一体型マイクロ流体および検体検出デバイスが開示される。一体型マイクロ流体および検体検出デバイスならびに関連システムを使用するための例示的な方法もまた本明細書に提供される。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら異なり得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「1つの電極」を参照することは、複数のそのような電極を含み、「そのウェル」を参照することは、1つ以上のウェルおよび当業者に既知のそれらの同等物を参照することなどを含む。
本明細書で言及される全ての公開物は、公開物が引用されるものとの関連で方法および/または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、本開示と参照により組み込まれる公開物との間に矛盾がある範囲で制御される。
本開示の実施形態は、試料中の検体を分析するための方法、システム、およびデバイスに関する。ある特定の実施形態では、試料は、生物学的試料であり得る。
定義
本開示の実施形態を説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら異なり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
本明細書で使用される場合、「備える(comprise)」、「含む(include)」、「有すること(having)」、「有する(has)」、「できる(can)」、「含有する(contain)」、およびそれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しない無制限の移行句、用語、または単語であることが意図されている。単数形「a」、「and」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示された実施形態または要素「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲の列挙に関して、同じ程度の精度でそれらの間に介在する各数が明示的に企図される。例えば、6~9の範囲については、6および9に加えて7および8の数が企図され、6.0~7.0の範囲については、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、および7.0の数が明示的に企図される。
本明細書で互換的に使用される「親和性」および「結合親和性」は、結合メンバーの検体への結合の傾向または強度を指す。例えば、結合親和性は、平衡解離定数(KD)、解離速度(kd)、または会合速度(ka)によって表すことができる。
本明細書で使用される場合、「類似体」は、対象となる分子と同様の構造を有する分子(例えば、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド類似体、糖リン酸類似体、検体類似体等)を指す。検体類似体は、検体と構造的に同様であるが結合メンバーが異なる親和性を有する分子である。
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、とりわけ高親和性および特異性を有する小分子、タンパク質、およびペプチドを含む予め選択された標的に結合し得るオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子を指す。アプタマーは、らせんおよび一本鎖ループを形成する傾向により、様々な形状をとり得る。オリゴヌクレオチドまたは核酸アプタマーは、一本鎖DNAまたはRNA(ssDNAまたはssRNA)分子であり得る。ペプチドアプタマーは、両末端でタンパク質骨格に付着した短い可変ペプチドドメインを含み得る。
「ビーズ」および「粒子」は、本明細書において互換的に使用され、実質的に球状の固体支持体を指す。
「成分」、「複数の成分」、または「少なくとも1つの成分」は、一般に、捕捉抗体、検出試薬または接合体、較正物質、対照、感度パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬/溶液、基質(例えば、溶液として)、停止溶液などを指し、これらは、本明細書に記載される方法および当該技術分野において既知の他の方法に従って、患者の尿、血清、全血、組織吸引物、または血漿試料などの試験試料のアッセイのためのキットに含まれ得る。いくつかの成分は、アッセイで使用するために溶液中に存在することができるか、または再構成のために凍結乾燥され得る。
本明細書で互換的に使用される「デジタルマイクロ流体(DMF)」、「デジタルマイクロ流体モジュール(DMFモジュール)」、または「デジタルマイクロ流体デバイス(DMFデバイス)」は、デジタルまたは液滴ベースのマイクロ流体技法を利用して、液滴の形態での個別かつ少量の液体の操作を提供する、モジュールまたはデバイスを指す。デジタルマイクロ流体は、エマルジョン科学の原理を使用して、チャネル内への流体-流体分散を作る(主に油中水エマルジョン)。それは、単分散液滴/泡の生成または非常に低い多分散性を可能にする。デジタルマイクロ流体は、再構成可能なネットワーク内の不連続な流体液滴の顕微操作に基づく。複雑な命令は、液滴形成、転位、分割、および融合の基本動作を組み合わせることによってプログラムされ得る。
デジタルマイクロ流体は、バイナリの電気シグナルによって操作され得る個別体積の流体上で動作する。個別の単位体積の液滴を使用することによって、マイクロ流体動作は、一連の繰り返される基本動作、すなわち1単位の流体を1単位の距離にわたって移動させることとして定義され得る。液滴は、液体の表面張力特性を用いて形成され得る。液滴の作動は、液滴が位置している底部面面の下に配置された電極によって発生する静電力の存在に基づく。異なる種類の静電力を使用して、液滴の形状および運動を制御することができる。前述の静電力を発生させるために使用され得る1つの技法は、誘電泳動に基づき、これは液滴と周囲の媒体との間の誘電率の差に依存し、高周波交流電界を利用することができる。前述の静電力を発生させるために使用され得る他の技法は、エレクトロウェッティングに基づき、これは表面上に存在する液滴とその表面との間の表面張力の、表面に印加される電界への依存性に依存する。
「ドラッグタグ」は、移動度改変因子を指す。ドラッグタグは、大きく、水溶性、かつ完全に単分散であるように設計された、遺伝子操作された高度に反復性のポリペプチド(「タンパク質ポリマー」)であり得る。正電荷アルギニンは、規則的な間隔でアミノ酸配列に意図的に導入されて、ドラッグタグの長さを増加させることなく流体力学的抗力を増加させ得る。ドラッグタグは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2012/0141997号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「酵素的開裂可能配列」は、酵素によって開裂され得る任意の核酸配列を指す。例えば、酵素は、プロテアーゼまたはエンドヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素とも呼ばれる)であり得る。制限エンドヌクレアーゼは、所定のヌクレオチド間の特異的DNA開裂部位でDNA分子を認識および開裂することが可能である。例えばFoklなどのいくつかのエンドヌクレアーゼは、この位置に存在するヌクレオチドにかかわらず、ある特定の位置でDNAを非特異的に開裂する開裂ドメインを含む。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼの特異的DNA開裂部位およびDNA認識部位は、同一である。
「球状タンパク質」は、略球状の形状を有する水溶性タンパク質を指す。球状タンパク質の例としては、オボアルブミン、βグロブリン、C反応性タンパク質、フィブリン、ヘモグロビン、IgG、IgM、およびトロンビンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で互換的に使用される「標識」または「検出可能な標識」は、特異的結合メンバーと検体との間の反応を検出可能にするために特異的結合メンバーまたは検体に付着した部分を指し、そのように標識された特異的結合メンバーまたは検体は、「検出可能に標識された」と称される。標識は、視覚的または機器的手段によって検出可能であるシグナルを発生させることができる。様々な標識は、(i)開裂可能なリンカーによって特異的結合メンバーまたは検体に付着したタグ、または(ii)クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、放射性化合物などのシグナル発生物質を含む。標識の代表例としては、光を発生させる部分、例えばアクリジニウム化合物、および蛍光を発生させる部分、例えばフルオレセインが挙げられる。他の標識は、本明細書に記載されている。これに関して、その部分それ自体は、検出可能ではない場合があるが、さらに別の部分との反応時に検出可能になる可能性がある。「検出可能に標識された」という用語の使用は、そのような標識を包含することを意図している。
「微粒子(複数可)」および「マイクロビーズ(複数可)」は、本明細書では互換的に使用され、例えば、検出モジュールのウェルアレイ内など、ウェルアレイ内で占有または沈降することができるマイクロビーズまたは微粒子を指す。微粒子およびマイクロビーズは、対象となる検体結合する少なくとも1つの特異的結合メンバー、および少なくとも1つの検出可能な標識を含み得る。あるいは、微粒子およびマイクロビーズは、検体に結合する第1の特異的結合メンバー、および同様に検体に結合し、かつ少なくとも1つの検出可能な標識を含む第2の特異的結合メンバーを含み得る。
「核酸塩基」または「塩基」は、ポリマーを生成するための核酸もしくはポリヌクレオチド技術またはペプチド核酸技術の分野で一般的に既知の天然に存在するものおよび合成複素環式部分を意味する。好適な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2-チオ-5-プロピニル-ウラシル、5-メチルシトシン、偽イソシトシン、2-チオウラシルおよび2-チオチミン、2-アミノプリン、N9-(2-アミノ-6-クロロプリン)、N9-(2,6-ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)、N9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)、およびN8-(7-デアザ-8-アザ-アデニン)が挙げられる。核酸塩基は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびヌクレオシド/チド類似体を形成するために他の部分に連結し得る。
