BR112020011309A2

BR112020011309A2 - uso de coriobacteriia para promover a saúde do intestino

Info

Publication number: BR112020011309A2
Application number: BR112020011309-3A
Authority: BR
Inventors: Dian Schatzmayr; Eva Maria Binder; Veronika Nagl; Gerd Schatzmayr
Original assignee: Erber Aktiengesellschaft
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-11-17
Also published as: RU2762268C1; SG11202005857YA; WO2019121891A1; AU2018390173B2; TW201938037A; US20200338138A1; JP2021508256A; AU2018390173A1; JP7275163B2; US11690881B2; EP3501526A1; EP3501526B1; ZA202003785B; CA3084141A1; TWI795496B; MX2020006462A

Abstract

A presente invenção refere-se ao uso de um microrganismo da classe de Coriobacteriia para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável. Também é fornecido um método para a produção de ácido quenodesoxicólico (CDCA) e um método para a produção de ácido litocólico (LCA).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE CORIOBACTERIIA PARA PROMOVER A SAÚDE DO INTESTINO".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao uso de um microrganismo da classe de Coriobacteriia para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável. Também é fornecido um método para a produção de ácido quenodesoxicólico (CDCA) e um método para a produção de ácido litocólico (LCA).

DESCRIÇÃO

[002] Na literatura biomédica comum, os ácidos biliares ou sais biliares possuem 24 átomos de carbono e são abreviados como ácidos biliares C24, em contraposição aos ácidos biliares "primitivos", que possuem 25 a 27 átomos de carbono (ácidos biliares C27, C26, C25) e estão presentes no pool de ácidos biliares de vertebrados primitivos (por exemplo, celacanto e tubarões) e menos primitivos (por exemplo, répteis e anfíbios). Nos vertebrados superiores, os ácidos biliares C24 constituem a maior parte da bile (Hofmann et al. (1992) "A proposed nomenclature for bile acids" Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604)). O fígado sintetiza os ácidos biliares às custas do colesterol e também recupera ácidos biliares reabsorvidos do sangue. A partir dos hepatóci- tos, eles são secretados contra gradientes de concentração acentua- dos na bile, juntamente com colesterol e fosfolipídeos. Assim, entre as refeições, a maior parte do pool de ácidos biliares reside na vesícula biliar, pronto para ser usado em pouco tempo.

[003] Os ácidos biliares primários são aqueles sintetizados como tal pelo fígado e compreendem predominantemente o ácido cólico (CA) e o ácido quenodesoxicólico (CDCA). Estes são secretados para a bile principalmente conjugados com glicina e taurina, tendo assim solubilidade em água aumentada. Após a liberação no intestino, os ácidos biliares promovem a absorção de gorduras da alimentação e de vitaminas lipossolúveis.

[004] Os ácidos biliares secundários são derivados dos ácidos biliares primários pelas modificações realizadas por bactérias intesti- nais. As principais modificações são desconjugação, oxidação de gru- pos hidroxila nas posições 3, 7 e 12 e 7-desidroxilação. Os principais ácidos biliares secundários são o ácido litocólico (LCA) e o ácido de- soxicólico (DCA).

[005] No entanto, os ácidos biliares desempenham não apenas um papel na digestão, mas também têm efeitos na saúde e na doença. Além disso, eles funcionam como moléculas de sinalização. Por exemplo, os ácidos biliares podem influenciar, como um dos múltiplos fatores, a composição da microbiota intestinal ou exercer atividades antimicrobianas (Boesjes and Brufau (2014) "Metabolic effects of bile acids in the gut in health and disease" Current Medicinal Chemistry, 21, 2822-2829).

[006] Em particular, os ácidos biliares medeiam efeitos na integri- dade intestinal e no desempenho de leitões desmamados precoce- mente. As evidências disponíveis indicam que a ativação de vias de sinalização intestinal controladas por ácidos biliares permite estimular a liberação de GLP-2 endógeno, melhorando a integridade intestinal em modelos experimentais de atrofia e disfunção intestinal (de Diego- Cabero et al. (2015) "Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets." BMC veterinary research 11:111).

[007] Nesse contexto, é observado que a barreira intestinal e a saúde intestinal em geral determinam a quantidade de patógenos que podem migrar da luz intestinal para o corpo, o que aumenta subse- quentemente a suscetibilidade à doença. Além disso, quanto melhor o epitélio intestinal funciona, mais nutrientes são absorvidos, o que, por sua vez, determina a capacidade de crescimento dos animais. A saúde da barreira intestinal, portanto, tem um impacto significativo no bem- estar dos animais.

[008] Em princípio, podem ser distinguidas três estratégias dife- rentes, a fim de fortalecer a barreira intestinal, por exemplo, de leitões na fase de desmame: 1) Melhoria da palatabilidade dos alimentos para aumentar o consumo de alimentos; 2) Adição de nutrientes essenciais para compensar as per- das causadas por uma barreira intestinal danificada; 3) Adição de substâncias biologicamente ativas que fortale- cem a barreira intestinal.

[009] A fim de neutralizar os problemas e defeitos descritos aci- ma, foi necessário desenvolver um conceito de alimentação que seja eficaz em leitões desmamados, por um lado, e que possa ser aplicado facilmente sob condições práticas, por outro lado.

[0010] Além disso, havia uma necessidade na técnica de desen- volver métodos/usos para promover a saúde intestinal em indivíduos saudáveis.

[0011] A solução da presente invenção está descrita a seguir, exemplificada nos exemplos, ilustrada nas Figuras e refletida nas rei- vindicações.

[0012] A presente invenção se refere ao uso de um microrganismo da classe de Coriobacteriia para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável.

[0013] Além disso, a presente invenção se refere a um método pa- ra a produção de ácido quenodesoxicólico (CDCA), o método compre- endendo: a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com um ácido glicoquenodesoxicólico (G-CDCA); obtendo assim o ácido quenodesoxicólico

[0014] Também é fornecido um método para a produção de ácido litocólico (LCA), o método compreendendo: a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com um ácido quenodesoxicólico (CDCA), obtendo desse modo o ácido litocólico.

[0015] A presente invenção também se refere a um método para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável, o método com- preendendo: a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com o indivíduo.

[0016] As Figuras mostram:

[0017] Fig. 1 Resultados obtidos no experimento in vitro.

[0018] Fig. 2 Efeito de BBSH 797 sobre a concentração plasmáti- ca de ácidos biliares (média ± desvio padrão, dia 42) em leitões des- mamados. Os animais (n = 8) receberam ração para desmame (Grupo A) ou ração para desmame com adição de BBSH 797 (2,2 * 109 unida- des formadoras de colônia/kg de ração, Grupo B) por 42 dias. As dife- renças estatisticamente significantes (p <0,05) entre os dois grupos são indicadas por sobrescritos (a, b).

[0019] Fig. 3 Influência de BBSH 797 sobre a proporção de lactu- lose/ramnose na urina de porco desmamado seis horas após a admi- nistração de uma solução de açúcar (500 mg de lactose/kg de peso corporal, 100 mg de ramnose/kg de peso corporal, dia 43). Os animais (n = 8) receberam ração para desmame (Grupo A) ou ração para des- mame com adição de BBSH 797 (2,2 * 109 unidades formadoras de colônia/kg de ração, Grupo B) por 44 dias. A diferença estatisticamen- te significante p <0,05) entre os dois grupos é indicada por um sobres- crito (*).

[0020] Surpreendentemente foi verificado que um microrganismo da classe de Coriobacteriia, isto é, da cepa DSM 11798, promove a saúde intestinal de um indivíduo. Os presentes inventores descobriram uma estratégia de alimentação que fortalece a barreira intestinal dos indivíduos. Isso é obtido pela adição da bactéria BBSH 797 (gênero novus da família Eggerthellaceae), cepa número 1798 (DSM 11798) na alimentação do indivíduo.

[0021] A adição de BBSH 797 à alimentação levou a um aumento significativo dos ácidos biliares, ácido glicolitocólico e ácido taurolitoco- lólico nos desmamados. Esses ácidos biliares atuam como mensagei- ros e iniciam cascatas moleculares que acabam levando a uma melho- ra significativa na integridade intestinal de leitões desmamados. Mais precisamente, a suplementação com BBSH 797 resulta em uma ele- vação específica de ácido glicolitocólico e ácido taurolitocólico no plasma de leitões desmamados. Isso é de relevância biológica, já que essas substâncias agem como fortes agonistas naturais nos recepto- res TGR5 (Schaap et al. (2014) "Bile acid receptors as targets for drug development" Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 11(1):55-67; Kawamata et al. (2003) "A G protein-coupled receptor responsive to bile acids*" vol. 278, no. 11, pp. 9435-9440). Esses re- ceptores estão localizados na membrana celular de certas células epi- teliais intestinais (células L). Após a ativação, esses receptores desen- cadeiam uma cascata, que finalmente leva à liberação do peptídeo si- milar ao glucagon-2 (GLP-2).

[0022] Notavelmente, o GLP-2 exógeno pode restaurar o cresci- mento da mucosa, o transporte transcelular e a expressão de proteí- nas das tight junction que controlam a permeabilidade paracelular. Além disso, a administração crônica de GPL-2 pode aumentar a altura das vilosidades e a profundidade das criptas no intestino delgado e no cólon. Também foi demonstrado que a administração de um análogo de ação prolongada da GPL-2 pode aumentar o peso intestinal e a ati- vidade enzimática. Alguns desses efeitos positivos de GPL-2 foram obtidos em animais desmamados precocemente (de Diego-Cabero et al. (2015) "Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets." BMC veterinary research 11:111). Similar- mente, Connor et al. (2016) descobriram que GPL-2 inicia uma varie- dade de reações intestinais que levam ao aumento da saúde intestinal, fortalecendo principalmente a barreira intestinal (Connor et al. (2016) "Glucagon-like peptide 2 and its beneficial effects on gut function and health in production animals" Domestic Animal Endocrinology 56, S56- S65).

[0023] Experiências adicionais conduzidas pelos presentes inven- tores mostraram que existe uma correlação entre concentrações ele- vadas de ácido biliar de ácido glicolitocólico e ácido taurolitocolólico e/ou a administração de BBSH 797 com uma barreira intestinal melho- rada. A integridade da barreira intestinal foi avaliada usando um ensaio de açúcar duplo. O princípio deste teste é baseado na coadministração de lactulose e ramnose. O dissacarídeo lactulose entra na corrente sanguínea apenas paracelularmente através das lacunas estreitas en- tre as células epiteliais intestinais individuais. Por outro lado, o monos- sacarídeo ramnose é transportado para o corpo paracelularmente e transcelularmente através das células intestinais. Quando a barreira intestinal enfraquece, o espaço intersticial se torna cada vez mais po- roso, como resultado de que quantidades comparativamente maiores de dissacarídeos são absorvidas. Consequentemente, a proporção entre lactulose/ramnose na urina aumenta. Uma barreira intestinal in- tacta ou reforçada está associada a uma proporção reduzida entre lac- tulose/ramnose na urina (Wijtten et al., (2011) "Intestinal barrier func- tion and absorption in pigs after weaning: a review." Br J Nutr 105:967- 981). Os Exemplos do presente pedido mostram que a administração de BBSH 797 por várias semanas resultou em uma proporção signifi- cativamente reduzida de lactulose/ramnose na urina. Isso prova que a integridade do intestino é reforçada com a aplicação do BBSH 797. Consequentemente, a saúde intestinal é promovida pelo BBSH 797.

