JP7267998B2 - 新規ペプチド系癌造影剤 - Google Patents

Description

（政府支援の確認）
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＣＡ１６８５０５、及びＰ３０ＣＡ０１６０５８によって実施された。政府は、本発明において、ある特定の権利を有する。

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年８月１９日出願の米国特許仮出願第６２／５４７，８２１号の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、乳癌、及び甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）などの他の癌では、癌の一部において手術が既に選択肢でない場合に、体外照射が局所的制御に使用される。従来の化学療法は有効でない場合も多く、キナーゼを標的とする阻害剤は、これらの治療に関連する毒性が高いため、効果が限られている。

最適な外科的成果を達成するには、全ての標的組織の除去と、手術時間及び他の組織に対する危険性を最小限に抑えることが必要である。これを達成するために、手術前の撮像は必要不可欠である。現在の撮像モダリティはめざましく進歩しているが、それぞれ限界がある。超音波（ＵＳ）、ＭＲＩ、及びＣＴは、原発腫瘍の同定に効果的に使用され、全体的なリンパ節の関与の判定に使用することができるが、有効性は主観的であり、ユーザの経験に基づくことがある。例えば、ＭＴＣでは、^１８Ｆ－Ｄｏｐａ－ＰＥＴ及び^１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴを用いた代謝イメージングは、３５～４５％の進行性ＭＴＣ病変のみが特定される。９９ｍＴｃセスタミビを使用した核イメージングを使用できるが、感度が乏しく、様々な組織への取り込みによって特異性を欠く。ＦＤＧは一般に、高グルコース代謝のみに特異的であり、癌特異的ではない。

病変組織の完全な除去は、正常組織を病変組織と区別する外科医の能力に依存する。術中評価は、その多くが、外科医の経験と、除去された組織、典型的にはリンパ節及び切除縁の病理学的凍結切開分析（ＦＳＡ）に基づく。ＦＳＡは、外科医が、試料調製、Ｈ＆Ｅ染色、及び病理医による検査を待つため、非常に時間がかかる。ＦＳＡはまた、除去された組織のわずかな部分のみを検査する。その他ＦＳＡの大きな制約は、その場（患者の体内）に残った組織を評価しないことである。除去される組織の程度は、外科医の裁量に基づく。この手術中の病理組織同定による制約は、より良い術中評価方法の必要性を指摘するものである。手術中の撮像は、他の癌種での適応が成功している。近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）造影剤を使用した蛍光画像ガイド下手術は、残留腫瘍を減少させ、黒色腫及び乳腺腺癌のマウスモデルにおける生存率を改善することが示されている。ＮＩＲＦ剤は、外科医が手術する際にリアルタイムで視認できる。腫瘍特異的造影剤は、これらの薬剤が全ての悪性組織の正確な外科的除去を増加させ得る場合、患者の転帰を改善することができる。したがって、疾患細胞により容易にかつ多く吸収され、より良好な病理組織の同定を可能にし得る、新たなＮＩＲＦ造影剤が必要とされている。

発明者らは、ヒト頭頸部扁平上皮（ＨＮＳＣＣ）細胞によって特異的に内在化される化学修飾ペプチド（ＨＮ１７及びＨＮ１８）の単離について、本明細書に記載している。特定の実施形態では、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドは、乳癌及びＭＴＣ、並びに他の癌などの固形腫瘍組織細胞にも特異的である。発明者らはまた、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８（及びその誘導体）とコンジュゲートした、抗体及び抗体断片、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ペプチド、ホルモン、脂質、及び炭水化物などのタンパク質系薬物を含む抗癌剤の、腫瘍組織への特異的送達を可能にする方法も記載している。加えて、発明者らは、検出可能な標識とＨＮ１７及び／又はＨＮ１８をコンジュゲートしてそのコンジュゲートを患者に送達する、又は、コンジュゲートを腫瘍組織とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることによる、癌細胞の撮像及び診断の方法を記載している。発明者らは更に、腫瘍の内在化ペプチドを単離する方法を提供している。加えて、発明者らは更に、内在化ペプチドの単離と、患者に投与するための薬物又は遺伝子治療組成物へのコンジュゲートによって、癌細胞を検出する方法を記載している。

発明者らが単離したＨＮ１７及びＨＩＮ１８ペプチドは、腫瘍関連内皮細胞ではなく腫瘍細胞に特異的であるという点で、Ａｒａｐら（１９９８）の研究に記載されているペプチドとは異なる。発明者らは、腫瘍細胞の直接的かつ特異的殺傷を達成するために、任意の種類の抗癌剤をこのペプチドにコンジュゲートさせることを想定している。ペプチドは元々腫瘍細胞に入る性質があり、力学的レベルでこのプロセスを促進する。前立腺

本開示の実施形態では、腫瘍細胞を標的とするペプチドがあり、このペプチドは腫瘍細胞によって内在化される。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９を含む。追加の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９からなる。本開示の別の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９をコードするＤＮＡ断片がある。特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９をコードする核酸を含む。追加の特定の実施形態では、ＤＮＡ断片は、組換えベクターとして更に定義される。

本開示の別の実施形態では、薬物と、腫瘍細胞を標的とするペプチドと、を含む、組成物が提供され、このペプチドは当該腫瘍細胞によって内在化される。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９からなる。更なる特定の実施形態では、薬物は化学療法剤である。別の特定の実施形態では、薬物は細胞毒性剤である。追加の特定の実施形態では、薬物はアポトーシス剤である。更なる特定の実施形態では、薬物はＤＮＡ損傷剤である。別の特定の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン、ブレオマイシン、タキソール（登録商標）（又は、例えば、ドセタキセルなどの類似体）、メトトレキサート、又はセツキシマブである。追加の特定の実施形態では、薬物は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン（bisulfan）、ニトロソウレア（nitrosurea）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、プリカマイシン（plicomycin）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、又はビンブラスチン、又は本明細書に開示される任意の他の抗癌剤である。

本開示の目的によれば、腫瘍細胞を、薬物と、腫瘍細胞を標的とするペプチドと、を含む、薬学的に許容される組成物と接触させることを含む、腫瘍細胞を殺傷する方法が提供され、このペプチドは腫瘍細胞によって内在化される。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９を含む。別の特定の実施形態では、薬物はペプチドにコンジュゲートされる。更なる特定の実施形態では、腫瘍細胞は、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌、乳癌、神経膠芽腫、及び星状細胞腫からなる群から選択される。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、ヒト頭頸部癌細胞である。特定の実施形態では、ヒト頭頸部癌細胞は、口腔細胞、咽頭細胞、咽喉細胞、副鼻腔細胞、鼻腔細胞、喉頭細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、唾液腺細胞、唾液腺細胞、顔の皮膚細胞、頸部の皮膚細胞又は頸部リンパ節細胞である。別の特定の実施形態では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。更なる特定の実施形態では、固形腫瘍細胞は乳癌細胞を含む。特定の実施形態では、接触させることは、静脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、特に前立腺癌及び肝臓癌では動脈内投与、腹腔内投与、又は局所投与によるものである。追加の特定の実施形態では、接触させることは、局部投与、局所投与、又は全身投与によるものである。別の特定の実施形態では、腫瘍細胞は患者内にある。

本開示の別の態様によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドを得ることであって、ペプチドが腫瘍細胞を標的とする、ことと、検出可能な標識をペプチドにコンジュゲートさせることと、コンジュゲートしたペプチド及び標識を患者に投与することと、好適な検出手段によって、コンジュゲートの腫瘍細胞への結合を検出することと、を含む、対象における癌又は癌細胞を検出する方法が提供される。特定の実施形態では、結合には、当該腫瘍細胞による取り込みを更に含む。別の特定の実施形態では、標識は、放射性標識、蛍光標識、又はＭＲＩ用の常磁性若しくは超常磁性標識である。追加の特定の実施形態では、投与することは、静脈内注射、動脈内注射、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、又は局所投与によるものである。特定の実施形態では、投与することは、局部投与、局所投与、又は全身投与によるものである。追加の実施形態では、検出は、磁気共鳴映像法、光学イメージング法、又は放射型コンピュータ断層撮影法によるものである。追加の実施形態では、二重プローブは、任意の２つの異なる標識をコンジュゲートすることによって行われ、検出は、対応する２つの検出技術、例えば光学イメージング法及び陽電子放出断層撮影法の両方によって行われる。

本開示の他の目的によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドを得ることであって、当該ペプチドが腫瘍を標的とする、ことと、検出可能な標識をペプチドにコンジュゲートさせることと、コンジュゲートしたペプチド及び標識を腫瘍を含有するサンプルに接触させることと、好適な検出手段によって、コンジュゲートの腫瘍への結合を検出することと、を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍を検出する方法が提供される。特定の実施形態では、結合は、腫瘍の細胞による取り込みを更に含む。特定の実施形態では、標識は、放射性ヌクレオチド、蛍光、又は常磁性若しくは常磁性若しくは強磁性（すなわち、スピン）標識である。別の実施形態では、検出は、核磁気共鳴映像法、放射型コンピュータ断層撮影法、又は陽電子放出断層撮影法によるものである。

本開示の別の目的によれば、好適な容器中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドの医薬組成物を含む、腫瘍検出キットが提供される。更なる特定の実施形態では、好適な容器中に、検出可能標識に結合した、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドは腫瘍細胞を標的とする、ペプチドの医薬組成物を含む、腫瘍検出キットがある。別の特定の実施形態では、好適な容器中に、検出可能標識に結合した、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、ペプチドは腫瘍細胞を標的とする、ペプチドの医薬組成物と、好適な検出手段と、を含む、腫瘍検出キットがある。特定の実施形態では、検出可能な標識は、外部撮像及び腹腔鏡下撮像、並びに腹腔鏡下蛍光顕微鏡法などの非侵襲的手段によって検出可能である。別の特定の実施形態では、検出可能な標識はスピン標識分子である。追加の特定の実施形態では、検出可能な標識は放射性同位体である。追加の特定の実施形態では、検出手段は、核磁気共鳴映像法、放射型コンピュータ断層撮影法、又は陽電子放出断層撮影法によるものである。

本開示の別の態様によれば、好適な容器中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドが腫瘍細胞を標的とする、ペプチドを含む、有効量の薬学的に許容される製剤を含む、腫瘍撮像キットが提供される。特定の実施形態では、腫瘍撮像キットは、好適な容器中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドが腫瘍細胞を標的とし、当該ペプチドが検出可能な標識に結合されている、ペプチドを含む、有効量の薬学的に許容される製剤を含む。更に特定の実施形態では、腫瘍撮像キットは、好適な容器中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、ペプチドが腫瘍細胞を標的とし、ペプチドが検出可能な標識に更に結合されている、ペプチドを含む、有効量の薬学的に許容される製剤と、当該検出可能な標識を検出する好適な手段と、を含む。特定の実施形態では、検出可能な標識は非侵襲的手段によって撮像される。別の特定の実施形態では、検出可能な標識はＭＲＩスピン標識分子である。更なる特定の実施形態では、検出可能な標識は放射性同位体である。特定の実施形態では、検出手段は、核磁気共鳴映像法、光学イメージング法、放射型コンピュータ断層撮影法、又は陽電子放出断層撮影法によるものである。

本開示の目的によれば、腫瘍細胞を殺傷する方法であって、放射線療法と、当該腫瘍細胞を標的とするペプチドにコンジュゲートされた抗腫瘍化合物を含む薬学的に許容される組成物と、を患者に施すことを含み、当該ペプチドが当該腫瘍細胞によって内在化される、方法がある。特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含む。追加の実施形態では、放射線療法は、全身、局部、又は局所的に施される。追加の特定の実施形態では、放射線療法は、放射性同位体照射、γ線照射、Ｘ線照射、紫外線照射、マイクロ波照射、又は電子線照射である。特定の実施形態では、患者は、腫瘍に対して約４０～約１００Ｇｙの放射線を照射される。別の特定の実施形態では、患者は、腫瘍に対して約５５～約６５Ｇｙの放射線を照射される。追加の特定の実施形態では、患者は、腫瘍に対して６２Ｇｙの放射線を照射される。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌、及び乳癌からなる群から選択される。更なる特定の実施形態では、腫瘍細胞は前立腺癌であり、投与は、前立腺動脈への動脈内注射による前立腺へのものである。

本開示の目的によれば、腫瘍細胞を殺傷する方法であって、化学療法と、当該腫瘍細胞を標的とするペプチドにコンジュゲートされた抗腫瘍化合物を含む薬学的に許容される組成物と、を患者に施すことを含み、当該ペプチドが当該腫瘍細胞によって内在化される、方法が提供される。

本開示の目的によれば、腫瘍細胞を殺傷する方法であって、化学療法と、当該腫瘍細胞を標的とするペプチドに連結されたリポソーム又はミセルを含む薬学的に許容される組成物と、を患者に施すことを含み、当該リポソーム又はミセルが抗腫瘍化合物を含み、当該ペプチドが当該腫瘍細胞によって内在化される、方法が提供される。

本開示の目的によれば、腫瘍細胞を殺傷する方法であって、化学療法と、当該腫瘍細胞を標的とするペプチドに連結された抗体又は抗体断片を含む薬学的に許容される組成物と、を患者に施すことを含み、当該抗体又は抗体断片が抗腫瘍活性を有し、当該ペプチドが当該腫瘍細胞によって内在化される、方法が提供される。一態様では、ペプチドは、結合を維持するために、特定の三次構造中に抗体又は抗体断片を維持することができる。

本開示の目的によれば、腫瘍細胞を殺傷する方法であって、外科的療法と、当該腫瘍細胞を標的とするペプチドにコンジュゲートされた抗腫瘍化合物を含む薬学的に許容される組成物と、を患者に施すことを含み、当該ペプチドが当該腫瘍細胞によって内在化される、方法が提供される。この実施形態では、内在化ペプチドは、抗腫瘍化合物及び蛍光光学造影剤の両方にコンジュゲートされてもよい。

本開示の別の目的によれば、腫瘍細胞を殺傷する方法であって、遺伝子治療と、当該腫瘍細胞を標的とするペプチドにコンジュゲートされた抗腫瘍化合物を含む薬学的に許容される組成物と、を患者に施すことを含み、当該ペプチドが当該腫瘍細胞によって内在化される、方法がある。特定の実施形態では、遺伝子治療は、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌ ａｂｌ、Ｒｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ－ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ－１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＷＴ－１、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ及びチミジンキナーゼからなる群から選択される核酸配列を対象とする。

本開示の追加の目的によれば、好適な容器中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドが腫瘍細胞を標的とする、ペプチドを含む、治療的有効量の薬学的に許容される製剤を含む、腫瘍治療キットがある。特定の実施形態では、腫瘍治療キットは、好適な容器中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドが腫瘍細胞及び抗腫瘍化合物を標的とする、ペプチドを含む、治療的有効量の薬学的に許容される製剤を含む。特定の実施形態では、抗腫瘍化合物は、ドキソルビシン、ブレオマイシン、タキソール（登録商標）（又は、例えば、ドセタキセルなどの類似体）、メトトレキサート、又はセツキシマブである。別の特定の実施形態では、抗腫瘍化合物は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、又はビンブラスチン、又は本明細書に開示される任意の他の化学療法剤からなる群から選択される。

本開示の別の目的によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドが腫瘍細胞を標的とする、ペプチドと、遺伝子治療用組成物を含むベクターと、を含む、組成物がある。特定の実施形態では、ベクターは、タンパク質、ペプチド、リポソーム、脂質、核酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子治療用組成物は核酸を含む。追加の特定の実施形態では、遺伝子治療用組成物はｐ５３核酸を含む。更なる特定の実施形態では、遺伝子治療用組成物は、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌ ａｂｌ、Ｒｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ－ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ－１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＷＴ－１、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ及びチミジンキナーゼからなる群から選択される、核酸を含む。

本開示の別の目的によれば、癌について生物を治療する方法であって、当該生物を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含むペプチドであって、当該ペプチドが腫瘍細胞を標的とする、ペプチドと、抗腫瘍化合物と、を含む、治療的有効量の薬学的に許容される組成物と接触させることを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、抗腫瘍化合物は当該ペプチドにコンジュゲートされる。別の特定の実施形態では、抗腫瘍化合物は、タキソール（登録商標）（又は、例えば、ドセタキセルなどの類似体）、メトトレキサート、又はセツキシマブである。別の特定の実施形態では、抗腫瘍化合物は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、又はビンブラスチン、又は本明細書に開示される任意の他の化学療法剤からなる群から選択される。特定の実施形態では、癌は、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌、及び乳癌からなる群から選択される。

本開示の追加の目的によれば、内在化ペプチド（例えば、ＨＮ１７、ＨＮ１８、又は表１又は３に列挙されるペプチドのいずれかなど）の単離方法であって、ペプチドライブラリを得る工程と、当該ライブラリのペプチドを細胞集団のメンバーと個々に接触させる工程と、当該細胞集団の当該メンバーによる当該ペプチドのエンドサイトーシスをアッセイする工程と、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、ペプチドライブラリはランダムペプチドディスプレイライブラリである。特定の実施形態では、ペプチドライブラリはＭ１３一本鎖バクテリオファージ系ランダムペプチドディスプレイライブラリである。特定の実施形態では、細胞は癌細胞である。

本開示の別の実施形態では、癌を検出する方法であって、内在化ペプチド（例えば、ＨＮ１７（配列番号１）又はＨＮ１８配列番号７、又は配列番号２～６、８、９のいずれか、又は表１若しくは３に列挙されるペプチドのいずれかなど）を得る工程と、検出可能な標識を当該ペプチドにコンジュゲートさせる工程と、コンジュゲートしたペプチド及び標識を生物に投与する工程と、好適な検出手段によって、当該コンジュゲートの癌細胞への結合を検出する工程と、を含む、方法がある。

本開示の追加の実施形態では、癌を検出する方法であって、ペプチドライブラリを得る工程と、当該ライブラリのペプチドを細胞集団のメンバーと個々に接触させる工程と、当該細胞集団の当該メンバーによる当該ペプチドのエンドサイトーシスをアッセイし、内在化ペプチド（例えば、ＨＮ１７（配列番号１）、ＨＮ１８（配列番号７）、配列番号２～６、８、９のいずれか、又は表１若しくは３に列挙されるペプチドのいずれかなど）を同定する工程と、検出可能な標識を当該ペプチドにコンジュゲートさせる工程と、コンジュゲートしたペプチド及び標識を生物に投与する工程と、好適な検出手段によって、当該コンジュゲートの細胞への結合を検出する工程と、を含む、方法がある。

発明者らは、これにより、他の細胞への有害な副作用の発生によって制限されることなく、腫瘍を破壊するために必要量の薬物の提供を可能にすると想定している。ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８の薬物送達のためのシャトルとしての可能性は、これらが非毒性であり、非免疫原性であり、ｉｎ ｖｉｖｏで安定であり（注射２４時間後、血中の無傷ペプチドの検出によって示される）、輸送中にその内容物が保護され、４８時間以内に腫瘍内に十分に蓄積するという事実によって更に強化される。

本明細書に組み込まれ、また本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に、開示される組成物及び方法を例証する。

ＨＮ－１－ＦＩＴＣ及び４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００分子の全化学構造を示す。また、ＩＲ８００がＨＮ１８にコンジュゲートされるのと同様にＨＮ１７にコンジュゲートし、厳密に類似した構造をもたらす、更なる色素標識の構造も示す。

細胞内の対応する色素標識の蛍光によって測定された、培養Ｃａｌ２７細胞（ヒトＨＮＳＣＣ）におけるハイブリッドペプチドの相対的取り込みを示す。図２Ａ、０．３、１、３、１０、３０μＭのｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）（細胞と４８時間インキュベーション）；図２Ｂ、１０μＭで０、２、４、８、２４、４８時間インキュベートした、ｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）；図２Ｃ、ＦＩＴＣ標識ペプチドを使用した２Ｂと同じ実験。色素化学物質（ＦＩＴＣ又はＩＲ８００）は、２つのハイブリッドペプチドによる取り込みの相対速度に有意な影響を及ぼさない。 細胞内の対応する色素標識の蛍光によって測定された、培養Ｃａｌ２７細胞（ヒトＨＮＳＣＣ）におけるハイブリッドペプチドの相対的取り込みを示す。図２Ａ、０．３、１、３、１０、３０μＭのｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）（細胞と４８時間インキュベーション）；図２Ｂ、１０μＭで０、２、４、８、２４、４８時間インキュベートした、ｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）；図２Ｃ、ＦＩＴＣ標識ペプチドを使用した２Ｂと同じ実験。色素化学物質（ＦＩＴＣ又はＩＲ８００）は、２つのハイブリッドペプチドによる取り込みの相対速度に有意な影響を及ぼさない。 細胞内の対応する色素標識の蛍光によって測定された、培養Ｃａｌ２７細胞（ヒトＨＮＳＣＣ）におけるハイブリッドペプチドの相対的取り込みを示す。図２Ａ、０．３、１、３、１０、３０μＭのｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）（細胞と４８時間インキュベーション）；図２Ｂ、１０μＭで０、２、４、８、２４、４８時間インキュベートした、ｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）；図２Ｃ、ＦＩＴＣ標識ペプチドを使用した２Ｂと同じ実験。色素化学物質（ＦＩＴＣ又はＩＲ８００）は、２つのハイブリッドペプチドによる取り込みの相対速度に有意な影響を及ぼさない。

２時間インキュベートしたＣａｌ２７細胞におけるＩＲ８００標識化合物の相対細胞取り込みを示す（略記については表３を参照されたい）。Ｃａｌ２７細胞を、０．６２５～１０μＭの示された薬剤と共にインキュベートした。細胞取り込みを、１０μＭのｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００に対して補正する。最下段の曲線は、遊離酸としての未コンジュゲートＩＲ８００色素である（ＩＲｄｙｅ－８００－ＣＷとして商業的に知られている。

１００％マウス血清中の４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００（実線）及びＨＮ１－ＩＲ８００（破線）の代謝を示す。ペプチド量は、蛍光で検出したＨＰＬＣクロマトグラム中の無傷分子のピーク面積によって決定した。

蛍光によって検出した投与後３時間の蓄積尿を使用した、４０ｎｍｏｌでｉ．ｖ．投与されたマウスからのペプチドの血液クリアランスを示す。

４０ｎｍｏｌのペプチドの静脈内投与３～４８時間後の、Ｃａｌ２７異種移植片腫瘍を有する完全なマウス全体のフルオビーム光学画像を示す。

７５ｍｓの蛍光イメージャ曝露でのＨＮ１－ＩＲ８００及び４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００（左２匹のマウス）と、３００ｍｓ曝露でのＨＮ１－ＩＲ８００（右）とを比較した、皮膚を剥がしたマウスの上部全体像を示す。図５Ｂの下では、２ｍｍ厚のスラブにスライスされ、同じ曝露量で撮像された、腫瘍と同様の大きさの筋肉を示す。

全体、並びにスライスされた腫瘍及び筋肉の強度を示す。^＊は、対応ｔ検定によるＨＮ－１－ＩＲ８００と４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００との間の有意差である（ｎ＝４：２４、４８時間、ｎ＝３：８時間）。

（上２段）：Ｃａｌ２７細胞と共にインキュベートしたＩＲ８００で標識した化合物の蛍光顕微鏡像を示す。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、１及び２４時間インキュベーションの細胞内に、明赤色のシグナルを示す。ＨＮ－１－ＩＲ８００、ＨＮＪ－ＩＲ８００、及びペプチドにコンジュゲートしていないＩＲ８００色素のみは全て、細胞内の蛍光をほとんど又は全く示さない。（下段）：１０μＭの４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＣＹ５（赤色）で１．５時間処理した生存Ｃａｌ２７細胞の共焦点顕微鏡像。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は細胞核を染色する（青色）。細胞骨格中のＦ－アクチンは、Ａｌｅｘａ－５４６によりオレンジ色に染色される、統合画像中の下段最も左の細胞参照）。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５は赤色に見える。下段右の白色光画像は、細胞が無傷であることを示す。統合したカラー画像は、４ＩｐｈＦ－ＨＮ１８－Ｃｙ５が核内又は膜内にないが、細胞のサイトゾル中に内在化されたことを示す。これは、最も特異的かつ望ましい種類の、サイトゾルに直接行う薬物送達である。下段右２つの顕微鏡写真では、Ｃａｌ２７細胞を、１０倍モル過剰の未標識４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８（１００μＭ）で１．５時間処理した後、１０μＭの４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５で処理した。過剰の未標識４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８は内在化を停止するため、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５は、細胞を囲むだけであって生細胞の内側には見られず、この機構が阻害可能であり、ＨＮ１８ペプチドが標識の存在とは独立して作用することを示している。

ＭＴＣ側腹部皮下異種移植モデルにおける、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の蛍光画像を示す。４０ｎｍｏｌを静脈内注射した４８時間後に、マウスを安楽死させ、皮膚除去後に画像を撮影した。

細胞をマウスの甲状腺に移植して腫瘍に成長した、ＴＴ及びＭＺ－ＣＲＣ１（ＭＴＣ細胞）同所性異種移植において高い蛍光が観察されたことを示す。４０ナノモルのＨＮ－ｊ－ＩＲ８００（左、スクランブル配列混合対照）又は４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００ＨＮ１８を尾静脈から投与した。３２時間後に得られた画像は、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００ＨＮ１８が、ＭＴＣの同所性異種移植片の撮像を可能にするのに対し、ペプチド配列スクランブル対照、又は４Ｉｐｈｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００ＨＮ１８投与マウスの周囲組織では、蛍光がほとんど観察されないことを示している。

雌性ヌードマウスの脂肪体のうち２ヶ所に移植された、ＭＢＡ－ＭＤ－２３１トリプルネガティブヒト乳癌細胞を示す。図９には、これらの腫瘍の増殖速度を経時的に示す。この２つの腫瘍を有するマウスのうちの１例において、腫瘍が直径約１ｃｍに増殖した後、マウスに４０ｎｍｏｌのｆ－ｆ－ＨＮ１７－ＩＲ８００を投与した。

４０ｎｍｏｌのｆ－ｆ－ＨＮ１７－ＩＲ８００を、脂肪体乳癌腫瘍（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を有するマウスに投与した２４時間後の、ＦｌｕＯｐｔｉｃｓ Ｆｌｕｏｂｅａｍ光学手術イメージャを用いて記録した画像を示す。光学画像内の大きな白色楕円は、腫瘍内にｆ－ＨＮ１７－ＩＲ８００が局在していることを実証する、２つの腫瘍である。