「ヌクレオシド」は、プリン、デアザプリン、またはピリミジン核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、7-デアザアデニン、7-デアザグアノシンからなる化合物を指し、1′位におけるペントース糖のアノマー炭素、例えばリボース、2′-デオキシリボース、または2′3′-ジ-デオキシリボースに連結している。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、モノ-、ジ-、またはトリリン酸エステルを指し、ここで、最も一般的なエステル化部位は、ペントースのC-5位に付着したヒドロキシル基である。
「核酸塩基ポリマー」または「核酸塩基オリゴマー」は、連結によって接続されてオリゴマーを形成する2つ以上の核酸塩基を指す。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーとしては、ポリおよびオリゴヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNAポリマーおよびオリゴマー)、ポリおよびオリゴヌクレオチド類似体、ならびにポリアミドまたはペプチド核酸などのポリおよびオリゴヌクレオチド模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、数個の核酸塩基から数百個の核酸塩基または数千個の核酸塩基までサイズが異なり得る。核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、約2~100個の核酸塩基または約8000~10000個の核酸塩基を含み得る。例えば、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーは、少なくとも約2個の核酸塩基、少なくとも約5個の核酸塩基、少なくとも約10個の核酸塩基、少なくとも約20個の核酸塩基、少なくとも約30個の核酸塩基、少なくとも約40個の核酸塩基、少なくとも約50個の核酸塩基、少なくとも約60個の核酸塩基、少なくとも約70個の核酸塩基、少なくとも約80個の核酸塩基、少なくとも約90個の核酸塩基、少なくとも約100個の核酸塩基、少なくとも約200個の核酸塩基、少なくとも約300個の核酸塩基、少なくとも約400個の核酸塩基、少なくとも約500個の核酸塩基、少なくとも約600個の核酸塩基、少なくとも約700個の核酸塩基、少なくとも約800個の核酸塩基、少なくとも約900個の核酸塩基、少なくとも約1000個の核酸塩基、少なくとも約2000個の核酸塩基、少なくとも約3000個の核酸塩基、少なくとも約4000個の核酸塩基、少なくとも約5000個の核酸塩基、少なくとも約6000個の核酸塩基、少なくとも約7000個の核酸塩基、少なくとも約8000個の核酸塩基、少なくとも約9000個の核酸塩基、または少なくとも約10000個の核酸塩基を有し得る。
「ポリマーブラシ」は、一端で表面に付着したポリマーの層を指す。ポリマーは互いに近接しており、それ自体の環境を形成する層またはコーティングを形成する。ブラシは、ダングリング鎖が溶媒に浸されているときは溶媒状態、またはダングリング鎖が使用可能な空間を完全に満たすときは溶融状態のいずれかであり得る。さらに、ポリマー鎖自体が静電荷を帯びている場合、別の種類の高分子電解質ブラシがある。ブラシは、高密度のグラフト鎖を特徴とし得る。次いで限定された空間は、鎖の強力な延長および系の異常な特性をもたらす。ブラシを使用して、コロイドを安定させ、表面間の摩擦を低減し、人工関節に潤滑を提供することができる。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、核酸塩基が糖リン酸連結(糖-リン酸骨格)によって接続されている、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを指す。例示的なポリおよびオリゴヌクレオチドとしては、2′-デオキシリボヌクレオチド(DNA)のポリマーおよびリボヌクレオチド(RNA)のポリマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチド、完全に2′-デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから構成され得る。核酸という用語は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドという用語を包含し、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを含む。
「ポリヌクレオチド類似体」または「オリゴヌクレオチド類似体」は、核酸塩基が1つ以上の糖リン酸類似体を含む糖リン酸骨格によって接続されている、核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーを指す。典型的な糖リン酸類似体としては、糖アルキルホスホネート、糖ホスホルアミダイト、糖アルキル-または置換アルキルホスホトリエステル、糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖リン酸、および糖が2′-デオキシリボースまたはリボース以外である糖リン酸類似体、米国特許第6,013,785号および米国特許第5,696,253号に記載されているものなどの正電荷糖-グアニジル相互連結を有する核酸塩基ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「受容体」は、内因性化学シグナルを認識し応答するタンパク質分子を指す。そのような内因性化学シグナルが受容体に結合すると、それらは何らかの形態の細胞/組織応答を引き起こす。受容体の例としては、神経受容体、ホルモン受容体、栄養受容体、および細胞表面受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「スペーサ」は、特異的結合メンバーからの開裂可能な基を延長させるか、または結合メンバーと支持体との間に連結を提供するか、またはその光開裂可能部分から標識/タグを延長させる、化学部分を指す。いくつかの実施形態では、特異的結合メンバーから配列を最適に遠ざけるために、ポリペプチドまたはヌクレオチドベースのタグまたは標識のN末端またはC末端に、1つ以上のスペーサが含まれ得る。スペーサとしては、6-アミノカプロン酸、6-アミノヘキサン酸;1,3-ジアミノプロパン;1,3-ジアミノエタン;1~5個のアミノ酸のポリエチレングリコール(PEG)ポリマー基および短いアミノ酸配列、例えばポリグリシン配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で互換的に使用される「特異的結合パートナー」または「特異的結合メンバー」は、他の分子の実質的により少ない認識と比較して、他の分子を特異的に認識する2つの異なる分子のうちの1つを指す。2つの異なる分子のうちの1つは、表面上または空洞内に、他の分子の特定の空間的および極性の構成と特異的に結合し、それによりその構成と相補的であると定義される領域を有する。分子は、特異的結合対のメンバーであり得る。例えば、特異的結合メンバーとしては、タンパク質、例えば受容体、酵素、抗体、およびアプタマー、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「タグ」または「タグ分子」の両方は、試料中の検体のレベルの指標を提供するために使用される分子(例えば、標的検体から解離した第2の結合メンバーから開裂される)を指す。これらの用語は、単一のタグ分子または複数の同じタグ分子を指す。同様に、「タグ」は、特に明記しない限り、1つまたは1つ以上のタグを指す。
本明細書で使用される場合、「トレーサ」は、タグまたは標識に接合した検体または検体フラグメントを指し、タグまたは標識に接合した検体は、その検体に特異的な抗体上の部位について検体と効果的に競合し得る。例えば、トレーサは、検体または検体の類似体、例えばシクロスポリンまたはその類似体ISA247、ビタミンDおよびその類似体、性ホルモンおよびそれらの類似体などであり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含む本文書が優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書で言及される全ての公開物、特許、および他の参考文献は、公開物が関連で引用される方法および/または材料を開示および記載するために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定的であることを意図しない。
検体分析のための方法
検体分析のための方法が本明細書に提供される。方法は、単一分子計数を伴い得る。ある特定の実施形態では、検体分析のための方法は、試料中に存在する検体を評価することを伴い得る。ある特定の実施形態では、評価は、試料中の検体の存在および/または濃度を決定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、方法はまた、試料中に存在する複数の異なる検体の存在および/または濃度を決定するためにも使用され得る。
液滴中の対象となる検体(対象となる検体は、試験試料または生物学的試料由来である)を検出するための方法が、本明細書に提供される。方法は、対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、対象となる検体に結合する特異的な結合メンバーを含む少なくとも1つの固体支持体(例えば磁性固体支持体(ビーズなど)など)を含む第2の液滴を提供することと、第1の液滴(対象となる検体を含む)を第2の液滴(少なくとも1つの固体支持体を含む)と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることと(アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する)、混合物の一部分をウェルアレイに移動させる前、後、または前もしくは後の両方で、検出可能な標識を混合物に付加することと、ウェル内の対象となる検体を検出することとを含む。ある特定の実施形態では、「第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用すること」は、少なくとも第1および第2の液滴(および任意に、追加の液滴)を操作(融合または混合など)して混合物にする力を提供するか、または及ぼす非機械的力(すなわち、例えばポンプおよび/または弁を使用せずに生じるエネルギー)の使用を指す。本明細書に記載される方法で使用され得る非機械的力の例としては、電気作動力(液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、もしくは吸引など)、および/または音響力(表面弾性波(もしくは「SAW」)など)が挙げられる。ある特定の実施形態では、発生する電気作動力は、交流である。例えば、交流は、10V、15V、20V、25V、30V、35V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有することができる。例えば、そのような交流は、10V以上、15V以上、20V以上、25V以上、30V以上、または35V以上のrms電圧を有することができる。あるいは、交流は、無線周波数範囲内の周波数を有することができる。