[0024] Além disso, foi surpreendentemente encontrado em experi- ências in vitro que o BBSH 797 é capaz de converter o ácido glicoque- nodesoxicólico em ácido quenodesoxicólico. De acordo com a literatu- ra, este último pode levar à liberação de GLP-2. Como explicado em de Diego-Cabero, um aumento de GLP-2 resulta em uma integridade intestinal aprimorada (de Diego-Cabero et al. (2015) "Bile acid media- ted effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets." BMC veterinary research 11:111).

[0025] Assim, a presente invenção se refere ao uso de um micror- ganismo da classe de Coriobacteriia para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável.

[0026] Como usado no presente documento, um "microrganismo da classe de Coriobacteriia" pode ser qualquer microrganismo da clas- se das Coriobacteriia. A classificação taxonômica da classe das Co- riobacteriia como no presente documento descrita é baseada em Gup- ta et al. (2013) "Molecular signatures for the class Coriobacteriia and its different clades; proposal for division of the class Coriobacteriia into the emended order Coriobacteriales, containing the emended family Coriobacteriaceae and Atopobiaceae fam. nov., and Eggerthellales ord. nov., containing the family Eggerthellaceae fam. nov." Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63 (Pt 9), pp. 3379-3397, assim como no NCBI Ta- xonomy Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi, versão que estava disponível on-line em 15 de outubro de 2017).

[0027] Ordens exemplificadoras de microrganismos que são abrangidas pela classe Coriobacteriia são a ordem Coriobacteriales e a ordem Eggerthellales. É previsto que o microrganismo usado na pre- sente invenção seja um microrganismo da ordem das Coriobacteriales ou da ordem das Eggerthellales. É previsto ainda que o microrganismo usado na presente invenção seja um microrganismo da ordem das Co- riobacteriales. Também é contemplado que o microrganismo usado na presente invenção seja um microrganismo da ordem Eggerthellales.

[0028] Um microrganismo da ordem das Coriobacteriales pode compreender qualquer microrganismo dentro da ordem das Coriobac- teriales. As famílias exemplares incluídas na ordem Coriobacteriales são, por exemplo, Atopobiaceae, Coriobacteriaceae e Coriobacteria- les. Um microrganismo da ordem Eggerthellales pode compreender qualquer microrganismo dentro da ordem Eggerthellales. As famílias exemplificadoras incluídas na ordem Eggerthellales são, por exemplo, Eggerthellaceae e Eggerthellales não classificados. É previsto que o microrganismo usado na presente invenção seja um microrganismo da família Coriobacteriaceae. Também é contemplado que o microrga- nismo usado na presente invenção seja um microrganismo da família Eggerthellaceae.

[0029] Gêneros exemplificadores incluídos na família Atopobiace- ae são, por exemplo, Atopobium, Libaniococcus, Olsenella e Atopobia- ceae não classificados. Gêneros exemplificadores incluídos na família Eggerthellaceae são, por exemplo, Adlercreutzia, Arábia, Asaccha- robacter, Cryptobacterium, Denitrobacterium, Eggerthella, Enterorhab- dus, Gordonibacter, Paraeggerthella. Phonicibacter, Raoultibacter, Slackia e Eggerthellaceae não classificados. A presente invenção con- templa que o microrganismo usado na presente invenção seja do gê- nero Eggerthellaceae não classificado. Gêneros exemplificadores in- cluídos na família Coriobacteriaceae são, por exemplo, Collinsella, Co- riobacterium e Chriobacteriales não classificados. É previsto que o mi- crorganismo usado na presente invenção seja um microrganismo da família Eggerthellaceae. Prevê-se que o microrganismo usado na pre- sente invenção seja um microrganismo do gênero DSM11798.

[0030] É previsto ainda que o microrganismo usado na presente invenção possa ser um microrganismo da cepa DSM11798 também no presente documento referido como BBSH 797. DSM11798 foi deposi- tado com DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em setembro. 17, 1997.

[0031] É contemplado que o microrganismo usado na presente invenção possa compreender uma molécula de ácido nucleico que te- nha uma identidade de sequência de pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência da SEQ ID NO. 1 (sequência 16S-RNA de DSM11798) e/ou SEQ ID NO: 2.

[0032] Como usada no presente documento, a expressão "molécu- la de ácido nucleico" ou "ácido nucleico" abrange qualquer molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeos de bases que compreendem bases de purina e pirimidina, que são compreendidas pela dita molécula de ácido nucleico, em que as ditas bases represen- tam a estrutura primária de uma molécula de ácido nucleico. As se- quências de ácidos nucléicos podem incluir DNA, cDNA, DNA genômi- co, RNA, fitas de senso e antissenso ou podem conter bases de nu- cleotídeos não naturais ou derivatizadas, como será prontamente apreciado por aqueles versados na técnica. Um polinucleotídeo pode ser composto por qualquer poliribonucleotídeo ou polidesoxribonucleo- tídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificados ou RNA ou DNA modificados. A expressão "RNA" pode incluir qualquer molécula de RNA. Moléculas de RNA exemplificadoras incluem RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência ou RNA ribossômico. A molécula de ácido nucleico pode ser um rRNAs 16S.

[0033] Uma variedade de modificações pode ser feita no DNA e RNA; assim, a expressão "moléculas de ácido nucleico" pode abranger formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modifica- das. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e ba-

ses incomuns, tais como a inosina. As moléculas de ácido nucleico modificadas podem, por exemplo, ser usadas em métodos para detec- ção de moléculas de ácido nucleico no presente documento descritas.

[0034] De acordo com a presente invenção, a expressão "idêntica" ou "percentual de identidade" no contexto de duas ou mais moléculas de ácido nucleico se refere a duas ou mais sequências ou subsequên- cias que são iguais ou que possuem um percentual especificado de nucleotídeos que é o mesmo (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade), quando comparadas e alinhadas para obter a correspondência máxima em uma janela de comparação ou em uma região designada, medida usando um algoritmo de compa- ração de sequência como conhecido na técnica, ou por alinhamento manual e inspeção visual. As sequências que possuem, por exemplo, 80% a 95% ou mais de identidade de sequência são consideradas substancialmente idênticas. Tal definição também se aplica ao com- plemento de uma sequência de teste. Aqueles versados na técnica saberão como determinar o percentual de identidade entre as sequên- cias usando, por exemplo, algoritmos tais como aqueles baseados no programa de computador CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) ou FASTDB (Brutlag Comp. Aplicativo. Biosci. 6 (1990), 237-245), como conhecido na técnica.

[0035] Também estão disponíveis para aqueles versados nesta técnica os algoritmos BLAST e BLAST 2.4 (Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402). O programa BLASTN para sequências de áci- dos nucléicos usa como padrões um tamanho de palavra (W) de 28, um limiar esperado de 10 e uma comparação de ambas as fitas. Além disso, a matriz de pontuação BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915) pode ser usada.

[0036] Por exemplo, BLAST2.4, que significa Basic Local Align- ment Search Tool (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997) 3389-3402;

Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993) 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), pode ser usada para procurar alinhamentos de se- quências locais.

[0037] Os métodos para obter um microrganismo usado na pre- sente invenção são conhecidos por aqueles versados na técnica. Ge- ralmente, isso leva ao isolamento do microrganismo usado na presen- te invenção a partir de uma fonte, por exemplo, DSM11799. Então o microrganismo pode ser cultivado em uma cultura ou em uma solução de fermentação. Alternativamente, uma fonte que compreende o mi- crorganismo pode ser cultivada diretamente em cultura ou em uma so- lução de fermentação. Após o crescimento, o microrganismo pode ser purificado. Também está previsto que a cultura ou solução de fermen- tação em que o microrganismo foi cultivado sejam usadas.

[0038] Por exemplo, tal microrganismo pode ser obtido como des- crito em WO 99/35240. Como no presente documento descrito, a cepa DSM 11798 pode ser obtida a partir da co-cultura do DSM 11799. No- tavelmente, a cepa DSM 11799 também foi depositada no DSMZ- DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKUL- TUREN GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Ale- manha, em 17 de setembro de 1997.

[0039] A bactéria gram-positiva ativa BBSH 797 (DSM 11798) foi originalmente (e repetidamente) isolada de vários conteúdos de rúmen bovino sob condição anaeróbica padronizada usando antibióticos dire- cionados a bactérias gram-negativas. Os métodos para isolar e obter um microrganismo de interesse são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0040] É ainda contemplado que o microrganismo usado na pre- sente invenção possa ser uma bactéria gram-positiva anaeróbica. Adi- cionalmente ou alternativamente, o microrganismo usado na presente invenção pode ter uma aparência similar a uma haste. Adicionalmente ou alternativamente, o microrganismo usado na presente invenção po- de não formar esporos. Adicionalmente ou alternativamente, o micror- ganismo usado na presente invenção pode ter 0,1 a 3 µm de compri- mento. Pode ocorrer individualmente, em pares ou em cadeias longas, em particular até aproximadamente às 150 µm. Aquele versado na técnica sabe como medir tais parâmetros.

[0041] Adicionalmente ou alternativamente, o microrganismo usa- do na presente invenção pode ser capaz de converter G-CDCA em CDCA, como também no presente documento descrito em outra parte. Adicionalmente ou alternativamente, o microrganismo usado na pre- sente invenção pode ser capaz de converter CDCA em LCA, como também descrito em outra parte no presente documento.

[0042] O microrganismo usado na presente invenção pode ser usado como microrganismos de célula única "intacta" e, portanto, mi- crorganismos visivelmente intactos. Também é contemplado que o mi- crorganismo usado na presente invenção possa ser um microrganismo viável ou vivo.

[0043] Também está previsto que uma preparação do microrga- nismo possa ser usada. Isto significa que os microrganismos podem não estar presentes como um todo, mas podem estar presentes como fragmentos celulares ou que seu DNA e/ou 16SrRNA ou enzimas es- pecíficas do microrganismo estão presentes.

[0044] Por exemplo, para detectar que o BBSH 797 está presente em uma composição ou se o BBSH 797 foi usado na presente inven- ção, análise da sequência de 16SrRNA usando métodos padronizados de extração de DNA, amplificação por PCR do código de DNA para 16SrRNA e sequenciamento de DNA do amplicon de PCR podem ser realizados.