３７℃及び４℃での生未固定Ｃａｌ２７細胞の共焦点画像を示す。白色光画像（右）は、細胞が無傷であることを示す。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、核を青色に染色した。Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｉＯは、膜部分を緑色に染色し、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５ハイブリッドペプチドは赤色である。温度を低下させることによって、利用可能な環境エネルギーの大部分を除去すると、膜結合及びペプチドの透過を含む全てのプロセスが減速する。

様々なエンドサイトーシス（endocytotosis）阻害剤の存在下における、ＨＮ１８ペプチド透過の共焦点及びＦＡＣＳ画像を示す。図１１では、中央の白色光画像は、左列画像の生未固定Ｃａｌ２７細胞が無傷であることを示す。細胞と共に１０μＭで１時間インキュベートした４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＦＩＴＣを用いた右欄のＦＡＣＳデータは、細胞の大部分が蛍光標識ハイブリッドペプチドで標識されていることを示す。左欄は、測定された各条件において、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５（赤色）が細胞膜に親友し、サイトゾル中に存在することを示す。青色に染色された核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色される。緑色は、膜の一部を染色するＶｙｂｒａｎｔ ＤｉＯである。ＮａＮ３はＡＴＰを枯渇させるため、ハイブリッドペプチドが、細胞エネルギー依存性プロセスを使用することなく細胞膜からサイトゾルまで透過することを示す。ノコダゾールはクラスリン被覆ピットの形成を阻害するため、ハイブリッドペプチドが、サイトゾルへの細胞透過にこの機構を使用しないことを示す。ＭβＣＤは脂質ラフトを介したカベオラ経路を阻害するため、ハイブリッドペプチドが、細胞透過にこの機構を使用しないことを示す。ＣＰＺはクラスリン非依存性経路を阻害するクロルプロマジンであり、ハイブリッドペプチドが、サイトゾルへの細胞透過にこの機構を使用しない（核が染色されず、黒色である）ことを示す。最後に、アミロライドはマクロピノサイトーシスを阻害するため、ハイブリッドペプチドが、サイトゾルへの細胞透過にこの機構を使用しないことを示す。

５μＭの４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５と共に１時間インキュベートした、生未固定Ｃａｌ２７細胞を示す。左側の画像の赤色は４１ｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５である。この画像の青色は、無傷の細胞膜を透過できない分子である、ヨウ化プロピジウムである。しかしながら、４１ｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５と同時にインキュベートすると、ヨウ化プロピジウムは、Ｃａｌ２７の細胞膜をサイトゾルまで侵入し、核に移動して、青色に染色する。

細胞が、使用される≧４１ｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５レサズリンの存在下で生存可能なままであることを示す。４１ｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５は細胞生存率に影響しないため、図１２Ａのヨウ化プロピジウムは、同じ状況でそのように振る舞う薬物に似た、穏やかな直接透過機構において、４１ｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５の存在下で細胞内にあることが可能である。

４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５によるＣａｌ２７生未固定細胞への細胞透過の動態を示す。２つの細胞が示される。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５は、バルク溶液から細胞膜へと数秒で透過し、その後、５分以内に視覚的にサイトゾル内に透過し、次の２５分にわたって細胞内へと移動し続ける。

本発明の化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法を開示及び説明する前に、特に指定されない限り、これらが特定の合成法又は特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されないこと、又は、特に指定されない限り、特定の試薬に限定されず、当然ながらそれ自体が変化してもよいことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するための目的のものにすぎず、限定することを意図しないことも理解するべきである。
Ａ．定義

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のこのような担体の混合物などを含む。

範囲は、「約」１つの特定の値から、かつ／又は「約」別の特定の値までとして表され得る。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から、かつ／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似として表されるとき、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれぞれの端点は、他の端点に関しても、他の端点とは独立しても、この両方において、有意であると更に理解されるであろう。本明細書でいくつかの値が開示され、各々の値がその値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書でもまた開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」もまた開示されている。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「その値以上」及び値間の可能な範囲もまた開示されていることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下」と同様に「１０以上」もまた開示されている。本願全体にわたってデータが多数の異なるフォーマットで提供され、このデータが、端点及び開始点並びにデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すこともまた理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」及び特定のデータポイント１５が開示されている場合、１０と１５との間と同様に、１０及び１５よりも大きい、１０及び１５以上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、並びに１０及び１５に等しいデータポイントが開示されていると見なされることが理解される。特定の２つの単位間のそれぞれの単位もまた開示されていることもまた理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３、及び１４もまた開示されている。

本明細書及び以下の「特許請求の範囲」において、多数の用語に言及し、それらは以下の意味を有すると定義されるものとする。

「任意選択的な」又は「任意選択的に」は、引き続いて記載された事象又は状況が起こってもよいかあるいは起こらなくてもよいこと、及び説明が、当該事象又は状況が起こる場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。

本明細書で使用するとき、用語「アポトーシス剤」は、細胞にアポトーシス、つまりプログラム細胞死をもたらす薬物、毒素、化合物、組成物、又は生物学的実体として定義される。特定の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、頭頸部癌細胞、扁平上皮細胞癌、脳腫瘍細胞、又は乳癌細胞である。
本明細書で使用するとき、用語「癌」は、腫瘍などの、制御されない細胞生育又は増殖として定義される。特定の実施形態では、腫瘍は局所浸潤及び転移をもたらす。
本明細書で使用するとき、用語「化学療法剤」は、癌の治療として使用される薬物、毒素、化合物、組成物、又は生物学的実体として定義される。

本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲート」は、ＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドの、薬物、組成物、化合物、又は検出可能な標識などの別の実体との連結又は結合として定義される。コンジュゲートは、特定の実施形態では、例えば、ＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドのカルボキシレート基又はアミン基及び対応する薬物上の活性化基に関連する化学反応によって実行される。当業者であれば、化学反応は、ＨＮ１７又はＨＮ１８又はその誘導体上に存在する官能基、及び薬物上に存在する対応する官能基に依存すると認識している。

本明細書で使用するとき、用語「細胞毒性剤」は、細胞を殺傷するために使用される薬物、毒素、化合物、組成物、又は生物学的実体として定義される。特定の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、頭頸部癌細胞、扁平上皮細胞癌、又は乳癌細胞である。

本明細書で使用するとき、用語「送達」は、腫瘍又は腫瘍細胞に結合、つまりコンジュゲートされた化合物について、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８のペプチド又は断片によって提供される分子輸送として定義される。標的化は、投与によって腫瘍又は腫瘍細胞に直接的であってもよく、又は間接的な手段又は機構によるものであってもよい。ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８化合物を含むコンジュゲートが、他の生物学的実体に対する非治療目的のための結合を含む、腫瘍又は腫瘍細胞を最終的に標的化するための間接経路に従うことを可能にすることは、この用語の範囲内である。本明細書で使用するとき、用語「送達」は、用語「標的化」と互換的に使用され得る。

本明細書で使用するとき、用語「ＤＮＡ損傷剤」は、核酸を損傷する薬物、毒素、化合物、組成物、又は生物学的実体である。損傷は、例えば、ＤＮＡ二重らせん分子の１本又は両方の鎖を切断するか、又は１つ以上のヌクレオチドの変異を引き起こすための任意の種類のものであってもよい。

本明細書で使用するとき、用語「薬物」は、医学的状態又は疾患の治療的処置に使用される薬剤又は薬として定義される。薬物は、別の薬物又は治療の種類と組み合わせて使用されてもよく、好ましい実施形態では、癌の治療に有効である。

本明細書で使用するとき、用語「頭頸部癌」は、頭頸部領域：口腔（唇又は舌などの口の組織、歯肉、頬及び唇の内側、口の底部、硬口蓋及び軟口蓋、並びに臼後三角を含む）；咽頭（下咽頭、上咽頭、及び中咽頭を含む）（喉とも呼ばれる）；副鼻腔（鼻の上部の前頭洞、上顎骨のいずれかの側の上部にある上顎洞、鼻上部のいずれかの側の真後ろにある篩骨洞、及び、頭蓋の中心の篩骨洞の後ろにある蝶形骨洞）、及び鼻腔；喉頭（又はｖｏｉｃｅｂｏｘ）；甲状腺（乳頭、濾胞、髄様、及び未分化の甲状腺癌を含む）；副甲状腺；唾液腺（舌下、耳の直前にある顔の側面、及び顎骨の下に見られる唾液腺の主要なクラスターを含む）；において発生し得る様々な悪性腫瘍のいずれか、顔及び頸部の皮膚、並びに頸部リンパ節の病変；並びに、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌として定義される。

本明細書で使用するとき、用語「内在化」は、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド、又は本明細書に記載されているのと同様の手段によって単離された他のペプチドの少なくとも一部の、腫瘍内又は腫瘍細胞内への取り込みとして定義される。腫瘍細胞内への内在化は、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８などのペプチドの一部又は全部が、細胞の内部領域内に取り込まれることを意味し、これには、細胞膜内へのペプチドの一部又は全ての保持が含まれ、また細胞の細胞質内のペプチドの一部又は全部も含まれる。内在化は、一過性又は恒久的であってもよい。

本明細書で使用するとき、用語「標識」は、ペプチドの検出を可能にするため、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドに、直接的又は間接的のいずれかで、結合又はコンジュゲートした実体として定義される。標識は、フルオロフォア、発色団、放射性標識、スピン標識、又はペプチドの検出を容易にする任意の他の手段であってもよい。

本明細書で使用するとき、用語「口腔癌」は、口腔の癌として定義される。

本明細書で使用するとき、用語「口腔」は、舌、歯肉、頬及び唇の内側、口の底部、硬口蓋及び軟口蓋、並びに臼後三角（智歯の後方領域）などの、唇又は口の組織のいずれかとして定義される。

本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」は、最大約５０個のアミノ酸の鎖として定義される。

本明細書で使用するとき、用語「特異的」は、一実施形態では、抗腫瘍化合物にコンジュゲートしたＨＮ１７及び／若しくはＨＮ１８ペプチド、又は他の内在化ペプチドによる、癌組織への送達又は標的化として定義される。別の実施形態では、用語、特異的は、ＨＮ１７及び／若しくはＨＮ１８ペプチド、又は別の内在化ペプチドが、癌組織に優先的に抗腫瘍化合物を送達又は標的化することを意味する。更に別の実施形態では、この用語は、ＨＮ１７及び／若しくはＨＮ１８ペプチド、又は別の内在化ペプチドを含むコンジュゲートが、主に癌組織以外に結合しない、抗腫瘍化合物の癌組織の送達又は標的化を指す。これらの実施形態の一態様では、本明細書に記載のコンジュゲートは、このプロセス、つまりコンジュゲートの腫瘍への送達の進行中に、他の生物学的実体と接触してもよい。

本明細書で使用するとき、用語「標的」は、腫瘍又は腫瘍細胞に結合、つまりコンジュゲートされた化合物について、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド又はその断片によって提供される分子方向付けとして定義される。標的化は、投与によって腫瘍又は腫瘍細胞に直接的であってもよく、又は間接的な手段又は機構によるものであってもよい。ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８／化合物を含むコンジュゲートが、他の生物学的実体に対する非治療目的のための結合を含む、腫瘍又は腫瘍細胞を最終的に標的化するための間接経路に従うことを可能にすることは、この用語の範囲内である。

本明細書で使用するとき、用語「治療する」は、医学的状態又は疾患の治療の適用を実践することとして定義される。治療により完全な治癒をもたらす必要はなく、少なくとも１つの症状が改善されるか又は根絶される場合に有効であると考えられる。更に、治療により、疾患状態又は医学的状態の恒久的な改善をもたらす必要はないが、これが好ましい。

本明細書で使用するとき、用語「腫瘍細胞」は、腫瘍又は癌などの悪性集団の細胞として定義される。細胞は、腫瘍内、腫瘍の表面上に位置してよく、又は腫瘍と関連付けられてもよい。

本明細書全体において、様々な出版物が参照される。これらの出版物の開示全体が、開示内容が関連する技術分野の状態をより十分に説明するためにここに参照により本出願に組み込まれる。開示される参照文献も、その参照文献が依拠される文において考察されるそれらに含まれる資料について、参照により本明細書に個々に、かつ具体的に組み込まれる。
Ｂ．組成物

開示される組成物を調製するために使用される成分と、本明細書で開示される方法の範囲内で使用される組成物それ自体が開示される。これら及び他の物質が本明細書で開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個々及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、特定のＨＮ１７及び／又はＨＮ１８が開示及び考察され、かつＨＮ１７及び／又はＨＮ１８を含むいくつかの分子になされ得るいくつかの修飾が考察される場合、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８のありとあらゆる組み合わせ及び順列、並びにそうでないと具体的に示されていない限り可能である修飾が具体的に想到される。したがって、分子Ａ、Ｂ及びＣの種類が開示されており、同様に分子Ｄ、Ｅ及びＦの種類及び分子Ａ～Ｄの組み合わせの例が開示されている場合、それぞれが個々に列挙されていない場合であっても、それぞれが個々にかつ集合的に企図され、組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ及びＣ－Ｆが開示されると見なされる。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせもまた開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ及びＣ－Ｅのサブグループが開示されていると見なされるであろう。この概念は、本出願の全ての態様に適用され、開示される組成物の作製及び使用方法における工程を含むが、これに限定されない。このように、実施することができる多様な更なる工程が存在する場合、これらの更なる工程のそれぞれは、任意の特定の実施形態又は開示される方法の実施形態の組み合わせにより実施することができることが理解される。

一態様では、本開示は、コンジュゲートした複合体を腫瘍に送達するための、化合物にコンジュゲートしたアミノ酸ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（ＨＮ１７）（配列番号１）、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（ＨＮ１）（配列番号２）、ＬＮＫＱＴＨＧＬＩＰＮＳ（ＨＮｓｃｒ）（配列番号３）、ＮＱＨＳＫＮＴＬＬＩＧＰ（ＨＮＪ）（配列番号４）、ＬＫＱＧＮＨＩＮＬＰＳ（配列番号５）、ＹＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号６）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（ＨＮ１８）（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）の利用を目的とする。このペプチドの能力は、頭頸部扁平上皮細胞癌及び乳癌などの腫瘍に対する抗癌剤の標的化を可能にする。他の特定の実施形態では、ペプチドは、検出可能な標識へのコンジュゲート及びその後の患者の腫瘍組織への送達を通じて、癌細胞の撮像及び診断を容易にする。

いくつかの実施形態では、ＨＮ１７ペプチド、変異体、及び合成分子は、式（Ｉ）によって定義され得る。
Ｘ_Ｒ－Ｚ－Ｋ_Ｒ１－Ｌ_Ｒ２ （Ｉ）、
式中、
Ｘは、Ｔ、Ｙ、（ｆ）と略されるフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、４－パラ－ヨード－ベンジル（４Ｉｐｈ）、又は３－ヨードチロシン（３ＩＹ）である。Ｘは、任意の終端残基であってもよい。例えば、Ｘは、固相ペプチド合成中に使用される固体支持樹脂からの生体適合性自己集合分子の開裂によって生じる化学的部分であり得る。例えば、Ｘは、アミン、アルコール、アミド基、又はカルボン酸基（例えば、Ｃ末端又はＮ末端のアミノ酸のＮＨ_２又はＣＯＯＨ基）であり得る。あるいは、終端残基Ｘは、プロピオン酸アミド又はプロピオン酸基であり得る。Ｘはまた、そのような部分の化学修飾形態（例えば、アルキル化アミン又はエステル化カルボン酸）であってもよい。任意の実施形態では、特に開示されるＸ、又は、本明細書で企図され、かつ本明細書の開示に包含される変異体は、親油性である。
Ｚは、ＨＮ１７のアミノ酸配列、ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号１）、ＨＮ１－ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号２）、ＨＮｓｃｒ－ＬＮＫＱＴＨＧＬＩＰＮＳ（配列番号３）、ＨＮＪ－ＮＱＨＳＫＮＴＬＬＩＧＰ（配列番号４）、ＬＫＱＧＮＨＩＮＬＰＳ（配列番号５）、ＹＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号６）、ＨＮ１８－ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）を表し、
Ｒは、ＮＲ_３Ｒ_４としての末端アミノ基を表し、親油性（例えば、４Ｉｐｈ及びＦｍｏｃなど）でなければならない。一態様では、親油性物質は、ＩＲ８００などの両親媒性物質であり得る。
Ｒ１は、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素（例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）又は水溶性ジシアニン色素）、又はＲ_２を表す。一態様では、Ｒ１はＩＲＤｙｅ８００（ＩＲ８００）、又はＨであってよい。
Ｒ２は、末端ＣＯＮＲ_５Ｒ_６を表し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、Ｈ、ＣＯアルキル（直鎖又は環状）又はＣＯＱＲ_７を表し、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＯアルキル（直鎖又は環状）を表し、
Ｑは、Ｏ又はＮＨＲ_８を表し、
Ｒ_８は、Ｈ、ＣＯアルキル（直鎖又は環状）、又はＣＯＸＲ_７を表す。
Ｒは、例えば、非活性親油性物質、親油性治療薬（例えば、タキソール）、又は１つ以上のＣＯＯ^－若しくはＳＯ^３－基を欠くジシアニンなどの親油性光学色素などの、親油性物質でなければならない。Ｒ１及びＲ２は親水性であり、Ｈ若しくはＦＩＴＣのいずれか、又は診断用の多価光学色素（例えば、光学式手術ナビゲーション又は組織学的組織染色など）ｍ、又は別のペプチド、ＰＫＣε、若しくはｓｉＲＮＡなどの親水性治療薬である。Ｒ１及びＲ２は、異なっていても、又は同じであってもよい。
アミノ酸を表１に分類する。

Ｒ_ｎは、アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基であり得る。本明細書で使用するとき、「アルキル」は、直鎖アルキル及び分岐鎖アルキル基を含む、飽和脂肪族基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、その骨格鎖中に３０個以下の炭素原子を含む（例えば、直鎖ではＣ_１～Ｃ_３０、分枝鎖ではＣ_３～Ｃ_３０）。例えば、アルキル基は、２５個以下の炭素原子、２２個以下の炭素原子、２０個以下の炭素原子、１９個以下の炭素原子、１８個以下の炭素原子、１７個以下の炭素原子、１６個以下の炭素原子、１５個以下の炭素原子、１４個以下の炭素原子、１２個以下の炭素原子、１２個以下の炭素原子、１０個以下の炭素原子、８個以下の炭素原子、又は６個以下の炭素原子をその骨格鎖中に含んでよい。いくつかの実施形態では、アルキル基は、６個以上の炭素原子、８個以上の炭素原子、１０個以上の炭素原子、１１個以上の炭素原子、１２個以上の炭素原子、１３個以上の炭素原子、１４個以上の炭素原子、１５個以上の炭素原子、１６個以上の炭素原子、１７個以上の炭素原子、１８個以上の炭素原子、１９個以上の炭素原子、又は２０個以上の炭素原子をその骨格鎖中に含んでよい。アルキル基は、上記の最小数の炭素原子のうちのいずれかから、最大数の炭素原子のいずれかまでの範囲であり得る。例えば、アルキル基は、Ｃ_６～Ｃ_３０アルキル基（例えば、Ｃ_１２～Ｃ_２２アルキル基、又はＣ_１２～Ｃ_１８アルキル基）であってよい。アルキルという用語は、非置換アルキル及び置換アルキルの両方を含み、後者は、ハロゲン又はヒドロキシ基などの１つ以上の置換基を有し、炭化水素骨格鎖の１つ以上の炭素上の水素を置換しているアルキル基を指す。アルキル基はまた、アルキル基の炭素骨格内に、１～４個のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、イオウ、及びこれらの組み合わせ）を含み得る。本明細書で使用するとき、「アルケニル」及び「アルキニル」は、長さ（例えば、Ｃ_２～Ｃ_３０）が類似している１つ以上の二重又は三重結合を含有し、上記のアルキル基への導入可能な置換を含む、不飽和脂肪族基を指す。

特定の実施形態では、Ｒ_ｎは、直鎖Ｃ_１２～Ｃ_１８アルキル基（例えば、直鎖Ｃ_１４～Ｃ_１６アルキル基）である。例えば、Ｒ_ｎは、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、又はステアリル基であり得る。

特定の実施形態では、Ｒ_ｎは環式である。

式（Ｉ）中の整数（ｑ、ｏ、ｐ、及びｎ、Ｃ_ｎ中の炭素原子数を表す整数である）のそれぞれは、より大きい（すなわち、より高い分子量の）、類似するバランスの引力及び斥力を有し得る、自己集合分子を提供するように、比例的に増加し得る。例えば、ｏは２～４の整数を表すことができ、ｐは１０～４０の整数を表すことができ、ｑは７～１４の整数を表すことができ、ｎは２０～４０の範囲であってよく（例えば、Ｃ_ｎは、Ｃ_２０～Ｃ_４０アルキル基を表す）、あるいは、ｏは４～６の整数を表すことができ、ｐは２０～６０の整数を表すことができ、ｑは１２～２１の整数を表すことができ、ｎは３０～６０の範囲であってよい（例えば、Ｃ_ｎは、Ｃ_３０～Ｃ_６０アルキル基を表す）。

本開示は、ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞又は乳癌細胞などの特定の他の固形腫瘍組織細胞によって特異的に内在化される、配列番号１（ＨＮ１７）及び配列番号７（ＨＮ１８）を有するペプチドの同定について記載する。発明者らは、癌組織への診断薬及び抗癌剤の腫瘍組織特異的送達を達成するために、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドの使用を想定している。したがって、本開示の特定の実施形態では、発明者らは、抗癌剤をＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドとコンジュゲートさせるために開発された方法、及びペプチドコンジュゲート薬の特定の腫瘍組織への送達を可能にする方法について記載している。他の実施形態では、発明者らは、腫瘍を、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド及び薬物複合体の薬学的に許容される組成物と接触させることによって、癌患者における癌及び／又は腫瘍細胞の選択的殺傷を達成するために使用され得る方法について記載している。更に他の実施形態では、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドがコンジュゲートした標識を使用して癌を撮像する方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ用途の両方について記載されており、他の実施形態では、診断用及び治療用標識が存在し得る。したがって、癌治療及び診断キットの開発について記載されている。

過去に、腫瘍特異的抗原を認識する抗体が、細胞毒性薬を腫瘍に送達するために使用されてきた。しかしながら、これらの免疫複合体は、腫瘍組織への透過能がないことから、固形腫瘍への効果が限定されている。対照的に、発明者らが単離した１２マーのペプチド（ＨＮ１７）及び１１マーのペプチド（ＨＮ１８）は、典型的な抗体と比較して質量が１／１００であり、ヌードマウスに形成されたヒト頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）異種移植片などの腫瘍に透過することができる。したがって、ＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドを薬物にコンジュゲートさせることにより、発明者らは、癌細胞の全身性蓄積における薬物の腫瘍特異的送達システムを開発した。

ＨＮ１７は、特定の癌に特異的であることが以前に示されているＨＮ－１の改変によって得られた。蛍光顕微鏡法により、蛍光色素にコンジュゲートしたＨＮ１７及びＨＮ１８ペプチドのＨＮＳＣＣ細胞への内在化をｉｎ ｖｉｔｒｏで実証した。ペプチドは、侵入後に細胞質中に局在化した。これは、ペプチドが特定の癌に特異的であることを実証する。更に、ＨＮ１７及びＨＮ１８ペプチドは、初代細胞レベルにおいて、正常細胞と比較してＨＮＳＣＣ細胞に優先的に結合した。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、静脈内に注射されたＨＮ１７及びＨＮ１８ペプチドは、ヌードマウスに形成されたＨＮＳＣＣ異種移植片に局在した。腫瘍全体に蓄積されたペプチドは、腫瘍塊の内部に透過する能力を実証する。

本明細書に開示されるように、ＨＮ１７の取り込みはＨＮ－１よりも有意に高かった。それにもかかわらず、Ｎ末端親油性物質をＨＮ１７に添加すると、細胞取り込みがＨＮ１７単独を超えて劇的に増加した。したがって、一態様では、ｆｍｏｃ又は４ＩｐｈなどのＮ末端親油性物質を含むＨＮ１７などのペプチドが本明細書に開示される。ＨＮ１７の取り込みがＮ末端親油性物質の存在により増加することがわかったので、ＨＮ－１（配列番号２）ＨＮｓｃｒ（配列番号３）、ＨＮＪ（配列番号４）、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９をそれぞれ、ｆｍｏｃ及び／又は４Ｉｐｈの添加により配列番号２、５、６及び７における取り込みが増加する、Ｎ末端親油性物質を含むように改変した（表１及び３）。一態様では、ＨＮ１７のアミノ末端アミノ酸（スレオニン）は、４Ｉｐｈが加えられると、ｆ－ＨＮ１７から除去することができ（すなわち、表３に記載されるＴ（ｆ）ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ）、したがって、４Ｉｐｈ－ｆ－ＨＮ１８を生じさせる。したがって、一態様では、本明細書では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９に記載されるペプチドが開示され、このペプチドは、Ｎ末端親油性物質を含むように修飾されており、Ｎ末端親油性物質は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、４－パラ－ヨード－ベンジル（４Ｉｐｈ）、４－パラ－ヨード－ベンゾイル、又は３－ヨードチロシン（３ＩＹ）を含む。一態様では、修飾ペプチドは、４Ｉｐｈ－ｆ－ＨＮ１７又は４Ｉｐｈ－ｆ－ＨＮ１８を含み得る。

薬物送達を模倣するために、４Ｉｐｈ－ｆ－ＨＮ１８を、約５０％分子量のタキソールを有する複合有機分子である、ＩＲ８００にコンジュゲートさせた。静脈内投与後、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、ヒト頭頸部癌細胞由来異種移植片に局在化された。ペプチドは腫瘍全体に見られ、コンジュゲート化合物を担持する腫瘍組織への浸潤能を実証した。ＩＲ８００にコンジュゲートしたペプチドによるペプチド取り込みは、ＨＮ－１及びＨＮ１７へのｆｍｏｃ又は４Ｉｐｈの添加により有意に改善された。Ｆｍｏｃ又は４Ｉｐｈが存在したＮ末端をＩＲ８００に切り替えると、ＨＮ－１若しくはＨＮ１７、又はＨＮ１８のみよりも増加したものの、最善の結果が得られた分子、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の約６０％の有効性であった。色素ＩＲ８００は両親媒性物質であるため、親油性及び親水性の両方の性質を有する。一態様では、本明細書に開示されるのは、アミノ末端アミノ酸にコンジュゲートされ、ＩＲ８００などの色素又は抗腫瘍薬にコンジュゲートされた親油性物質を含む、配列番号１～９のいずれかである。