ある特定の実施形態では、磁性固体支持体が使用される場合、混合物の少なくとも一部分に対して、電気作動力および磁場が反対方向から印加および印加され得る。ある特定の他の実施形態では、混合物を前後に移動させること、円形パターンで移動させること、またはそれを2つ以上の副混合物に分割し、次いで副混合物を融合することによって、混合物が混合される。ある特定の他の実施形態では、電気作動力は、一連または複数の電極(すなわち、少なくとも2個以上、少なくとも3個以上、少なくとも4個以上、少なくとも5個以上、少なくとも6個以上、少なくとも7個以上、少なくとも8個以上、少なくとも9個以上、少なくとも10個以上、少なくとも11個以上、少なくとも12個以上、少なくとも13個以上、少なくとも14個以上、少なくとも15個以上など)を使用して発生し得、混合物をウェルアレイに移動させて、ウェル(少なくとも1つ以上の固体支持体が装填される)を密封する。
ある特定の実施形態では、混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることで、少なくとも1つの固体支持体がウェルアレイに装填(充填および/または配置)される。ある特定の実施形態では、混合物の、したがって少なくとも1つの固体支持体の、アレイの1つ以上のウェルへの移動を容易にするために、磁場が使用される。ある特定の実施形態では、少なくとも1つの固体支持体をウェルに装填した後、ウェルに装填されていない任意の固体支持体は、当技術分野において既知の日常的な技法を使用して除去され得る。例えば、そのような除去は、一連の電極を用いて電気作動力(本明細書において前述されるものなど)を発生させて、流体液滴(分極性流体液滴など)をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離(その長さは重要ではない)まで移動させることを伴い得る。ある特定の実施形態では、水性洗浄液体を使用して、対象となる検体に結合していない固体支持体を除去することができる。そのような実施形態では、除去は、一連または複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、水性洗浄(wash)(または洗浄(washing))液滴(第3の液滴)をウェルアレイにわたって移動させることを伴う。前述の洗浄液に使用される水性液体の量および種類は、重要ではない。
ある特定の実施形態では、方法における混合物は、水性液体である。他の実施形態では、混合物は、不混和性液体である。他の実施形態では、液滴は、疎水性液滴である。他の実施形態では、液滴は、親水性液滴である。ある特定の実施形態では、方法で使用されるウェルアレイは、疎水性表面を有する。他の実施形態では、ウェルアレイは、親水性表面を有する。
ある特定の実施形態では、方法で使用される第1の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、方法で使用される第2の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、方法で使用される第1および第2の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、混合物は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、第1の液滴、第2の液滴、および混合物のうちの1つ以上は、分極性液体である。
ある特定の実施形態では、少なくとも1つの固体支持体は、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させる前に混合物に付加される。ある特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、対象となる検体の少なくとも一部分を移動させた後に混合物に付加される。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む。ある特定の実施形態では、結合メンバーは、受容体、アプタマー、または抗体である。ある特定の実施形態では、方法は、混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイ上に位置付けることをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、マイクロ流体デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、デジタルマイクロ流体デバイス(DMF)を使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイス(SAW)を使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、一体型DMFおよび検体検出デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、一体型表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイスおよび検体検出デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ロボティクスベースのアッセイ処理ユニットを使用して行われる。
液滴中の対象となる検体(対象となる検体は、試験試料または生物学的試料由来である)を検出するための方法が、本明細書に提供される。方法は、対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、対象となる検体に結合する特異的な結合メンバーを含む少なくとも1つの検出可能な標識を含む第2の液滴を提供することと、第1の液滴(対象となる検体を含む)を第2の液滴(少なくとも1つの固体支持体を含む)と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物(すなわち、検体/検出可能な標識特異的結合メンバー複合体)を作ることと、混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることと(アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する)、ウェル内の対象となる検体を検出することとを含む。ある特定の実施形態では、「第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用すること」は、少なくとも第1および第2の液滴(および任意に、追加の液滴)を操作(融合または混合など)して混合物にする力を提供するか、または及ぼす非機械的力(すなわち、例えばポンプおよび/または弁を使用せずに生じるエネルギー)の使用を指す。本明細書に記載される方法で使用され得る非機械的力の例としては、電気作動力(液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、もしくは吸引など)、および/または音響力(表面弾性波(もしくは「SAW」)など)が挙げられる。ある特定の実施形態では、発生する電気作動力は、交流である。例えば、交流は、10V、15V、20V、25V、30V、35V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有することができる。例えば、そのような交流は、10V以上、15V以上、20V以上、25V以上、30V以上、または35V以上のrms電圧を有することができる。あるいは、交流は、無線周波数範囲内の周波数を有することができる。
ある特定の実施形態では、混合物を前後に移動させること、円形パターンで移動させること、またはそれを2つ以上の副混合物に分割し、次いで副混合物を融合することによって、混合物が混合される。ある特定の他の実施形態では、電気作動力は、一連のまたは複数の電極(すなわち、少なくとも2個以上、少なくとも3個以上、少なくとも4個以上、少なくとも5個以上、少なくとも6個以上、少なくとも7個以上、少なくとも8個以上、少なくとも9個以上、少なくとも10個以上、少なくとも11個以上、少なくとも12個以上、少なくとも13個以上、少なくとも14個以上、少なくとも15個以上など)を使用して発生し得、混合物をウェルアレイに移動させて、ウェル(少なくとも1つ以上の固体支持体が装填される)を密封する。
ある特定の実施形態では、混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることで、検体/検出可能な標識特異的結合メンバー複合体がウェルアレイに装填(充填および/または配置)される。ある特定の実施形態では、混合物の、したがって少なくとも1つの検体/検出可能な標識特異的結合メンバー複合体の、アレイの1つ以上のウェルへの移動を容易にするために、磁場が使用される。例えば、そのような除去は、一連の電極を用いて電気作動力(本明細書において前述されるものなど)を発生させて、流体液滴(分極性流体液滴など)をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離(その長さは重要ではない)まで移動させることを伴い得る。ある特定の実施形態では、水性洗浄液を使用して、検体に結合していない任意の検出可能な標識特異的結合メンバーを除去することができる。そのような実施形態では、除去は、一連または複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、水性洗浄(wash)(または洗浄(washing))液滴(第3の液滴)をウェルアレイにわたって移動させることを伴う。前述の洗浄液に使用される水性液体の量および種類は、重要ではない。
ある特定の実施形態では、方法における混合物は、水性液体である。他の実施形態では、混合物は、不混和性液体である。他の実施形態では、液滴は、疎水性液滴である。他の実施形態では、液滴は、親水性液滴である。ある特定の実施形態では、方法で使用されるウェルアレイは、疎水性表面を有する。他の実施形態では、ウェルアレイは、親水性表面を有する。