[0045] Adicionalmente ou alternativamente, especialmente para uma composição tal como a alimentação da reação em cadeia da po-

limerase em tempo real (qPCR) pode ser usada para detecção e iden- tificação de BBSH 797. Portanto, o DNA pode ser extraído e purificado de amostras/composições com métodos padronizados. A detecção por qPCR pode ser baseada na detecção de genes marcadores, como a sequência do gene de 16SrRNA de BBSH 797, como mostrada na SEQ ID NO. 1 (adicionalmente ou alternativamente também o gene cpn60 como mostrado na SEQ ID NO. 2). Uma vez que o gene de 16SrRNA contém regiões variáveis e conservadas, para a detecção específica de iniciadores para BBSH 797, pode-se direcionar para re- giões variáveis, como descrito em Matsuki et al. 2004, permitindo a amplificação específica da sequência de RNA de BBSH 797 a partir de amostras como material de alimentação (Matsuki et al. (2004) "Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Human Feces." Applied and Envi- ronmental Microbiology 70(12): 7220-7228). Dentro da reação de qPCR, o sinal de fluorescência obtido é proporcional à quantidade do produto de PCR e fornece informações sobre a presença da sequência alvo na amostra. A análise da curva de fusão fornece mais informa- ções sobre a especificidade do amplicon, mostrando o comportamento de fusão dependente da sequência.

[0046] Assim, a expressão microrganismo também abrange prepa- rações do microrganismo. A presente invenção também contempla que o microrganismo é usado como uma preparação do microrganis- mo. Tal preparação também pode compreender moléculas e/ou prote- ínas e/ou substâncias adicionais, por exemplo uma sobra de um tam- pão usado ao isolar e/ou cultivar o microrganismo usado na presente invenção.

[0047] O microrganismo usado na presente invenção pode ser for- necido dentro de uma composição. Em princípio, o microrganismo po- de ser fornecido dentro de qualquer composição adequada para os usos e métodos da presente invenção.

[0048] Assim, a presente invenção também se refere ao uso de uma composição, que compreende um microrganismo da classe das Coriobacteriia para promover a saúde intestinal de um indivíduo sau- dável. As composições exemplificadoras incluem composições alimen- tares, composições de ração, composições líquidas, por exemplo, para beber. É previsto que o microrganismo usado na presente invenção possa ser fornecido dentro de uma composição de alimentos e/ou ra- ção. O microrganismo usado na presente invenção também pode ser fornecido como um aditivo para alimentos para animais ou como uma preparação de um aditivo para alimentos para animais.

[0049] Portanto, a presente invenção também se refere ao uso de um microrganismo da classe das Coriobacteriia na preparação de uma composição para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudá- vel.

[0050] Os métodos para preparar tais composições de alimentos e/ou rações para animais são conhecidos por aqueles versados na técnica e são, entre outros, descritos no WO 99/35240.

[0051] Por exemplo, uma solução de cultura ou fermentação que compreende o microrganismo usado na presente invenção pode ser concentrada, por exemplo, por centrifugação ou filtração e/ou estabili- zação, em particular por liofilização ou secagem por pulverização ou encapsulação. Neste contexto, por exemplo, a cultura ou solução de fermentação que compreende o microrganismo usado na presente in- venção pode ser concentrada em uma primeira etapa, pela remoção do líquido por centrifugação ou filtração e/ou realizando a estabilização diretamente da solução de fermentação. Também está previsto que uma carga, agente de liberação e/ou material de transporte, tais como silicatos de alumínio, terra de diatomáceas, carboidratos, álcoois de açúcar, amidos, leite e soro de leite em pó, hidrolisados de proteínas,

leveduras, farinha de algas e/ou polivinilpolipirrolidona (PVPP) estão presentes na composição como no presente documento descrita. Também está previsto que leveduras e/ou farinhas de algas marinhas sejam adicionadas como veículos. Também está previsto que a terra de diatomáceas seja adicionada como agente de liberação. Pela adi- ção destes veículos ou cargas, por exemplo, é possível na etapa de estabilização a seguir, tal como a etapa de liofilização, secagem por pulverização, encapsulação da etapa de peletização, obter um produto sólido no qual uma cultura do microrganismo usado na presente in- venção pode ser depositada diretamente em um veículo. O microrga- nismo ou sua cultura mista podem ser depositados em uma substância com uma grande área superficial interna, tal como terras argiláceas, silicatos de alumínio, zeólitas e similares. Em particular, o microrga- nismo pode ser depositado em leveduras e/ou farinhas de algas mari- nhas.

[0052] A composição pode adicionalmente ou alternativamente compreender um material transportador e/ou cargas e/ou agente de liberação. Por meio da adição de materiais de transporte e/ou cargas, é possível, se desejado, ligar substâncias nocivas a serem degrada- das, que podem estar contidas na ração fisicamente às substâncias, como resultado o que elas não são mais disponíveis para metaboliza- ção. Neste caso, em particular, silicatos de alumínio, terra de diatomá- ceas, carboidratos, álcoois de açúcar, amido, leite e soro em pó, hidro- lisados de proteínas, leveduras e/ou polivinilpolipirrolidona podem ser empregados como material de transporte e/ou carga.

[0053] A composição usada na presente invenção pode compre- ender o microrganismo da classe de Coriobacteriia em spray ou liofili- zado de 1 a 99% em peso, preferivelmente de 0,5 a 1% em peso e/ou 99 a 1% em peso do material de transporte e/ou carga.

[0054] A composição pode ser um aditivo para ração animal. O aditivo para ração animal pode ser aplicado em uma quantidade de 0,1 a 8,0 kg/1000 kg de composição, tal como composição de alimen- tos/ração para animais, em particular 0,5 a 2,0 kg / 1000 kg de compo- sição, tal como composição de alimentos/ração para animais.

[0055] A composição pode adicionalmente ou alternativamente compreender um ou mais probióticos. "Probióticos", como usado no presente documento, são microrganismos que se acredita proverem benefícios à saúde quando consumidos. Probióticos têm que estar vi- vos quando administrados. Em princípio, qualquer probiótico pode ser usado. Aquele versado na técnica conhece probióticos adequados pa- ra uso na presente invenção.

[0056] A composição pode então compreender um ou mais mi- crorganismos diferentes do microrganismo usado na presente inven- ção. Em princípio, qualquer microrganismo adequado pode ser adicio- nado à composição. Os microrganismos exemplificadores incluem Bacteroides fragilis, B. vulgatus, Listeria monocytogenes e espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium bifidum ou seu equivalente biologicamente funcional, Clostridium, tal como Clos- tridium perfringens e Eubacteria.

[0057] A composição pode adicionalmente ou alternativamente compreender um ou mais prebióticos. "Prebióticos", como usado no presente documento, são ingredientes alimentícios que induzem o crescimento ou a atividade de microrganismos benéficos (por exemplo, bactérias e fungos). Mais precisamente, um prebiótico pode ser um ingrediente fermentado seletivamente que permite alterações específi- cas, tanto na composição quanto na atividade da microflora gastroin- testinal, o que confere benefícios. Em princípio, qualquer prebiótico pode ser usado. Aquele versado na técnica conhece prebióticos ade- quados para uso na presente invenção.

[0058] Os prebióticos podem ser compostos de fibras não digerí-

veis que passam não digeridos através da parte superior do trato gas- trointestinal e estimulam o crescimento ou a atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso, atuando como substrato para elas. Os alimentos que compreendem prebióticos e que podem ser adicionados à composição incluem Goma Arábica, Raiz de Chicó- ria Seca Crua, Alcachofra de Jerusalém Seca Crua, Dentes-de-leão Verdes Secos Crus, Alho Seco Cru, Alho-poró Cru Seco, Cebola Seca Crua, Aspargos Crus, farelo de trigo, farinha de trigo Integral e Banana crua cozida. O prebiótico também pode incluir uma fibra, como descrito em Slavin (2013) "Fiber and Prebiotics: Mechanisms and Health Bene- fits" Nutrients. 5(4): 1417–1435. O prebiótico também pode ser um ga- lacto-oligossacarídeo.

[0059] Portanto, a composição pode adicionalmente ou alternati- vamente compreender uma ou mais fontes de galacto- oligossacarídeos. Por exemplo, a composição pode ainda compreen- der um ou mais de leite líquido, leite em pó seco, como leite em pó in- tegral, leite em pó desnatado, pós de leite com gordura, pós de soro de leite, produtos lácteos fermentados, bebidas, cereais, pão, suple- mentos alimentícios e rações, suplementos dietéticos, rações para animais, rações para aves ou qualquer outro alimento ou bebida. Ou- tros galacto-oligossacarídeos e como os galacto-oligossacarídeos po- dem ser obtidos estão descritos, por exemplo, em Torres et al. (2010) "Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics" Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Volume 9, Issue 5, p. 438-454.

[0060] A composição pode adicionalmente ou alternativamente compreender pelo menos um componente selecionado do grupo de vitaminas, minerais, enzimas e componentes para desintoxicar micoto- xinas. A enzima pode ser selecionada do grupo de proteases, amila- ses, celulases ou glicanases, hidrolases, enzimas lipolíticas, manosi-

dases, oxidases, oxidoredutases, fitases e xilanases e/ou combina- ções das mesmas. Os componentes desintoxicantes de micotoxinas podem ser selecionados a partir de enzimas desintoxicantes de mico- toxinas, tais como aflatoxina oxidase, ergotamina hidrolases, ergota- mina amidases, ocratoxina amidases, fumonisina carboxilesterases, fumonisina aminotransferases, aminopoliol aminoxidases, desoxiniva- lenol epóxido hidrolases e zearalenona hidrolases; ou microrganismos desintoxicantes de micotoxinas; ou componentes que se ligam a mico- toxinas, tais como paredes celulares microbianas ou materiais inorgâ- nicos, tais como bentonita. Também está previsto que a composição possa compreender bentonita e/ou uma fumonisina aminotransferase, por exemplo, EC 3.1.1.87.

[0061] Está previsto ainda que o microrganismo ou a composição usada na presente invenção possa ser fornecida por mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70 ou mais dias. Por exemplo, o micror- ganismo usado na presente invenção pode ser fornecido por 42 ou 44 dias. O microrganismo usado na presente invenção também pode ser fornecido por menos de 70, 60, 50, 45, 40 ou menos dias.