本開示の好ましい実施形態では、ＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドは、ドキソルビシン、ブレオマイシン、タキソール（登録商標）（又は、例えば、ドセタキセルなどの類似体）、メトトレキサート、又はセツキシマブなどの抗腫瘍薬にコンジュゲート又は結合される。抗腫瘍薬は、一般に、腫瘍細胞膜全体への拡散を可能にするのに十分な疎水性であるが、ＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドが、他の手段によって薬物を腫瘍細胞に標的化し、抗腫瘍薬の改善された移動又は内在化を可能にすることは、本開示の範囲内である。

当該技術分野では、細胞毒性薬を固形腫瘍内に送達するために既に使用されている特定のペプチドについて記載しているが、かかるペプチドは、結合したタンパク質とは機能しなかった。１つの種類としては、漏出性の腫瘍脈管構造に起因して腫瘍によって選択的に保持されるポリ－Ｌ－リジン（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７）などの高分子量カチオン性ポリマーが挙げられ、他の種類としては、腫瘍脈管構造に選択的に結合し、腫瘍成長に必要な血管新生内皮血管の破壊を可能にするペプチドが挙げられる。しかしながら、直径１ｍｍより小さい腫瘍は、隣接する正常な血管から得られる栄養素によって生存し続けることができるため（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９０）、これらのより小さい腫瘍を排除する課題は依然として残っている。本開示は、固形腫瘍への透過、及び／又は固形腫瘍による取り込みが可能である、腫瘍特異的ペプチドのＨＮ１７又はＨＮ１８を提供することによってこれらの問題を解決するものである。本開示は、抗癌剤へのＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドのカップリングを目的とし、このペプチドは、動物に投与されるとき、抗癌剤の腫瘍特異的標的化をもたらし、それによって、有効な抗癌剤療法を提供する。加えて、本開示は、ＨＮ－１（配列番号２）、ＨＮ１７（配列番号１）、ＨＮ１８（配列番号７）、又は表１及び３に示されるような配列番号１～９の任意の他のペプチドへのＮ末端のける親油性物質の添加が、ペプチド取り込み速度及び量を有意に増加させることを提供する。

発明者らは、これにより、他の細胞への有害な副作用の発生によって制限されることなく、腫瘍を破壊するために必要量の薬物の提供を可能にすると想定している。ＨＮ１７又はＨＮ１８の薬物送達のためのシャトルとしての可能性は、これらが非毒性であり、非免疫原性であり、ｉｎ ｖｉｖｏで安定であり（血中半減期が５．２９時間であることによって示される）、輸送中にその内容物が保護され、４８時間以内に腫瘍内に十分に蓄積され、そこに留まるという事実によって更に強化される。
１．ペプチド
ａ）ＨＮ１７及びＨＮ１８

発明者らは、頭頸部癌の診断及び治療のためのＨＮ１７及び／又はＨＮ１８の使用を企図している。また、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８は、乳癌、皮膚癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、及び脳腫瘍などの他の固形腫瘍の治療に使用され得ることも想到される。

したがって、一実施形態では、発明者らは、ＨＮＳＣＣ（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）及び乳癌の治療に対する最も強力な化学療法剤であるタキソールを、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８にコンジュゲートする。他の実施形態では、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８は、他の化学療法剤にコンジュゲートされる。

他の実施形態では、腫瘍撮像、腫瘍診断における使用が挙げられるが、これらに限定されない、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８のいくつかの用途が存在し、遺伝子導入法への腫瘍特異性を提供する（Ｃｌａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）。

本開示の一実施形態では、腫瘍細胞を標的とするペプチドがあり、特定の実施形態では、腫瘍細胞によって内在化される。本開示の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号９を含む又はからなるペプチドである。本開示の好ましい実施形態では、ペプチドの内在化が存在するが、抗癌剤を腫瘍に直接的又は間接的な手段又は機構によって標的化するために、ＨＮ１７ペプチド（配列番号１）又は別の内在化ペプチド（ＨＮ１８）（配列番号７）を利用することは、本開示の範囲内である。

一態様では、薬物と、腫瘍細胞を標的とするＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドと、を含む組成物が存在し、特定の実施形態では、当該腫瘍細胞によって内在化される。特定の実施形態では、薬物は、化学療法剤、細胞毒性剤、アポトーシス剤、ＤＮＡ損傷剤、又はタキソールである。特定の実施形態では、薬物は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン又はメトトレキサートである。
ｂ）ＨＮ１７及びＨＮ１８の変異体

ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８のアミノ酸配列変異体もまた、本開示に包含される。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換変異体、欠失変異体、又は挿入変異体であり得る。

挿入変異体は、典型的には、ペプチド中の非末端点に物質を追加することを含む。これは、少数の残基、免疫反応性エピトープ、又は単に１つの残基の挿入を含んでもよい。追加された物質は、メチル化、アセチル化などによって修飾されてもよい。あるいは、追加の残基をペプチドのＮ末端又はＣ末端に追加してもよい。

欠失は、１つ以上のアミノ酸残基をタンパク質配列から除去することを特徴とする。一般的に、わずか約２～６個の残基のみが、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それにより、変異体をコードするＤＮＡを作製し、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させる。

置換変異体は、典型的には、ペプチド内の１つ以上の部位での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含み、別の機能や特性を失うことなく、ペプチドの１つ以上の特性、例えば、タンパク質切断に対する安定性を調節するように設計され得る。

既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換変異を行う技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。アミノ酸置換は、一般的には単一の残基についてであるが、一度に多数の異なる位置で起こることができ、挿入は、通常、約１～１０個のアミノ酸残基程度となり、欠失は、約１～３０個の残基の範囲となる。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接する対において行われ、すなわち、２個の残基の欠失又は２個の残基の挿入である。

置換、欠失、挿入又はこれらの任意の組み合わせは、最終構築物に到達するように組み合わせてもよい。突然変異は、配列を読み枠の外に配置する必要がなく、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生することができると考えられる相補領域を生成しないこととなる。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入された変異体である。

機能又は免疫的同一性における実質的な変化は、表２の置換よりも保守的ではない置換を選択すること、すなわち、（ａ）例えば、シート又はヘリカル立体配座としての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ高さを維持するその効果において顕著に異なる残基を選択することによって行われる。タンパク質特性において最大変化を生じることが概ね期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリル若しくはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル若しくはアラニルに（又はこれらによって）置換されるか、（ｂ）システイン若しくはプロリンが、任意の他の残基に（又はこれらによって）置換されるか、（ｃ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル若しくはヒスチジルが、負電荷残基、例えば、グルタミル若しくはアスパルチルに（又はこれらによって）置換されるか、又は、（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないアミノ酸、例えば、グリシンに（又はこれによって）置換され、この場合は、（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増加させることによる置換となる。

例えば、置換は保存的と称され、すなわち、１つのアミノ酸が、類似の型及び電荷を有する１つに置換される。保存的置換は、当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンに対してセリン、アルギニンに対してリジン、アスパラギンに対してグルタミン又はヒスチジン、アスパルテートに対してグルタメート、システインに対してセリン、グルタミンに対してアスパラギン、グルタメートに対してアスパルテート、グリシンに対してプロリン、ヒスチジンに対してアスパラギン又はグルタミン、イソロイシンに対してロイシン又はバリン、ロイシンに対してバリン又はイソロイシン、リジンに対してアルギニン、メチオニンに対してロイシン又はイソロイシン、フェニルアラニンに対してチロシン、ロイシン、又はメチオニン、セリンに対してトレオニン、スレオニンに対してセリントリプトファンに対してチロシンチロシンに対してトリプトファン又はフェニルアラニン、並びにバリンに対してイソロイシン又はロイシン、又は、表２に列挙される置換のいずれかが挙げられる。

置換又は欠失の変異誘発は、Ｎ－グリコシル化（Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ－グリコシル化（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のための挿入部位に対して使用することができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失もまた、望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇの欠失又は置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失させるか、又はグルタミニル残基若しくはヒスチジン残基により塩基性残基を置換することによって達成される。

特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドへの組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基及びアスパリル残基に頻繁に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、温和な酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジンの側鎖のｏ－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ ７９－８６［１９８３］）、Ｎ－末端アミンのアセチル化並びに、いくつかの例では、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。

以下は、ペプチドのアミノ酸の変化に基づいて、同等の、又は更には改善された第２世代分子を生成することに基づく考察である。例えば、特定のアミノ酸は、例えば、基質分子又は抗体の抗原結合領域上の結合部位などの構造との相互作用的結合能を明らかに失うことなく、ペプチド／タンパク質構造中の他のアミノ酸に置換されてもよい。ペプチド／タンパク質の生物学的機能活性を定義するペプチド／タンパク質の相互作用的能力及び性質であるため、特定のアミノ酸置換を、ペプチド／タンパク質配列、及びその元となるＤＮＡコード配列内になすことができ、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、以下で論じられるように、それらの生物学的有用性又は活性を明らかに失うことなく、遺伝子のＤＮＡ配列において様々な変化がなされ得ることが企図される。更に、本開示のアミノ酸は、メチル化、アセチル化、ミリスチル化などの改変を含んでもよい。

このような変更を行う際には、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。ペプチド／タンパク質における相互作用的生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、得られるペプチド／タンパク質の二次構造に寄与し、ひいては、ペプチド／タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義するとされている。

各アミノ酸には、疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられており（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）である。

特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換でき、同様の生物活性を有するペプチド／タンパク質をもたらし得る、すなわち、依然として生物学的機能的に同等のペプチド／タンパク質を得ることができることが、当該技術分野において既知である。このような変更を行う際には、ハイドロパシー指数が．＋－．２以内であるアミノ酸の置換が好ましいが、．＋－．１以内にあるものが特に好ましく、．＋－．０．５以内のものが更に特に好ましい。

同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることも、当該技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大局所平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって決まるように、タンパク質の生物学的特性と相関することを示している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられており、アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋－．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋－．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５．＋－．１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）、フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）である。

アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものに置換され得、依然として生物学的に等価で免疫学的に同等のタンパク質を得ることができると理解される。このような変更では、親水性値が．＋－．２以内であるアミノ酸の置換が好ましいが、．＋－．１以内にあるものが特に好ましく、．＋－．０．５以内のものが更に特に好ましい。

上記に概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する代表的な置換は、当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；並びに、バリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。しかしながら、本開示のアミノ酸の改変は保存的以外であってもよく、ペプチドが依然として腫瘍細胞を標的とする機能を保持する限り、依然として本開示の範囲内である。

本開示によるペプチドの調製の別の実施形態は、ペプチド模倣体の使用である。模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３を参照されたい。ペプチド模倣体使用の理論的根拠は、抗体と抗原などの分子相互作用を促進する方法でアミノ酸側鎖を配向するために、タンパク質のペプチド骨格が主に存在することである。ペプチド模倣体は、天然分子と同様の分子相互作用を可能にすることが期待される。これらの原理を上記の原理と併せて、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８の天然の特性の多くを有するが、改変され、更に改善された特性を有する第２世代の分子を設計するために使用してもよい。例えば、アミノ酸を置換して、腫瘍細胞へのより強い結合を有するモチーフ、又は、異なる種類の腫瘍細胞に結合させるために特異的に作製できるモチーフを生成することで、異なる腫瘍型についてそれぞれ異なるＨＮ１７及び／又はＨＮ１８関連ペプチドの生成を可能にできる。

本開示の実施形態では、ＨＮ１７及び／若しくはＨＮ１８、又はその断片若しくは誘導体を含むペプチドに関連する追加の手段が存在し、これらは、ペプチド－抗腫瘍組成物複合体の腫瘍細胞への形質導入又は内在化を促進する。特定の実施形態では、タンパク質形質導入ドメインも、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８／抗腫瘍組成物複合体と結合、コンジュゲート、ないしは別の方法で会合される。別の特定の実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質であり（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、タンパク質形質導入ドメインが血液脳関門の通過を可能にするため、このドメインの付加により、脳腫瘍細胞などの腫瘍細胞への送達が促進される。したがって、本開示のこの実施形態では、タンパク質変換ドメインは、任意の組織への送達を促進するが、本開示のＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドは、複合体全体を、頭頸部癌細胞、乳癌細胞、又は脳癌細胞などの腫瘍細胞に特異的に誘導し、タンパク質形質導入ドメインは、主に、抗腫瘍薬複合体の送達及び形質導入を促進する補助手段である。他のタンパク質形質導入ドメインは、本開示の範囲内であり、当該技術分野において既知である。

当業者であれば、容易に変異体をスクリーニング又は検査し、その変異体が依然として腫瘍標的化特性を保持しているかどうかを判定できると認識している。すなわち、実施例などの本明細書に提供される方法によると、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド変異体又は他の内在化ペプチド変異体を、検出可能な標識にコンジュゲートさせ、細胞に導入し、細胞による内在化についてアッセイすることができる。好ましい実施形態におけるアッセイ法は蛍光顕微鏡法であるが、当業者は、利用される標識の種類に応じたアッセイ法を使用すべきであると認識している。このｉｎ ｖｉｔｒｏ法に加えて又はこれに代えて、ｉｎ ｖｉｖｏでの内在化アッセイを使用してもよい。例えば、検出可能な標識にコンジュゲートした変異体を、腫瘍又は癌組織を有しているヌードマウスなどの動物に導入し、動物の腫瘍組織を、標識の検出についてアッセイする。当業者は、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８などの内在化ペプチドを細胞に対して標的化するために、当該技術分野において既知の他の方法又はこれらの方法の変形を使用してもよい。

開示される組成物に組み込むことができるアミノ酸及びペプチド類似体が多数あることを理解されたい。例えば、Ｌアミノ酸とは異なる機能的置換基を有するＤアミノ酸が多数ある。天然型ペプチドの反対の立体異性体及びペプチド類似体の立体異性体もまた開示される。これらのアミノ酸は、例えば、最適なアミノ酸を伴うｔＲＮＡ分子を投入することによって、またアンバーコドンを利用して類似体アミノ酸を部位特異的な方法でペプチド鎖に挿入する遺伝子構築物を操作することによって、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる。

ペプチドに類似しているが、天然型ペプチド結合を介して接続されていない分子を作製することができる。例えば、アミノ酸又はアミノ酸類似体の結合には、ＣＨ_２ＮＨ－、－ＣＨ_２Ｓ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）、－ＣＯＣＨ_２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－及び－ＣＨＨ_２ＳＯ－を挙げることができる（これらの結合及び他の結合は、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的レビュー）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３－４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７－１８５（１９７９）（－ＣＨ_２ＮＨ－，－ＣＨ_２ＣＨ_２－）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３－１２４９ （１９８６） （－ＣＨ Ｈ_２－Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７－３１４（１９８２）（－ＣＨ－ＣＨ－，ｃｉｓ及びｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（１９８０）（－ＣＯＣＨ_２－）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（－ＣＯＣＨ_２－）；Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ，ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－）；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１－４４０４（１９８３）（－Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２－）；及びＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９－１９９（１９８２）（－ＣＨ_２－Ｓ－）に見出すことができ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましい非ペプチド結合は、－ＣＨ_２ＮＨ－である。ペプチド類似体は、β－アラニン、γ－アミノ酪酸などの、結合原子間に２個以上の原子を有することできることを理解されたい。

アミノ酸類似体及び類似体及びペプチド類似体は、より経済的な生産、より高い化学的安定性、向上した薬理学的性質（半減期、吸収、力価、有効性など）、変化した特異性（例えば、生物活性の広域スペクトル）、低減した抗原性などの、増強された又は所望の特性を多くの場合有する。

Ｄ－アミノ酸は、ペプチダーゼなどにより認識されないため、Ｄ－アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用することができる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じ種類のＤ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リシンの代わりにＤ－リシン）による系統的置換は、より安定なペプチドを生成するために使用することができる。システイン残基は、環化するため又は２つ以上のペプチドを一緒に接続するために使用することができる。これは、ペプチドを特定の立体配座に拘束するために有益であり得る。
ｃ）合成ペプチド

本開示は、本開示の様々な実施形態で使用するためのＨＮ１７及び／又はＨＮ１８、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８関連ペプチド、並びに他の癌細胞特異的ペプチドについて記載する。これらのペプチドは、正常細胞ではなく、癌／腫瘍細胞によって特異的に取り込まれる能力を有する。ＨＮ１７ペプチドは１２マーあり、ＨＮ１８ペプチドは１１マーである。しかしながら、１２マーのペプチドに他の配列を追加することができる。また、腫瘍細胞膜を通って移動する能力を依然として保持する他の変異体及びＨＮ１７又はＨＮ１８関連ペプチドも想到される。このようなペプチドは、一般に、ＨＮ１７若しくはＨＮ１８配列全体、又はその一部を含み得、長さが少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個のアミノ酸残基であり、５～１０個、１０～１５個、１５～２０個、２０～２５個、２５～３０個、３０～３５個、３５～４０個、４０～４５個、又は更に５５～５０個の残基、又はそれぐらいの長さであってもよい。

これらは比較的小さいサイズのため、本開示のペプチドは、従来の技術に従って、溶液中又は固体担体上で合成することもできる。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，（１９８４）；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６）；及びＢａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）を参照されたい。本明細書に記載の選択された領域に対応する、通常は約６個から最大約３５～５０個のアミノ酸である、短いペプチド配列、又は重複ペプチドライブラリが容易に合成され、その後、反応性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングすることができる。
２．コンジュゲート法

本開示の実施形態では、抗腫瘍化合物は、癌細胞を殺傷する方法のためにＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドにコンジュゲートされる。本開示の別の実施形態では、検出可能な標識は、癌細胞を対象とする診断及び撮像方法のために、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、標識は直接可視化される。別の実施形態では、標識は、標識を検出する第２の生物学的実体の可視化などの二次手段によって可視化される。

本開示の目的において、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドは、抗腫瘍薬又は組成物にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、ペプチドは、抗腫瘍薬又は組成物を含有するリポソームにコンジュゲートされる。コンジュゲートとは、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ（１９８０）又はＮａｇｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）によって教示されるものを意味する。本開示の実施形態では、抗腫瘍薬又は組成物はカルボジイミドによりコンジュゲートされる。本開示の特定の実施形態では、ドキソルビシンなどの抗腫瘍薬は、Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．（１９９９）などの参考文献に教示されているように、１－エチル－３－（３－ジメチル－アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によってコンジュゲートされる。あるいは、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチドは、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）の方法を使用して抗腫瘍薬にコンジュゲートされるが、これは、オキソン及びモノペルオキシフタル酸などのオキシダントの存在下で、トリペプチドＮＨ．ｓｕｂ．２－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨ（配列番号２）のＮｉ（ＩＩ）錯体を利用する。
３．コンジュゲート

癌細胞を検出又は撮像する目的でＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号７など）を標識するためのコンジュゲートとしては、放射線標識、核磁気スピン共鳴原子、例えば、キレート化Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）及びＧｄ（ＩＩＩ）又はＦｅＯナノ粒子、蛍光標識及び適切な基質との接触により着色生成物を生成できる酵素タグが挙げられる。例えば、コンジュゲートは、ＩＲＤｙｅ８００（ＩＲ８００）であってよい。

本明細書で使用するとき、コンジュゲートには、蛍光色素、ビオチン／ストレプトアビチンなどの結合対の部材、金属（例えば、金）、又は着色された基質若しくは蛍光を生成することによって検出可能な分子と特異的に相互作用することができるエピトープタグを挙げることができる。タンパク質を検出可能に標識するために好適な物質は、（フルオロクローム及びフルオロフォアとして本明細書でも既知の）蛍光染料及び発色基質（colorometric substrate）と反応する酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ）が挙げられる。蛍光染料の使用は、蛍光色素を非常に低量で検出することができるため、本発明の実施において一般的に好ましい。更に、複数の抗原が単一の配列と反応する場合、各抗原は、同時検出のために異なる蛍光化合物で標識され得る。配列上の標識スポットは、蛍光光度計を用いて、特定の抗体に結合した抗原を示すシグナルの存在が検出される。

フルオロフォアは、発光する化合物又は分子である。一般的には、フルオロフォアは、ある波長で電磁エネルギーを吸収し、第２の波長で電磁エネルギー放出する。代表的なフルオロフォアには、１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ、１，８－ＡＮＳ、４－メチルウンベリフェロン、５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、５－カルボキシナフトフルオレセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＡＴ）、５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、６－カルボキシローダミン６Ｇ、６－ＣＲ ６Ｇ、６－ＪＯＥ；７－アミノ－４－メチルクマリン、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、７－ヒドロキシ－４－Ｉメチルクマリン、９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）、ＡＢＱ、酸性フクシン、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、アクリジンイエロー、アクリフラビン、アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ、エクリオン（発光タンパク質）、ＡＦＰ－自家蛍光タンパク質－（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰを参照されたい）、アレクサフルオロ３５０（商標）、アレクサフルオロ４３０（商標）、アレクサフルオロ４８８（商標）、アレクサフルオロ５３２（商標）、アレクサフルオロ５４６（商標）、アレクサフルオロ５６８（商標）、アレクサフルオロ５９４（商標）、アレクサフルオロ６３３（商標）、アレクサフルオロ６４７（商標）、アレクサフルオロ６６０（商標）、アレクサフルオロ６８０（商標）、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ－Ｓ、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、ＡＭＣＡ－Ｘ、アミノアクチノマイシンＤ、アミノクマリン、アニリンブルー、ステアリン酸アントロシル、ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＡＰＴＲＡ－ＢＴＣ、ＡＰＴＳ、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ、アタブリン、ＡＴＴＯ－ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ、ＡＴＴＯ－ＴＡＧ（商標）ＦＱ、オーラミン、オーロホスフィンＧ、オーロホスフィン、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）、ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）、硫酸ベルベリン、β－ラクタマーゼ、ＢＦＰブルーシフトＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）、青色蛍光タンパク質、ＢＦＰ／ＧＦＰ ＦＲＥＴ、ビマン、ビスベンゼミド（Bisbenzemide）、ビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、ビス－ＢＴＣ、ブランコフォアＦＦＧ、ブランコフォアＳＶ、ＢＯＢＯ（商標）－１、ＢＯＢＯ（商標）－３、Ｂｏｄｉｐｙ４９２／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３、Ｂｏｄｉｐｙ５００／５１０、Ｂｏｄｉｐｙ、５０５／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ５３０／５５０、Ｂｏｄｉｐｙ５４２／５６３、Ｂｏｄｉｐｙ５５８／５６８、Ｂｏｄｉｐｙ５６４／５７０、Ｂｏｄｉｐｙ５７６／５８９、Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１、Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０－Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ６５０／６６５－Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ６６５／６７６、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ－セラミド、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ ＳＥ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ共役体、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ，ＳＥ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ－Ｘ ＳＥ、ＢＯ－ＰＲＯ（商標）－１、ＢＯ－ＰＲＯ（商標）－３、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、ＢＴＣ、ＢＴＣ－５Ｎ、カルセイン、カルセインブルー、カルシウムクリムゾン－、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン－１ Ｃａ^２＋色素、カルシウムグリーン－２ Ｃａ^２＋、カルシウムグリーン－５Ｎ Ｃａ^２＋、カルシウムグリーン－Ｃ１８ Ｃａ^２＋、カルシウムオレンジ、カルコフロールホワイト、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）、カスケードブルー（商標）、カスケードイエロー、カテコールアミン、ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＦＰ／ＹＦＰ ＦＲＥＴ、クロロフィル、クロモマイシンＡ、クロモマイシンＡ、ＣＬ－ＮＥＲＦ、ＣＭＦＤＡ、セレンテラジン、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｆｃｐ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｈｃｐ、セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｎ、セレンテラジンＯ、クマリンファロイジン、Ｃ－フィコシアニン、ＣＰＭ Ｉメチルクマリン、ＣＴＣ、ＣＴＣホルマザン、Ｃｙ２（商標）、Ｃｙ３．１ ８、Ｃｙ３．５（商標）、Ｃｙ３（商標）、Ｃｙ５．１ ８、Ｃｙ５．５（商標）、Ｃｙ５（商標）、Ｃｙ７（商標）、Ｃｙａｎ ＧＦＰ、サイクリックＡＭＰ蛍光センサ（ＦｉＣＲｈＲ）、ダブシル、ダンシル、ダンシルアミン、ダンシルカダベリン、塩化ダンシル、ダンシルＤＨＰＥ、フッ化ダンシル、ＤＡＰＩ、ダポキシル、ダポキシル２、ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ、ＤＣＦＨ（二酢酸ジクロロジヒドロフルオレセイン）、ＤＤＡＯ、ＤＨＲ（ジヒドローダミン（Dihydorhodamine）１２３）、Ｄｉ－４－ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ－８－ＡＮＥＰＰＳ（ノンレシオ）、ＤｉＡ（４－Ｄｉ １６－ＡＳＰ）、二酢酸ジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦＨ）、ＤｉＤ－親油性トレーサ、ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））、ＤＩＤＳ、ジヒドローダミン１２３（ＤＨＲ）、Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））、Ｉジニトロフェノール、ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））、ＤｉＲ、ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））、ＤＭ－ＮＥＲＦ（高ｐＨ）、ＤＮＰ、ドーパミン、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ＤＹ－６３０－ＮＨＳ、ＤＹ－６３５－ＮＨＳ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＬＦ９７、エオシン、エリスロシン、エリスロシンＩＴＣ、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー－１（ＥｔｈＤ－１）、オイクリシン、オイコライト、塩化ユウロピウム（１１１）、ＥＹＦＰ、ファーストブルー、ＦＤＡ、フォイルゲン（パラローズアニリン）、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘発蛍光）、ＦＩＴＣ、フラゾオレンジ、フルオ－３、フルオ－４、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、二酢酸フルオレセイン、フルオロエメラルド、フルオロゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）、フルオロルビー、フルオロＸ、ＦＭ １－４３（商標）、ＦＭ ４－４６、フラレッド（商標）（高ｐＨ）、フラレッド（商標）／フルオ－３、フラ－２、フラ－２／ＢＣＥＣＦ、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ、（ＣＣＦ２）、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＧＦＰレッドシフト（ｒｓＧＦＰ）ＧＦＰ野生型、非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）ＧＦＰ野生型、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）ＧＦＰｕｖ、グロキサン酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０、ＨＰＴＳ、ヒドロキシクマリン、ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）、ヒドロキシトリプタミン、インド－１、高カルシウム、インド－１、低カルシウム、インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）、インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）、イントラホワイトＣｆ、ＪＣ－１、ＪＯ ＪＯ－１、ＪＯ－ＰＲＯ－１、レーザープロ、ローロダン、ＬＤＳ７５１（ＤＮＡ）、ＬＤＳ７５１（ＲＮＡ）、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ、リサミンローダミン、リサミンローダミンＢ、カルセイン／エチジウムホモダイマー、ＬＯＬＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、ルシファーイエロー、リソトラッカーブルー、リソトラッカーブルーホワイト、リソトラッカーグリーン、リソトラッカーレッド、リソトラッカーイエロー、リソセンサーブルー、リソセンサーグリーン、リソセンサーイエロー／ブルー、マググリーン、マグダラレッド（フロキシンＢ）、マグ－フラレッド、マグ－フラ－２、マグ－フラ－５、マグ－インド－１、マグネシウムグリーン、マグネシウムオレンジ、マラカイトグリーン、マリーナブルー、Ｉマキシロンブリリアントフラビン１０ ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ ＧＦＦ、メロシアニン、メトキシクマリン、ミトトラッカーグリーンＦＭ、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーレッド、ミトラマイシン、モノブロモビマン、モノブロモビマン（ｍＢＢｒ－ＧＳＨ）、モノクロロビマン、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ＮＢＤ、ＮＢＤアミン、ナイルレッド、ニトロベンゾオキセジドール（Nitrobenzoxedidole）、ノルアドレナリン、ヌクレアファストレッド、ｉヌクレアイエロー、ナイロサンブリリアントラビンＥ８Ｇ、オレゴングリーン（商標）、オレゴングリーン（商標）４８８、オレゴングリーン（商標）５００、オレゴングリーン（商標）５１４、パシフィックブルー、パラローズアニリン（フォイルゲン）、ＰＢＦＩ、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＰＥ－テキサスレッド（Ｒｅｄ６１３）、フロキシンＢ（マグダラレッド）、ホルワイトＡＲ、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フォトレジスト、フィコエリスリンＢ［ＰＥ］、フィコエリスリンＲ［ＰＥ］、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）、ＰＫＨ６７、ＰＭＩＡ、ポントクロームブルーブラック、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、ＰＯ－Ｉ ＰＲＯ－３、プリムリン、プロシオンイエロー、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、ＱＳＹ７、キナクリンマスタード、レソルフィン、ＲＨ４１４、Ｒｈｏｄ－２、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミングリーン、ローダミンファリシジン、ローダミンファロイジン、ローダミンレッド、ローダミンＷＴ、ローズベンガル、Ｒ－フィコシアニン、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ｒｓＧＦＰ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、サファイアＧＦＰ、ＳＢＦＩ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンＩブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）、ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）、ＳＩＴＳ（プリムリン、スチルベンイソチオスルホン酸）、ＳＮＡＦＬカルセイン、ＳＮＡＦＬ－１、ＳＮＡＦＬ－２、ＳＮＡＲＦカルセイン、ＳＮＡＲＦ１、ナトリウムグリーン、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッド、ＳＰＱ（６－メトキシ－Ｎ－（３スルホプロピル）キノリニウム）、スチルベン、スルホローダミンＢ及びＣ、スルホローダミンエクストラ、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ１８、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２２、ＳＹＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０、ＳＹＴＯ４１、ＳＹＴＯ４２、ＳＹＴＯ４３、ＳＹＴＯ４４、ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ５９、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６１、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６３、ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０、ＳＹＴＯ８１、ＳＹＴＯ８２、ＳＹＴＯ８３、ＳＹＴＯ８４、ＳＹＴＯ８５、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、テトラサイクリン、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド（商標）、テキサスレッド－Ｘ（商標）共役体、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チアジンレッドＲ、チアゾールオレンジ、チオフラビン５、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＯＮ、チオライト、チアゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ（カルコフロールホワイト）、ＴＩＥＲ、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３、トリカラー（ＰＥ－Ｃｙ５）、Ｔ
ＲＩＴＣテトラメチルローダミンルソチオシアナート（TetramethylRodaminelsoThioCyanate）、トルーブルー、トルーレッド、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユビテックスＳＦＣ、ｗｔＧＦＰ、ＷＷ７８１、Ｘ－ローダミン、ＸＲＩＴＣ、キシレンオレンジ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、イエローＧＦＰ、ＹＦＰ、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、サイバーグリーン、インドシアニングリーン、チアゾールオレンジ（インターキレーション色素）、量子ドットなどの半導体ナノ粒子、若しくは（光又は他の電磁エネルギー源により活性化することができる）ケージドフルオロフォア、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