ある特定の実施形態では、方法で使用される第1の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、方法で使用される第2の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、方法で使用される第1および第2の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、混合物は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、第1の液滴、第2の液滴、および混合物のうちの1つ以上は、分極性液体である。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、少なくとも1つの固体支持体に結合している。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む。ある特定の実施形態では、結合メンバーは、受容体、アプタマー、または抗体である。ある特定の実施形態では、方法は、混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイ上に位置付けることをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、マイクロ流体デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、デジタルマイクロ流体デバイス(DMF)を使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイス(SAW)を使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、一体型DMFおよび検体検出デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、一体型表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイスおよび検体検出デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ロボティクスベースのアッセイ処理ユニットを使用して行われる。
液滴中の対象となる検体(対象となる検体は、試験試料または生物学的試料由来である)を測定するための方法が、本明細書に提供される。方法は、対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、対象となる検体に結合する特異的な結合メンバーを含む少なくとも1つの固体支持体(例えば磁性固体支持体(ビーズなど)など)を含む第2の液滴を提供することと、第1の液滴(対象となる検体を含む)を第2の液滴(少なくとも1つの固体支持体を含む)と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることと(アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する)、混合物の一部分をウェルアレイに移動させる前、後、または前もしくは後の両方で、検出可能な標識を混合物に付加することと、ウェル内の対象となる検体を測定することとを含む。ある特定の実施形態では、「第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用すること」は、少なくとも第1および第2の液滴(および任意に、追加の液滴)を操作(融合または混合など)して混合物にする力を提供するか、または及ぼす非機械的力(すなわち、例えばポンプおよび/または弁を使用せずに生じるエネルギー)の使用を指す。本明細書に記載される方法で使用され得る非機械的力の例としては、電気作動力(液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、もしくは吸引など)、および/または音響力(表面弾性波(もしくは「SAW」)など)が挙げられる。ある特定の実施形態では、発生する電気作動力は、交流である。例えば、交流は、10V、15V、20V、25V、30V、35V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有することができる。例えば、そのような交流は、10V以上、15V以上、20V以上、25V以上、30V以上、または35V以上のrms電圧を有することができる。あるいは、交流は、無線周波数範囲内の周波数を有することができる。
ある特定の実施形態では、磁性固体支持体が使用される場合、混合物の少なくとも一部分に対して、電気作動力および磁場が反対方向から印加および印加され得る。ある特定の他の実施形態では、混合物を前後に移動させること、円形パターンで移動させること、またはそれを2つ以上の副混合物に分割し、次いで副混合物を融合することによって、混合物が混合される。ある特定の他の実施形態では、電気作動力は、一連または複数の電極(すなわち、少なくとも2個以上、少なくとも3個以上、少なくとも4個以上、少なくとも5個以上、少なくとも6個以上、少なくとも7個以上、少なくとも8個以上、少なくとも9個以上、少なくとも10個以上、少なくとも11個以上、少なくとも12個以上、少なくとも13個以上、少なくとも14個以上、少なくとも15個以上など)を使用して発生し得、混合物をウェルアレイに移動させて、ウェル(少なくとも1つ以上の固体支持体が装填される)を密封する。
ある特定の実施形態では、混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることで、少なくとも1つの固体支持体がウェルアレイに装填(充填および/または配置)される。ある特定の実施形態では、混合物の、したがって少なくとも1つの固体支持体の、アレイの1つ以上のウェルへの移動を容易にするために、磁場が使用される。ある特定の実施形態では、少なくとも1つの固体支持体をウェルに装填した後、ウェルに装填されていない任意の固体支持体は、当技術分野において既知の日常的な技法を使用して除去され得る。例えば、そのような除去は、一連の電極を用いて電気作動力(本明細書において前述されるものなど)を発生させて、流体液滴(分極性流体液滴など)をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離(その長さは重要ではない)まで移動させることを伴い得る。ある特定の実施形態では、水性洗浄液体を使用して、対象となる検体に結合していない固体支持体を除去することができる。そのような実施形態では、除去は、一連または複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、水性洗浄(wash)(または洗浄(washing))液滴(第3の液滴)をウェルアレイにわたって移動させることを伴う。前述の洗浄液に使用される水性液体の量および種類は、重要ではない。
ある特定の実施形態では、方法における混合物は、水性液体である。他の実施形態では、混合物は、不混和性液体である。他の実施形態では、液滴は、疎水性液滴である。他の実施形態では、液滴は、親水性液滴である。ある特定の実施形態では、方法で使用されるウェルアレイは、疎水性表面を有する。他の実施形態では、ウェルアレイは、親水性表面を有する。
ある特定の実施形態では、方法で使用される第1の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、方法で使用される第2の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、方法で使用される第1および第2の液滴は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、混合物は、分極性液体である。ある特定の実施形態では、第1の液滴、第2の液滴、および混合物のうちの1つ以上は、分極性液体である。
ある特定の実施形態では、少なくとも1つの固体支持体は、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させる前に混合物に付加される。ある特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、対象となる検体の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させた後に混合物に付加される。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む。ある特定の実施形態では、結合メンバーは、受容体、アプタマー、または抗体である。ある特定の実施形態では、方法は、混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイ上に位置付けることをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、マイクロ流体デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、デジタルマイクロ流体デバイス(DMF)を使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイス(SAW)を使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、一体型DMFおよび検体検出デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、一体型表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイスおよび検体検出デバイスを使用して行われる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ロボティクスベースのアッセイ処理ユニットを使用して行われる。
ある特定の実施形態では、測定は最初に、アレイのウェル内の固体支持体の総数(「全固体支持体数」)を決定することを伴う。次に、検出可能な標識を含むアレイのウェル内の固体支持体の数が決定され、例えば、検出可能な標識によって発生するシグナルの強度を決定する(「正」)。検出可能な標識を含まないか、または検出されないウェルアレイ内の固体支持体の数を提供するために、陽性を全固体支持体数から減算する(「負」)。次いで、ウェルのアレイ内の負に対する正の比が決定され、次いで較正曲線と比較され得る。あるいは、以下に示されるように、ポアソン方程式P(x;μ)を使用するデジタル定量化。
P(x;μ)=(e-μ)(μx)/x!