[0062] Ainda é contemplado que o microrganismo usado na pre- sente invenção pode ser fornecido em uma dosagem de 0,25*109, 0,5*109, 0,75*109, 1,0*109, 1,25*109, 1,5*109, 1,75*109, 2,0*109, 2,25*109, 2,5*109, 2,75*109, 3,0*109, 3,25*109, 3,5*109, 3,75*109, 4,0*109, 4,25*109, 4,5*109, 4,75*109, 5,0*109 ou mais unidades forma- doras de colônia por kg. O microrganismo pode ser fornecido nessa dose dentro de uma composição, por exemplo, como alimento e/ou ração (composição), que pode ser usada pelo indivíduo. Por exemplo, o microrganismo usado na presente invenção pode ser fornecido em uma dosagem de pelo menos 2,0*108, 5,0*108, 7,0*108, 1,0*109,

2,0*109 ou pelo menos 2,2*109 unidades formadoras de colônias por kg. O microrganismo pode ser fornecido em tal dosagem em uma composição, por exemplo, alimentícia e/ou ração para animais (com- posição), que podem ser usados pelo indivíduo. O microrganismo usa- do na presente invenção pode ser fornecido em uma dosagem inferior a 5,0*109, 4,5*109, 4,0*109, 3,5*109, 3,0*109, 2,5*109, 2,0*109, 1,5*109, 1,0*109, 9,0*108, 8,0*108, 7,0*108, 6,0*108, 5,0*108, 4,0*108, 3,0*108, 2,0*108, 1,0*108 ou menos unidades formadoras de colônias por kg. O microrganismo pode ser fornecido em tal dosagem em uma composi- ção, por exemplo, um alimento e/ou ração (composição), que pode ser consumido pelo indivíduo. O microrganismo usado na presente inven- ção pode ser fornecido em uma dosagem de 7,0*109 - 1,0*108, 6,0*109 - 2,0*108, 5,0*109 - 3,0*108, 4,0*109 - 5,0*108, 3,0*109 - 6,0*108, or 2,5*109 - 8,5*108unidades formadoras de colônia por kg.

[0063] É claro que quando o microrganismo usado na presente invenção é fornecido como aditivo para ração animal, o número de unidades formadoras de colônias pode ser muito maior dentro dessa ração para animais do que o número de unidades formadoras de colô- nias que são usadas em uma composição final, tal como uma compo- sição (final ou ração) alimentícia/ração como descrita no presente do- cumento.

[0064] Como usada no presente documento, a expressão "unida- des formadoras de colônias" ou "CFU" é uma medida para estimar o número de bactérias viáveis em uma amostra. Viável é definido como a capacidade de multiplicar através da fissão binária sob condições controladas. Os métodos para determinar CFU são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0065] A presente invenção também contempla que o microrga- nismo usado na presente invenção seja capaz de converter ou conver- ta o ácido glicoquenodesoxicólico (G-CDCA) em ácido quenodesoxicó-

lico (CDCA).

[0066] Além disso, a presente invenção prevê que o microrganis- mo usado na presente invenção possa aumentar o(s) ácido(s) bili- ar(es) ácido glicolitocólico (GLCA) e/ou ácido taurolitocólico (TLCA) no indivíduo, por exemplo, comparados ao nível/concentração de GLCA e/ou TLCA antes da administração do microrganismo ou comparados a um controle adequado. Por exemplo, o ácido glicolitocólico do ácido biliar (GLCA) e/ou o ácido taurolitocólico (TLCA) podem ser medidos em uma amostra como uma amostra de sangue, tal como uma amos- tra de plasma que foi obtida de um indivíduo. Os métodos para medir a presença de GLCA e TLCA são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, esses ácidos biliares podem ser medidos usan- do HPLC ou um kit ELISA disponível no mercado.

[0067] O microrganismo no presente documento descrito é usado para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável.

[0068] A expressão "saúde intestinal", como descrito no presente documento, significa o estado de saúde do intestino. Qualquer marca- dor/característica/aspectos morfológicos ou similares podem ser usa- dos para determinar a saúde intestinal. Tais marcado- res/características/aspectos morfológicos são conhecidos por aquele versado na técnica. Métodos exemplificadores estão descritos em De- rikx et al. (2010) "Non-invasive markers of gut wall integrity in health and disease" World Journal of Gastrology 16(42):5272-5279.

[0069] É ainda contemplado que a saúde intestinal é considerada promovida quando a integridade intestinal está aumentada/promovida. Assim, a presente invenção também se refere ao uso de um microrga- nismo da classe de Coriobacteriia para promover a integridade intesti- nal de um indivíduo saudável.

[0070] Como usada no presente documento, "integridade intesti- nal" significa a integridade da barreira intestinal (epitelial). A barreira intestinal (epitelial) mantém as funções fisiológicas do intestino e pode servir como a primeira linha de defesa do hospedeiro contra agresso- res potencialmente prejudiciais do ambiente, tais como bactérias e ví- rus, assim como antígenos e toxinas naturais que ocorrem nos alimen- tos. A barreira física intestinal é formada principalmente por células epiteliais, conectadas pelas tight junctions, que formam uma rede de vedação de células epiteliais adjacentes próximas à superfície luminal, impedindo assim o transporte paracelular de antígenos luminais. Uma quebra da barreira epitelial do intestino, normalmente impecável, resul- ta no desenvolvimento de um intestino com "vazamento" ou na integri- dade intestinal comprometida. As tight junctions intestinais desintegra- das podem permitir a infiltração paracelular de antígenos luminais e são consideradas como um fator patogênico essencial no aparecimen- to e na promoção de inflamações intestinais crônicas, tais como a do- ença inflamatória intestinal (IBD). Como a integridade intestinal (função da barreira intestinal) pode ser avaliada é conhecida pela pessoa ver- sada na técnica e, por exemplo, descrita em Wang et al. (2015) "Me- thods to determine intestinal permeability and Bacterial translocation during liver disease". J Immunol Methods; 421:44-53 ou Grootjans et al. (2010)" Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut" World J Gastrointest Surg; 2(3):61-69.

[0071] Por exemplo, a integridade intestinal pode ser considerada promovida quando a proporção entre lactulose/ramnose na urina 6 ho- ras após o indivíduo ter se alimentado com lactulose e ramnose é me- nor do que a proporção entre lactulose/ramnose na urina no momento da alimentação com lactulose e ramnose. Como explicado em outra parte, o indivíduo pode ser um indivíduo saudável.

[0072] A saúde intestinal/integridade intestinal também pode ser considerada promovida quando o ácido glicolitocólico e/ou o ácido tau- rolitocólico do ácido biliar estão aumentados até certo ponto em com-

paração com um controle. Por exemplo, esse aumento pode ser um aumento similar ao aumento observado quando o ácido glicolitocólico e/ou ácido taurolitocólico do ácido biliar dos indivíduos que recebem um microrganismo usado na presente invenção é comparado com in- divíduos que não recebem um microrganismo usado na presente in- venção. Em tal comparação, a concentração de ácido glicolitocólico e/ou ácido taurolitocólico está aumentada no indivíduo que recebe o microrganismo usado na presente invenção. Alternativamente ou adi- cionalmente, o ácido glicolitocólico e/ou ácido taurolitocólico do ácido biliar podem estar aumentados em indivíduos que recebem um micror- ganismo usado na presente invenção em comparação com os indiví- duos antes de receber um microrganismo usado na presente invenção. Assim, também pode ser considerado um aumento similar ao último aumento detectado na concentração de ácido glicolitocólico e/ou ácido taurolitocólico para promover a saúde intestinal.

[0073] A expressão "indivíduo" se refere a qualquer indivíduo ade- quado para os fins da presente invenção. O indivíduo pode ser um ver- tebrado. Assim, o indivíduo pode ser um mamífero, pássaro, anfíbio, réptil ou peixe. Mamíferos incluem, entre outros, animais de fazenda, animais esportivos, animais de estimação, primatas, humanos, ca- mundongos e ratos. O mamífero pode ser um humano, cão, gato, rato, rato etc. O indivíduo também pode ser um cavalo, vaca, porco, cabra, galinha, ovelha, burro, coelho, alpaca, lhama, ganso, boi, peru ou simi- lares. O indivíduo também pode ser um humano. O indivíduo pode ser um animal, de preferência o indivíduo pode ser um mamífero. Por exemplo, o indivíduo pode ser um porco, de preferência um leitão, de preferência um leitão no desmame.

[0074] O indivíduo pode ser um "indivíduo saudável". Um indivíduo saudável pode ser um indivíduo não afetado por uma doença ou dis- túrbio. De preferência, a definição de "indivíduo saudável" compreende indivíduos que não são afetados por envenenamento devido a toxinas, que estão presentes, por exemplo, nos alimentos ou nas rações para animais. Preferivelmente, a definição de "indivíduo saudável" compre- ende indivíduos que não são afetados pela flora intestinal prejudicial. Mais preferivelmente, a flora intestinal nociva compreende flora bacte- riana prejudicial. Por exemplo, um indivíduo saudável pode ter uma concentração de ácidos biliares comparável a um nível ou valor de controle. Além disso, o indivíduo saudável pode ter uma concentração de um ou mais ácidos biliares medidos em uma amostra de plasma, que foi obtida do indivíduo, cuja concentração de ácidos biliares é comparável à concentração de ácidos biliares presentes em uma amostra de controle. Em particular, a concentração dos ácidos biliares GLCA e/ou TLCA, quando medida em uma amostra de plasma obtida do indivíduo (saudável) é comparável (é aproximadamente a mesma) com a concentração de GLCA e/ou TLCA medida em uma amostra de controle. Tais ácidos biliares podem ser medidos em uma amostra de plasma, que foi obtida do indivíduo. A maneira como esses ácidos bili- ares são medidos é conhecida por aquele versado na técnica e tam- bém no presente documento descrita.

[0075] O indivíduo também pode ser um indivíduo afetado por uma doença ou distúrbio. Tais distúrbios ou doenças podem, por exemplo, incluir doenças ou distúrbios que afetam o intestino. O indivíduo sau- dável também pode ser um animal desmamado.

[0076] Como usado no presente documento, um "controle" se refe- re a qualquer controle adequado para os métodos/usos da presente invenção. Por exemplo, um controle pode ser uma concentração de um biomarcador/marcador, por exemplo a concentração de um certo ácido biliar, como no presente documento descrito, que tenha sido de- terminada em uma amostra de controle. Alternativamente ou adicio- nalmente, o controle também pode ser um valor de controle, que foi determinado por meios e métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0077] Por exemplo, um nível de controle/concentração de um bi- omarcador/marcador (por exemplo, ácido biliar) pode ser a concentra- ção do marcador em uma amostra obtida de um indivíduo saudável, por exemplo, um animal não atingido por doenças do intestino ou uma doença como no presente documento descrita. Assim, a amostra de controle pode, por exemplo, ser obtida de um indivíduo saudável, por exemplo, um indivíduo, tal como um animal, não atingido por nenhuma doença ou distúrbio, particularmente nenhuma doença ou distúrbio que afete o intestino. Então a concentração do marcador, por exemplo, um ácido biliar como descrito no presente documento pode ser medido nesta amostra de controle para fornecer um valor de controle para comparação. O indivíduo do qual a amostra de controle pode ser obti- da pode, por exemplo, ter a mesma idade e/ou peso etc. como o indi- víduo do qual a amostra é obtida ou que é para ser testada. Por exemplo, o controle ou amostra de controle pode ser do mesmo tipo da amostra obtida do indivíduo.