放射性核種などの修飾ユニットを、ハロゲン化により本明細書に記載される化合物のうちの任意に直接組み込むか又は付着させることができる。本実施形態において有用な放射性核種の例には、トリチウム、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、アスタチン２１０、炭素１１、炭素１４、窒素１３、フッ素１８が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、放射性核種は、連結基に接続されるか又はキレート基で結合され、その後、直接又はリンカーによって化合物に接続することができる。その態様で有用な放射性核種には、Ｔｃ－９９ｍ、Ｒｅ－１８６、Ｇａ－６８、Ｒｅ－１８８、Ｙ－９０、Ｓｍ－１５３、Ｂｉ－２１２、Ｃｕ－６７、Ｃｕ－６４、Ｌｕ－１７７、及びＣｕ－６２が挙げられるが、これらに限定されない。これらのような放射性標識技術は、放射性薬剤産業において日常的に使用されている。

放射性標識化合物は、神経学的疾患（例えば、神経変性疾患）若しくは精神状態を診断するため、又は哺乳動物（例えば、ヒト）におけるそのような疾患若しくは状態の進行若しくは治療を追跡するための造影剤として有用である。本明細書に記載された放射性標識化合物は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）などの撮像技術と併用して好都合に使用することができる。

標識は、直接的に又は間接的に行うことができる。直接標識において、検出抗体（対象分子に対する抗体）又は検出分子（対象分子に対する抗体によって結合することができる分子）は、標識を含む。標識の検出は、検出抗体又は検出分子の存在を示し、すなわち、対象分子の存在又は対象分子に対する抗体の存在をそれぞれ示す。間接標識では、付加分子又は付加部分は、免疫複合体と接触しているか、又は免疫複合体の部位で生成される。例えば、酵素などのシグナル生成分子又はシグナル生成部分は、検出抗体又は検出分子に取り付けることができるか又は関連付けることができる。次いで、シグナル生成分子は、免疫複合体の部位において検出可能なシグナルを生成することができる。例えば、好適な基質が供給されるとき、酵素は、免疫複合体の部位において可視又は検出可能な生成物を生成することができる。ＥＬＩＳＡは、この種類の間接標識を使用する。
４．抗酸化剤

一般に、抗酸化剤は、酸素と反応し、典型的には酸素によって消費される化合物である。抗酸化剤は典型的には酸素と反応するため、抗酸化剤は、典型的にはフリーラジカル発生剤及びフリーラジカルとも反応する。（「Ｔｈｅ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ－－Ｔｈｅ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｔｈａｔ Ｇｕａｒｄ Ｙｏｕｒ Ｂｏｄｙ」ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｐａｓｓｗａｔｅｒ，Ｐｈ．Ｄ．，１９８５，Ｋｅａｔｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、少なくとも抗酸化剤に関連する物質について参照により本明細書に組み込まれる）。組成物は、任意の抗酸化剤を含有することができ、非限定的なリストには、フリーラジカルを直接除去できる非フラボノイド系抗酸化剤及び栄養素、例えば、マルチカロテン、β－カロテン、α－カロテン、γ－カロテン、リコピン、ルテイン及びゼアキサンチン（zeanthins）、セレン、α－、β－及びγ－を含むビタミンＥ（トコフェロール、特にα－トコフェロールなど、ビタミンＥサクシネート、及びトロロクス（可溶性ビタミンＥアナログ）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）及びナイアシン（ビタミンＢ３、ニコチン酸及びニコチンアミド）、ビタミンＡ、１３－シスレチノイン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、アスコルビン酸ナトリウム、ピロリジン－ジチオ－カルバメート、及び補酵素Ｑ１０；フリーラジカルの破壊を触媒する酵素、例えば、Ｈ_２Ｏ_２及び、例えば有機過酸に作用するグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨＰＸ）などのペルオキシダーゼ、例えば、Ｈ_２Ｏ_２に作用するカタラーゼ、Ｏ_２Ｈ_２Ｏ_２を不均化するスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；グルタチオンＳ－転移酵素（ＧＳＨＴｘ）、グルタチオン還元酵素（ＧＲ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、並びにそれらの模倣体、類似体及びポリマー（ＳＯＤなどの抗酸化酵素の類似体及びポリマーは、例えば、少なくとも抗酸化剤及び抗酸化酵素に関連する物質について参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１７１，６８０号に記載されている）；グルタチオン；セラロプラスミン；システイン、及びシステアミン（β－メルカプトエチルアミン）、並びに、葉酸及び葉酸塩などが含まれるが、これらに限定されない。抗酸化酵素及びその模倣体及び抗酸化剤栄養素の総説は、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．Ｖｏｌ ３９：３０１，１９８８及びＭａｃｈｌｉｎ Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ，Ｆ．Ａ．Ｓ．Ｅ．Ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１：４４１－４４５，１９８７に見出すことができ、これらは、抗酸化剤に関する材料について参照することによって本明細書に組み込まれる。

「フェニルクロモン」としても知られるフラボノイドは、天然に存在し、抗酸化特性を有する水溶性化合物である。フラボノイドは、維管束植物に広く分布しており、多くの野菜、果物、並びに、茶及びワイン（特に赤ワイン）などの飲料に見出される。フラボノイドは、共役芳香族化合物である。最も広く存在するフラボノイドは、フラボン及びフラボノール（例えば、ミリセチン、（３，５，７，３’，４’，５’，－ヘキサヒドロキシフラボン）、ケルセチン（３，５，７，３’，４’－ペンタヒドロキシフラボン）、ケンフェロール（３，５，７，４’－テトラヒドロキシフラボン）、及びフラボンであるアピゲニン（５，７，４’－トリヒドロキシフラボン）及びルテオリン（５，７，３’，４’－テトラヒドロキシフラボン）、並びにこれらのグリコシド、及びケルセチン）である。
５．核酸

核酸系である、本明細書で開示される様々な分子があり、例えば、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８をコードする核酸又はこれらの断片及び様々な機能性核酸を含む。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体からなる。これらの分子及び他の分子の非限定的な例は、本明細書において議論されている。例えば、細胞内でベクターが発現されるとき、発現されたｍＲＮＡは、一般的には、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵからなることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性の送達を通じて細胞又は細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体からなることが有益であることが理解される。
ａ）ヌクレオチド及び関連分子

ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を生成するそれらのリン酸部分及び糖部分を通じて結合され得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）及びチミン－１－イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシンモノリン酸）又は５’－ＧＭＰ（５’－グアノシンモノリン酸）であろう。

ヌクレオチド類似体は、塩基、糖又はリン酸部分のいずれかにある種の修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分への修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕ、並びに、ウラシル－５－イル（．ｐｓｉ．）、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、及び２－アミノアデニン－９－イルなどの異なるプリン又はピリミジン塩基への、天然又は合成的修飾が挙げられる。修飾された塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシ、及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに、３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。追加の塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に見出すことができる。特定のヌクレオチド類似体、例えば、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びに、Ｎ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン、例えば、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシン。５－メチルシトシンは、二本鎖形成の安定性を増加させることができる。多くの場合、塩基修飾は、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルなどの糖修飾と組み合わせて、二本鎖安定性の増加などの固有の特性を達成することができる。

ヌクレオチド類似体はまた、糖部分の修飾を含むこともできる。糖部分に対する修飾には、リボース及びデオキシリボースの天然修飾、並びに合成的修飾が挙げられる。糖修飾としては、２’位置における、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキル（このとき、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換の、Ｃ_１～Ｃ_１０、アルキル、又は、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであってよい）が挙げられるが、これらに限定されない。２’糖修飾としては、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２（式中、ｎ及びｍは、１～約１０である）も含むが、これらに限定されない。

２’位における他の修飾としては、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、又は、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない。同様の修飾はまた、糖上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド又は２’－５’結合オリゴヌクレオチド上の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位でなされてもよい。修飾された糖はまた、ＣＨ_２及びＳなどの架橋環酸素の位置の修飾を含むものも含む。ヌクレオチド糖類似体はまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。

ヌクレオチド類似体はまた、リン酸部分においても修飾され得る。修飾されたリン酸部分としては、２つのヌクレオチド間の結合が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミダート、例えば、３’－アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボルノホスフェートを含有するように修飾され得るものが挙げられるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸塩又は修飾リン酸塩の結合は、３’－５’結合又は２’－５’結合を介してもよく、この結合は、３’－５’から５’－３’、又は２’－５’から５’－２’などの逆極性を含有し得ることが理解される。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。

ヌクレオチド類似体は、単一の修飾を含有するだけでなく、部分のうちの１つ又は異なる部分間に複数の修飾を含有してもよいことが理解される。

ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドに対して同様の機能性を有するが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド置換体は、ワトソン－クリック又はフーグスティーンの様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通じて共に結合する分子である。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用する際に二重らせん型構造に適合することができる。

ヌクレオチド置換基は、置換されたリン酸部分及び／又は糖部分を有するヌクレオチド又はヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド置換基は、標準的なリン原子を含有しない。リン酸塩の代替物は、例えば、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、又は、１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合であってよい。これらとして、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの、並びに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２成分部分の混合を有する他のものが挙げられる。

また、ヌクレオチド置換基において、ヌクレオチドの糖及びリン酸部分の両方を、例えばアミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることも理解される。

他の種類の分子（コンジュゲート）をヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に結合させて、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に化学結合することができる。このようなコンジュゲートとしては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７－３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９－９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９－２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３－９３７のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。

ワトソン－クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のワトソン－クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のワトソン－クリック面は、プリン塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のＣ２位、Ｎ１位及びＣ６位、並びにピリミジン塩基ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又はヌクレオチド置換体のＣ２位、Ｎ３位、Ｃ４位を含む。

フーグスティーン相互作用は、二本鎖ＤＮＡの主溝において露出したヌクレオチド又はヌクレオチド類似体のフーグスティーン面で起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位及びＣ６位における反応性基（ＮＨ２又はＯ）を含む。
６．発現系

細胞に送達される核酸は、発現制御系を一般的に含む。例えば、ウイルス又はレトロウイルスの系に挿入された遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるためのプロモーター及び／又はエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメント及び応答エレメントを含むことができる。
ａ）ウイルスプロモーター及びエンハンサー

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な起源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなど、最も好ましくは、サイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、又は非相同哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得てもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点もまた含む、ＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。当然ながら、宿主細胞又は関連する種からのプロモーターもまた、本明細書において有用である。

エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から不定の距離で機能するＤＮＡの配列を指し、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））又は３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかに存在し得る。更に、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、及びコーディング配列それ自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））に存在し得る。エンハンサーは、通常、１０～３００ｂｐの長さであり、シス型で機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答性のエレメントをしばしば含む。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答性のエレメントを含み得る。エンハンサーは、遺伝子の発現の調節を多くの場合決定する。現在、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、－フェトプロテイン及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られているが、一般的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが一般的な発現のために使用されることとなる。好ましい例は、複製起点（ｂｐ１００～２７０）の後位置のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後位置のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーである。

プロモーター及び／又はエンハンサーは、それらの機能を引き起こす光又は特定の化学事象のいずれかによって特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリン及びデキサメタゾンなどの試薬によって制御できる。ガンマ線照射などの照射又はアルキル化化学療法薬への曝露によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もまた存在する。

ある実施形態において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、転写されるべき転写ユニットの領域の発現を最大化するために、構成的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用することができる。ある構築物において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、たとえそれが特定の時期に特定の型の細胞においてのみ発現する場合であっても、真核生物細胞の全ての種類で活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。

全ての特定の制御エレメントを、コンストラクト発現ベクターにクローニングして、使用することができ、それは、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現することが明らかになっている。グリア線維性酢酸性タンパク質（glial fibrillary acetic protein、ＧＦＡＰ）のプロモーターは、膠細胞起源の細胞において選択的に遺伝子を発現するのに使用されている。

真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）に用いられる発現ベクターはまた、転写の終止に必要な配列を含んでいてもよく、これはｍＲＮＡの発現に影響を及ぼす。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写単位がポリアデニル化領域もまた含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、それが転写単位をｍＲＮＡのように加工及び輸送する可能性を高めることである。発現コンストラクトにおけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、よく確立されている。同種のポリアデニル化シグナルが導入遺伝子コンストラクトにおいて使用されることが好ましい。ある転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写単位が他の標準的な配列を単独で、又は上述の配列と組み合わせて含み、コンストラクトからの発現、又はその安定性を向上させることもまた好ましい。
ｂ）マーカー

ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、送達された後に発現されるかどうかを確認するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質である。

いくつかの実施形態では、マーカーは、選択可能マーカーであってもよい。哺乳動物細胞に対する好適な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイドロマイシン（hydromycin）及びピューロマイシンが挙げられる。このような選択可能マーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に導入されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧に置かれた場合に生存することができる。広く使用されている２つの異なるカテゴリの選択体制が存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝と、補充された培地と独立して増殖する能力を欠落する変異細胞株の使用とに基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養素の添加なしで増殖する能力を欠落する。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠損しているので、失われたヌクレオチドが補充された培地中に供給されなければ生存できない。培地を補充することの代替としては、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を、対応する遺伝子を欠損している細胞へと導入し、それによってそれらの増殖要求を改変することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の細胞は、無添加培地において生存することができない。

第２のカテゴリは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、一般的には、宿主細胞の増殖を停止するための薬剤を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性をもたらすタンパク質を発現し、選択を生き延びることができる。そのような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））又はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））を使用する。それらの３つの例は、真核生物の制御下で細菌の遺伝子を使用し、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性をもたらす。他は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューラマイシンを含む。
７．ｉｎ ｖｉｖｏ撮像

本開示はまた、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８と他の癌特異的タンパク質コンジュゲートを使用して癌を撮像するｉｎ ｖｉｖｏ法も提供する。用語「ｉｎ ｖｉｖｏ撮像」は、動物又はヒト対象の体内に位置する癌細胞に特異的に結合するペプチド又はその断片の検出を可能にする、任意の非侵襲的方法を指す。本開示では、ペプチド又はその断片は癌細胞によってと特異的に取り込まれるため、発明者らは、ペプチド又はその断片を好適な検出剤にコンジュゲートさせることによってペプチドの取り込みを検出することを想定している。

本開示の方法による、内在化ペプチドの単離及び癌の検出に従うと、当業者は、腫瘍細胞を撮像又は診断するために内在化ペプチドが利用されると認識している。当業者は、ＨＮ１７又はＨＮ１８に対する実施例にて本明細書に記載される方法によって教示されるように、特定の癌細胞型を内在化、同定、又は検出する内在化ペプチドを単離することができる。実施例は、扁平上皮細胞癌などの頭頸部癌細胞を対象としているが、任意の癌細胞型を同じ方法で利用し、その癌細胞型の特定の内在化ペプチドを同定することができる。特定の実施形態に従い、当業者は、本明細書に記載の方法を用いて、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、及び上皮癌、腎臓癌、結腸直腸癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌種、大腸癌、造血性癌；精巣癌；前立腺癌、又は膵臓癌を非限定的に含む、他の腫瘍又は癌組織を内在化する他のペプチドを同定することができる。

撮像方法は、一般に、医薬的に有効な担体中の、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９に記載のペプチド（例えば、ＨＮ１７ペプチド、ＨＮ１８ペプチド、又はそれらの任意の断片）にコンジュゲートされた、撮像有効量の検出可能な標識を動物又は対象に投与することと、次いで、癌組織による、標識されたＨＮ１７ペプチド－標識コンジュゲート及び／又はＨＮ１８ペプチド－標識コンジュゲートの取り込みを検出することと、を含む。検出可能な標識は、好ましくは、非侵襲的方法によって検出可能な、スピン標識分子又は放射性同位体である。

「撮像有効量」は、投与されるとき、標識ペプチド又は断片の癌組織への取り込みを、後に検出可能にするのに十分な、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９に記載の、検出可能に標識されたペプチド（例えば、ＨＮ１７ペプチド、ＨＮ１８ペプチド、又はそれらの任意の断片）の量である。ペプチド－標識コンジュゲートの有効量は、患者の組織内に存在する癌組織と接触するのに十分な時間を可能にし、続いて患者を検出デバイスに曝露し、検出可能な標識を識別する。

したがって、本開示の一実施形態は、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８－色素コンジュゲート又はイメージング用構造体を提供し、これは、例えば磁気共鳴映像法、Ｘ線撮像法、コンピュータ断層撮影法などによって腫瘍の画像を提供する能力を有する。磁気共鳴映像法（「ＭＲＩ」）における特に有用な元素としては、核磁気スピン共鳴同位体である、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｃｒ、及び^５６Ｆｅが挙げられ、多くの場合ガドリニウムが好ましい。ガンマ線シンチレーションカメラ又は検出器を使用して検出され得る、テクニチウム（technicium）^９９ｍ又はインジウム^１１１などの放射性物質が使用されてもよい。本開示での使用に好適な金属イオンの更なる例は、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^９７Ｒｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^１２５Ｉ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^８９Ｚｒ、^１８Ｆ、及び^２０１Ｔｌである。

放射性核種は、中間官能基を使用することによって直接的又は間接的に、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド又はその断片に結合されてもよい。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合するために使用されることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ（ドデカン四酸性酸、ＤＯ３Ａ（ドデカントリ酸性酸）、ＮＯＴＡ（シクロノナン三酢酸）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及びＲ－ＤＯ３Ａ（式中、Ｒは金属に結合するヒドロキシルを含有する部分である）である。

標識されたＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド又はその断片の投与は、局所的又は全身的であってもよく、静脈内に、動脈内に、脊髄液などを介して達成され得る。投与はまた、診察中の身体部位に応じて、皮内又は腔内であってもよい。標識されたＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド又はその断片が病変組織、今回の場合癌組織に結合するのに十分な時間、例えば３０分～４８時間経過した後、続いて、検査する対象の面積を撮像技術によって検査する。ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、平面シンチレーション撮像、ＰＥＴ、ＮＩＲＦ光学イメージング、及び他の新しい撮像技術を全て使用してもよい。複数の撮像技術を利用して、検出を明確化又は確認することができる。

結合した放射性同位体の分布及びその経時的な増加又は減少を監視し、記録する。臨床的に正常な個体の研究から得られたデータと結果を比較することにより、病変組織の存在及び程度を判定することができる。

正確な撮像プロトコルは、患者に特異的な因子に応じて必然的に変化し、また、診察中の身体部位、投与方法、使用される標識の種類などに依存し得る。しかしながら、特定の手順の決定は、当業者には日常的なものである。撮像の実施形態の用量は、患者の年齢及び体重に依存するが、患者当たり約０．１～約２０ｍｇ、より好ましくは約１．０～約２．０ｍｇの標識ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド又はその断片の一回用量が有用であると考えられる。２０ｇのマウスにおいて、１０～１００ｎｍｏｌ、又は０．５～５マイクロモル／ｋｇの撮像用量は、腫瘍マウスにおいて非常に有効であり、マウス当たり４０ｎｍｏｌ、又は２マイクロモル／ｋｇが好ましい。ヒトでの使用では、用量は、ヒト患者の体重又は身体表面積に従って、例えば、マウスの０．０２ｋｇから患者の７０ｋｇまでスケールアップし、用量は、４０ｎｍｏｌから約３５００倍、又は約１４０マイクロモルまで増加するであろう。

したがって、本明細書に開示される一態様は、対象における癌細胞を検出する方法であって、ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、ペプチドが、ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号１）、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号２）、ＬＮＫＱＴＨＧＬＩＰＮＳ（配列番号３）、ＮＱＨＳＫＮＴＬＬＩＧＰ（配列番号４）、ＬＫＱＧＮＨＩＮＬＰＳ（配列番号５）、ＹＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号６）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）のアミノ酸配列を含み、ペプチドが、検出可能な標識にコンジュゲートされている、方法である。一態様では、ペプチドは、アミノ末端アミノ酸に結合した親油性物質（lypophile）（例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル、４－パラ－ヨード－ベンジル、４－パラ－ヨード－ベンゾイル、及び／又は３－ヨードチロシン）を更に含む。
８．内在化ペプチドの単離

本開示の実施形態では、内在化ペプチドを単離するための方法が本明細書に提供される。当業者であれば、これらの方法は一般に、腫瘍又は癌組織内に内在化するペプチドを同定することを目的としていることを理解しているが、特定の例は、例えば扁平上皮細胞癌などの癌を検出、撮像、又は同定する際に使用するためのＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号７など）の同定を目的とする実施例に提供される。特定の実施形態に従い、当業者は、本明細書に記載の方法を用いて、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、及び上皮癌、腎臓癌、結腸直腸癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌種、大腸癌、造血性癌；精巣癌；前立腺癌、又は膵臓癌を非限定的に含む、他の腫瘍又は癌組織を内在化する他のペプチドを同定することができる。
９．本開示の方法による癌の検出

本開示の実施形態では、癌を提供するための方法が本明細書に提供される。本明細書で提供される方法の説明は、当業者が、内在化ペプチドを単離する方法、及びこのペプチドを利用して癌細胞を検出する方法を全般的に教示されることに基づいているが、具体的な例は、例えば扁平上皮細胞癌などの癌の検出のための、内在化ペプチドとしてのＨＮ１７及び／又はＨＮ１８ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号７など）の単離、及びその利用に関する実施例に記載されている。特定の方法の工程は、内在化ペプチドを得ることと、検出可能な標識をペプチドにコンジュゲートさせる工程と、コンジュゲートしたペプチド及び標識を生物に投与することと、好適な検出手段によって、コンジュゲートの癌細胞への結合を検出することと、を含む。

追加の実施形態では、癌を検出する方法は、ペプチドライブラリを得ることと、ライブラリのペプチドを細胞集団のメンバーと個々に接触させることと、細胞集団のメンバーによるペプチドのエンドサイトーシスをアッセイし、内在化ペプチドを同定することと、検出可能な標識を当該ペプチドにコンジュゲートさせることと、コンジュゲートしたペプチド及び標識を生物に投与することと、好適な検出手段によって、コンジュゲートの細胞への結合を検出することと、を含む。細胞は頭頸部癌細胞を含む扁平上皮細胞癌細胞であってよいが、あるいは、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、及び上皮癌、腎臓癌、結腸直腸癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌種、大腸癌、造血性癌；精巣癌；前立腺癌、又は膵臓癌由来の細胞であってもよい。
１０．癌治療

本開示の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のいずれかのペプチド又は断片を利用する、癌の治療が存在する。治療される患者は、乳児、小児、青年、又は成人であってもよく、好ましい実施形態では、腫瘍サイズの減少を含む、疾患の少なくとも１つの症状の改善を示す。