式中、
e:Aは、約2.71828に等しい定数であり、
μ:ix ghdは、指定された領域内で生じる成功数を意味し、
x:は、指定された領域内で生じる、触知できる成功数である。
試料は、対象となる検体を含むか、または含む疑いがある任意の試験試料であり得る。本明細書で使用される場合、「検体」、「標的検体」、「対象となる検体」は互換的に使用され、本明細書に開示される方法およびデバイスにおいて測定される検体を指す。対象となる検体は、以下にさらに記載される。
本明細書で使用される場合、「接触」およびその文法的等価物は、結合メンバーに特異的な対象となる検体が試料中に存在する場合に結合相互作用が生じるように、結合メンバーを試料中の対象となる検体と十分に近接させる任意の種類の組み合わせ作用を指す。接触は、試料を結合メンバーと組み合わせること、結合メンバーを検体に近接して導入することによって標的検体を結合メンバーに曝露することなどを含む、様々な異なる方法で達成され得る。
ある特定の場合、第1の結合メンバーは、固体支持体上に固定化され得る。本明細書で使用される場合、「固定化された」という用語は、第1の結合メンバーと固体支持体の表面との安定した会合を指す。「安定した会合」とは、例えば生理的条件下で、会合の平均半減期が1日以上である、2つの実体間の物理的会合を意味する。ある特定の態様では、2つの実体間の物理的会合は、4℃のPBS中で2日以上、1週間以上、1ヶ月以上(6ヶ月以上、例えば1年以上を含む)平均半減期を有する。ある特定の実施形態によると、安定した会合は、2つの実体間の共有結合、2つの実体間の非共有結合(例えば、イオンもしくは金属結合)、または他の形態の化学的誘引、例えば水素結合、ファンデルワールス力などから生じる。
結合試薬が固定化された表面を有する固体支持体は、平面または非平面配座における任意の便利な表面、例えば、マイクロ流体チップの表面、チャンバの内部表面、ビーズ(本明細書で定義されるような)の表面、または多孔性ビーズの内部および/もしくは外部表面であってもよい。例えば、第1の結合メンバーは、ビーズ、例えば、ラテックス、アガロース、セファロース、ストレプトアビジン、トシル活性化、エポキシ、ポリスチレン、アミノビーズ、アミンビーズ、カルボキシルビーズなどに共有結合または非共有結合され得る。ある特定の実施形態では、ビーズは、粒子、例えば微粒子であり得る。いくつかの実施形態では、微粒子は、約0.1nm~約10ミクロン、約50nm~約5ミクロン、約100nm~約1ミクロン、約0.1nm~約700nm、約500nm~約10ミクロン、約500nm~約5ミクロン、約500nm~約3ミクロン、約100nm~700nm、または約500nm~700nmであってもよい。例えば、微粒子は、約4~6ミクロン、約2~3ミクロン、または約0.5~1.5ミクロンであってもよい。約500nm未満の粒子は、時にナノ粒子と見なされる。したがって、微粒子は任意に、約0.1nm~約500nm、約10nm~約500nm、約50nm~約500nm、約100nm~約500nm、約100nm、150nm、約200nm、約250nm、約300nm、約350nm、約400nm、約450nm、または約500nmのナノ粒子であってもよい。
ある特定の実施形態では、ビーズは、磁気ビーズまたは磁性粒子であり得る。ある特定の実施形態では、ビーズは、磁性ナノビーズ、ナノ粒子、マイクロビーズ、または微粒子であり得る。磁気ビーズ/粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性、または磁性流体であり得る。例示的な強磁性材料としては、Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO、NiO/Feが挙げられる。フェリ磁性材料の例としては、NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(またはFeO.Fe2O3)が挙げられる。ビーズは、磁性であり、かつ1つ以上の非磁性層によって包囲されている、ソリッドコア部分を有することができる。あるいは、磁性部分は、非磁性コアの周囲の層であり得る。第1の結合メンバーが固定化されている固体支持体は、乾燥形態で、または液体中で保存されてもよい。第1の結合メンバーが固定化されている磁気ビーズと試料とを接触させる前または後に、磁気ビーズが磁場に供されてもよい。
接触ステップ後、試料および第1の結合メンバーは、結合メンバーと検体との間の結合相互作用が生じることを可能にするのに十分な期間インキュベートされ得る。さらに、インキュベーションは、特異的結合相互作用を容易にする結合緩衝液中であり得る。第1の結合メンバーおよび/または第2の結合メンバーの結合親和性および/または特異性は、結合緩衝液を変化させることによってアッセイにおいて操作または変更され得る。いくつかの実施形態では、結合親和性および/または特異性は、結合緩衝液を変えることによって増加し得る。いくつかの実施形態では、結合親和性および/または特異性は、結合緩衝液を変えることによって減少し得る。
第1の結合メンバーおよび/または第2の結合メンバーの結合親和性および/または特異性は、以下に記載される開示された方法およびデバイスを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、試料の1つのアリコートは、1組の条件を使用してアッセイされ、異なる組の条件を使用してアッセイされた別の試料のアリコートと比較され、それにより結合親和性および/または特異性に対する条件の影響を決定する。例えば、条件の変化または変更は、試料から標的検体を除去すること、結合について標的検体またはリガンドと競合する分子を添加すること、およびpH、塩濃度、または温度を変化させることのうちの1つ以上であり得る。加えて、またはあるいは、期間は可変であり得、条件の変化は、検出方法を再度行う前にある期間待つことを含み得る。
結合緩衝液は、アルブミン(例えばBSA)、非イオン性界面活性剤(Tween-20、Triton X-100)、および/またはプロテアーゼ阻害剤(例えばPMSF)などの抗原-抗体結合緩衝液に対して標準的な分子を含み得る。ある特定の場合、結合緩衝液は、試料を添加する前または後に、マイクロ流体チップ、チャンバなどに添加され得る。ある特定の場合、第1の結合メンバーは、試料と接触する前に結合緩衝液中に存在してもよい。結合メンバーと検体との間の結合相互作用が生じるための時間の長さは、経験的に決定され得、結合メンバーと検体との間の結合親和性および結合アビディティに依存し得る。ある特定の実施形態では、接触またはインキュベーションは、5秒~1時間、例えば10秒~30分、または1分~15分、または5分~10分、例えば10秒、15秒、30秒、1分、5分、10分、15分、30分、45分、1時間、または2時間の期間であってもよい。結合相互作用のための他の条件、例えば温度、塩濃度もまた経験的に決定され得るか、または製造業者の説明書に基づき得る。例えば、接触は、室温(21℃~28℃、例えば23℃~25℃)、37℃、または4℃で実施され得る。ある特定の実施形態では、試料と第1の結合メンバーとの任意の混合は、接触ステップ中に実施されてもよい。
固定化された第1の結合メンバーと検体との間の複合体形成に続いて、第1の結合メンバーと検体との複合体が、その固体支持体との会合により保持され得る一方で、任意の未結合の検体が試料と一緒に第1の結合メンバーの付近から除去され得る。任意に、固体支持体は、洗浄緩衝液と接触して、固体支持体に非特異的に結合している任意の分子を除去し得る。
第1の接触ステップ、ならびに任意の試料除去および/または任意の洗浄ステップ後、第1の結合メンバーと検体との複合体は、第2の結合メンバーと接触し得、それにより検体が2つの結合メンバーによって結合されているサンドイッチ複合体の形成をもたらす。第2のメンバーと第1の結合メンバー-検体複合体との任意の混合は、第2の接触ステップ中に実施されてもよい。いくつかの実施形態では、表面に対する検体分子の固定化は、表面から検体分子を取り除くことを懸念することなく、溶液から任意の過剰な第2の結合メンバーを除去するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、第2の結合メンバーは、クロマジェン、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、放射性化合物などの1つ以上のシグナル発生物質を含む検出可能な標識を含み得る。
上述のように、第の接触ステップは、検体と第2の結合メンバーとの間の結合相互作用のために十分な条件で実施され得る。第2の接触ステップに続いて、任意の未結合の第2の結合メンバーが除去され得、任意の洗浄ステップが続く。任意の未結合の第2の結合メンバーは、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、吸引、またはSAWなどの好適な手段によって、第1の結合メンバー-検体-第2の結合メンバーの複合体から分離され得る。第1の結合メンバー-検体-第2の結合メンバーの複合体の付近から任意の未結合の第2の結合メンバーを除去すると、第1の結合メンバー-検体-第2の結合メンバーの複合体中に存在する、第2の結合メンバーに付着した検出可能な標識は、好適な手段によって分離されてもよく、または当技術分野において既知の技法を使用して検出されてもよい。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、放射性化合物などの1つ以上のシグナル発生物質を含む検出可能な標識を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、検出可能な標識がタグを含む場合、タグは、未結合の試薬の除去後に残る複合体から開裂または解離され得る。例えば、タグは、(本明細書に記載される「開裂可能なリンカー」開裂可能なリンカーを介して第2の結合メンバーに付着し得る。第1の結合メンバー-検体-第2の結合メンバーの複合体は、開裂可能なリンカーの開裂を媒介する開裂剤に曝露されてもよい。
