggtcgcggc ctattaggta gtcggcgggg 240
taacggccca ccgagcccgc gataggtagc cgggttgaga gaccgatcgg ccacattggg 300
actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaattttgc gcaatggggg 360
aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtgcggg acgaaggcct tcgggttgta aaccgctttc 420
agcagggaag aagttgacgg tacctgcaga agaagctccg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtagggagc gagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgcgcgtagg 540
cgggcgctta agcggaatct ctaatctgag ggctcaaccc ccagccggat tccgaactgg 600
gcgcctcgag ttcggtagag gaagacggaa ttcccagtgt agcggtgaaa tgcgcagata 660
ttgggaagaa caccgatggc gaaggcagtc ttctgggccg taactgacgc tgaggtgcga 720
aagctagggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc tagccgtaaa cgatgggcac 780
taggtgtggg ggggaatgcc cctccgtgcc gcagctaacg cattaagtgc cccgcctggg 840
gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag 900
catgtggctt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag ggcttgacat gcaggtgaag 960
cggcggaaac gccgtggccg agaggagcct gcacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc 1020
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctgtcgt atgttgccat 1080
cattcagttg gggactcgta cgagactgcc ggcgtcaagc cggaggaagg tggggacgac 1140
gtcaagtcat catgcccttt atgccctggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaac 1200
gggctgcgag ccagcgatgg cgagcgaatc cctcaaaacc ggtcccagtt cggatcggag 1260
gctgcaaccc gcctccgtga agtcggagtt gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320
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<222> ()..()
<223> cpn60基因
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atggcaaaag atatcaagtt cgaagccgac gcgcgcagcg ctcttgcggc tggagtttca 60
aagctggccg acgccgttaa agtgacgctt ggccccaagg gtcgttacgt cgctctcgag 120
aaatcctacg gcgcccccac catcaccaac gacggcgtca ccgttgccaa agaagtcgag 180
ctcgaggatc cggtagagaa catgggcgcc cagctcgtcc gcgaggttgc cgttaagacc 240
aacgatgttg cgggcgacgg caccaccacc gcaacgctgc tcgccgacgt catcgtctcc 300
gagggtctgc gcaacgtcac cgcaggcgcc gatgcgctcg gcatccgccg cggcatccag 360
aaggccaccg atgcggtggt cgaagagatc aagaacaccg caaccgaggt ttccggcaaa 420
gagcagatcg ccaatgtcgg caccatttcc gcaggcgatg ccgagatcgg cgagaagatc 480
gccgaggcca tggacgccgt tggcaaagac ggtgcgattt ctgttgagga gagccagacg 540
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Claims (13)

1.一种菌株DSM11798的微生物用于促进健康受试者的肠道健康的用途，其中促进肠道健康包括促进肠道完整性，所述肠道完整性能够通过测量用乳果糖和鼠李糖饲喂的受试者的尿液中乳果糖/鼠李糖比率的变化而评估。
2.根据权利要求1所述的用途，其中在组合物中提供所述微生物。
3.根据权利要求1所述的用途，其中在食品组合物和/或饲料组合物中提供所述微生物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中提供所述微生物达多于1天。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中提供所述微生物达42或44天。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中以每kg组合物0.25*109、0.5*109、0.75*109、1.0*109、1.25*109、1.5*109、1.75*109、2.0*109、2.25*109、2.5*109、2.75*109、3.0*109、3.25*109、3.5*109、3.75*109、1.0*109、1.25*109、1.5*109、1.75*109、4.0*109或更多菌落形成单位(CFU)的剂量提供所述微生物。
7.根据权利要求5所述的用途，其中以每kg组合物0.25*109、0.5*109、0.75*109、1.0*109、1.25*109、1.5*109、1.75*109、2.0*109、2.25*109、2.5*109、2.75*109、3.0*109、3.25*109、3.5*109、3.75*109、1.0*109、1.25*109、1.5*109、1.75*109、4.0*109或更多菌落形成单位(CFU)的剂量提供所述微生物。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中以每kg组合物至少2.2*109菌落形成单位的剂量提供所述微生物。
9.根据权利要求5所述的用途，其中以每kg组合物至少2.2*109菌落形成单位的剂量提供所述微生物。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述微生物将甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)转化为鹅去氧胆酸(CDCA)。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述微生物使所述受试者中的胆汁酸甘氨石胆酸(GLCA)和/或牛磺石胆酸(TLCA)增加。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述健康受试者是未被疾病或病症影响的受试者。
13.一种用于体外生产鹅去氧胆酸(CDCA)的方法，所述方法包括：使菌株DSM11798的微生物与甘氨鹅去氧胆酸(G-CDCA)接触；由此获得鹅去氧胆酸。
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