当業者に既知の多種多様な癌療法を、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドと組み合わせて（同時投与、投与時に混合、同組成物内に配合、又は共有結合のいずれか）使用できる。発明者らは、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドを使用して、当該技術分野において既知の様々な化学療法剤の癌細胞及び／又は腫瘍細胞への特異的かつ標的化された送達を達成することを想到した。他の実施形態は、当該技術分野において既知の他の癌治療に加えて、抗癌剤を標的化するために、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドの使用を企図する。既存の癌療法及び化学療法薬の一部を以下に記載する。当業者であれば、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドとのコンジュゲートに使用され得る他の抗癌剤療法の存在及び開発を認識し、更に、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドの使用は、以下に記載される薬剤に限定されないことを認識しているであろう。一態様では、ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号７など）を含む組成物が本明細書に開示され、このときペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端又はリジン残基において、抗癌剤（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ドセタキセル、メトトレキサート、又はセツキシマブ又は本明細書に開示される任意の他の抗癌剤など）に共有結合されている。別の態様では、ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号７など）と、抗癌剤（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ドセタキセル、メトトレキサート、又はセツキシマブ又は本明細書に開示される任意の他の抗癌剤など）と、を含む組成物が本明細書に開示される。
１１．放射線治療剤

放射線治療剤は、例えば、ガンマ線照射、ベータ放射線、アルファ放射線、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、電子放射などのＤＮＡ損傷を誘発する放射線を放出する。治療は、局所的な腫瘍部位に上述の形態の放射線を照射することによって達成され得る。これらの因子の全てが、広範な損傷ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の集合及び維持に、影響する可能性が最も高い。ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８を用いて、放射線療法の２つの有効な手段を癌細胞に送達することができる。１つ目は、１つ以上の放射性原子であり、２つ目は、ビーム放射などの外部から照射される放射線に対する補助剤としての放射線増感分子である。放射線増感分子はまた、ＨＮ１７及び／又はＨＮ１８を標的化して付着してもよく、第２の標的化された放射性同位体原子は、ＨＮ１７及び／若しくはＨＮ１８にも付着することによって癌に対し、又は、ＨＮ１７及び／若しくはＨＮ１８にコンジュゲートした放射線増感剤を含有する癌細胞に標的化させる任意の他の手段に対し、別々に標的化され得る。

Ｘ線の用量範囲は、長期間（３～４週間）用の１日用量である５０～２００レントゲンから、２０００～６０００レントゲンの単回用量に及ぶ。放射性同位体の用量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度及び種類、並びに新生細胞による取り込みに依存する。一般に、少なくとも２５Ｇｙ、好ましくは少なくとも５０Ｇｙが癌腫瘍に標的化される。

本開示の文脈において、放射線療法は、細胞特異的癌療法を達成するために、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドを使用することに加えて使用され得る。

いくつかの場合では、放射線核種を含む複合体を、それらが使用される場所又はその近く（例えば、病院の薬局又は診療所）で調製することが便利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、開示されるペプチドは、金属イオンと錯体を形成していない金属キレート剤を含む。このような実施形態では、開示されるペプチドは、投与前に好適な金属イオンと錯体形成され得る。他の実施形態では、開示されるペプチドは、好適な金属イオン（例えば、常磁性金属イオン又は放射性核種）と錯体形成した金属キレート剤を含む。

好適な金属キレート剤としては、例えば、直鎖、大環状、ターピリジン、及びＮ_３Ｓ、Ｎ_２Ｓ_２、又はＮ_４キレート剤（その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６４７，４４７号、同第４，９５７，９３９号、同第４，９６３，３４４号、同第５，３６７，０８０号、同第５，３６４，６１３号、同第５，０２１，５５６号、同第５，０７５，０９９号、同第５，８８６，１４２号も参照されたい）、及び、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、及びビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレート剤が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の他のキレート剤（米国特許第５，７２０，９３４も参照されたい）が挙げられる。例えば、大環状キレート剤、特にＮ_４キレート剤は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８８５，３６３号、同第５，８４６，５１９号、同第５，４７４，７５６号、同第６，１４３，２７４号、同第６，０９３，３８２号、同第５，６０８，１１０号、同第５，６６５，３２９号、同第５，６５６，２５４号、及び同第５，６８８，４８７号に記載されている。特定のＮ_３Ｓキレート剤は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＣＡ９４／００３９５号、同第ＰＣＴ／ＣＡ９４／００４７９号、同第ＰＣＴ／ＣＡ９５／００２４９号、及び米国特許第５，６６２，８８５号、同第５，９７６，４９５号、及び同第５，７８０，００６号に記載されている。キレート剤としてはまた、Ｎ_３Ｓ、及びＮ_２Ｓ_２系を含むキレート配位子である、メルカプト－アセチル－グリシル－グリシル－グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体、例えば、ＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール）、ＤＡＤＳ（Ｎ_２Ｓジアミンジチオール）、ＣＯＤＡＤＳなどが挙げられ得る。これらの配位子系及びその他様々なものは、Ｌｉｕ ａｎｄ Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９，９９，２２３５－２２６８；Ｃａｒａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９，９９，２２９３－２３５２と、その参照文献に記載されており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

金属キレート剤はまた、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１８３，６５３号、同第５，３８７，４０９号、及び同第５，１１８，７９７号に記載されているものなど、テクネチウム及びレニウムジオキシムのボロン酸付加物として知られる錯体を含んでもよい。

好適なキレート剤の例として、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１－置換１，４，７，－トリカルボキシメチル１，４，７，１０テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）の誘導体、１－１－（１－カルボキシ－３－（ｐ－ニトロフェニル）プロピル－１，４，７，１０テトラアザシクロドデカントリアセテート（ＰＡ－ＤＯＴＡ）及びＭｅＯ－ＤＯＴＡ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、３，３，９，９－テトラメチル－４，８－ジアザウンデカン－２，１０－ジオンジオキシム（ＰｎＡＯ）の誘導体；並びに、３，３，９，９－テトラメチル－５－オキサ－４，８－ジアザウンデカン－２，１０－ジオンジオキシム（オキサＰｎＡＯ）の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。追加のキレート配位子は、エチレンビス－（２－ヒドロキシ－フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、及びこれらの誘導体、例えば、５－Ｃ１－ＥＨＰＧ、５－Ｂｒ－ＥＨＰＧ、５－Ｍｅ－ＥＨＰＧ、５－ｔ－Ｂｕ－ＥＨＰＧ、及び５－ｓｅｃ－Ｂｕ－ＥＨＰＧ；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ－ＤＴＰＡ）及びこれらの誘導体、例えば、ジベンゾ－ＤＴＰＡ、フェニル－ＤＴＰＡ、ジフェニル－ＤＴＰＡ、ベンジル－ＤＴＰＡ、及びジベンジル－ＤＴＰＡ；ビス－２（ヒドロキシベンジル）－エチレン－ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）及びこれらの誘導体；少なくとも３個の炭素原子及び少なくとも２個のヘテロ原子（Ｏ及び／又はＮ）を含有する大環状化合物の種類、大環状化合物は、１つの環、又は、ヘテロ環要素において互いに結合した２つ若しくは３つの環からなり得、例えば、ベンゾ－ＤＯＴＡ、ジベンゾ－ＤＯＴＡ、及びベンゾ－ＮＯＴＡ（ＮＯＴＡは、１，４，７－トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ”－三酢酸である）、ベンゾ－ＴＥＴＡ、ベンゾ－ＤＯＴＭＡ（ＤＯＴＭＡは、１，４，７，１０－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチル四酢酸）である）、及びベンゾ－ＴＥＴＭＡ（ＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－（メチル四酢酸）である）；１，３－プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１，５，１０－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリス（２，３－ジヒドロキシベンゾイル）－トリカテコレート（ＬＩＣＡＭ）及び１，３，５－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリス（２，３－ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）の誘導体である。代表的なキレート剤及びキレート基の例は、国際公開第９８／１８４９６号、同第８６／０６６０５号、同第９１／０３２００号、同第９５／２８１７９号、同第９６／２３５２６号、同第９７／３６６１９号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１４７３号、同ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０１８２号、並びに、米国特許第４，８９９，７５５号、同第５，４７４，７５６号、同第５，８４６，５１９号、及び同第６，１４３，２７４号に記載されており、そのそれぞれは、全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。上記のＤＯＴＡ誘導体はまた、Ｒ－ＤＯ３Ａ誘導体であってもよく、このとき、Ｒ＝Ｈであるか、又はアミド若しくはヒドロキシル金属結合原子を含有する。いくつかの実施形態では、金属キレート剤は、デスフェリオキサミン（デフェロキサミン、デスフェリオキサミンＢ、デスフェロキサミンＢ、ＤＦＯ－Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢ、又はデスフェラールとも呼ばれる）又はその誘導体を含む。例えば、デスフェリオキサミン及びデスフェリオキサミン誘導体の教示についてそれぞれが全体を参照することによって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３０９，５８３号、同第４，６８４，４８２号、及び同第５，２６８，１６５号を参照されたい。

当該技術分野において周知のように、金属キレート剤は、特定の金属イオンに特異的であり得る。好適な金属キレート剤は、自己集合分子の所望の金属イオン及び使用目的に基づいて、自己集合分子に組み込むように選択することができる。

常磁性イオンは、そこに外部磁場が印加されると磁気モーメントを形成する。熱運動は、外部磁場がない場合に不対電子のスピンをランダムに配向させるため、外部から印加された磁場がない場合は磁化は保持されない。水分子の磁気緩和時間を短縮する特性を利用することにより、常磁性物質は、ＭＲＩ造影剤の活性成分として使用可能である。好適な常磁性遷移金属イオンとしては、Ｃｒ^３＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｚｒ^４＋、Ｃｕ^２＋、及びＣｕ^３＋が挙げられる。好ましい実施形態では、常磁性イオンは、ランタニドイオン（例えば、Ｌａ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ｃｅ^３＋、Ｔｂ^３＋、Ｐｒ^３＋、Ｄｙ^３＋、Ｎｄ^３＋、Ｈｏ^３＋、Ｐｍ^３＋、Ｅｒ^３＋、Ｓｍ^３＋、Ｔｍ^３＋、Ｅｕ^３＋、Ｙｂ^３＋、又はＬｕ^３＋）である。ＭＲＩにおいて、特に好ましい金属イオンは、Ｇｄ^３＋、Ｍｎ^２＋、Ｆｅ^３＋、及びＥｕ^２＋である。

ＭＲＩ造影剤はまた、キレート剤及び常磁性金属イオンの代わりに常磁性窒素酸化物分子で作製することもできる。

好適な放射性核種として、^９９ｍＴｃ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６６Ｇａ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^１６７Ｔｍ、^１４１Ｃｅ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、１２４Ｉ、^１８Ｆ、^１１Ｃ、^１５Ｎ、１７Ｏ、^１６８Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１４０Ｌａ、^９０Ｙ、^８８Ｙ、^８６Ｙ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^９７Ｒｕ、^１０３Ｒｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２５Ａｃ、^２１１Ａｔ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１６１Ｔｂ、^１７７Ｌｕ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、８９Ｚｒ、及びこれらの酸化物又は窒化物が挙げられる。同位体の選択は、所望の治療又は診断用途に基づいて決定される。例えば、診断目的（例えば、原発腫瘍及び転移の治療の進展を診断又は監視）では、好適な放射性核種として、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６６Ｇａ、^９９ｍＴｃ、及び^１１１Ｉｎ、^１８Ｆ、^８９Ｚｒ、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^１２４Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１５Ｎ、^１７Ｏが挙げられる。治療目的（例えば、前立腺、乳房、胚などの癌に関連する原発腫瘍及び転移への放射線療法の提供）では、好適な放射性核種として、^６４Ｃｕ、^９０Ｙ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^{１８６／１８８}Ｒｅ、^１９９Ａｕ、^１３１Ｉ、及び^１２５Ｉ、^２１２Ｂｉ、^２１１Ａｔが挙げられる。

開示されたペプチドが、ＰＥＴを使用した撮像に設計されている場合、炭素１１（～２０分）、窒素１３（～１０分）、酸素１５（～２分）、フッ素１８（～１１０分）、又はルビジウム８２（～１．２７分）などの半減期が短い放射性核種が多く使用される。特定の実施形態では、非金属放射性核種が用いられる場合、治療剤又は診断剤は、自己集合分子に共有結合した放射性トレーサを含む。例示として、好適な^１８Ｆ系放射性トレーサとして、^１８Ｆ－フルオロデオキシグルコース（fluordesoxyglucose）（ＦＤＧ）、^１８Ｆ－ドーパミン、^１８Ｆ－Ｌ－ＤＯＰＡ、^１８Ｆ－フルオロコリン（fluorcholine）、^１８Ｆ－フルオロメチルエチルコリン（fluormethylethylcholin）、及び^１８Ｐ－フルオロジヒドロテストステロン（fluordihydrotestosteron）が挙げられる。

ＰＥＴを使用した撮像に設計された自己集合分子の場合、^１２４Ｉ、又は^８９Ｚｒなどの半減期が長い放射性核種も多く使用される。
１２．手術

癌性腫瘍を取り除くための外科的処置は、一般に、腫瘍及び癌の治療の標準的な手法である。これは、癌性腫瘍の全てを取り除くことを試みる。しかしながら、手術は、化学療法及び／又は放射線療法と一般的に組み合わせ、あらゆる残存する腫瘍細胞又は悪性細胞を確実に破壊する。したがって、本開示の文脈において、手術は、細胞特異的癌療法を達成するために、本開示の腫瘍細胞特異的ペプチドを使用することに加えて使用され得る。
１３．化学療法剤

本明細書で使用するとき、化学療法剤は、作用機構にかかわらず、任意の抗癌剤を指す。これらは、例えば、ＤＮＡを直接架橋する薬剤、ＤＮＡにインターカレートする薬剤、並びに、核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体及び有糸分裂異常につながる薬剤であってよい。

核酸、具体的にはＤＮＡを直接架橋する薬剤が想定され、本明細書では、相乗的な抗悪性腫瘍薬の組み合わせにつながるＤＮＡ損傷を起こすことが示される。シスプラチンなどの薬剤、及び他のＤＮＡアルキル化剤が使用されてもよい。

ＤＮＡを損傷させる薬剤としては、ＤＮＡ複製、有糸分裂、及び染色体分離を阻害する化合物も挙げられる。これらの化合物の例としては、ベラパミル、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸塩、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ－Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、Ａｄｏ－トラスツズマブエミタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブジマレイン酸塩、アフィニトール（エベロリムス）、Ａｋｙｎｚｅｏ（ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｄａｒａ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレセンサ（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、Ａｌｉｑｏｐａ（コパンリシブ塩酸塩）、アルケラン静注用（メルファラン塩酸塩）、アルケラン錠（メルファラン）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｕｎｂｒｉｇ（ブリガチニブ）、Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ（クロラムブシル）、Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎクロラムブシル）、アミホスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、Ａｒｅｄｉａ（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化二ヒ素、アーゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー、アテゾリズマブ、アバスチン（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バベンチオ（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、Ｂｅｃｅｎｕｍ（カルムスチン）、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベスポンサ（イノツズマブオゾガマイシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ビーリンサイト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、ブスルフェクス（ブスルファン）、カバジタキセル、Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩、ＣＡＦ、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、Ｃａｒａｃ（フルオロウラシル－－外用）、カルボプラチン、カルボプラチン－タキソール、カルフィルゾミブ、Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（ビカルタミド）、ＣＥＭ、セリチニブ、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロラムブシル、クロラムブシル－プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、Ｃｌａｆｅｎ（シクロホスファミド）、クロファラビン、Ｃｌｏｆａｒｅｘ（クロファラビン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダラザレックス（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、デファイテリオ（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンディフティトックス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（シタラビンリポソーム）、デキサメタゾン、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、デュルバルマブ、Ｅｆｕｄｅｘ（フルオロウラシル－－外用）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、イメンド（アプレピタント）、エムプリシティ（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、エリブリンメシル酸塩、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー）、Ｅｔｈｙｏｌ（アミホスチン）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシドリン酸塩）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Ｅｖａｃｅｔ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ、（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｅｖｏｍｅｌａ（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射用）、５－ＦＵ（フルオロウラシル－－外用）、フェアストン（トレミフェン）、ファリーダック（パノビノスタット）、フェソロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマーラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（フルダラビンリン酸塩）、フルダラビンリン酸塩、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（フルオロウラシル－－外用）、フルオロウラシル注射用、フルオロウラシル－－外用、フルタミド、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート）、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ（メトトレキサート）、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ－セツキシマブ、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキサート）、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガザイバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブジマレイン酸塩）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシル酸塩）、ギリアデル（カルムスチンインプラント）、Ｇｌｉａｄｅｌ ｗａｆｅｒ（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（エリブリンメシル酸塩）、Ｈｅｍａｎｇｅｏｌ（プロプラノロール塩酸塩）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン組換え、ＨＰＶ九価ワクチン組換え、ＨＰＶ四価ワクチン組換え、ハイカムチン（トポテカン塩酸塩）、ハイドレア（ヒドロキシウレア）、ヒドロキシウレア、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、Ｉｄｈｉｆａ（エナシデニブメシル酸塩）、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、イホスファミド、Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｕｍ（イホスファミド）、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、イムブルビカ（イブルチニブ）、イミフィンジ（デュルバルマブ）、イミキモド、Ｉｍｌｙｇｉｃ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、インライタ（アキシチニブ）、イノツズマブオゾガマイシン、インターフェロンα－２ｂ組換え、インターロイキン－２（アルデスロイキン）、イントロンＡ（組換えインターフェロンα－２ｂ）、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、イストダックス（ロミデプシン）、イクサベピロン、イキサゾミブクエン酸塩、Ｉｘｅｍｐｒａ（イクサベピロン）、Ｊａｋａｆｉ（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、ジェブタナ（カバジタキセル）、カドサイラ（Ａｄｏ－トラスツズマブエミタンシン）、Ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（パリフェルミン）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、Ｋｉｓｑａｌｉ（リボシクリブ）、キムリア（チサゲンレクロイセル）、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブ二トシル酸塩、Ｌａｒｔｒｕｖｏ（オララツマブ）、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、レンビマ（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロラムブシル）、リュープロリド酢酸塩、ロイスタチン（クラドリビン）、Ｌｅｖｕｌａｎ（アミノレブリン酸）、Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ（クロラムブシル）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ロムスチン、ロンサーフ（トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ（リュープロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（リュープロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ－Ｐｅｄ（リュープロリド酢酸塩）、リムパーザ（オラパリブ）、Ｍａｒｑｉｂｏ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、メキニスト（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソン臭化物、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ－ＡＱ（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサホル）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン塩酸塩）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシンＣ）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｓａｒ（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネシツムマブ、ネララビン、Ｎｅｏｓａｒ（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシル酸塩）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸塩）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎｐｌａｔｅ（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、Ｏｄｏｍｚｏ（ソニデジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシナート、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペグアスパラガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、Ｏｎｉｖｙｄｅ（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、Ｏｎｔａｋ（デニロイキンディフティトックス）、オプジーボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩及びネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、Ｐａｒａｐｌａｔ（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンα－２ｂ、ペグイントロン（ペグインターフェロンα－２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、ポー
トラーザ（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｒｏｌｉａ（デノスマブ）、Ｐｒｏｍａｃｔａ（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプリューセル－Ｔ）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｐｕｒｉｘａｎ（メルカプトプリン）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα－２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒｅｌｉｓｔｏｒ（メチルナルトレキソン臭化物）、Ｒ－ＥＰＯＣＨ、レブラミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒ－ＩＣＥ、リツキサン（リツキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ Ｈｙｃｅｌａ（リツキシマブ及びヒアルロニダーゼヒト）、リツキシマブ、リツキシマブ及び、ヒアルロニダーゼヒト、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｒｕｂｒａｃａ（ルカパリブカンシル酸塩）、ルカパリブカンシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、Ｒｙｄａｐｔ（ミドスタウリン）、Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ Ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ Ａｅｒｏｓｏｌ（タルク）、シルツキシマブ、シプリューセル－Ｔ、ソマチュリンデポ（ランレオチド酢酸塩）、ソニデジブ、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、滅菌タルク粉末（タルク）、Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（ペグインターフェロンα－２ｂ）、Ｓｙｌｖａｎｔ（シルツキシマブ）、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシンメペスクシナート）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、ＴＡＣ、タフィンラー（ダブラフェニブ）、タグリッソ（オシメルチニブ）、タルク、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、タモキシフェンクエン酸塩、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テセントリク、（アテゾリズマブ）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、Ｔｏｌａｋ（フルオロウラシル－－外用）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（テムシロリムス）、トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、Ｔｏｔｅｃｔ（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、Ｔｒｅａｎｄａ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩、トリセノックス（三酸化二ヒ素）、タイケルブ（ラパチニブ二トシル酸塩）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ）、ウリジントリアセテート、ＶＡＣ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、Ｖａｒｕｂｉ（ロラピタント塩酸塩）、ベクティビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、Ｖｅｌｓａｒ（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（アベマシクリブ）、Ｖｉａｄｕｒ（リュープロリド酢酸塩）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデギブ、Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ（ウリジントリアセテート）、Ｖｏｒａｘａｚｅ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ヴォトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、Ｖｙｘｅｏｓ（ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ヨンデリス（トラベクテジン）、ザルトラップ（ジヴ－アフリベルセプト）、Ｚａｒｘｉｏ（フィルグラスチム）、Ｚｅｊｕｌａ（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、ゼルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（デクスラゾキサン塩酸塩）、ジヴ－アフリベルセプト、ゾフラン（オンダンセトロン塩酸塩）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、Ｚｙｄｅｌｉｇ（イデラリシブ）、ジカディア（セリチニブ）、及び／又はザイティガ（アビラテロン酢酸塩）が挙げられる。また、本明細書では、ＰＤ１／ＰＤＬ１遮断阻害剤（例えば、ランブロリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、又はアベルマブなど）である化学療法剤も想到される。新生物の治療のため臨床において広く使用されているこれらの化合物は、アドリアマイシンについては２１日間隔で、２５～７５ｍｇ／ｍ．ｓｕｐ．２の範囲の用量で静脈内ボーラスで、エトポシドについては３５～１００ｍｇ／ｍ．ｓｕｐ．２で静脈内又は経口的に、投与される。
１４．医薬担体／医薬品の送達

上述のように、組成物はまた、薬学的に許容される担体中で、インビボで投与され得る。「薬学的に許容される」とは、生物学的に又はその他の点で望ましい物質を意味し、すなわち、その物質は、望ましくない生物学的効果をいずれも引き起こすことなく、又は物質が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸又はベクターと共に被検体に投与されてもよい。担体は、当業者に公知であるように、活性成分の分解を最小限にするように、かつ被検体における任意の有害な副作用を最小限にするように、当然選択されるであろう。

組成物は、局所鼻腔内投与又は吸入による投与を含んで、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外に、局所的になどで投与されてもよい。本明細書で使用するとき、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方又は両方を通る鼻及び鼻腔への組成物の送達を意味し、噴霧機構若しくは液滴機構による送達又は核酸若しくはベクターのエアロゾル化を介した送達を含むことができる。吸入による組成物の投与は、噴霧機構又は液滴機構による送達を介して鼻又は口を通して行うことができる。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に対して直接行うことができる。必要とされる組成物の正確な量は、被検体の人種、年齢、体重及び全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸又はベクター、組成物の投与様式などに依存して、被検体によって異なるであろう。したがって、全ての組成物の正確な量を指定することは不可能である。しかし、適量は、本明細書の教示に鑑みて、通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。

組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に注射を特徴とする。注射剤は、溶液若しくは懸濁液、注射前における液体での溶解又は懸濁に好適な固形、又は乳剤のいずれかとして、従来の形態で調製されてよい。非経口投与についてごく最近改良された方法は、一定用量が維持されるように徐放系又は持続放出系の使用を伴う。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。

材料は、溶液、（例えば、微小粒子、リポソーム又は細胞に組み込まれた）懸濁液であってもよい。これらは、抗体、受容体又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的としてもよい。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７－４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５－２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００－７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３－９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１－４２５，（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７－８０，（１９９２）；及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２－２０６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクル及び（結腸癌を標的とする脂質介在性薬物を含む）他の抗体共役リポソーム、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体介在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、並びにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特異的治療的レトロウイルス標的化。以下の参照文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４－６２２０，（１９８９）；及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９－１８７，（１９９２））。全般的に、受容体は、構成的誘発性又はリガンド誘発性のいずれかで、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が分別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細胞内に保存されるか又はリポソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見侵入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル調節などの多様な機能を果たす。多数の受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンドの価数及びリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子機構及び細胞機構がレビューされている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９－４０９（１９９１））。
ａ）薬学的に許容される担体

抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療する上で使用することができる。

好適な担体及びこれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。一般的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して、製剤等張性（formulation isotonic）を与える。薬学的に許容される担体の例には、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５～約８、より好ましくは、約７～約７．５である。更に、担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤を含み、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルム、リポソーム又は微粒子である。例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体が更に好ましい場合があることは、当業者には明白であろう。

医薬担体は、当業者に既知である。これらは、最も一般的には、滅菌水、生理食塩水及び生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的な担体であると考えられる。組成物は、筋肉内又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与されることとなる。

医薬組成物は、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１種以上の有効成分を含んでもよい。

医薬組成物は、局所治療又は全身治療が望まれているかどうか、及び治療すべき領域に応じて、多数の方法で投与されてもよい。投与は、（眼科的、経腟的、経直腸的、鼻腔内を含んで）局所的に、経口的に、吸入により又は、例えば、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射若しくは筋肉内注射による非経口的にでもよい。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内又は経皮的に投与することができる。

非経口的投与の製剤には、滅菌した水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づく電解質補充剤など）などが挙げられる。防腐剤及び他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなどとして存在してもよい。

局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、スプレー、液体及び粉末を含んでもよい。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤又は油性基剤、増粘剤などが、必要となるか又は望ましい場合がある。

経口投与のための組成物には、粉末若しくは顆粒、水中又は非水性媒体中の懸濁液若しくは溶液、カプセル、小袋又はタブレットが挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。

組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸などの無機酸並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸などの有機酸との反応によって、又は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基並びにモノ、ジ、トリアルキルアミン及びアリールアミン及び置換エタノールアミンなどの有機塩基類との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩として、投与される可能性がある場合がある。
ｂ）治療的使用