本明細書に述べられるように、タグは、核酸を含んでもよい。ある特定の実施形態では、検体の定量化は、タグ中に存在する核酸配列の少なくとも一部分の同一性を決定することによって、タグの同一性を決定することを含まない。例えば、計数ステップは、タグの配列を決定することを含まなくてもよい。他の実施形態では、タグは、配列決定されなくてもよいが、タグの同一性は、そのサイズ、配座、電荷、電荷量により、タグに関連する識別可能なシグナルに基づき1つのタグが別のタグと区別され得る程度に決定され得る。タグの同定は、試料中の複数の異なる検体、例えば試料中の2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の異なる検体の同時分析を伴う方法において有用であり得る。
ある特定の実施形態では、単一試料中の複数の検体の同時分析は、複数の異なる第1および第2の結合メンバーを使用することによって行われ得、第1および第2の結合メンバーの対は、試料中の単一の検体に特異的である。これらの実施形態では、単一の検体に特異的な第1および第2の結合メンバーの第1の対の第2の結合メンバーに関連する検出可能な標識は、異なる検体に特異的な第1および第2の結合メンバーの第2の対の第2の結合メンバーに関連する検出可能な標識とは区別可能であり得る。上述のように、第1の検出可能な標識は、シグナル発生物質の相違などに基づき、第2の検出可能な標識から区別可能であり得る。
いくつかの実施形態では、実質的に正確に決定され得る流体試料中の検体の濃度は、約5000fM(フェムトモル)未満、約3000fM、約2000fM未満、約1000fM未満、約500fM未満、約300fM未満、約200fM未満、約100fM未満、約50fM未満、約25fM未満、約10fM未満、約5fM未満、未満約2fM未満、約1fM未満、約500aM未満(アトモル)、約100aM未満、約10aM未満、約5aM未満、約1aM未満、約0.1aM未満、約500zM(ゼプトモル)未満、約100zM未満、約10zM未満、約5zM未満、約1zM未満、約0.1zM未満、またはそれ以下である。
場合によっては、検出限界(例えば、溶液中で決定され得る検体の最低濃度)は、約100fM、約50fM、約25fM、約10fM、約5fM、約2fM、約1fM、約500aM(アトモル)、約100aM、約50aM、約10aM、約5aM、約1aM、約0.1aM、約500zM(ゼプトモル)、約100zM、50zM、約10zM、約5zM、約1zM、約0.1zM、またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、実質的に正確に決定され得る流体試料中の検体の濃度は、約5000fM~約0.1fM、約3000fM~約0.1fM、約1000fM~約0.1fM、約1000fM~約0.1zM、約100fM~約1zM、約100aM~約0.1zM、またはそれ以下である。
検出の上限(例えば、溶液中で決定され得る検体の上限濃度)は、少なくとも約100fM、少なくとも約1000fM、少なくとも約10pM(ピコモル)、少なくとも約100pM、少なくとも約100pM、少なくとも約10nM(ナノモル)、少なくとも約100nM、少なくとも約10μM、少なくとも約100μM、少なくとも約1000μM、少なくとも約10mM、少なくとも約100mM、少なくとも約1000mM、またはそれ以上である。
場合によっては、試料中の検体の存在および/または濃度は、通常約1時間未満、例えば45分、30分、15分、10分、5分、1分、または30秒で迅速に検出され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法の少なくともいくつかのステップは、本明細書に記載されるデバイスなどのデジタル一体型マイクロ流体および検体検出デバイス上で実施され得る。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、検体検出デバイスと併せてデジタル一体型マイクロ流体デバイスを使用して実施される。例えば、デジタルマイクロ流体デバイスおよび検体検出デバイスは、別々のデバイスであり得、検出可能な標識を含む液滴は、マイクロ流体デバイス中で生成され、検体検出デバイスに輸送され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、以下に記載されるデバイスなど、デジタルマイクロ流体モジュールが検体検出デバイスと一体化されたデバイスを使用して実施される。ある特定の実施形態では、デジタル一体型マイクロ流体モジュールおよび検体検出デバイスは、可逆的に一体化され得る。例えば、2つのモジュールを物理的に組み合わせて一体型デバイスを形成し、そのデバイスは次いで個々のモジュールに分離され得る。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、内蔵検体検出デバイスを備えたマイクロ流体モジュールを含む使い捨てカートリッジを使用して実施される。本明細書に提供される方法を行うために使用されるデバイスの例示的な実施形態は、次のセクションでさらに説明される。
本方法の例示的な実施形態は、対象となる検体に結合し、かつ固体支持体(例えば磁性粒子またはビーズなど)上に固定化され得る第1の結合メンバーを含む液滴と、対象となる検体を含む試料液滴を融合することを含む。単一の融合した液滴は、対象となる検体への第1の結合メンバーの結合を可能にするのに十分な期間インキュベートされ得る。任意に、試料と第1の結合メンバーとの混合を容易にするために、単一の液滴が撹拌され得る。混合は、単一の液滴を前後に移動させること、単一の液滴を複数の電極上で動き回らせること、液滴を分割して次いで融合すること、またはSAWを使用することなどによって達成され得る。次に、単一の液滴は磁力に供されて、ビーズをデバイス内のある位置に保持し得、一方で液滴は、離れて移動し、第2の結合メンバーを含む液滴と交換され得、その第2の結合メンバーは任意に、検出可能な標識を含むことができる。第2の結合メンバーを添加する前に、磁力を使用してビーズが保持されている位置に洗浄緩衝液の液滴を移動させることによって、任意の洗浄ステップが行われ得る。第2の結合メンバーが第1の結合メンバーに結合した検体と結合するのに十分な期間の後、第2の結合メンバーを含む液滴は離れて移動し得、一方でビーズは、第1の位置に保持されている。ビーズは、洗浄緩衝液の液滴を使用して洗浄され得る。洗浄ステップに続いて、磁力が除去され得、(第1の特異的結合メンバー/検体/第2の特異的結合メンバー-任意の検出可能な標識を含む)標識ビーズを含む液滴は、本明細書に記載されるような検出モジュールに移動する。標識ビーズは、検出モジュール内のウェルアレイ内に沈降される。ビーズは、重力を介して、または電気力もしくは磁力を加えることによって沈降し得る。ウェル内に位置していない任意のビーズを除去するための洗浄ステップに続いて、ウェルは、疎水性液体を使用して密封され得る。上記の実施形態では、任意に、組み合わせた後、液滴は操作され得(例えば、前後への移動、円周方向への移動、振動、分割/融合、SAWへの曝露など)、アッセイ試薬、例えば第1の結合メンバー、第2の結合メンバーなどと試料との混合を容易にする。検出可能な標識が酵素である実施形態では、複合体の移動がウェルアレイに移動する前または後のいずれかに、基質が添加され得る。
一体型マイクロ流体および検体検出デバイスにおける液滴の移動は、電気力(例えば、エレクトロウェッティング、誘電泳動、電極媒介、オプトエレクトロウェッティング、電界媒介、および静電作動)圧力、表面弾性波などを使用して実施され得る。液滴を移動させるために使用される力は、以下のセクションに記載され、かつ本明細書に記載される特定のデバイスについてのデバイスの詳細に基づき決定され得る。
多重化
方法は、多重化アッセイにおいて試料中の1つ以上(または代替的に2つ以上)の標的検体を検出するための1つ以上(または代替的に2つ以上)の特異的結合メンバーを含み得る。1つ以上(または代替的に2つ以上)の特異的結合メンバーの各々は、異なる標的検体に結合し、各特異的結合メンバーは、異なる検出可能な標識で標識されている。例えば、第1の特異的結合メンバーは第1の標的検体に結合し、第2の特異的結合メンバーは第2の標的検体に結合し、第3の特異的結合メンバーは第3の標的検体に結合するなどであり、第1の特異的結合メンバーは検出可能な標識で標識され、第2の特異的結合メンバーは第2の検出可能な標識で標識され、第3の特異的結合メンバーは第3の検出可能な標識で標識されるなどである。例えば、第1、第2、および第3の検出可能な標識は各々、異なる色を有することができる。あるいは、異なる種類の標識が使用され得、例えば、第1の標識は酵素標識であり、第2の標識はクロマジェンであり、第3の標識は化学発光化合物である。