[0078] O controle para os fins da presente invenção também pode compreender indivíduos saudáveis (controle), preferivelmente indiví- duos que não tenham uma doença ou distúrbio, particularmente que não tenham uma doença ou distúrbio que afete o intestino ou mesmo controles padronizados que representem um grupo de controle saudá- vel, ou geral, conhecido nos padrões da técnica para doença intestinal. Os indivíduos do grupo controle, idealmente, não têm doença ou dis- túrbio concomitante e, particularmente, nenhuma doença intestinal. Um grupo de controle pode ser um grupo de várias pessoas saudá- veis, por exemplo, 3 ou mais, preferivelmente 5 ou mais, mais preferi- velmente 10, 20, 30, 40 ou 50 pessoas e a saúde pode ser examinada com métodos conhecidos, alguns dos quais também são no presente documento mencionados.

[0079] O controle também pode ser um indivíduo desmamado. O controle também pode ser um indivíduo que não recebe o microrga- nismo usado na presente invenção.

[0080] A presente invenção também se refere a um método para a produção de ácido quenodesoxicólico (CDCA), o método compreen- dendo: a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com um ácido glicoquenodesoxicólico (G-CDCA); obtendo assim o ácido quenodesoxicólico.

[0081] Adicionalmente ou alternativamente, a presente invenção também se refere a um método para a produção de ácido quenodeso- xicólico (CDCA), o método compreendendo: a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com um ácido tauroquenodesoxicólico (T-CDCA); obtendo assim o ácido quenodesoxicólico.

[0082] Os microrganismos usados na presente invenção são ca- pazes de executar esta etapa de desconjugação necessária para a conversão de T-CDCA/G-CDA em CDCA, podem ser vistos nos Exemplos no presente documento descritos.

[0083] Como usado no presente documento, o "ácido quenodeso- xicólico" (também conhecido como ácido quenodesoxicólico, ácido quenocólico e ácido 3α, 7α-di-hidróxi-5β-colan-24-óico ou CDCA) ocor- re como um ácido biliar. Os sais deste ácido carboxílico são chamados de quenodesoxicolatos. O ácido quenodesoxicólico é um dos princi- pais ácidos biliares produzidos pelo fígado. É insolúvel em água, mas solúvel em álcool e ácido acético, com um ponto de fusão de 165- 167°C. O ácido quenodesoxicólico pode ser sintetizado no fígado a partir do colesterol por um processo que envolve várias etapas enzi- máticas. Como outros ácidos biliares, ele pode ser conjugado no fíga-

do com taurina ou glicina, formando ácido tauroquenodesoxicólico (T- CDCA) ou ácido glicoquenodesoxicólico (G-CDCA). Em particular, es- ses conjugados são formados por uma ligação N-acil amida C-24, que liga o ácido biliar ao seu conjugado amino (glicina e taurina). No entan- to, dependendo da espécie, também pode ser uma ligação N-acil ami- da C-25, uma ligação N-acil amida C-26 ou uma ligação N-acil amida C-

27.

[0084] Tipicamente, a hidrólise da ligação N-acil amida C-24 dos ácidos biliares conjugados é catalisada por hidrolases de sal biliar (BSHs). A maioria das BSHs hidrolisam os ácidos biliares conjugados com glicina e taurina, embora alguns apresentem forte especificidade. Os genes BSH foram detectados nos principais gêneros bacterianos da microbiota intestinal e a enzima pode, por exemplo, ser purificada a partir de Bacteroides fragilis, B. vulgatus, Clostridium perfringens, Lis- teria monocytogenes e várias espécies de Lactobacillus e Bifidobacte- rium.

[0085] Assim, para confirmar que o método da presente invenção funciona, o seguinte teste pode ser realizado. Primeiro uma cultura de microrganismos usada na presente invenção e uma segunda cultura que compreende uma das bactérias que são capacitadas para esta conversão, por exemplo, Clostridium perfringens, são contatadas com T-CDCA e/ou G-CDCA. Após um período de tempo, o sobrenadante da cultura é amostrado e analisado quanto à presença de CDCA. Se o CDCA estiver presente em ambas as culturas, o método da presente invenção demonstrou funcionar.

[0086] O método pode incluir o contato de T-CDCA e/ou G-CDCA com uma preparação que compreende o microrganismo usado na pre- sente invenção. Por exemplo, a preparação pode compreender apenas componentes citoplasmáticos do microrganismo usado na presente invenção.

[0087] O método pode ainda compreender a etapa de purificação do ácido quenodesoxicólico.

[0088] Além disso, os métodos para realizar tais reações, assim como tampões adequados e etc. são conhecidos da pessoa versada na técnica e também estão descritos no presente documento nos Exemplos. É ainda contemplado que o método seja realizado em um biorreator tal como um biorreator em larga escala.

[0089] O ácido quenodesoxicólico obtido por um método da pre- sente invenção pode ser usado para qualquer finalidade. Por exemplo, ele pode ser usado em um método para dissolver cálculos biliares. Adicionalmente ou alternativamente, o ácido quenodesoxicólico obtido por um método da presente invenção pode ser usado no tratamento de xantomatose cérebro-tendinosa, infecção por Hepatite C e / ou consti- pação.

[0090] A presente invenção também se refere a um método para a produção de ácido litocólico (LCA), o método compreendendo: a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com um ácido quenodesoxicólico (CDCA); obtendo assim o ácido litocólico

[0091] Como usado no presente documento, a expressão "ácido litocólico", também conhecido como "ácido 3α-hidróxi-5β-colan-24- óico" ou "LCA", é um ácido biliar que atua como um detergente para solubilizar as gorduras para absorção. É sabido que o LCA é produzi- do a partir de, por exemplo, 7a-desidroxilase bacteriana a partir de CDCA. Sabe-se que cepas de Clostridium e Eubacteria podem realizar tal 7-desidroxilação.

[0092] Por exemplo, nos hepatócitos, os ácidos biliares primários e secundários sofrem conjugação de aminoácidos no ácido carboxílico C-24 (ou C-25, C-26 ou C-27) na cadeia lateral e quase todos os ácidos biliares no duto biliar existem, portanto, em uma forma conjugada com glicina. A ação bacteriana no cólon pode produzir LCA a partir do ácido quenodesoxicólico pela redução do grupo funcional hidroxila no carbo- no-7 no anel "B" da estrutura de esteroide. Uma vez produzido, o LCA pode se tornar conjugado com glicina para formar G-LCA (ou GLCA, como usado no presente documento). Uma vez produzido, o LCA tam- bém pode ser conjugado com taurina para formar T-LCA (ou TLCA, como usado no presente documento).

[0093] Notavelmente, nos Exemplos in vivo no presente documen- to descritos, foi encontrado um aumento no ácido glicolitocólico e no ácido taurolitocólico. Uma vez que o ácido litocólico se conjuga com glicina ou taurina, por exemplo, nos hepatócitos, é claro que um au- mento no próprio ácido litocólico também deve estar presente. Nota- velmente nos Exemplos no presente documento descritos (por exem- plo, na Fig. 2), o ácido litocólico foi medido e estava aumentado nume- ricamente no grupo B (que recebe um microrganismo usado na pre- sente invenção) em comparação com o grupo A (que não recebeu um microrganismo usado na presente invenção) Assim, embora não seja significativo, no entanto, um aumento da forma de LCA de 128,7 a 155,9 nM (dados não mostrados nos Exemplos) foi detectado no grupo B. Como o LCA é produzido a partir de CDCA, um aumento na con- versão de CDCA deve estar presente. Assim, também é plausível que o microrganismo da presente invenção seja capaz de também execu- tar a conversão de CDCA em LCA.

[0094] O método pode incluir o contato do CDCA com uma prepa- ração como no presente documento descrita, que compreende o mi- crorganismo usado na presente invenção. Por exemplo, a preparação pode compreender apenas componentes citoplasmáticos do microrga- nismo usado na presente invenção.

[0095] O método pode ainda compreender a etapa de purificação da LCA.

[0096] Além disso, os métodos para realizar tais reações, assim como tampões adequados e etc., são conhecidos por aqueles versa- dos na técnica e também são descritos nos Exemplos no presente do- cumento. É ainda contemplado que o método seja realizado em um biorreator tal como um biorreator em larga escala.

[0097] O LCA obtido por um método da presente invenção pode ser usado para qualquer finalidade. Por exemplo, o LCA pode ser usa- do para tratar câncer, tal como o câncer de cólon ou em um método para ativar o receptor da vitamina D.

[0098] Os métodos para confirmar que o ácido quenodesoxicólico/ ácido litocólico é produzido pelo microrganismo usado na presente in- venção ou que, de fato, T-CDCA e/ou G-CDCA ou LCA são usados como substância são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, estão disponíveis kits comerciais de ELISA para esse fim. Um outro método também é descrito nos Exemplos no presente do- cumento. Alternativamente, a presença de ácido quenodesoxicóli- co/LCA também pode ser determinada por métodos de cromatografia também conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0099] A presente invenção também se refere a um método para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável, o método com- preendendo a) contatar o indivíduo com um microrganismo da classe de Coriobacteriia.

[00100] Para os métodos da presente invenção, o que foi dito para o uso da presente invenção se aplica mutatis mutandis.

[00101] A presente invenção também se refere a um microrganismo da classe de Coriobacteriia para uso na promoção da saúde intestinal de um indivíduo, preferivelmente o indivíduo é atingido por uma doen- ça ou distúrbio. O microrganismo da classe de Coriobacteriia também pode ser usado para tratar um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio, como descrito no presente documento.

[00102] O microrganismo da classe de Coriobacteriia também pode ser usado para preparar uma composição para o tratamento de um indivíduo que é afetado por uma doença ou distúrbio, como descrito no presente documento. A composição pode compreender outros ingredi- entes, tal como no presente documento descrito, para a composição promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável.

[00103] Como usada no presente documento, a expressão "tratan- do" ou "tratamento" pode incluir a administração de um microrganismo como usado na presente invenção, preferivelmente na forma de um medicamento, por exemplo, a um indivíduo que sofra de uma doença que afeta o intestino com o objetivo de melhorar ou tratar os sintomas.

[00104] O indivíduo pode ser afetado por qualquer doença, por exemplo, doença do intestino. As doenças exemplificadoras incluem sepse, diarreia, doença inflamatória intestinal, doença do intestino irri- tável, obesidade, diabetes, doenças hepáticas, doenças cardíacas crônicas, doença celíaca e câncer.

[00105] O indivíduo pode ser afetado por uma doença do sistema imunológico.

[00106] A presente invenção também se refere a um método para a produção de ácido quenodesoxicólico (CDCA), o método compreen- dendo a) contatar um microrganismo da classe de Coriobacteriia com um ácido tauro- e/ou glicoquenodesoxicólico (G-CDCA); obtendo assim o ácido quenodesoxicólico.