組成物を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定を行うことは、当業者の技能の範囲内である。組成物の投与の用量範囲は、疾患の症状に影響する所望の効果を生じるほど大きい用量である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般に、用量は、年齢、状態、性別及び患者の疾患の程度、投与経路又は他の薬物がレジメンに含まれているかどうかにより変動することとなり、当業者によって決定することができる。用量は、いずれかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整することができる。用量は、変更することができ、毎日、１日又は数日間、１つ以上の用量の投与において投与することができる。指針は、所与のクラスの医薬製品に対する適切な用量に関する文献において見出すことができる。例えば、抗体について適切な用量を選択する際の指針は、抗体の治療用途に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３－３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５－３８９に見出すことができる。単独使用の抗体の一般的な１日用量は、上記の因子に基づいて、１日につき体重１ｋｇ当たり約１μｇ～最大１００ｍｇ又はそれ以上の範囲である場合がある。
１５．キット

本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される方法を実践する際に使用され得る試薬となるキットが開示される。キットは、本明細書に記載の任意の試薬又は試薬の組み合わせを含むことができ、又は開示される方法の実践に必要とされる又は有益であると理解される。例えば、キットは、これらの方法の特定の実施形態に記載される増幅反応を実施するためのプライマー、並びに意図されるようにプライマーを使用するのに必要な緩衝剤及び酵素を含むことができる。例えば、ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（ＨＮ１７）（配列番号１）、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（ＨＮ１）（配列番号２）、ＬＮＫＱＴＨＧＬＩＰＮＳ（ＨＮｓｃｒ）（配列番号３）、ＮＱＨＳＫＮＴＬＬＩＧＰ（ＨＮＪ）（配列番号４）、ＬＫＱＧＮＨＩＮＬＰＳ（配列番号５）、ＹＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号６）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（ＨＮ１８）（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）に記載される１つ以上のペプチドを含む、病理組織を同定するためのキットが開示される。また、病理組織を検出するための撮像コンジュゲート若しくは標識、及び／又は、親油性薬物などの親油性物質も開示される。
Ｃ．組成物の製造方法

本明細書に開示される組成物及び開示された方法を実施するのに必要な組成物は、特に断らない限り、特定の試薬又は化合物について当業者に既知の任意の方法を使用して作製することができる。
１．ペプチド合成

配列番号１などの開示されるタンパク質を作製する１つの方法は、タンパク質化学手法によって２つ以上のペプチド又はポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル）化学のいずれか一方を用いて、現在利用可能な実験装置を用いて化学的に合成することができる。（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、開示されるタンパク質に相当するペプチド又はポリペプチドが、例えば、標準的な化学反応により合成することができることを、容易に理解することができる。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、合成することができ、その合成樹脂から開裂させることができないが、その一方で、ペプチド又はタンパク質の他の断片は、合成して、それに続いて樹脂から開裂させることができ、それによって、他の断片上で官能基的に遮断されている末端基を暴露させる。ペプチドの縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それらのカルボキシ末端及びアミノ末端でのペプチド結合を介してそれぞれ共有結合的に接合して、抗体又はそのフラグメントを形成することができる。（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｍ ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ（この文献は、少なくともペプチド合成に関連する材料について参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、ペプチド又はポリペプチドは、本明細書に記載されるようにｉｎ ｖｉｖｏで別個に合成される。単離されると、これらの別個のペプチド又はポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応を介してペプチド又はその断片を形成するように連結されてもよい。

例えば、クローニングされた又は合成されたペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントが接合することを可能にし、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチド又はタンパク質ドメイン全体を産生する（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然型化学的ライゲーションは、大きなペプチド又はポリペプチドをより短いペプチドフラグメントから合成的に構築するために利用することができる。この方法は、二工程化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６－７７９（１９９４））。第１の工程は、非保護の合成ペプチド－－チオエステルの、アミノ末端のＣｙｓ残基を含む他の非保護ペプチドとの化学選択的反応であり、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体を与える。反応条件を変更することなく、この中間体は、自発的な迅速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位で天然型ペプチドコンジュゲートを形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７－１０１；Ｃｌａｒｋ－Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ－Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：６６２３－３０（１９９４））。

あるいは、無保護ペプチドセグメントは、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合が非天然型（非ペプチド）結合である位置で化学的に連結される（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体及び完全な生物活性を有する比較的純粋な大量のタンパク質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７－２６７（１９９２））。
Ｄ．癌を治療する方法

開示される組成物は、癌などの制御不能な細胞増殖が生じる任意の疾患を治療するために使用することができる。したがって、一態様において、表１又は表３に開示されたペプチドのいずれかを対象に投与することを含む、癌を治療する方法が本明細書に開示される。当該ペプチドは、撮像標識又はコンジュゲート（例えば、蛍光色素又は放射性標識など）を含み得ると理解される。いくつかの態様では、ペプチドは、親油性物質及び／又は化学療法剤を更に含むことができる。２つの異なる撮像標識、２つの異なる治療薬、又は治療薬と撮像標識を、１つのＨＮ１７又はＨＮ１８ペプチドに同時に組み込むことができる。撮像標識又は治療薬はまた、末端親油性物質としても機能し得る。

開示される組成物で治療され得る種々の型の癌の非限定的リストには、以下のものがある。リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、白血病、癌、固形組織の癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫、神経膠芽腫、高悪性度神経膠芽腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、酸素欠乏腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫若しくは肉腫、転移性癌又は一般的な癌、肺、前立腺、乳房、大腸、膵臓、白血病、リンパ腫、及び腎臓の癌を含む。

開示する組成物を治療に使用することができる癌の代表的な、しかし非限定的リストには、以下のものがある。リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頚部癌、頭頚部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫、膠芽腫、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色癌、口腔、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌種、乳癌、並びに上皮癌、腎癌、直腸結腸癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頚部癌腫、大腸癌、造血性癌；精巣癌；前立腺癌、又は膵臓癌、白血病及びリンパ腫を含む。

本明細書で開示される化合物はまた、子宮頸部異形成及び肛門異形成などの前癌状態、他の異形成、高度異形成上皮、過形成、非定型過形成及び新生組織形成を治療するために使用してもよい。

開示される治療方法は、アミノ酸配列ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（ＨＮ１７）（配列番号１）、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（ＨＮ１）（配列番号２）、ＬＮＫＱＴＨＧＬＩＰＮＳ（ＨＮｓｃｒ）（配列番号３）、ＮＱＨＳＫＮＴＬＬＩＧＰ（ＨＮＪ）（配列番号４）、ＬＫＱＧＮＨＩＮＬＰＳ（配列番号５）、ＹＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号６）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（ＨＮ１８）（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）を含むペプチドを含む組成物の投与を想定している。したがって、本明細書に開示されるのは、対象における癌を治療する方法であって、ペプチドを対象に投与することを含み、当該ペプチドが、ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号１）、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号２）、ＬＮＫＱＴＨＧＬＩＰＮＳ（配列番号３）、ＮＱＨＳＫＮＴＬＬＩＧＰ（配列番号４）、ＬＫＱＧＮＨＩＮＬＰＳ（配列番号５）、ＹＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号６）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、方法である。一態様では、ペプチドを、例えばＦｍｏｃ及び／又は４－パラ－ヨード－ベンジル（４Ｉｐｈ）などの親油性物質に共有結合させることができ、ここで親油性物質は、ペプチドのアミノ末端に結合している（例えば、ペプチドは４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８であってよい）。

一態様では、開示される癌を治療する方法は、抗癌剤（本明細書では化学療法剤とも呼ばれる）の投与を更に想定している。抗腫瘍剤は、抗体、腫瘍浸潤リンパ球、チェックポイント阻害剤、樹状細胞ワクチン、抗腫瘍ワクチン、免疫療法、及び化学療法剤を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の抗癌剤を含み得る。一態様では、抗腫瘍剤として、ベラパミル、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸塩、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ－Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、Ａｄｏ－トラスツズマブエミタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブジマレイン酸塩、アフィニトール（エベロリムス）、Ａｋｙｎｚｅｏ（ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｄａｒａ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレセンサ（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、Ａｌｉｑｏｐａ（コパンリシブ塩酸塩）、アルケラン静注用（メルファラン塩酸塩）、アルケラン錠（メルファラン）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｕｎｂｒｉｇ（ブリガチニブ）、Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ（クロラムブシル）、Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎクロラムブシル）、アミホスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、Ａｒｅｄｉａ（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化二ヒ素、アーゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー、アテゾリズマブ、アバスチン（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バベンチオ（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、Ｂｅｃｅｎｕｍ（カルムスチン）、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベスポンサ（イノツズマブオゾガマイシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ビーリンサイト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、ブスルフェクス（ブスルファン）、カバジタキセル、Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩、ＣＡＦ、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、Ｃａｒａｃ（フルオロウラシル－－外用）、カルボプラチン、カルボプラチン－タキソール、カルフィルゾミブ、Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（ビカルタミド）、ＣＥＭ、セリチニブ、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロラムブシル、クロラムブシル－プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、Ｃｌａｆｅｎ（シクロホスファミド）、クロファラビン、Ｃｌｏｆａｒｅｘ（クロファラビン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダラザレックス（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、デファイテリオ（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンディフティトックス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（シタラビンリポソーム）、デキサメタゾン、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、デュルバルマブ、Ｅｆｕｄｅｘ（フルオロウラシル－－外用）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、イメンド（アプレピタント）、エムプリシティ（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、エリブリンメシル酸塩、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー）、Ｅｔｈｙｏｌ（アミホスチン）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシドリン酸塩）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Ｅｖａｃｅｔ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ、（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｅｖｏｍｅｌａ（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射用）、５－ＦＵ（フルオロウラシル－－外用）、フェアストン（トレミフェン）、ファリーダック（パノビノスタット）、フェソロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマーラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（フルダラビンリン酸塩）、フルダラビンリン酸塩、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（フルオロウラシル－－外用）、フルオロウラシル注射用、フルオロウラシル－－外用、フルタミド、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート）、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ（メトトレキサート）、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ－セツキシマブ、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキサート）、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガザイバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブジマレイン酸塩）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシル酸塩）、ギリアデル（カルムスチンインプラント）、Ｇｌｉａｄｅｌ ｗａｆｅｒ（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（エリブリンメシル酸塩）、Ｈｅｍａｎｇｅｏｌ（プロプラノロール塩酸塩）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン組換え、ＨＰＶ九価ワクチン組換え、ＨＰＶ四価ワクチン組換え、ハイカムチン（トポテカン塩酸塩）、ハイドレア（ヒドロキシウレア）、ヒドロキシウレア、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、Ｉｄｈｉｆａ（エナシデニブメシル酸塩）、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、イホスファミド、Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｕｍ（イホスファミド）、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、イムブルビカ（イブルチニブ）、イミフィンジ（デュルバルマブ）、イミキモド、Ｉｍｌｙｇｉｃ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、インライタ（アキシチニブ）、イノツズマブオゾガマイシン、インターフェロンα－２ｂ組換え、インターロイキン－２（アルデスロイキン）、イントロンＡ（組換えインターフェロンα－２ｂ）、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、イストダックス（ロミデプシン）、イクサベピロン、イキサゾミブクエン酸塩、Ｉｘｅｍｐｒａ（イクサベピロン）、Ｊａｋａｆｉ（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、ジェブタナ（カバジタキセル）、カドサイラ（Ａｄｏ－トラスツズマブエミタンシン）、Ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（パリフェルミン）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、Ｋｉｓｑａｌｉ（リボシクリブ）、キムリア（チサゲンレクロイセル）、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブ二トシル酸塩、Ｌａｒｔｒｕｖｏ（オララツマブ）、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、レンビマ（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロラムブシル）、リュープロリド酢酸塩、ロイスタチン（クラドリビン）、Ｌｅｖｕｌａｎ（アミノレブリン酸）、Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ（クロラムブシル）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ロムスチン、ロンサーフ（トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ（リュープロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（リュープロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ－Ｐｅｄ（リュープロリド酢酸塩）、リムパーザ（オラパリブ）、Ｍａｒｑｉｂｏ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、メキニスト（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソン臭化物、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ－ＡＱ（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサホル）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン塩酸塩）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシンＣ）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｓａｒ（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネシツムマブ、ネララビン、Ｎｅｏｓａｒ（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシル酸塩）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸塩）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎｐｌａｔｅ（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、Ｏｄｏｍｚｏ（ソニデジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシナート、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペグアスパラガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、Ｏｎｉｖｙｄｅ（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、Ｏｎｔａｋ（デニロイキンディフティトックス）、オプジーボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩及びネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、Ｐａｒａｐｌａｔ（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンα－２ｂ、ペグイントロン（ペグインターフェロンα－２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキ
セド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、ポートラーザ（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｒｏｌｉａ（デノスマブ）、Ｐｒｏｍａｃｔａ（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプリューセル－Ｔ）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｐｕｒｉｘａｎ（メルカプトプリン）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα－２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒｅｌｉｓｔｏｒ（メチルナルトレキソン臭化物）、Ｒ－ＥＰＯＣＨ、レブラミド（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒ－ＩＣＥ、リツキサン（リツキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ Ｈｙｃｅｌａ（リツキシマブ及びヒアルロニダーゼヒト）、リツキシマブ、リツキシマブ及び、ヒアルロニダーゼヒト、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｒｕｂｒａｃａ（ルカパリブカンシル酸塩）、ルカパリブカンシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、Ｒｙｄａｐｔ（ミドスタウリン）、Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ Ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ Ａｅｒｏｓｏｌ（タルク）、シルツキシマブ、シプリューセル－Ｔ、ソマチュリンデポ（ランレオチド酢酸塩）、ソニデジブ、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、滅菌タルク粉末（タルク）、Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（ペグインターフェロンα－２ｂ）、Ｓｙｌｖａｎｔ（シルツキシマブ）、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシンメペスクシナート）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、ＴＡＣ、タフィンラー（ダブラフェニブ）、タグリッソ（オシメルチニブ）、タルク、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、タモキシフェンクエン酸塩、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テセントリク、（アテゾリズマブ）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、Ｔｏｌａｋ（フルオロウラシル－－外用）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（テムシロリムス）、トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、Ｔｏｔｅｃｔ（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、Ｔｒｅａｎｄａ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩、トリセノックス（三酸化二ヒ素）、タイケルブ（ラパチニブ二トシル酸塩）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ）、ウリジントリアセテート、ＶＡＣ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、Ｖａｒｕｂｉ（ロラピタント塩酸塩）、ベクティビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、Ｖｅｌｓａｒ（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（アベマシクリブ）、Ｖｉａｄｕｒ（リュープロリド酢酸塩）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデギブ、Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ（ウリジントリアセテート）、Ｖｏｒａｘａｚｅ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ヴォトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、Ｖｙｘｅｏｓ（ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ヨンデリス（トラベクテジン）、ザルトラップ（ジヴ－アフリベルセプト）、Ｚａｒｘｉｏ（フィルグラスチム）、Ｚｅｊｕｌａ（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、ゼルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（デクスラゾキサン塩酸塩）、ジヴ－アフリベルセプト、ゾフラン（オンダンセトロン塩酸塩）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、Ｚｙｄｅｌｉｇ（イデラリシブ）、ジカディア（セリチニブ）、及び／又はザイティガ（アビラテロン酢酸塩）が挙げられ得るが、これらに限定されない。また、本明細書では、ＰＤ１／ＰＤＬ１遮断阻害剤（例えば、ランブロリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、又はアベルマブなど）である化学療法剤も想到される。

本明細書に開示される癌を治療する方法において、抗癌剤は、ペプチドに共有結合される（例えば、ペプチドのリジン又はペプチドのカルボキシ末端に結合される）か、ペプチドと同じ製剤に製剤化されるか、又は、ペプチドと同時に投与される（混合又は同時投与を含む）場合がある。親油性の抗癌剤（例えば、化学療法剤）が使用される場合、抗癌剤は、カルボキシ末端に付着されるのではなく、４Ｉｐｈ又はＦｍｏｃの代わりになり得ることが理解され、本明細書において企図される。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、抗癌剤に共有結合したペプチド（例えば、ＨＮ１７又はＨＮ１８など）であり、このとき抗癌剤は親油性であり、抗癌剤はペプチドのアミノ末端部分又は末端でペプチドに結合する。抗癌剤が親水性であるか、又は、ペプチド、タンパク質、又は他の巨大分子である場合、カルボキシ末端又はリジン上のペプチドに結合した抗癌剤を有することが有利であり得ることが更に理解され、本明細書において企図される。
Ｅ．実施例

以下の実施例は、本明細書において特許請求の範囲に記載された化合物、組成物、物品、デバイス及び／又は方法をどのように製造及び評価するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために示され、純粋に例示的であることが意図され、開示を制限することを意図しない。数字（例えば、量、温度など）に関して精度を保証する努力がなされたが、ある程度の誤差及び偏差を考慮するものとする。特に記載のない限り、部分は、重量部であり、温度は、℃単位又は周囲温度であり、圧力は、大気圧又はほぼ大気圧である。
１．実施例１：ＨＮ１７創薬

頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）は、米国において６番目に多い悪性疾患である。診断及び治療が進歩しているにもかかわらず、５年相対生存率が１０年以上有意に改善されていない。癌組織の外科的除去は、依然として、ＨＮＳＣＣの一次治療法である。手術は、５年以内に約６０％の局所再発の可能性があり、切除後に切除縁が陽性である場合は９０％と高くなり場合がある。残念ながら、陽性の切除縁は患者の２５％近くで検出される。手術前の画像診断と経験により、手術計画が支援されるが、術中での切除縁の決定は、主に目視及び触診によって行われる。したがって、切除縁に沿った腫瘍組織の術中検出の精度を改善する任意の実用的な撮像方法は、再発の低減、生存率の増加、及び正常な組織除去によって引き起こされる外観変更の低下をもたらす可能性が高い。

主な従来の撮像法である、ＭＲＩ、及びＰＥＴ／ＣＴは、サイズが大きく、画像収集時間がかかるため、術中での応用が非常に限定されている。最近、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング又は光学式手術ナビゲーション（ＯＳＮ）が、実行可能な選択肢として浮上している。この手技はリアルタイムで動作し、癌受容体に標的化されたｎＭのジシアニン色素を検出するのに十分な感度である。ＩＲｄｙｅ８００標識抗体である、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）及び抗ＣＤ１４７は、現在、ＨＮＳＣＣに対する非臨床及び臨床試験中である。標的が単離され検証されていると、抗体の発見は比較的単純である。しかしながら、小さいペプチドは、同等に強力であり、特定の標的結合剤であり得、組織に透過し、より迅速に除去される可能性がある。また、一般に、スケールアップ、開発、及び商業化にはより安価である。

いくつかの新たなＨＮＳＣＣ標的化ペプチドが探索されてきた。環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）をベースとする３つのペプチドが同定されている。αｖβ３及び他のインテグリンは、ヒトＨＮＳＣＣ細胞の表面上で過剰発現することが知られている。Ｈｓｉａｏらは、ファージをバイオパニングしてαｖβ６特異的ペプチドを発見した。Ｎｏｔｈｅｌｆｅｒらにより発見されたＨＮＳＣＣ結合ペプチド（ＨＢＰ－１）は、ＲＧＤ及びＬＸＸＬモチーフから構成され、αｖβ６インテグリンに優先して結合する。この応用に加えて、Ａｔａｌｌａｈらは、Ｃｙ５標識ＲＧＤ系ペプチドが、マウス頬同所モデルにおける切除中に人間の目によって認識されていない小さな腫瘍組織を検出することができ、それらの組織の除去がマウスの生存を延長すると報告している。

ＨＮＳＣＣのために開発された最も古いペプチドであるＨＮ１は、ＨＮＳＣＣ細胞への親和性が複数の実験室で再現されている唯一のものである。ＨＮ１は、ヒトＨＮＳＣＣ癌細胞のファージディスプレイスクリーニングによって発見され、光学的に標識されたアナログであるＨＮ１－ＦＩＴＣを使用して、ヒトＨＮＳＣＣ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒト癌組織においてｅｘ ｖｉｖｏで、及びマウス腫瘍異種移植片においてｉｎ ｖｉｖｏで検証されている。ＨＮ１は、癌細胞内で内在化されるため、その後、抗癌剤の担体としての探索が成功した。ＢａｏらはＨＮ１の内在化を確認し、ＨＮ１－ＰＫＣイプシロンコンジュゲートがＨＮＳＣＣ細胞内で内在化され、ＰＫＣεの活性を遮断し、異種移植マウスモデルにおける腫瘍成長を阻害することを発見した。Ｕｎらは、ペプチド－ｓｉＲＮＡコンジュゲートであるＨＮ１－抗－ｈＲＲＭ２が、ＨＮＳＣＣ及びヒト乳癌細胞内で内在化され、内因性ｈＲＲＭ２の発現を抑制したことを示した。これらの研究は、全て、ＨＮ１の確実な内在化を実証するために、準最適である長時間（＞２４時間）のインキュベーション時間を使用した。この問題を認識すると、Ｄｕｄａｓらは、ＨＮ１結合に対するより幅広い条件を調べ、ペプチド配列をスクランブルし、取り込みにおいてＨＮ１から有意に異なるものではない、ＨＮｓｃｒを作製した。彼らは、ＨＮ１はアミノ酸配列の影響を大きく受けないが、長いインキュベーション期間を必要としたと結論付けた。

ＯＳＮ用途におけるＨＮ１の第２の欠点は、これまで結合されている色素が、全ての臨床で使用されているｉｎ ｖｉｖｏ外科用イメージャが動作する８００ｎｍの近赤外領域をはるかに下回る放出を行うことである。室内光にて最大浸透深さで動作させるために、既存のイメージャは、非腫瘍特異的な、ＦＤＡ承認された光学色素である、インドシアニングリーンの検出に最適化されている。ＨＮ１の作用機構も未知であるが、細胞透過性ペプチドのように挙動する。本明細書に開示されるのは、ＨＮ１と比較して、ＨＮＳＣＣ細胞における取り込み速度及び内在化を大幅に増加させ、また蛍光標識として臨床的に有用なＮＩＲＦ色素を使用する、新たなハイブリッドペプチド含有分子を生み出した、体系的研究である。最良の新しい分子は、ＨＮ１の良い特徴の全てを示すが、培養細胞の１時間における内在化速度は２７倍に上昇し、マウス異種移植片ＨＮＳＣＣ腫瘍撮像においてはるかに強力な発光強度を示す。
ａ）材料及び方法
（１）材料。

樹脂、試薬、及び全てのアミノ酸は、ＡＡＰＰＴＥＣ又はＣＨＥＭＩＭＰＥＸ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．のいずれかから購入した。合成及び精製用の溶媒は、ＰＨＡＲＭＣＯ－ＡＡＰＥＲ Ｉｎｃ．から試薬グレードを入手した。ペプチドは、ＡＡＰＰＴＥＣ Ｉｎｃ．製のＥｎｄｅａｖｏｒ ９０固相ペプチド合成装置を使用して構築した。
（２）薬剤合成

本明細書で示されるペプチドコンジュゲート分子を、２段階で合成した。標準的なＦｍｏｃ保護法を使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて出発ペプチド分子を入手した。つまり、樹脂上の各ｍｍｏｌのアミンについて、保護されたアミノ酸４．０ｍｍｏｌを、ＨＡＴＵ又はＨＢＴＵなどの適切なカップリング剤４．０ｍｍｏｌ及びＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）８．０ｍｍｏｌを５分間用いて活性化した。次いで、活性化した酸を固相上のアミンに移し、反応容器を１時間振盪した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、フェノール、トリスイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び水を９５：２：２：１で含有する混合液を用いて、最終生成物及び保護基を樹脂から遊離させた（このプロセスを２回繰り返す、１０ｍＬ）後、混合物をメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルに沈殿させた。沈殿物を濾過し、粗固体を、Ｃ１８カラム（１０μｍ、５０×２５０ｍｍ、１００ｍＬ／分で６０分実行）を、水（０．１％ＴＦＡ）：ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）－溶媒１０～１００％で用いる分取ＨＰＬＣ［Ｓｈｉｍａｄｚｕ分取精製ユニット（ＬＣ８Ａ）］で精製した。純度＞９０％を有する画分をプールし、ＭＳ（質量スペクトル分析）によって生成物を確認した。必要な質量及び純度＞９０％を有する画分をプールし、凍結乾燥させて、無色の綿毛状固体として生成物を得た。

ＨＮ１７の調製は、Ｆｍｏｃ－４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニンによりアミノ酸Ｎ－Ｆｍｏｃ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－スレオニンを置換することによって最終カップリングが実施されることを必要とする。ｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００及び８３Ａを得るための、色素コンジュゲートであるｆ－ＨＮ－１－ＩＲ８００及び８３Ｂ中のＦｍｏｃ保護の除去は、周囲温度でアセトニトリル中２０％ジエチルアミンと共にインキュベートすることによって達成された。反応をＨＰＬＣによりモニターし、真空下で蒸発させて終了させ、その後、ＨＰＬＣ精製して所望の生成物を得た。
（３）蛍光標識。

ＤＭＳＯ（乾燥、２５０μＬ）中、等モル量（０．０００６５ミリモル）の精製したペプチド及びＩＲ８００－ＮＨＳエステルに、４－メチルモルホリン（５μＬ）を添加した。得られた混合物を４０℃で１時間インキュベートした。反応の完了後（ＬＣ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩにより確認）、生成物を、Ｓｕｎｆｉｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８（３０×２５０ｍｍ、５μｍ）カラムを３０ｍＬ／分の流速で使用する分取ＨＰＬＣにより単離した。溶媒系は、溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）及びＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）からなり、溶媒Ｂの勾配は６０分間かけて５～７０％に上昇する。分析後、最終化合物を回収し、凍結乾燥して、純度約９０％の緑青色生成物を得た。蛍光標識であるＣｙ５を、同じ方法で作製した。

高分解能ＭＳを使用して、製品の同一性を確認した。合成された色素コンジュゲートペプチド分子それぞれについて、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を使用し、Ｎ２ ｓｍａｒｔｂｅａｍ ＩＩ（商標）レーザー（later）（３３７ｎｍ）と、ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎモードで操作するＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（商標）（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行した。レーザー出力を、信号発生に必要とされる閾値レベルで使用し、好適なデータが得られるまで１０００Ｈｚで取得した。機器は、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩ、サブスタンスＰ、ボンベシン、ＡＣＴＨ ｃｌｉｐ１～１７、ＡＣＴＨ ｃｌｉｐ１８～３９、ソマトスタチン２８、ブラジキニンフラグメント１～７、レニン基質であるブタテトラデカペプチドを含有し、質量範囲が～７００Ｄａ～３２００Ｄａである、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓから購入したＰｅｐｔｉｄｅ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＩで校正した。