例示的な標的検体
当業者に理解されるように、第1および第2の結合メンバーによって特異的に結合され得る任意の検体は、本開示の方法およびデバイスを使用して検出され、任意に定量化され得る。
いくつかの実施形態では、検体は生体分子であり得る。生体分子の非限定的な例としては、タンパク質、脂質、および炭水化物などの巨大分子が挙げられる。ある特定の場合、検体は、ホルモン、抗体、成長因子、サイトカイン、酵素、受容体(例えば神経、ホルモン、栄養、および細胞表面受容体)またはそれらのリガンド、癌マーカー(例えばPSA、TNF-アルファ)、心筋梗塞のマーカー(例えばトロポニン、クレアチンキナーゼなど)、毒素、薬物(例えば、中毒薬)、代謝剤(例えばビタミンを含む)などであり得る。タンパク質検体の非限定的な実施形態としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質フラグメント、タンパク質複合体、融合タンパク質、組換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などが挙げられる。
ある特定の実施形態では、検体は、翻訳後修飾タンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化タンパク質)であってもよく、第1または第2の結合メンバーは、翻訳後修飾に特異的な抗体であってもよい。修飾タンパク質は、固体支持体上に固定化された第1の結合メンバーに結合してもよく、第1の結合メンバーは、修飾タンパク質に結合するが、非修飾タンパク質には結合しない。他の実施形態では、第1の結合メンバーは、非修飾タンパク質と修飾タンパク質の両方に結合し得、第2の結合メンバーは、翻訳後修飾タンパク質に特異的であり得る。
いくつかの実施形態では、検体は、細胞、例えば循環腫瘍細胞、病原性細菌、ウイルス(レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、糸状ウイルス(エボラ)、肝炎ウイルス(例えばA、B、C、D、およびE)、HPVなどを含む)、胞子などであり得る。
本明細書に提示される方法によって分析され得る検体の非限定的なリストとしては、Aβ42アミロイドベータ-タンパク質、フェチュイン-A、タウ、セクレトグラニンII、プリオンタンパク質、アルファ-シヌクレイン、タウ蛋白質、ニューロフィラメント軽鎖、パーキン、PTEN誘導性推定キナーゼ1、DJ-1、ロイシンリッチリピートキナーゼ2、変異ATP13A2、アポH、セルロプラスミン、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベータ-1アルファ(PGC-1α)、トランスサイレチン、ビタミンD結合タンパク質、アポトーシス促進性キナーゼR(PKR)およびそのリン酸化PKR(pPKR)、CXCL13、IL-12p40、CXCL13、IL-8、Dkk-3(精液)、p14エンドカンフラグメント、血清、ACE2、CD25に対する自己抗体、hTERT、CAI25(MUC 16)、VEGF、sIL-2、オステオポンチン、ヒト精巣上体タンパク質4(HE4)、アルファ-フェトプロテイン、アルブミン、アルブミン尿、微量アルブミン尿、好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン(NGAL)、インターロイキン18(IL-18)、腎臓損傷分子-1(KIM-1)、肝型脂肪酸結合タンパク質(L-FABP)、LMP1、BARF1、IL-8、癌胎児性抗原(CEA)、BRAF、CCNI、EGRF、FGF19、FRS2、GREB1、およびLZTS1、アルファ-アミラーゼ、癌胎児性抗原、CA 125、IL8、チオレドキシン、ベータ-2ミクログロブリンレベル-ウイルスの活性のモニタ、腫瘍壊死因子-アルファ受容体-ウイルスの活性のモニタ、CA15-3、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、T細胞リンパ腫浸潤および転移1(TIAM1)、N-カドヘリン、EC39、アンフィレグリン、dUTPase、分泌型ゲルゾリン(pGSN)、PSA(前立腺特異抗原)、チモシンβ15、インスリン、血漿C-ペプチド、グリコシル化ヘモグロビン(HBA1c)、C反応性タンパク質(CRP)、インターロイキン-6(IL-6)、ARHGDIB(Rho GDP解離阻害剤2)、CFL1(コフィリン-1)、PFN1(プロフィリン-1)、GSTP1(グルタチオンS-トランスフェラーゼP)、S100A11(タンパク質S100-A11)、PRDX6(ペルオキシレドキシン-6)、HSPE1(10kDa熱ショックタンパク質、ミトコンドリア)、LYZ(リゾチームC前駆体)、GPI(グルコース-6-リン酸イソメラーゼ)、HIST2H2AA(ヒストンH2Aタイプ2-A)、GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)、HSPG2(基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体)、LGALS3BP(ガレクチン-3結合タンパク質前駆体)、CTSD(カテプシンD前駆体)、APOE(アポリポタンパク質E前駆体)、IQGAP1(Ras GTPase活性化様タンパク質IQGAP1)、CP(セルロプラスミン前駆体)、およびIGLC2(IGLC1タンパク質)、PCDGF/GP88、EGFR、HER2、MUC4、IGF-IR、p27(kip1)、Akt、HER3、HER4、PTEN、PIK3CA、SHIP、Grb2、Gab2、PDK-1(3-ホスホイノシチド)依存性タンパク質キナーゼ-1)、TSC1、TSC2、mTOR、MIG-6(ERBB受容体フィードバック阻害剤1)、S6K、src、KRAS、MEK分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ1、cMYC、TOPO IIトポイソメラーゼ(DNA)IIアルファ170kDa、FRAP1、NRG1、ESR1、ESR2、PGR、CDKN1B、MAP2K1、NEDD4-1、FOXO3A、PPP1R1B、PXN、ELA2、CTNNB1、AR、EPHB2、KLF6、ANXA7、NKX3-1、PITX2、MKI67、PHLPP、アディポネクチン(ADIPOQ)、フィブリノーゲンアルファ鎖(FGA)、レプチン(LEP)、終末糖化産物特異的受容体(AGER別名RAGE)、アルファ-2-HS-糖タンパク質(AHSG)、アンジオジェニン(ANG)、CD14分子(CD14)、フェリチン(FTH1)、インスリン様成長因子結合タンパク質1(IGFBP1)、インターロイキン2受容体、アルファ(IL2RA)、血管細胞接着分子1(VCAM1)およびフォンヴィレブランド因子(VWF)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、IL1α、TNFα、核周囲型抗好中球細胞質抗体(p-ANCA)、ラクトフェリン、カルプロテクチン、ウィルムス腫瘍-1タンパク質、アクアポリン-1、MLL3、AMBP、VDAC1、E.coliエンテロトキシン(熱不安定性外毒素、熱安定性エンテロトキシン)、インフルエンザHA抗原、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、志賀様毒素I、志賀様毒素II、Clostridium difficile毒素AおよびBなどが挙げられる。
試料
本明細書で使用される場合、「試料」、「試験試料」、「生物学的試料」は、対象となる検体を含むか、または含むことが疑われる流体試料を指す。試料は、任意の好適な供給源に由来し得る。場合によっては、試料は、液体、流動性粒子状固体、または固体粒子の流体懸濁液を含み得る。場合によっては、試料は、本明細書に記載される分析の前に処理され得る。例えば、試料は、分析前にその供給源から分離または精製され得るが、ある特定の実施形態では、検体を含む未処理試料が直接アッセイされ得る。検体分子の供給源は、合成(例えば実験室で生成される)、環境(例えば空気、土壌、流体試料、例えば給水源など)、動物、例えば哺乳動物、植物、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。特定の例では、検体の供給源は、ヒト体内物質(例えば体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、痰、精液、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄液、脳脊髄液、糞便、組織、臓器など)である。組織としては、骨格筋組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、心筋組織、脳組織、骨髄、子宮頸部組織、皮膚などが挙げられ得るが、これらに限定されない。試料は、液体試料または固体試料の液体抽出物であり得る。ある特定の場合、試料の供給源は、組織分解/細胞溶解によって可溶化され得る、生検試料などの臓器または組織であり得る。