[00107] A presente invenção também se refere a um método para promover a saúde intestinal de um indivíduo saudável, o método com- preendendo a) contatar o indivíduo com um microrganismo da classe de Coriobacteriia.

[00108] A presente invenção também se refere a um kit que com- preende o microrganismo usado na presente invenção. O kit pode ain- da compreender um prebiótico e/ou um probiótico. Por exemplo, o kit pode compreender pelo menos um microrganismo diferente do micror- ganismo usado na presente invenção. Por exemplo, o microrganismo diferente do microrganismo usado na presente invenção pode ser se- lecionado a partir de Clostridium, por exemplo, Clostridium perfringens, Eubacteria, Bacteroides fragilis, B. vulgatus, Listeria monocytogenes, Lactobacillus e Bifidobacterium.

[00109] É observado que, como usado no presente documento, as formas no singular "o/a", "um/uma" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um reagente" inclui um ou mais de tais rea- gentes diferentes e a referência ao "método" inclui a referência a eta- pas e métodos equivalentes conhecidos por aqueles versados na téc- nica que podem ser modificados ou substituídos pelo métodos no pre- sente documento descritos.

[00110] Salvo indicação em contrário, a expressão "pelo menos" que precede uma série de elementos deve ser entendida como se re- ferindo a todos os elementos da série. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades es- pecíficas da invenção no presente documento descritas. Tais equiva- lentes pretendem ser abrangidos pela presente invenção.

[00111] A expressão "e/ou" onde quer que seja usada no presente documento inclui o significado de "e", "ou" e "toda ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo referida expressão".

[00112] A expressão "menor do que" ou, por sua vez, "maior do que" não inclui o número concreto.

[00113] Por exemplo, menos de 20 significa menos que o número indicado. Da mesma forma, mais que ou maior do que significa mais do que ou maior do que o número indicado, por exemplo, mais do que 80% significa mais do que ou maior do que o número indicado de 80%.

[00114] Ao longo deste pedido e das reivindicações a seguir, a me- nos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender" e variações como "compreende" e "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qual- quer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas. Quando usada no presente documento, a expressão "compre- endendo" pode ser substituída pela expressão "contendo" ou "incluin- do" ou, às vezes, quando usada no presente documento com a ex- pressão "tendo". Quando usado no presente documento, "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado.

[00115] A expressão "incluindo" significa "incluindo, mas não limita- do a". "Incluindo" e "incluindo, mas não limitado a" são usados de for- ma alternativa.

[00116] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, materiais, reagentes e substâncias particula- res, etc., no presente documento descritos e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações.

[00117] Todas as publicações citadas ao longo do texto deste pedi- do (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações ci- entíficas, instruções, etc.), sejam supra ou infra, estão no presente do- cumento incorporadas por referência em sua totalidade. Nada no pre- sente documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção está a autorizada a anteceder essa descrição em virtude da invenção precedente. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com este pedido, o pedido substituirá tal material.

[00118] O conteúdo de todos os documentos e documentos de pa- tentes no presente documento mencionados está incorporado por refe- rência na sua totalidade.

[00119] As seguintes sequências são usadas no presente pedido. Se- Descrição da Sequência quência sequência # 1 sequência de CCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACA 16S-RNA TGCAAGTCGAACGGATAACCCGCCTCCGGGCGGTTATA deDSM11798 GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGACCAACCTACC

TCCCACTCCGGGATAACCCAGGGAAACCTGCGCTAATA CCGGATACTCCGGGGCCCCCGCATGGGGGCGCCGGG AAAGCCCCGACGGTGGGAGATGGGGTCGCGGCCTATT AGGTAGTCGGCGGGGTAACGGCCCACCGAGCCCGCGA TAGGTAGCCGGGTTGAGAGACCGATCGGCCACATTGG GACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATTTTGCGCAATGGGGGAAACCCTGACGCAG CAACGCCGCGTGCGGGACGAAGGCCTTCGGGTTGTAA ACCGCTTTCAGCAGGGAAGAAGTTGACGGTACCTGCAG AAGAAGCTCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATACGTAGGGAGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCG TAAAGCGCGCGTAGGCGGGCGCTTAAGCGGAATCTCTA ATCTGAGGGCTCAACCCCCAGCCGGATTCCGAACTGGG CGCCTCGAGTTCGGTAGAGGAAGACGGAATTCCCAGTG TAGCGGTGAAATGCGCAGATATTGGGAAGAACACCGAT GGCGAAGGCAGTCTTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAG GTGCGAAAGCTAGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGGCACTAGGTGTGGG GGGGAATGCCCCTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGT GCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTC AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCA TGTGGCTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAG GGCTTGACATGCAGGTGAAGCGGCGGAAACGCCGTGG CCGAGAGGAGCCTGCACAGGTGGTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCCTGTCGTATGTTGCCATCATTCAGTTG GGGACTCGTACGAGACTGCCGGCGTCAAGCCGGAGGA AGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCTTTATGCC CTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAACGG GCTGCGAGCCAGCGATGGCGAGCGAATCCCTCAAAAC CGGTCCCAGTTCGGATCGGAGGCTGCAACCCGCCTCC GTGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGC CGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCACCCGAGTTGTCTGCACCCGAAGTCGACGG CCCAACCCGCGAGGGGGGAGTCGCCGAAGGTGTGGG GAGTAAGGGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACC GGAAGGTGCGGCT

Se- Descrição da Sequência quência sequência # 2 gene cpn60 atggcaaaagatatcaagttcgaagccgacgcgcgcagcgctcttgcggctgga (nome alter- gtttcaaagctggccgacgccgttaaagtgacgcttggccccaagggtcgttacgt nativo GroEL) cgctctcgagaaatcctacggcgcccccaccatcaccaacgacggcgtcaccgtt >fig|84107.3.p gccaaagaagtcgagctcgaggatccggtagagaacatgggcgcccagctcgt ex.158 [Co- ccgcgaggttgccgttaagaccaacgatgttgcgggcgacggcaccaccaccgc riobacteriace- aacgctgctcgccgacgtcatcgtctccgagggtctgcgcaacgtcaccgcaggc ae] [Chapero- gccgatgcgctcggcatccgccgcggcatccagaaggccaccgatgcggtggtc na da família gaagagatcaagaacaccgcaaccgaggtttccggcaaagagcagatcgcca 60 da proteí- atgtcggcaccatttccgcaggcgatgccgagatcggcgagaagatcgccgagg na de choque ccatggacgccgttggcaaagacggtgcgatttctgttgaggagagccagacgtt térmico Gro- cggtctcgagatggacatcgtcgagggcatgcagtacgagcgcggctacatctcc EL] ccgtacatggcaaccgacatggagaagatggaagccgtcctcaaagatccctac atcctccttaccgaccagaaggtcaacaacatccaggacatggttccgctgcttga agaggttatgaagtccggtcgtccgctgttcctcgtcgccgaagacgtcgagggcg aggcgctcgccaccatcctgctcaacaagctgcgcggcaccttcaactgcgtcgc catcaaggcccccggcttcggcgatcgtcgcaagcgcatcctcgaggacattgcg gccgttaccggcgcgcaggtcatcgacaaggacttcggcatgaccatggccgat gccaccatcgatatgatgggccacgcgaagaccgtcaaggtcaccaaggacag cgcgctcatcgttgacggcgcaggcgataagaaggccatcgaggatcgcatcca tcagatcaaggccgagctcgaccgcgtcgactccgacttcgatcgcgagaagctc caggagcgcttggccaagctctccggcggcgttgcggtgctcaaggtgggcgctg ctaccgaatcggagctcaaggaaaagaagagccgcattgaagatgcgctgcag gcaacccgcgcagcggtcgaagagggcatcgttgccggcggcggcgtggcgct tgtgaacgctatccccgcactcgacaaggttgaagtcgccgacaaggacgaaga ggtcggcgtgagcatcgtccgcaaggcgcttgaggctcccatgcgcgccattgctc aaaacgccggtttcgagggaagcgtcgttgtcgagcacgtgaagggcatgaagg tcggcgaaggcctgaactgcgctacgggcgagtatggcaacatgatcgagatgg gcgtgaacgatccggtgaaggttacccgtacggcgctgcagtctgccgcttccgtg ggtgcgctcatcctcatcaccgaagccacgatcaacgagatcccgaaagaggg ccccgacttgtctgcgctcgccggtgctggcggcatgggcgggatgatgtag

[00120] Uma melhor compreensão da presente invenção e de suas vantagens será obtida a partir dos exemplos a seguir, oferecidos ape- nas para fins ilustrativos. Os exemplos não se destinam a limitar o es- copo da presente invenção de forma alguma.

EXEMPLOS DA INVENÇÃO EXEMPLO 1: Desconjugação de G-CDCA por BBSH 797

[00121] Tampões usados no Exemplo: solução mineral I: K2HPO4 (6 g/L), KH2PO4 (6 g/L), (NH4)2SO4 (6 g/L), NaCl (12 g/L), H2O dest. adicionar até 1 L solução mineral II: MgSO4 x 7 H2O (2,5 g/L), H2O dest. adicionar até 1

L solução mineral III: CaCl2 x 2 H2O (3 g/L), H2O dest. adicionar até 1 L solução de vitaminas: Biotina (Vitamina H, 2 mg/L), Ácido fólico (2 mg/L), Piridoxina-HCl (Vitamina B6, 10 mg/L), Tiamina-HCl (Vitamina B1, 5 mg/L), Riboflavina (Vitamina B2, 5 mg/L), Nicotinamida (5 mg/L), D,L-Pantotenato (5 mg/L), Cianocobalamina (Vitamina B12, 0,1 mg/L), Menadiona (100 mg/L), Filoquinona (Vitamina K1, 22 mg/L), Ácido p- aminobenzóico (5 mg/L), Ácido tióctico (5 mg/L), H2O dest. adicionar até 1 L; armazenada a 4°C solução de elementos residuais (TE): ZnSO4 x 7 H2O (0,10 g/L), MnCl2 x 7 H2O (0,03 g/L), H3BO3 (0,30 g/L), CuCl2 x 2 H2O (0,01 g/L), CoCl2 x 6 H2O (0,20 g/L), NiCl2 x 6 H2O (0,02 g/L), Na2MoO4 x 2 H2O (0,03 g/L), H2O dest. adicionar até 1 L; armazenada a 4°C. solução de hemina (10 000 ppm): 1 g de hemina foi dissolvida em de uma solução de NaOH 1M. Posteriormente, 50 ml de EtOH (92,7 % v/v) foram adicionados. Armazenada a 4°C. tampão fosfato: Tampão KH2PO4 0,5 M + Na2HPO4 0.5 M x 2 H2O, pH = 6.9, esterilizado por filtração solução de cisteina-Na2S (agente redutor): A solução é feita sob at- mosfera de N2 em um frasco de Schott com septo cap. 0,5 g de Cistei- na-HCl foram dissolvidas em 18,2 ml cozidas, água destilada aerada com N2. 1,8 ml de NaOH 4 M (pH 10) e 0,5 g de Na2S foram adiciona- dos. Preparada recentemente, esterilizada por filtração e armazenada a 4°C tampão de diluição: Combine 75 ml de cada solução mineral I, II e III com 10 ml de solução de vitamina, 0,5 ml de solução de elemento re- sidual, 0,5 ml de solução de hemina e 0,5 g de cisteina-HCl; H2O dest. adicionar até 1 L. pH = 6,8 a 6,9 (ajustado com solução de NaOH 4M), autoclavada a 121°C por 15 minutos, preparada recentemente

[00122] Para determinar a capacidade de BBSH 797 de desconju- gar GCDCA em CDCA, experimentos de incubação foram realizados. Portanto, os três tipos de lotes a seguir foram gerados em triplicatas:

Lote T contendo GCDCA e BBSH 797 (4,09E+6 CFU/mL) Lote C1 contendo GCDCA apenas sem BBSH 797 Lote C2 contendo GCDCA em conjunto com BBSH 797 ina- tivado (4,09E+6 CFU/mL). BBSH 797 inativado significa que o BBSH 797 não é viável.