合成生成物及び出発ペプチドの純度（＞９０％）の分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－１０ＡＴｖｐモデル、及びＷａｔｅｒｓ Ｃ１８－ＲＰ分析カラム（ＸＢｒｉｄｇｅカートリッジ、１５０×４．６ｍｍ、３．５μｍ；流速＝１ｍＬ／分）を、最初の１０分間を８０：２０緩衝液Ａ／緩衝液Ｂで開始し、次いで、２０分間かけて３０：７０緩衝液Ａ／緩衝液Ｂに達する線形勾配を用いて、実施した。色素コンジュゲート生成物のＨＰＬＣピークは、ＮＩＲＦ発光を検出する蛍光検出器（ＲＦ－１０ＡＸＬ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）により可視化し、純度は、７５０～８２０ｎｍの相対ＨＰＬＣピーク面積によって、それぞれ＞９０％であった。出発ペプチドのピークは、ＵＶ－Ｖｉｓ検出器（２２０ｎｍ）で可視化され、純度は、相対ＨＰＬＣピーク面積によって＞９０％であった。Ａ
（４）細胞株。

ヒト経口扁平上皮癌細胞株Ｃａｌ２７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－２０９５）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００Ｕのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２で３７℃に維持した。細胞を週に２回継代した。
（５）細胞取り込み。

各反応のために、Ｃａｌ２７を９６ウェルプレート３枚に７，０００～１２，０００個／ウェルで播種した。適切な濃度を決定するため、２４時間後、細胞培養培地を、ウェル当たり０～３０μＭのＨＮペプチドを含有する１５０μＬの培地に置換した。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。適切なインキュベーション継続時間を決定するため、２４～４８時間後、培地を、ウェル当たり１０μＭのＨＮペプチドを含有する１５０μＬの培地に置換し、２～４８時間インキュベートした。スクリーニング実験では、２４時間後、培地を、ウェル当たり０～１０μＭのＨＮペプチドを含有する１５０μＬの培地に置換し、１～２時間インキュベートした。次いで、細胞を１５０μＬのＰＢＳで５回洗浄した。最後の洗浄後にＰＢＳを完全に除去し、細胞を６０μＬの溶解緩衝液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、及び１０％グリセロール）中に溶解した。蛍光強度を、ＩＲ８００－コンジュゲートについては７６４／８０９ｎｍの、ＦＩＴＣ複合体については４８５／５２８ｎｍのｅｘ／ｅｍで、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーを使用して測定した。新たに開発された薬剤については、薬剤ｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００をＣａｌ２７細胞スクリーニング実験に含め、１０μＭでのｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００の読み取り値を、独自に１００％又は１として設定した。全ての他の読み取り値をその値と比較した。細胞数は、同じ処理を有する２枚のプレートを対照とした。
（６）蛍光顕微鏡アッセイ。

Ｃａｌ２７細胞を、２枚の８０ウェルのチャンバスライドに７０，０００個／ウェルで播種し、一晩付着させた。細胞培養培地を、１０μＭの薬剤を含有する２００μＬの培地と置き換えた。細胞を３７℃で１～２４時間インキュベートした後、３００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）で４回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含有する緩衝液で１回洗浄した。次いで、チャンバスライドの足場を除去した。次いで、各チャンバを１滴のａｑｕａ－ｐｏｌｙ ｍｏｕｎｔとカバースリップで多い、透明なマニキュアで密封した。ＩＲＤｙｅ８００コンジュゲートには８００ｎｍの発光フィルターセット、ＤＡＰＩには４６１ｎｍを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１顕微鏡を用いて細胞を撮像した。Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡上で４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５を使用して、共焦点イメージングを行った。共焦点顕微鏡用の細胞洗浄は、増殖培地を使用した。ＦＢＳタンパク質結合アッセイ。

薬剤４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００及びＨＮ１－ＩＲ８００（最終濃度２５μＭ）を、４００μＬのＦＢＳ中、室温で３０秒間インキュベートした。濃度は、血液因子が０．０７８の２０ｇのマウスにおける、予測される４０ｎｍｏｌの静脈内撮像用量に基づいて選択した。次いで、溶液（３００μＬ）をＡｍｉｃｏｎユニット（０．５ｍＬ、１０Ｋカットオフ）に入れ、１２，０００ｇで１５分間遠心分離した。濾液（５０μＬ）、残留物（５μＬ）、及び元の溶液（５μＬ）由来のサンプルを、５０（濾液）又は９５（残留物及び元の溶液）μＬの、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳを含有する、２枚の黒色壁の９６ウェルプレートに入れた。更なる洗浄のために、３００μＬのＰＢＳをＡｍｉｃｏｎユニットに加えた。このユニットを上記のように遠心分離した。同量の各成分をウェルに加えた。各画分の蛍光単位を、画分体積×蛍光単位／μＬによって計算した。
（７）ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清安定性。

薬剤４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００及びＨＮ１－ＩＲ８００（最終濃度６．４μＭ）を、２００μＬの新鮮なマウス血清（ｎｕ／ｎｕマウス由来）中、３７℃にて、０、０．５、１．５、３及び６時間インキュベートした。２％ＳＤＳを添加し、続いて１００μＬの氷冷ＥＴＯＨ及び３００μＬのＣＡＮと混合して、１２，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離することにより、薬剤を血清タンパク質から分離した。液相（５０μＬ）をＣ１８逆カラムを用いるＨＰＬＣで分析し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ－１０ＡＸＬ蛍光ＨＰＬＣ検出器を使用して、８００ｎｍの発光蛍光によって検出した。別の対照サンプルには、緩衝液のみ、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００及びＨＮ１－ＩＲ８００、並びにＩＲｄｙｅ８００－ＣＷを含めた。クロマトグラム中のピーク面積に基づいて、薬剤の量を決定した。分解曲線をフィットさせ、ＭＳ Ｅｘｃｅｌを用いて半減期を計算した。
（８）血液クリアランス。

健康な雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、６～８週齢を使用した。血液サンプル（５μＬ）を、投与後（ｐ．ｉ．）２分、０．５、１、３、６、及び２４時間で伏在静脈から採取し、各ウェルが、０．１５％ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）及び０．２％ＢＳＡを有する９５μＬのＰＢＳを含有する９６ウェルプレートに投入した。マウス尿をｐ．ｉ．３時間まで採取した。蓄積尿の分析には、１μＬの尿を３枚の９６ウェルプレートに入れ、９５μＬのＰＢＳで希釈した。未投与のマウス由来の血液及び尿サンプルを陰性対照として使用した。蛍光強度は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーを使用して測定した。各マウスの全血蛍光（％ＩＤ／血液）（ＩＤは投与量）は、（血液体積×血液１μＬ当たり蛍光単位）／（ＩＤ １μＬ当たり蛍光単位×１００）として、各マウスの３時間尿排泄は、（％ＩＤ／尿）＝（尿体積×尿１μＬ当たり蛍光単位）／（ＩＤ １μＬ当たり蛍光単位×１００）として計算した。血中体積をマウスの体重に基づいて計算した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用して、血液の蛍光変化を時間に対してプロットした。全てのデータは平均（ＳＤ）として表記される。スチューデントのｔ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェア）を用いて、２つの点間の差を解析した。ｐ値の０．０５を、統計的に有意であると見なした。
（９）ｉｎ ｖｉｖｏ撮像。

生存動物を使用した全ての実験は、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルに従って実施した。５～７週齢の雌性ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した。１００μＬのＰＢＳ中Ｃａｌ２７細胞（１．５×１０７）を、左側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズを週２回測定し、体積を、長さ×幅×幅／２を用いて計算した。撮像の１週間前に、マウスの食餌を通常のものから蛍光低減食（カタログ＃ＴＤ．９７１８４、Ｈａｒｌａｎ，ＷＩ）に変更した。

腫瘍が約１５０ｍｍ３に増殖したとき、１０％ＤＭＳＯを有するＰＢＳ１００μＬ中、４０ｎｍｏｌの４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００又はＨＮ１－ＩＲ８００を、尾静脈を介してマウスに投与した。ＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏ白色光励起イメージャ（ＣＲｉ Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））及びレーザー励起ＦｌｕｏｂｅａｍＴＭ ８００ ＮＩＲ撮像システム（Ｆｌｕｏｐｔｉｃｓ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））の両方を用いて、動物を撮像した。簡潔に述べると、撮像は、マウス全体及び皮膚を剥がしたマウス、骨格筋と大きさが類似したｅｘ ｖｉｖｏ腫瘍において行われ、腫瘍を筋肉から２ｍｍの厚さの同様の寸法にスライスした。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、腫瘍全体及びスライスした腫瘍の蛍光強度を筋肉の対照に対して測定し、相対比を計算した。
ｂ）結果
（１）合成及び命名。

表３には、命名された略称と共に合成して実験したペプチドを示し、図１は、記載される色素の構造及び略称を示す。ＨＮ１及びＨＮ－Ｊ由来ペプチドの元の名称はそのままとし、コンジュゲートされた蛍光物を末尾に加え（例えば、ＨＮ１－ＦＩＴＣ又はＨＮ１－ＩＲ８００）、Ｃ末端の追加のアミノ酸及び有機部分を、例えば、ＩＲＤｙｅ８００－ＮＨＳとＫでコンジュゲートされたＨＮ１配列のＮ末端Ｆｍｏｃ付加物については、ｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００とした。更に、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８は、ｆ－ＨＮ１７に類似しているが、４－Ｉｐｈで置換した末端スレオニン（Ｔ）を有することが示されている。

極性アミノ酸は、太字体である。Ｆ－Ｆｍｏｃ；４Ｉｐｈ＝ＨＮ１７又はＨＮ１８系については４－パラ－ヨード－ベンジル、ＨＮ１系については４－パラ－ヨード－ベンゾイル。色素は、リジン（Ｋ）にコンジュゲートされる。

合成したＨＮ１ペプチドにＦＩＴＣ－ＮＨＳをコンジュゲートさせることによって元のＨＮ１－ＦＩＴＣを再現しようとする最初の試みにより、ＭＳによって決定される、スレオニン（Ｔ）とリジン（Ｌ）のいずれか又は両方にＦＩＴＣがコンジュゲートした、３種類のペプチドの混合物が得られた。公表されているＨＮ１－ＦＩＴＣ及びＨＮ１－Ｃｙ５コンジュゲートの合成の詳細は、それらの生物学的実験において単一のペプチド又は混合物が使用されたかどうかを結論するには不十分であった。リジンにコンジュゲートした色素を有する別個のコンジュゲートを生成するために、ペプチドを、末端Ｆｍｏｃを除去する前に、ＦＩＴＣ又はＩＲ８００－ＮＨＳ（図１）と常にコンジュゲートさせた。その後、Ｆｍｏｃを任意選択的に除去することができる。３種類の分子の実験を行った：１つが元のＨＮ１配列、２つ目は、従来の陰性対照である「混合」ペプチドのＨＮ－Ｊに基づくものであり、７個の極性アミノ酸が、Ｎ末端に隣接してクラスター化されている。新たな第３の群は、同じアミノ酸の新規配列であるＨＮ１７を用いて実施した。
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験。

この目的は、より短いインキュベーションが可能であるかを判定することであった。これまで公表されている研究は一貫して、いくつかのＨＮＳＣＣ細胞における取り込みを示しており、不死化されているが形質転換されていないヒト上皮細胞における取り込みは非常にわずかである。ＨＮ１－ＦＩＴＣ及びＨＮ１－ＩＲ８００を比較すると、Ｃａｌ２７ ＨＮＳＣＣ細胞における取り込み速度の有意差は見られなかった（図２Ｂ及び２Ｃ）。その後、Ｃａｌ２７細胞を一貫して使用して、ＩＲ８００誘導体のみを調べた。最高濃度として３０μＭの条件で実験を開始し、４８時間のインキュベーションを使用した。図２Ａに示すように、細胞による薬剤取り込みは、ＨＮ１－ＩＲ８００及びｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００の両方について、４８時間で１０μＭでほぼ飽和したが、濃度を３０μＭまで増加させたとき、わずかな増加が観察された。しかしながら、明らかに、Ｎ末端に付加された無極性親油性物質であるＦｍｏｃは、細胞取り込みを増加させた。

インキュベーション時間の影響は、Ｃａｌ２７細胞を、１０μＭのこれらの２つの薬剤と２～４８時間インキュベートすることによって決定した。図２Ｂは、全ての時点で同じ相対的取り込みを示すが、ｆ－ＨＮ－ＩＲ８００は（ＨＮ１－ＩＲ８００ではない）２時間でピークに達し、２４～４８時間でプラトーまで徐々に低下した。この現象は、ＦＩＴＣ標識類似体を含むＮ末端に親油性を有する一連の他のペプチドにおいて再現可能であった（図２Ｃ）。データは、Ｎ末端Ｆｍｏｃペプチドは、使用される色素にかかわらず、より短いインキュベーション時間でより高い取り込みを有し得る一方で、長時間での色素蓄積のための総合的な能力には、末端Ｆｍｏｃによる影響がはるかに小さいことを実証している。データの補正のためｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００を内部対照として使用して、一連の濃度で１～２時間インキュベートしたＣａｌ２７細胞で、更なるスクリーニングを行った。

２時間インキュベートにおける新規ペプチド全てのスクリーニング結果を図３に示す。ＨＮＪＦＩＴＣについてのＨｏｎｇらの知見と同様に、ＨＮ－Ｊ－ＩＲ８００が示す取り込みは低く、遊離ＩＲＤｙｅ－８００－ＣＷ（ＣＷ＝ＮＨＳの代わりの非反応性カルボキシレート）と同等であった。Ｆｍｏｃを配列の極性末端に追加したｆ－ＨＮ－Ｊ－ＩＲ８００は、取り込みを有意に増加させた。第３のペプチド群を、ＨＮ１配列から極性及び非極性アミノ酸を分離することによって合成した。４－ヨード－フェニル基を、Ｆｍｏｃよりも高い分極性親油性物質として試験した。ここで、一連の分子は、＞１２倍の範囲に及ぶ。蛍光発光の範囲は、図３で見られた効果と比較して有意ではなく、３０％であった。２時間のインキュベーション時間は、２４～４８時間のインキュベーションで見られる効果を拡大する傾向があるが、細胞への取り込みの順序は同じである。Ｆｍｏｃ及び４ＩｐｈのＮ末端置換、並びに極性アミノ酸分離は、独立して、Ｃａｌ２７の取り込みを増加させた。

４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の細胞取り込みも蛍光顕微鏡アッセイによって確認した。Ｃａｌ２７細胞の取り込みは、１時間及び２４時間の両方で明るく、発光強度は、巨視的蛍光シグナルの変化に一致して、２４時間よりも１時間ではるかに明るかった。対照的に、１時間又は２４時間のいずれも、ＨＮ１－ＩＲ８００又はＨＮ－Ｊ－ＩＲ８００、又はＩＲＤｙｅ８００ＣＷとインキュベートした細胞において、８００ｎｍで捕捉された蛍光シグナルはほとんどなかった。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究に先立ち、血清タンパク質結合能及び血清安定性を確認した。２５μＭの４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、ＨＮ１－ＩＲ８００よりもわずかに強いタンパク質結合剤である。１００％ＦＢＳにおいて、約７０％及び５２％がＦＢＳに結合した。タンパク質結合が取り込みの主な機構でないことを検証するために、培地中のＦＢＳを含めて、及び含めずに取り込みを測定したところ、恐らく主要な取り込み機構において利用可能なペプチドの濃度を減少させることによって、ＦＢＳが細胞取り込みを実質的に減少させることが発見された。タンパク質を含まないＰＢＳに対して２％アルブミンを調べると、アルブミンへの結合は、同様に、細胞取り込みを有意に減少させたことを示した。結合実験で使用される１０％ＦＢＳでは、タンパク質はＣａｌ２７取り込みを減少させる。これらの２つの化合物が一連の範囲の大部分を表すと仮定した場合、タンパク質結合は、細胞取り込みにおける変数であり、より強いタンパク質結合は、内在化に利用可能な遊離ペプチドの濃度を低減することによって、細胞取り込みを低減すると結論付けることができる。しかしながら、取り込みの機構は、遊離タンパク質結合を伴わない。

薬剤の有効濃度をｉｎ ｖｉｖｏで維持するための重要な因子として、血清安定性を調べた。図４Ａに示すように、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、３７℃のマウス血清中において、ＨＮ１－ＩＲ８００よりも６．３倍長い血清半減期を有した（５．２９時間対０．８４時間）。４０ｎｍｏｌの静脈内投与量では、初期血漿濃度はヘマトクリット値に応じて～５０μＭであると推定され、したがって、代謝される前に腫瘍を標的とするのに十分な安定性を有する。興味深いことに、ＨＮ１７のｄｅ ｎｏｖｏ選択ペプチド配列は、ファージ由来ＨＮ１よりも血清分解に対する耐性が高かった。後者は、血清を含有する増殖培地において、具体的には、その最終的な安定性をｉｎ ｖｉｖｏ送達剤として確実にするために作製された。ＨＮ１７又はＨＮ１８配列のより強いタンパク質結合は、ペプチドを血清ペプチダーゼから分離することによって血清安定性に寄与する可能性がある。
（３）ｉｎ ｖｉｖｏ試験。

４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００及びＨＮ１－ＩＲ８００の血液クリアランスデータを図４Ｂに示し、一連のペプチドについての挙動の範囲を表す。両方のペプチドは、急速な初期血液クリアランス又は分布相と、その後のより遅い血液クリアランス排出相を示し、２４時間までにほぼ完全に排出された。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、最初の３時間でのクリアランスが有意に遅かった（５分、３０分、１時間、及び３時間にのいて、それぞれ３７．１％対９．７％、２２．２％対２．８％、１４．１％対２．１％、及び９．６％対０．３％）（全ての時点でｐ＜０．０５）。より遅い血液クリアランスは、より長い血清安定性及びより強い血清タンパク質結合と一致する。親油性及びタンパク質結合はまた、小分子におけるより高い肝対腎排泄をもたらす傾向もあり、ＨＮ１－ＩＲ８００の３４．５％と比較して、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００では、静脈内投与後最初の３時間以内の尿中に４．４％ＩＤのみであった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏデータに基づくと、両方の薬剤は、マウスモデルにおける腫瘍造影剤として機能するのに十分な生物学的利用能を有する。

４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００を、Ｃａｌ２７側腹部異種移植腫瘍を有するマウスにおいて更に調査した。パイロット用量試験に基づいて、マウス当たり４０ｎｍｏｌを選択した。最初に、マウスを様々な時間で撮像して、腫瘍及びマウス全体における蛍光強度の経時変化を特定した。使用した色素は、早い時点で高い組織バックグラウンドをもたらすことが周知であるが、これに対向して、腫瘍内の取り込みの消失も遅かった。図５Ａに示すように、腫瘍は、マウス全体のバックグラウンドシグナルが取り除かれるときに顕著に目立った。体のバックグラウンドに対する腫瘍の最良のコントラストは４８時間で現れた。これは、ＵＭ－ＳＣＣ－１腫瘍マウス及び同所的に移植された甲状腺髄様腫瘍マウスについても見出された。対照的に、４０ｎｍｏｌのＨＮ１－ＩＲ８００を投与したマウスの腫瘍は、全観察期間中に腫瘍及び身体の残りの部分において同様の蛍光強度を示した。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００（ＨＮ１－ＩＲ８００ではない）を有する腫瘍は、マウスを安楽死させ皮膚を剥がした後、より区別可能になった（図５Ｂ）。蛍光強度をより良好に比較し、半定量化するために、まず、切除された腫瘍を、同様の大きさの切除された骨格筋に隣接させて撮像し、次いで、２ｍｍ厚のサンプルにスライスした後に再度撮像した。図５Ｃに示すように、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の腫瘍は、４８時間の全腫瘍及び２ｍｍ厚切片の両方について、はるかに高い腫瘍対筋肉シグナル比を有した（全腫瘍について１１．１対６．３、厚さ２ｍｍの腫瘍に対して１７．５対４．２、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。

早い時点での撮像可能性を更に調べるために、対にしたマウスにＨＮ１－ＩＲ８００及び４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００を投与し、安楽死させ、８及び２４時間で撮像した。マウス皮膚における高い取り込みが、２４時間より前にマウス全体での腫瘍の撮像の邪魔となった。図５Ｃは、ｅｘ ｖｉｖｏ組織の腫瘍対筋肉比の値を示す。腫瘍対筋肉のコントラスト比は、両方の薬剤において８時間で小さかった（全腫瘍について３．８対３．９、２ｍｍのスライスについて３．０対４．０、ｎ＝３）。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００については、２４～４８時間で値が幾分改善されたが、ｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００の比は有意に変化しなかった。２４時間及び４８時間での腫瘍対筋肉比はまた、ＨＮ１－ＩＲ８００のものよりも有意に高かった（全腫瘍について８．８対４．７、２ｍｍ厚さで１１．７対４．６、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。

４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００対ＨＮ１－ＩＲ８００のより大きい腫瘍シグナル及び腫瘍対筋肉比は、恐らく次の複数の要因による結果である。（１）血清タンパク質が存在する場合、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００のモル蛍光発光は、ＨＮ１－ＩＲ８００よりも約１．５倍大きい。（２）４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の血液クリアランスはより遅く、より長時間にわたって腫瘍を薬剤に曝露する。（３）４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００の癌細胞取り込みはとても速く、より高濃度で平衡化される。（４）マウス血清中の安定性はより高かった。これらの要因は、腫瘍取り込みの生物学的利用能を低減する、より強い血清タンパク質結合を上回った。

標的細胞における４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８の局在化を更に示すために、生きているＣａｌ２７細胞を４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５で処理し、共焦点顕微鏡で撮像した。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５で処理し、続いて洗浄した後の生きているＣａｌ２７を、染色して細胞の微視的構造を明らかにした。４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５は、ＨＮＳＣＣ癌細胞であるＣａｌ２７の内側に明らかに位置していた。色素は細胞のサイトゾルと対応しており、ＨＮ１８が細胞膜を浸透し、膜を越えてサイトゾルに局在することを示している。この特徴は、ＨＮ１８を、癌診断及び治療のための細胞透過送達デバイスとして有益なものにする。
ｃ）考察。

Ｈｏｎｇ及びＣｌａｙｍａｎは、単一のＨＮＳＣＣ細胞株に対するファージライブラリからＨＮ１を得た。２．６μＭでの４８時間にわたる細胞内在化実験を実施した：１）ＨＮ１－ＦＩＴＣは、時間及び用量依存的に６種類のＨＮＳＣＣ細胞株内に内在化されたが、不死化されているが形質転換されていない上皮細胞、及び前立腺癌又は結腸癌細胞株では見られなかった、２）２００倍のＨＮ１は、ＨＮ１－ＦＩＴＣの取り込みを阻害した、３）ＨＮ１－ＦＩＴＣは、ヒト腫瘍組織を染色した、４）２６０ｎｍｏｌ用量で、ＨＮ１－ＦＩＴＣは、マウス異種移植片腫瘍においてｉｎ ｖｉｖｏで局在化した。１２マーのペプチドの両端は、内在化を阻害することなく、いくつかのアミノ酸を延長することができる。５）ＨＮ１を、ＰＢＳ及び培地中のテキサスレッド及びＦＩＴＣ標識で処理し、スクランブルしたペプチドであるＨＮＪ（同一の１２アミノ酸）の内在化が陰性であることから、配列特異的であると判定された。しかし、ＤｕｄａｓはＨＮ１を再度スクランブルし（ＨＮｓｃｒ）、機能の顕著な損失がなかったことから、内在化及び結合が特に配列特異的ではなく、むしろ構造特異的であると結論付けた。このデータは、親油性を増したＣ末端を持たないペプチドに対する２４～４８時間のインキュベーションに関する問題は解決しないが、親油性を増したペプチドを用いた１～２時間の短時間インキュベーションにおいて、ペプチド配列が非常に重要であることを示す。ＨＮ１のＮ末端に結合して残ったＦｍｏｃが取り込みを改善したという思わぬ発見は、Ｎ末端の親油性置換により得られる早期取り込みにおける改善の発見につながった。

本研究は、光学式手術ナビゲーション（ＯＳＮ）のための有用なＨＮＳＣＣ剤を作成する目的を有していた。これまでの研究は、ＦＩＴＣ及びＣＹ５色素をベースとしており、この色素は、Ｂａｏの治療薬での内在化を阻害しないと思われた。ＣＹ５は、構造がＦＩＴＣと非常に異なるジシアニン色素である。この機能を果たすＨＮ１の能力を探索するために、別のジシアニンであるＩＲＤｙｅ８００（ＦＤＡに承認されている光学イメージャで検出可能な、最適＞８００ｎｍの範囲で発光するＮＩＲＦ色素であり、ＩＲＤｙｅ８００は、完全に開発が進んだ前臨床毒性パッケージを有し、その標識としての使用が、臨床での抗体へのコンジュゲートについて試験されている）を代わりに使用した。色素（図１）の分子サイズ及びＩＲ８００の４つの陰性スルホネートを考慮すると、ＦＩＴＣ、ＣＹ５、又はＩＲ８００のいずれかで標識された条件と同じ条件下で同様に機能するＨＮ１が観察されたことは、若干驚くべきことである。しかしながら、更に驚くべきことに、親油性物質がＣ末端アミノ酸に付加されたときに、劇的な違いがもたらされる。親油性が増したペプチドの中で、分子のペプチド部分を再整列し、リジンをペプチドの中央に向かって移動させることによって、極性アミノ酸のほとんどを中央に集め、ＮＩＲＦ色素を中央に集めて、第２の改善を得た。細胞取り込み速度を改善するのと同様の目的で、Ｄｕｄａｓは、Ｋ－ＦＩＴＣ標識を中央のＣ末端側に移動させたが、その変更はＨＮ１－ＦＩＴＣの性能を著しく改善しなかった。