[00123] Em detalhes, o seguinte procedimento foi realizado: O tam- pão de diluição foi esterilizado por filtração e foram adicionados tam- pão fosfato 2,5% (v/v) e agente redutor 1% (v/v) para obter o tampão de diluição final. 18 ml de tampão de diluição final foram colocados em frascos Schott estéreis de 25 ml para todas as experiências de trata- mento (lotes T) e os controles de inativação (lotes C2). 20 mL de tam- pão de diluição final foram colocados em frascos Schott estéreis de 25 mL para controle negativo (lotes C1). 200 µL de uma solução de GCDCA foram adicionados a todos os lotes para obter uma concentra- ção final de 5 µM.

[00124] A cultura de BBSH 797 foi cultivada a partir de liofilizados e um inóculo de BBSH 797 (4,09E + 7 CFU/mL) foi preparado em tam- pão de diluição final. 2 mL deste inóculo foram adicionados aos lotes T para obter 20 mL (volume negligenciado de solução de GDCA) com uma densidade celular de 4,09E+6 CFU de BBSH 797 por mL. Uma parte do inóculo de BBSH 797 (4,09E+7 CFU/mL) foi inativada pela incubação em banho-maria a 90°C por 15 min. 2 mL deste inóculo ina- tivado foram adicionados aos lotes C2 para obter 20 mL (volume ne- gligenciado de solução de GDCA) com uma densidade celular equiva- lente a 4,09E+6 CFU de BBSH 797 inativado por mL.

[00125] No tempo t = 0 minutos, todos os lotes foram homogenei- zados por agitação e amostras (amostras t0, 1 mL) foram imediata- mente aquecidas a 95 C por 5 minutos e armazenadas a -20°C.

[00126] Todos os lotes foram posteriormente incubados a 37°C por 48 horas. Após 48 horas, todos os lotes foram homogeneizados por agitação e foram colhidas amostras (amostras t = 48 h, 1 mL) que fo- ram imediatamente aquecidas a 95°C por 5 minutos e armazenadas a -20°C. Antes da quantificação de GCDCA e CDCA, todas as amostras foram descongeladas e centrifugadas a 16.600 x g por 10 minutos. 10 ml das amostras clarificadas foram diluídos com 990 µL do eluente pa- ra HPLC (20% de acetonitrila + 80% de H2O destilada) e as quantida- des de GCDA e CDCA foram quantificadas.

[00127] Os resultados obtidos estão resumidos na Figura 1. O que pode ser visto na Fig. 1 é que, em ambos os lotes de controle (C1 e C2), nenhuma transformação de GCDCA em CDCA foi identificada. Portanto, o GCDCA não é desconjugado espontaneamente (C1) nem pelo microrganismo BBSH 797 inativado (morto). Para o tratamento (lotes T), é claramente mostrado que o GCCA é absorvido pelo mi- crorganismo vivo muito rápido, pois as amostras t = 0h já mostram concentrações de GCDCA significativamente reduzidas no meio de incubação (1,59 µM) em comparação com as amostras C1 e C2. Além disso, o GCDCA é de-conjugado pelo BBSH 797 vivo e o CDCA é ge- rado (CDCA 0,02 µM em t = 0h e CDCA 1,06 µM em t = 48 h). Uma razão pela qual não foram encontrados mais GCDCA e CDCA no tam- pão de incubação dos lotes T pode ser devido a um armazenamento intermediário de ambas as substâncias no microrganismo.

[00128] Assim, apenas o BBSH 797 ativo é capaz de converter GCDCA em CDCA. A partir desses dados, pode ser concluído que BBSH 797 é capaz de hidrolisar a ligação N-acilamida C24 (e, portanto, provavelmente também a ligação N-acilamida C25, a ligação N- acilamida C26 e a ligação N-acilamida C27) dos ácidos biliares conjuga- dos. Portanto, pode ser esperado que BBSH 797 compreenda uma ou mais enzimas que possam realizar essa hidrólise. Também pode ser esperado que CDCA conjugado com taurina também possa ser hidroli- sado na presença de BBSH 797.

[00129] Em resumo, experimentos in vitro mostraram uma conver- são do ácido glicoquenodesoxicólico em ácido quenodesoxicólico. De acordo com a literatura, este último leva à liberação de GLP-2 e, por- tanto, à integridade intestinal melhorada (Diego-Cabero et al., 2015). Com base nas experiências in vitro, foi realizado um estudo in vivo com leitões desmamados para avaliar o efeito do BBSH 797 na barrei- ra intestinal. EXEMPLO 2: Experimentos de Alimentação Configuração experimental:

[00130] Um total de 16 leitões (Ö-HYB, 4-5 semanas de idade, cer- ca de 10 kg) foram divididos em dois grupos diferentes após o des- mame. O grupo A recebeu uma composição de ração (ração completa para desmame), cujos componentes foram adaptados à idade dos animais. No grupo B, BBSH 797 foi adicionado à mesma ração de desmame (concentração final de BBSH 797 na ração de 2,2 * 109 uni- dades formadoras de colônias/kg de composição de ração de desma- me). Durante o período experimental de 44 dias, a ração foi adminis- trada duas vezes por dia. Os leitões tinham livre acesso à água potá- vel, eram mantidos em condições controladas (espaço, temperatura, umidade e luz) e recebiam leitões de brinquedo como enriquecimento. Os animais foram tratados diariamente por pessoas treinadas e super- visionadas por veterinários. Amostragem:

[00131] No dia 42, foram coletadas amostras de sangue individuais da veia cava cranial de todos os animais (Primavette® EDTA, Kabe Laboratory GmbH, Nuembrecht-Elsenroth, Alemanha). Após centrifu- gação (2.300xg, 10 min), duas alíquotas (100 µL cada) foram transpor- tadas em gelo seco para a Biocrates Life Sciences AG (Innsbruck, Áustria). Lá, as amostras foram armazenadas a -80°C até que as con- centrações de ácido biliar fossem determinadas.

[00132] Nos dias 42 e 43, os leitões foram mantidos em gaiolas me- tabólicas. Nestes dois dias, por volta das 9 horas da manhã, os ani- mais receberam aproximadamente 15 ml de ágar agar contendo lactu- lose (500 mg/kg de peso corporal) e ramnose (100 mg/kg de peso cor- poral). Posteriormente, a urina foi coletada para cada um dos três pe- ríodos de tempo diferentes: 0-2, 2-4 e 4-6 horas após a administração da solução de açúcar. Além disso, uma amostra de urina foi coletada diretamente antes da primeira administração de açúcar (amostra em branco). As amostras de urina foram armazenadas a -20°C até a aná- lise da proporção entre lactulose/ramnose. Análise de amostras:

[00133] Para a medição de ácidos biliares, foi usado um Kit de Tes- te de Ácido Biliar disponível comercialmente (Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Áustria). Para esse fim, as amostras foram extraídas por meio da técnica de mancha de filtro seco e, em seguida, analisa- das por meio de cromatografia líquida espectrometria de massa em tandem (Thermo Fischer Scientific TSQ, ionização por eletrospray ne- gativa, modo de monitoramento de reação múltipla). Um total de 20 ácidos biliares primários e secundários foram quantificados usando padrões externos (curva de calibração de 7 pontos) e internos (10 pa- drões marcados com isótopos). Os dados foram então avaliados usando o software Thermo Fischer Scientic Xcalibur™ e Biocrates Me- tIDQ. Resultados e discussão:

[00134] No dia 42, foi observado um aumento significativo no ácido glicolitocólico e no ácido taurolitocolólico no grupo B (Figura 2). Eles representam ácidos biliares secundários, aos quais um aminoácido (glicina ou taurina) está ligado. Em geral, a conversão do ácido primá- rio (ácido cólico, ácido quenodesoxicólico) em ácidos biliares secundá- rios (ácido desoxicólico, ácido litocólico) ocorre por micróbios intesti-

nais. Assim, foram descritos os processos metabólicos enzimáticos necessários (desconjugação, 7-hidroxilação) em vários gêneros bacte- rianos, tais como Bacteroides, Bifidobacterium ou Clostridium (Gerard, 2014). Para BBSH 797 (gênero novus da família Coriobacteriaceae, cepa número DSM 11798), esses relatórios não estão disponíveis até o momento.

[00135] Para a medição de lactulose e ramnose, a urina foi diluída por um fator de 1,6 * 106 em várias etapas intermediárias com metanol. Posteriormente, a lactulose e a ramnose foram determinadas pelo mé- todo LC-MS. Para isso, foi usado um instrumento Agilent 1290 Infinity I (Agilent Technologies, Estados Unidos) ao qual foi acoplado um es- pectrômetro de massa Triple Quad 5500 (AB Sciex, Canadá). Os anali- tos foram separados em uma coluna Luna NH2 de 150 x 2,0 mm (Phenomenex, Reino Unido, 30°C, 0,250 mL/min, eluição com gradien- te de acetonitrila por 10 min). O espectrômetro de massa foi operado com ionização por electrospray negativa e no modo de monitoramento de reação múltipla (m / z 341 → m / z 161 e m / z 341 → m / z 101 pa- ra lactulose; m / z 163 → m / z 59 e m / z 163 → m / z 103 para ram- nose). Os dados foram analisados por meio do Analyst Software (AB Sciex, Canadá) e a proporção entre lactulose/ramnose calculada no MS-Excel (Microsoft, EUA).