取り込み速度の改善は、ＨＮ１－ＦＩＴＣ及びＨＮ１－ＣＹ５について観察されたものとは異なる機構によるものである。陰性対照であるＨＮＪを含み、全ての配列がＦｍｏｃの添加によって改善される。４Ｉｐｈ及び／又はＦｍｏｃが付加されるとＨＮ１及びＨＮ１７配列の両方が改善され、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００で示される構造的相違にもかかわらず、４Ｉｐｈ及びＦｍｏｃの効果は相加的である。操作的定義により、このアミノ酸組成を有するペプチドファミリーは、配列に関係なく、恐らく細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）類に属する。これらの分子は周知であり、薬物標的化デバイスとして数十年にわたって研究されてきた。これらの主にマイクロモル濃度のドメイン（すなわち弱い結合）での機能性と内在化能は主な特徴であるが、癌特異的ではない。ＨＮファミリーはまれであり、ペプチドの追跡のために選択された色素のみに依存して、－１～－３の総電荷を有する。他のクラスのＣＰＰは、複数のカチオン性アミノ酸を有し全体的に高いカチオン性であり、共有結合した薬物の送達に使用されるか、又は、親水性及び疎水性アミノ酸の連続ドメインを含む両親媒性であり、非共有結合性薬物の送達に使用されるかのいずれかである。しかしながら、ＦＩＴＣ、ＣＹ５、及びＩＲ８００を、共有結合した薬物サイズ分子として考慮すると、ＨＮペプチドはＣＣＰの基準ら逸脱する。－３の総電荷を有する新規ハイブリッド有機ペプチド化合物は、両親媒性ＣＰＰクラスの新しい変化体であるか、又は新しいＣＰＰクラスである。新規のハイブリッド親油性増加ペプチドは、恐らくまだ未知の異なる機構を、もしかするとＨＮ１ファミリーの未知の機構と組み合わせて使用して、このような劇的に異なる早期の内在化を示す。
ｄ）結論

ＦＩＴＣ標識されたファージ由来ペプチドであるＨＮ１－ＦＩＴＣから開始し、再整列し、Ｎ末端親油性物質を置換してから、実用的なＮＩＲＦ色素で標識することで４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１－ＩＲ８００を生成した。この新しい光学剤は、はるかに早く腫瘍細胞に取り込まれ、より高い蛍光度を有し、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍撮像特性を有する。これらの特徴は、光学ガイド下のＨＮＳＣＣ腫瘍切除の実用的な撮像ツールとして、更なる検討をするのにふさわしい。新規化合物は、未確認ではあるが癌特異性が見込まれる、両親媒性ＣＰＰのように挙動する。ＨＮ１－ＰＫＣｅ及びＨＮ１－ｓｉＲＮＡを用いた良好な治療結果を考慮すると、新たな標的化ベクターを使用してより高い治療効果を期待する理由にもなる。
２．実施例２：同所性モデルにおける甲状腺髄様癌に対する新規蛍光造影剤の生物学的評価

理想的な分子造影剤は、容易に吸収され、毒性がなく、外科手術中に利用可能であり、手術直後に排出される。この分子は、バックグラウンド活性を低下させるために、正常組織での取り込みは低く、疾患組織特異的である必要がある。分子は、外科医が容易に観察するために手術中に利用可能であるべきである。近赤外線剤は、外科医に対し、比較的低い自己蛍光を有する肉眼では見えない蛍光波長の可視化を可能にする。ＩＲｄｙｅ８００は、ほとんどのその他近赤外剤よりも良好な組織浸透性及び光度を提供する一方で、低い毒性プロファイルを有するため、分子の標識として選択された。

特定の方法で腫瘍細胞の標的化を可能にする様々なＮＩＲＦ剤が開発されてきた。これらの分子の目的は、一般には薬物送達であるが、それらの腫瘍特異性もまた、術中イメージングを強化するために利用され得る。初期の研究は、毒素又は阻害ペプチドにコンジュゲートしたときに癌細胞殺傷効果を有することがこれまで示されている、ＨＮ－１として知られる化合物に基づくものであった。更なる開発とＩＲＤｙｅ－８００を用いる標識化により、悪性細胞への親和性がはるかに高い化合物につながった。

本明細書では、生物学的文脈における新規造影ペプチドの特性について説明する。このペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて２種類のＭＴＣ細胞に対して高い親和性を有することが実証される。結合動力学は、分子が、ＭＴＣ細胞のミトコンドリアと会合し得る細胞透過性ペプチドとして挙動することを示す。マウス側腹部異種移植モデルにおける研究は、バックグラウンドの蛍光があるにも関わらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を検証した。この分子のｉｎ ｓｉｔｕでの画像化を調べるために、ＭＴＣの同所性異種移植モデルが確立された。このモデルは、既存の脈管構造及び腫瘍微小環境を使用することによって、天然のＭＴＣ状況における造影剤の局在化の実験を可能にする。これはまた、消化器系及び腎臓系において化合物によって見られるバックグラウンドの蛍光も減少させる。ＭＴＣの両方のｉｎ ｖｉｖｏモデル（側腹部異種移植及び同所性異種移植）において、造影ペプチドは、異種移植部位での顕著な蛍光をもたらした。この造影分子は、ＭＴＣの外科的除去を向上させることができる。
ａ）材料及び方法
（１）細胞株の培養：

ＭＺ－ＣＲＣ１細胞は、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｇｅｌ（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ）から入手した。ＴＴ細胞は、Ｄｒ．Ｂａｒｒｙ Ｎｅｌｋｉｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。全ての細胞について、ＰＣＲによってマイコプラズマ不含を確認した。全ての細胞について、短いタンデム反復鑑定によって甲状腺由来であることを確認した。２万個の細胞を、透明底／黒色プレート９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ＃３６０３）に播種し、２０％の加熱不活性化血清（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１０４３７－０２８）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）及び１％Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏカタログ＃２５０３０－１６４）を補充した１６４０ＲＰＭＩ中にて、３７℃で２４時間付着させた。
（２）皮下異種移植片：

細胞を、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）とインキュベーションすることによって、１０ｃｍ^３の組織培養皿から取り出した。細胞を１×ＰＢＳですすぎ、１×ＰＢＳ中に細胞１×１０^７個／ｍＬで再懸濁した。２つの細胞株（ＴＴ及びＭＺ－ＣＲＣ１）のそれぞれについて、１００万個の各細胞株を１００μＬのマトリゲルと合わせ、胸腺欠失ヌードマウス（５週齢、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＴａｒｇｅｔ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手）の別の側腹部（ＴＴ－右、ＭＺ－ＣＲＣ１－左）に注入した。体積がキャリパー測定によって判定できるまで、目視検査によって腫瘍の成長をモニタリングした。腫瘍体積は、式：腫瘍体積＝１／２×（長さ×幅^２）を用いて決定した。両方の腫瘍が１５０ｍｍ^３の最小体積に達すると、動物に、尾静脈注射によって、４０ｎｍｏｌの４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００を投与した。注射後３、６、２４、３６、及び４８時間後に、ＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏを使用して動物を撮像した。
（３）近赤外蛍光像：

注射４８時間後に、動物を安楽死させ、撮像のために皮膚を剥がした。撮像のため、内部臓器と共に腫瘍を除去した。ＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏ白色光励起イメージャ（ＣＲｉ Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））及びレーザー励起ＦｌｕｏｂｅａｍＴＭ ８００ ＮＩＲ撮像システム（Ｆｌｕｏｐｔｉｃｓ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））の両方を用いて、動物を撮像した。曝露時間を均一化するために、同じ画像での比較に関連する全ての組織を配置することによって、組織間の比較を行った。
（４）ＭＴＣ同所性異種移植片：
（ａ）細胞調製及び投与プロトコル：

細胞を０．２５％トリプシンＥＤＴＡで処理し、培養皿から除去した。細胞をすすぎ、１×ＰＢＳ中に細胞５×１０^７個／ｍＬで再懸濁し、氷上に維持した。胸腺欠失ヌードマウス（～５～６週齢、ＴＶＳＲ）をイソフルランで麻酔し、４％クロルヘキシジン（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ））を使用して皮膚を消毒した。消毒野を確立し、垂直頸部切開を行った。手術用顕微鏡を用いて視野を確認した。鈍的切開を使用して、帯状筋及び顎下腺をそれぞれ分離及び反射させた。気管及び甲状腺が十分に可視化された時点で、１０マイクロリットルの細胞懸濁液を、インスリン注射用針（２７ ｇａ、Ｔｅｒｕｍｏ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，ＵＳＡ））を使用して、標的とする甲状腺葉部に注入した。顎下組織を再度接近させ、６－０吸収性外科用縫合糸を使用して切開部を閉じた。マウスを麻酔から覚醒させ、ケージに戻し、鎮痛剤（イブプロフェン２ｍｇ／ｍＬ）を７日間投与した。全ての動物実験は、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｒｅｃｏｕｒｓｅによって承認されたプロトコル下で行った。
（５）統計分析：

ウィルコクソンの順位和検定を使用して、同週齢の非投与マウスと異種移植片を有するマウスとの間のカルシトニン濃度を比較した。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関を、カルシトニン濃度及び剖検時の体積について計算した。
（６）４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の同所性異種移植片：

４０ｎｍｏｌの４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００を、尾静脈を介して動物に注入した。ＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏ白色光励起イメージャ（ＣＲｉ Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））及びレーザー励起ＦｌｕｏｂｅａｍＴＭ ８００ ＮＩＲ撮像システム（Ｆｌｕｏｐｔｉｃｓ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））の両方を用いて、動物を撮像した。腫瘍及び等量の筋組織を切除し、蛍光について比較した。
ｂ）結果
（１）ＭＴＣ皮下側腹部異種移植モデルにおける４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の特性評価

４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の局在化を、両ＭＴＣ細胞の皮下側腹部異種移植モデルにおいて調べた。実験では、少なくとも１５０ｍｍ^３の腫瘍を使用した。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、２４時間までの間、体全体に比較的均等に分布した（図７）。２４時間目から開始し、実験終了までの間、異種移植部位においてバックグラウンドを有するコントラストが増加し、３６時間及び４８時間において更なるコントラストが観察された（図７）。両細胞株は、対応する異種移植片内に、４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００を等しく濃縮できると思われ（図７）、カルシウム代謝が薬剤の取り込み及び保持に関与していないことを示している。
（２）甲状腺髄様癌同所性異種移植片の特徴

疾患の正常部位における４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の濃度を調べるために、各細胞株を５例（ＴＴ）又は６例（ＭＺ－ＣＲＣ１）の動物の甲状腺葉部に注入することにより、ＴＴ及びＭＺ－ＣＲＣ１細胞株の両方について、同所性異種移植片を確立した。異種移植片は、ＴＴ細胞株を注入した全ての動物における確立が成功し、ＭＺ－ＣＲＣ１細胞株を注入した動物６例のうち５例の動物における確立が成功した。注入後２週目に開始した３Ｄ ＵＳによって、異種移植片の増殖を毎週確認した。同所性異種移植片は、注入した甲状腺葉部内の小さい低密度結節として、３週間の早期に検出可能であった。異種移植片が増えると、丸い輪郭を呈し、周囲の組織と比較して低密度のまま維持された。より大きい腫瘍は、気管及び食道後方の頸部の対側部位まで拡大していることが観察された。ＴＴ細胞を注入した動物において、各同所性異種移植片間の成長のばらつきはほとんどなかった。ＵＳソフトウェアによって計算された同所性異種移植片の最終体積、及び、ＭＺ－ＣＲＣ１細胞由来の異種移植片の剖検後のキャリパー測定によって判定された体積において、いくらかの差が観察された。
（３）ＭＴＣ同所性モデルにおける４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の画像化

同所性異種移植片を使用して、４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の同所性異種移植部位への蓄積能を調べた。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、容易に可視化される蛍光を発するマウスの異所性異種移植片において主に見られた（図８）。重要なことに、周囲組織は蛍光を発しなかったことから、４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、腫瘍細胞由来異種移植片に特異的に内在化／結合することを示している。配列混合対照を注入したマウスは、特異的な（実際には、いかなる検出可能な）蛍光を有さなかった（図８）。腫瘍体積と蛍光強度との間に観察可能な相関は存在しなかった。

第２の同所性異種移植片を使用して、４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の、ＭＢＡ－ＭＤ－２３１トリプルネガティブヒト乳癌細胞を用いる、乳癌の同所性異所移植部位への蓄積能について調べた。ＭＢＡ－ＭＤ－２３１細胞を、雌性ヌードマウスの脂肪体のうち２ヶ所に移植した。図９Ａには、これらの腫瘍の増殖速度を経時的に示す。２ヶ所にこのような腫瘍を有するこれらマウスのうち１例では、腫瘍が直径約１ｃｍに増殖した後、マウスに４０ｎｍｏｌのｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００を注入し、ＦｌｕＯｐｔｉｃｓ Ｆｌｕｏｂｅａｍ光学手術イメージャを使用して２４時間後に画像を記録した（図９Ｂ）。光学画像内の大きな白色楕円は、腫瘍内にｆ－ＨＮ１８－ＩＲ８００が局在していることを実証する腫瘍である。
ｃ）考察

本明細書では、甲状腺髄様癌における新規近赤外造影分子の生物学的評価が開示される。初期の実験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、この分子が２種類のＭＴＣ細胞株に結合及び／又は細胞内に内在化され得ることを示す。素早い内在化に必要な比較的高い濃度と共に、同じアッセイを用いた顕微鏡的評価では、分子が細胞透過性ペプチドとして挙動することを示す。蛍光顕微鏡を使用して、４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の細胞局在をＭＴＣ細胞において調べ、処理した細胞内の蛍光が、ミトコンドリアの局在と一致していたことがわかった。この局在化は、その場所での内在化、又はその場所における蛍光代謝産物の局在化によるものである。対照化合物（８３ａ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの蛍光を実質的に示さず、１７の特異性を示している。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００が細胞に結合し、細胞に侵入する機構は、現時点では不明である。Ｈｏｎｇ ａｎｄ Ｃｌａｙｍａｎは、ＨＮ１と呼ばれるペプチドについて説明しており、恐らくは受容体媒介性エンドサイトーシスを介して扁平上皮癌細胞によって取り込まれることがわかったが、その機構は確実に示されなかった。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、一部は同じアミノ酸由来であり、同様の侵入機構を有するが、より迅速に取り込まれる。

特定の蛍光もまた、側腹部異種移植片において観察され、これは皮膚を通して明らかであった。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、腎臓にも蓄積しているようであり、これらの器官による排泄を示す。また、ネフロンに対するいくらかの親和性も示す。同じ動物由来の筋組織（大腿部）を調べると、異種移植片と比較して非常に低い蛍光が明らかになり、優れたシグナル対バックグラウンド比を提供している。興味深いことに、薬剤は、腫瘍全体に均一かつ広範囲に拡散するように見える。薬剤は、血管又はリンパの中又はその近くに保持されていないようである。これにより、腫瘍の血管に富んだ領域だけではなく、全ての腫瘍組織での完全な可視化がもたらされる。

術中の状況における４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の実用性をより良好に評価するために、マウスにおけるＭＴＣの同所性モデルが開発された。異種移植片を、外科処置中に甲状腺床に直接注入することによって確立した。これにより、周囲の甲状腺濾胞細胞、脈管構造、及びパラ分泌シグナル伝達を含む微小環境における、異種移植片の成長と発達が可能となった。ＭＴＣについては説明されていない。異種移植片の同所性位置は、ヒトにおいて用いられるものと同様の非侵襲的方法を提供するマウス頸部ＵＳによって確認された。代替的な監視システムは、典型的には生物発光を利用するが、これは、遺伝子改変した細胞を必要とする。ＭＴＣ細胞株の増殖は遅く、ルシフェラーゼ遺伝子を導入するプロセスは、サブクローンの選択などの悪影響を及ぼし得る。腫瘍不均一性及びＵＳを使用する微妙な差異のため、不完全な腫瘍のＵＳ画像を有し、結果として、３Ｄ ＵＳ上の腫瘍の全体積が実際の病態より低く予測される動物が、いくつか存在し得る。この用途でＵＳを使用するにあたって学習曲線が存在するが、未標識細胞株の使用を可能にし、かつ非侵襲的な有益なツールである。全体として、成長曲線は動物間で平滑で一貫しており、最終的なＵＳで記録された腫瘍の体積は、剖検中に測定した体積に非常に近似することが見出された。ＰＴＣ及びＡＴＣ同所性異種移植片の報告では、４～５週間で大きな異種移植片（１００～２００ｍｍ^３）を示しているが、ＭＴＣ同所性腫瘍は、９～１０週間でそのような大きな体積に達し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の遅さと相関している。ＭＴＣ同所性モデルにおいて腫瘍増殖を評価する際の別の有用な補助的手段は、ＥＬＩＳＡアッセイによる血清カルシトニン測定である。カルシトニンは、ＭＴＣを有するヒトにおける有用なバイオマーカーである。ＭＴＣ異種移植片を有する動物では、同齢同性対照動物と比較して、カルシトニン濃度の増加が見出された。これは、これらの動物における４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の評価には適用できなかったが、腫瘍によってカルシトニンが産生されるというコンセプトの実証の代わりとなり、異種移植片の増殖及び／又は治療に対する応答のバイオマーカーとして使用することができる。更なる研究によって、カルシトニンは、他の方法によって異種移植片の増殖を確認する必要性をなくすことができるかもしれない。

ＭＴＣ同所性モデルにおける４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００の使用は、外科的切除におけるその潜在的な用途を示す。腫瘍は、周囲組織と比較して強い蛍光を示す。周囲の筋肉、気管、及び食道におけるバックグラウンド蛍光はわずかである。蛍光の分解能は、センチメートル以下であることは確実であり、場合によっては１ミリメートル単位である。広く広がった局所性疾患を有する患者、並びに再手術における局所性再発を有する患者においては、このレベルの分解能は、瘢痕組織を活性疾患と区別する際に有用である。この区別化のレベルは、側頸部切開中の繊細な領域、例えば反回神経及びその他脳神経の周囲において、更に有益である。生検を必要とすることなく、悪性組織と非悪性組織とをリアルタイムで区別する能力は、患者に対するリスクを最小化し、より完全な切除を得るための最終的な目標である。４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は優れた候補であるが、ヒトで使用を進め、並びに、他の用途においてその潜在性を最大化するためには、更なる研究が必要である。これには、感度及び特異性の範囲、作用機構、薬力学及び薬物動態、並びに忍容性を評価することを含む。撮像前の化合物の最適な投与タイミングを決定することは、シグナル対バックグラウンド比を最大化するために必要である。実施すべきことがたくさんあるが、４Ｉｐｈ－ＨＮ１８－ＩＲ８００は、ＭＴＣを有する患者にとって著しい影響を与える可能性があると思われる。
３．実施例３：細胞透過性ペプチドによる細胞膜の直接透過

最適なペプチド（４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＣＹ５）のＣＹ５標識類似体を作製して、共焦点顕微鏡法を用いてＨＮＳＣＣ生細胞内の内在化を検証した。ＨＮ１８が実際に内在化され、主な細胞成分分画が細胞質内であると結論付けられた。アクチンは、膜の位置を染色し、ヘキストは細胞核を染色する。共焦点画像は、サイトゾル中に位置する内在化４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＣＹ５を明確に示した。染色を実施するために、細胞を、５～１０μＭの４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＣＹ５中で１時間インキュベートし、細胞を損傷することなく可能な限り多くのハイブリッドペプチドを除去するために、ＦＢＳ（ハイブリッドペプチドに結合する）を含有する細胞増殖培地で５回洗浄した。

ＨＮ１７及びＨＮ１８の細胞の細胞質への到達方法を判定するため、直接透過又はエンドサイトーシスによって内在化が生じ得ることが理解された。どちらの機構が使用されたのかを明らかにするために、共焦点画像を再度取得したが、このときは様々な阻害剤が存在していた。

利用可能な熱エネルギーを低減することにより、細胞膜の固着及び内在化は、完全ではないが、ほぼ停止した（図１０）。これは、両方の機構と一致しているが、内在化は、生存細胞及びその生存状態に関連しない何らかの種類の物理吸着ではないことも示している。更に、観察された細胞膜固着は、全体的な機構の一部であることを意味する。その後の動態により、第１の工程がほんの数秒から数分間で発生することが示される。

どちらの内在化経路が生じていたか識別するために、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－ＣＹ５を、様々な阻害剤の存在下でＣａｌ－２７細胞と共にインキュベートした（図１１）。アジ化ナトリウムは細胞のＡＴＰプールを枯渇させるため、アジ化ナトリウムの使用により、内在化機構が多くの細胞供給エネルギーを必要としないことが示される。これは、直接透過機構と一致している。エンドサイトーシスはエネルギー依存性である。次の４枚のスライドはそれぞれ、様々な種類のエンドサイトーシスを停止するために細胞に適用された非常に効果的なエンドサイトーシス阻害剤にもかかわらず、内在化を示す。具体的には、この結果は、ノコダゾール、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、クロロプロマジン、及びアミロライド阻害によって示された。ノコダゾールは、クラスリン（clartherin）被覆ピットの形成を阻害するため、クラスリン（calthrin）依存性エンドサイトーシスを検査することができる。ＭβＣＤは、主なクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路のうちの１つである、脂質ラフト媒介性カベオラ経路を阻害する。同様に、クロロプロマジンは、エンドサイトーシスのクラスリン非依存性経路を阻害する。最後に、アミロライドは、微飲作用（すなわち、非受容体媒介性エンドサイトーシス）を阻害する。上記のように、各阻害は、内在化を停止しなかった。ＦＡＣＳを、ＦＩＴＣ標識ハイブリッドペプチドで実施する。これにより、全ての細胞がバルクに含まれ、細胞結合に関与し、顕微鏡下で観察された細胞が少なくないことが示される。したがって、ＨＮ１７を介した細胞透過は、直接機構を介して生じる。

ヨウ化プロピジウムは、機能している新たな機構があるか、細胞が死滅しつつある、若しくは死亡している場合を除き、細胞に侵入できず、核を青色に染色できない。最も右側の図は、使用した濃度及び条件において、ハイブリッドペプチドが細胞を損傷しないことを示す（図１２）。それにもかかわらず、左のスライドは、ＨＮ１８の存在下で、ヨウ化プロピジウムが細胞に侵入し、核を青く染色することを示す。これはいずれのメカニズムとも一致しているが、この機構は直接透過のはずであると今では知られているため、ハイブリッドペプチドは、サイトゾルへのヨウ化プロピジウムの一時的到達を可能にする、そこから核内に移行するための、小さく、無害で、かつ一時的な細胞膜の欠陥を生成しなければならない。ハイブリッドペプチドは、核を標的とするため、強く結合できないが、ハイブリッドペプチドはサイトゾルに留まっている。この現象により、単純にハイブリッドペプチドと共に治療薬を混合及び投与することによって、ハイブリッドペプチドに結合していなくても、標的化治療が可能になる。

ＨＮ１８ペプチドの浸透、より具体的には、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８のＣａｌ２７生細胞への浸透を更に調べるため４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５は、バルク溶液から細胞膜へと数秒で透過し、その後、５分以内に視覚的にサイトゾル内に透過し、次の２５分にわたって細胞内へと移動し続ける。未固定の細胞を、４Ｉｐｈｆ－ＨＮ１８－Ｃｙ５と接触させた（図１３）。

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Claims (32)

1. 腫瘍細胞を標的とする単離ペプチドであって、ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号１）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）のアミノ酸配列からなる、ペプチド。
2. 配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
3. 配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
4. アミノ末端アミノ酸に結合した親油性物質を更に含む、請求項１に記載のペプチド。
5. 前記親油性物質が、フルオレニルメチルオキシカルボニル、４－パラ－ヨード－ベンジル、４－パラ－ヨード－ベンゾイル、及び／又は３－ヨードチロシンを含む、請求項４に記載のペプチド。
6. 前記親油性物質が、フルオレニルメチルオキシカルボニル及び４－パラ－ヨード－ベンジルを含む、請求項５に記載のペプチド。
7. 前記ペプチドが、前記腫瘍細胞によって内在化される、請求項１に記載のペプチド。
8. ａ）抗癌剤と、ｂ）腫瘍細胞を標的とするペプチドとを含む医薬組成物であって、前記ペプチドが、ＴＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号１）、ＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号７）、ＹＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号８）、又はＦＬＰＮＳＮＨＩＫＱＧＬ（配列番号９）のアミノ酸配列からなる、医薬組成物。
9. 前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記ペプチドが配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の医薬組成物。
11. 前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
12. 前記抗癌剤が細胞毒性剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
13. 前記抗癌剤がアポトーシス剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
14. 前記抗癌剤がＤＮＡ損傷剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
15. 前記抗癌剤が植物アルカロイドである、請求項８に記載の医薬組成物。
16. 前記抗癌剤が、放射線増感剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
17. 前記抗癌剤が、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、ドセタキセル、セツキシマブ、タモキシフェン、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン又はメトトレキサートを含む、請求項８に記載の医薬組成物。
18. 前記抗癌剤が、前記ペプチドに共有結合している、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記抗癌剤が、リジン残基において前記ペプチドに共有結合している、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 前記ペプチドが、アミノ末端アミノ酸に結合した親油性物質を更に含む、請求項８に記載の医薬組成物。
21. 前記親油性物質が、フルオレニルメチルオキシカルボニル、４－パラ－ヨード－ベンジル、４－パラ－ヨード－ベンゾイル、及び／又は３－ヨードチロシンを含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 前記親油性物質が、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ｆ）及び４－パラ－ヨード－ベンジル（４Ｉｐｈ）を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記ペプチドが、前記腫瘍細胞によって内在化される、請求項８に記載の医薬組成物。
24. 検出可能なコンジュゲートを更に含む、請求項８に記載の医薬組成物。
25. 前記ペプチドが配列番号１又は配列番号７であり、前記親油性物質が４Ｉｐｈ及びｆであり、前記検出可能なコンジュゲートが近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素である、請求項２０または２４に記載の医薬組成物。
26. 前記ペプチドが配列番号１又は配列番号７であり、前記親油性物質が４Ｉｐｈ及びｆであり、前記検出可能なコンジュゲートがＩｎｆｒａｒｅｄ（赤外） ８００（ＩＲ８００）である、請求項２０または２４に記載の医薬組成物。
27. 請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項８～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、癌細胞を検出するための造影剤。
28. 癌を治療するための薬剤の製造における請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項８～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
29. 請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項８～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む癌細胞の検出剤であって、ここで前記ペプチドが検出可能なコンジュゲートにコンジュゲーションする、癌細胞の検出剤。
30. 前記検出可能なコンジュゲートが、シアニン－５（Ｃｙ５）、ＩＲ８００、又はＮＩＲＦ色素を含む、請求項２９に記載の検出剤。
31. 前記ペプチドが配列番号１又は配列番号７であり、前記親油性物質が４Ｉｐｈ及びｆであり、前記検出可能なコンジュゲートがＮＩＲＦ色素である、請求項２９に記載の検出剤。
32. 前記ペプチドが配列番号１又は配列番号７であり、前記親油性物質が４Ｉｐｈ及びｆであり、前記検出可能なコンジュゲートがＩＲ８００である、請求項２９に記載の検出剤。

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