[00136] No experimento, uma correlação entre concentrações ele- vadas de ácido biliar e uma barreira intestinal melhorada pode ser de- monstrada. A integridade da barreira intestinal foi avaliada usando um ensaio de açúcar duplo. O princípio deste teste é baseado na co- administração de lactulose e ramnose. O dissacarídeo lactulose entra na corrente sanguínea apenas paracelularmente através dos estreitos espaços entre as células epiteliais intestinais individuais. Por outro la- do, o monossacarídeo ramnose é transportado para o corpo paracelu- larmente e transcelularmente através das células intestinais. Quando a barreira intestinal enfraquece, o espaço intersticial se torna cada vez mais poroso, resultando na absorção de quantidades comparativamen- te maiores de dissacarídeos. Consequentemente, a proporção entre lactulose/ramnose na urina aumenta. Uma barreira intestinal intacta ou reforçada está associada a uma proporção reduzida de lactulo- se/ramnose na urina (Wijtten et al., 2011 citados no presente docu- mento). Na experiência realizada, a administração de BBSH 797 por várias semanas resultou em uma proporção significativamente reduzi- da entre lactulose/ramnose na urina (p = 0,0173, Figura 3). EXEMPLO 3: Efeito de BBSH 797 sobre o ganho de peso e a taxa de conversão alimentar (FCR) em indivíduos saudáveis Configuração experimental:

[00137] Leitões desmamados de ambos os sexos (tipo genético: O- HYB FI [(Landrace x Large White) x Pietrain]) de aproximadamente 4- 10 semanas de idade foram marcados nas orelhas, pesados individu- almente e atribuídos a um grupo controle (GC), um grupo experimental (TG) ou um grupo experimental de alta concentração (hTG). Os ani- mais foram selecionados de um rebanho saudável. Os animais do gru- po de controle (GC) foram alimentados com uma dieta basal sem anti- bióticos, coccidiostáticos, probióticos, aditivos fitogênicos ou ácidos orgânicos. A alimentação da dieta basal continha os seguintes ingredi- entes para os dias 1 a 14 em % (p/p): Milho, 30; cevada, 32,9; óleo de girassol, 0,6; proteína de batata, 7; milho cozido na pressão, 6; con- centrado de proteína de soja, 5,7; trigo cozido na pressão, 4; dextrose, 4; lactose, 3; palmiste, gordura de coco, 2,5; monofosfato de cálcio, 1,23; fosfato de magnésio, 0,1; cloreto de sódio, 0,43; pré-mistura de vitaminas, 0,1; pré-mistura de oligoelementos, 0,15; L-lisina, 0,56; DL- metionina, 0,17; L-treonina, 0,16; L-triptofano, 0,08; edulcorante, 0,02. Nos dias 15 a 42, o alimento da dieta basal continha os seguintes in- gredientes em% (m / m): Milho, 40,7; cevada, 35; soja 48%, 20; óleo de girassol, 0,5; monofosfato de cálcio, 0,94; carbonato de cálcio, 1,31; fosfato de magnésio, 0,2; cloreto de sódio, 0,46; pré-mistura de vitami- nas, 0,1; pré-mistura de oligoelementos, 0,15; L-lisina, 0,4; DL- metionina, 0,12; L-treonina, 0,12. Os animais do grupo experimental (TG) foram alimentados com a mesma dieta basal como o grupo de controle, mas a ração foi suplementada com BBSH 797 (DSM 1 1798) até uma concentração final de 2,2 * 109 CFU por kg de ração. Os ani- mais do grupo experimental de alta concentração (hTG) também foram alimentados com a mesma dieta basal que o CG, mas a ração foi adi- cionalmente suplementada com BBSH 797 (DSM 11798) até uma con- centração final de 2,2 * 1011 CFU por kg de ração. O período de trata- mento foi de 42 dias. Durante todo o período experimental, os animais foram alimentados ad libitum. Também foi fornecida água potável ad libitum. As condições climáticas foram operadas por computador, regu- ladas automaticamente de acordo com as recomendações padroniza- das para o desmame de leitões e registradas diariamente. De manhã e à tarde, os funcionários da fazenda checavam o estado geral de saúde dos animais e controlavam as instalações de alojamento para garantir alimentação e abastecimento de água constantes, temperatura e venti- lação corretas. Além disso, os animais eram examinados regularmente por um veterinário para confirmar a boa saúde dos animais durante todo o experimento. Durante o experimento, o consumo de ração por pocilga foi medido com precisão. O peso corporal foi determinado indi- vidualmente nos dias 1, 14 e 42. A ingestão média diária de ração por pocilga foi determinada entre os dias 1 e 42, assim como entre os dias 15 e 42. A ingestão média de ração e o peso corporal médio por pocil- ga foram usados para calcular a taxa média de ganho de peso (taxa de conversão alimentar, FCR). Resultados:

[00138] Durante todo o período do teste, todos os animais perma-

neceram livres de quaisquer problemas de saúde perceptíveis ou quaisquer sintomas de doenças clínicas e não ocorreu nenhuma per- da. O efeito benéfico da suplementação da ração com BBSH 797 so- bre o ganho de peso é mostrado na tabela 1 a seguir. Tabela 1: Efeito da suplementação da ração com BBSH 797 sobre o ganho de peso em animais saudáveis Média diária de ganho de peso (g) CG TG hTG Dia 1-42 470 492 487 Dia 15-42 581 614 594

[00139] Além disso, proporção de ração para o ganho de peso, também conhecida como taxa de conversão alimentar (FCR), foi en- contrada melhorada em animais alimentados com uma dieta basal su- plementada com BBSH 797 do que em animais alimentados apenas com dieta basal não suplementada com BBSH 797. No período do dia 1 a 42, a FCR melhorou de 1,63 kg kg dos animais alimentados exclu- sivamente com dieta basal para 1,54 kg/kg dos animais alimentados com dieta basal suplementada com BBSH 797. No período do dia 15 a 42, a FCR melhorou de 1,69 kg/kg dos animais alimentados exclusi- vamente com dieta basal para 1,59 kg/kg dos animais alimentados com dieta basal suplementada com BBSH 797. Como mostrado nos Exemplos deste documento, a suplementação alimentar com BBSH 797 promoveu a saúde intestinal de animais saudáveis, resultando em uma melhoria de ambos, ganho de peso e taxa de conversão alimentar de animais alimentados com ração suplementada com BBSH 797, en- quanto não foram observados efeitos adversos. Lista de Referências Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402 Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300 Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402

Boesjes and Brufau (2014) "Metabolic effects of bile acids in the gut in health and disease" Current Medicinal Chemistry, 21, 2822- 2829 Brutlag Comp.

App.

Biosci. 6 (1990), 237-245 Connor et al.(2016) "Glucagon-like peptide 2 and its bene- fcial effects on gut function and health in production animals" Domstic Aniaml Endocrinology 56 S56-S65) de Diego-Cabero et al. (2015) "Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets." BMC veterinary research 11:111 Derikx et al. (2010) "Non-invasive markers of gut wall inte- grity in health and disease" World Journal of Gastrology 16(42):5272- 5279 Grootjans et al. (2010) "Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut" World J Gastrointest Surg; 2(3): 61–69 Gupta et al. (2013) "Molecular signatures for the class Co- riobacteriia and its different clades; proposal for division of the class Coriobacteriia into the emended order Coriobacteriales, containing the emended family Coriobacteriaceae and Atopobiaceae fam. nov., and Eggerthellales ord. nov., containing the family Eggerthellaceae fam. nov." Int.

J.

Syst.

Evol.

Microbiol. 63 (Pt 9), pp. 3379-3397 Henikoff Proc.

Natl.

Acad.

Sci., USA, 89, (1989), 10915 Hofmann et al. (1992) "A proposed nomenclature for bile acids" Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604 Kawamata et al. (2003) "A G protein-coupled receptor res- ponsive to bile acids*" vol. 278, no. 11, pp. 9435-9440 Matsuki et al. (2004) Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Human Feces.

Applied and Environmental Microbiology

70(12): 7220-7228). Slavin (2013) "Fiber and Prebiotics: Mechanisms and Health Benefits" Nutrients. 5(4): 1417–1435 Thompson Nucl.

Acids Res. 2 (1994), 4673-4680 Torres et al. (2010) "Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics" Comprehensi- ve Reviews in Food Science and Food Safety, Volume 9, Issue 5, p. 438-454 Schaap et al. (2014) "Bile acid receptors as targets for drug development" Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 11(1):55-67 Wang et al. (2015) "Methods to determine intestinal perme- ability and bacterial translocation during liver disease." J Immunol Me- thods; 421: 44–53. Wijtten et al., (2011) "Intestinal barrier function and absor- ption in pigs after weaning: a review." Br J Nutr 105:967-981

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um microrganismo da classe de Coriobacteriia, caracterizado pelo fato de ser para promover a integridade intestinal de um indivíduo saudável.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é fornecido dentro de uma composição, preferivelmente dentro de uma composição alimentícia e/ou ração.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é fornecido por mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70 ou mais dias, preferivelmente o mi- crorganismo é fornecido por 42 ou 44 dias.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é forne- cido em uma dosagem de 0,25*109, 0,5*109, 0,75*109, 1,0*109, 1,25*109, 1,5*109, 1,75*109, 2,0*109, 2,25*109, 2,5*109, 2,75*109, 3,0*109, 3,25*109, 3,5*109, 3,75*109, 1,0*109, 1,25*109, 1,5*109, 1,75*109, 4,0*109 ou mais unidades formadoras de colônias (CFU) por kg de composição, preferivelmente o microrganismo é fornecido em uma dosagem de pelo menos 2,2*109 unidades formadoras de colô- nias por kg de composição.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um mi- crorganismo da ordem Eggerthellales.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um mi- crorganismo da família Eggerthellaceae.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um mi-

crorganismo da cepa DSM11798.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microrganismo converte ácido glicoquenodesoxicólico (G-CDCA) em ácido quenodesoxicólico (CDCA).

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o microrganismo aumenta o ácido glicolitocólico (GLCA) do ácido biliar e/ou o ácido taurolitocóli- co (TLCA) dentro do indivíduo, em comparação com GCLA e/ou TLCA presentes antes da administração do microrganismo.

10. Uso de acordo qualquer uma das reivindicações prece- dentes, caracterizado pelo fato de que a integridade intestinal é pro- movida quando a proporção entre a lactulose/ramnose na urina 6 ho- ras após o indivíduo ter sido alimentado com lactulose e ramnose é menor que a proporção entre lactulose/ramnose na urina no ponto no tempo da alimentação com lactulose e ramnose.

11. Uso de acordo qualquer uma das reivindicações prece- dentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo saudável é um indi- víduo não afetado por uma doença ou distúrbio.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o indivíduo saudável tem uma concentração de ácidos biliares medida em uma amostra de plasma, que tenha sido obtida do indivíduo, cuja concentração de áci- dos biliares é comparável à concentração de ácidos biliares presentes em uma amostra de controle.

13. Método in vitro para a produção de ácido quenodesoxi- cólico (CDCA), caracterizado pelo fato de compreender a) contatar de microrganismo da cepa DSM11798 com um ácido glicoquenodesoxicólico (G-CDCA); obtendo assim o ácido quenodesoxicólico.