広範囲の体積の流体試料が分析され得る。いくつかの例示的な実施形態では、試料体積は、約0.5nL、約1nL、約3nL、約0.01μL、約0.1μL、約1μL、約5μL、約10μL、約50μL、約100μL、約1mL、約5mL、約10mLなどであり得る。場合によっては、流体試料の体積は、約0.01μL~約10mL、約0.01μL~約1mL、約0.01μL~約100μL、約0.1μL~約10μL、約1μL~約100μL、約10μL~約100μL、または約10μL~約75μLである。
場合によっては、流体試料は、アッセイで使用する前に希釈され得る。例えば、検体分子の供給源がヒト体液(例えば血液、血清)である実施形態では、流体は、適切な溶媒(例えばPBS緩衝液などの緩衝液)で希釈され得る。流体試料は、使用前に約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約10倍、約100倍、またはそれ以上希釈され得る。
場合によっては、試料は、分析前処理を受け得る。分析前処理は、非特異的タンパク質除去および/または効果的ではあるが安価に実施可能な混合機能などの追加の機能を提供し得る。分析前処理の一般的な方法は、動電捕捉、AC動電学、表面弾性波、等速電気泳動、誘電泳動、電気泳動、または当技術分野において既知の他の予備濃縮技法の使用を含み得る。場合によっては、流体試料は、アッセイで使用する前に濃縮され得る。例えば、検体分子の供給源がヒト体液(例えば血液、血清)である実施形態では、流体は、沈殿、蒸発、濾過、遠心分離、またはそれらの組み合わせによって濃縮され得る。流体試料は、使用前に約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約10倍、約100倍、またはそれ以上濃縮され得る。
ある特定の実施形態では、検体の測定前に、検体は増幅されない(すなわち、検体のコピー数が増加しない)。例えば、検体がDNAまたはRNAである場合、検体は、検体のコピー数を増加させるために複製されない。ある特定の場合、検体は、タンパク質または小分子である。
特異的結合メンバー
当業者によって理解されるように、結合メンバーは、分析される検体によって決定される。多種多様な標的分子に対する結合メンバーが既知であるか、または既知の技術を使用して容易に発見または開発され得る。例えば、標的検体がタンパク質である場合、結合メンバーは、タンパク質、特にその抗体またはフラグメント(例えば抗原結合フラグメント(Fab)、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(「scFv」)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物由来の可変重鎖ドメイン(「VHH」;「VHHフラグメント」としても既知)(VHHおよびそれらを作製する方法は、Gottlin et al.,Journal of Biomolecular Screening,14:77-85(2009)に記載される)、組換えVHH単一ドメイン抗体、およびVNARフラグメント、ジスルフィド連結Fv(「sdFv」)、および抗イディオタイプ(「抗Id」)抗体、ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメント、全長ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体など)、抗体様フラグメントなど)、他のタンパク質、例えば受容体タンパク質、タンパク質A、タンパク質Cなどを含み得る。検体が小分子、例えばステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質である場合、第1および/または第2の結合メンバーは、足場タンパク質(例えばリポカリン)または受容体であり得る。場合によっては、タンパク質検体のための結合メンバーは、ペプチドであり得る。例えば、標的検体が酵素である場合、好適な結合メンバーは、酵素基質および/または酵素阻害剤を含んでもよく、それらは、ペプチド、小分子などであり得る。場合によっては、標的検体がリン酸化種である場合、結合メンバーは、リン酸塩結合剤を含み得る。例えば、リン酸塩結合剤は、米国特許第7,070,921号および米国特許出願第2006/0121544号に記載されるものなどの金属イオン親和性媒体を含み得る。
ある特定の場合、結合メンバーのうちの少なくとも1つは、米国特許第5,270,163号、同第5,475,096号、同第5,567,588号、同第5,595,877号、同第5,637,459号、同第5,683,867号、同第5,705,337号に記載されるものなどのアプタマーであり得る。核酸アプタマー(例えば、一本鎖DNA分子または一本鎖RNA分子)は、実質上あらゆる標的分子を捕捉するために開発され得る。アプタマーは、典型的には非常に高い親和性で、非常に特異的かつ立体配座依存的な方法で、標的分子に結合するが、より低い結合親和性を有するアプタマーが選択され得る。アプタマーは、メチルまたはヒドロキシル基の有無などの非常に小さい構造上の相違に基づき標的検体分子を区別し得、ある特定のアプタマーは、D-およびL-エナンチオマーとジアステレオマーとを区別することができる。アプタマーは、薬物、金属イオン、および有機染料、ペプチド、ビオチン、およびタンパク質を含む小分子標的に結合し得る。アプタマーは、ビオチン化、フルオレセイン標識、ならびにガラス表面およびミクロスフェアへの付着後に機能的活性を保持することができる。
核酸アプタマーは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、または修飾オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドであり得る、オリゴヌクレオチドである。「修飾された」という用語は、共有結合的に修飾された塩基および/または糖を有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドは、3’位のヒドロキシル基以外および5’位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドを含む。したがって、修飾ヌクレオチドはまた、2’置換糖、例えば、2’-O-メチル-;2-O-アルキル;2-O-アリル;2’-S-アルキル;2’-S-アリル;2’-フルオロ-;2’-ハロまたは2-アジド-リボース、炭素環式糖類似体a-アノマー糖;エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプツロースを含み得る。
ペプチドアプタマーは、タンパク質相互作用を妨げるように設計され得る。ペプチドアプタマーは、可変ペプチドループが付着しているタンパク質骨格に基づくことができ、それによりアプタマーの立体配座を制約する。場合によっては、ペプチドアプタマーの骨格部分は、細菌チオレドキシンA(TrxA)に由来する。
標的分子が炭水化物である場合、(本明細書で定義される)潜在的に好適な捕捉成分は、例えば、抗体、レクチン、およびセレクチンを含む。当業者に理解されるように、対象となる標的分子と特異的に会合することができる任意の分子は、潜在的に結合メンバーとして使用され得る。
ある特定の実施形態について、好適な標的検体/結合メンバー複合体としては、抗体/抗原、抗原/抗体、受容体/リガンド、リガンド/受容体、タンパク質/核酸、酵素/基質およびまたは阻害剤、炭水化物(糖タンパク質および糖脂質を含む)/レクチンおよび/またはセレクチン、タンパク質/タンパク質、タンパク質/小分子などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、第1の結合メンバーは、連結を介して固体支持体に付着し得、それは、支持体への結合メンバーの付着を容易にする、支持体および/または結合メンバーの任意の部分、官能化、または修飾を含み得る。結合メンバーと支持体との間の連結は、1つ以上の化学的または物理的(例えば、ファンデルワールス力を介した非特異的付着、水素結合、静電相互作用、疎水性/親水性相互作用など)結合、および/またはそのような結合(複数可)を提供する化学スペーサを含み得る。
ある特定の実施形態では、固体支持体はまた、検出中の偽陽性シグナルまたはシグナル損失をもたらす可能性がある、アッセイ中の結合表面への非捕捉成分(例えば、検体分子、結合メンバー)の非特異的付着を排除または最小化することができる、保護、遮断、または不動態化層を含んでもよい。不動態化層を形成するためにある特定の実施形態において利用され得る材料の例としては、タンパク質の非特異的結合を阻止するポリマー、例えばポリ(エチレングリコール);血清アルブミンおよびカゼインなどのこの性質を有する天然に存在するタンパク質;界面活性剤、例えばスルホベタインなどの双極性イオン界面活性剤;天然に存在する長鎖脂質;ポリマーブラシ、およびサケ精子DNAなどの核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態は、タンパク質またはポリペプチドである結合メンバーを利用する。当技術分野において既知であるように、ポリペプチドを多種多様な固体支持体に付着させるために任意の数の技法が使用され得る。タンパク質に反応性部分を付加するための技術多種多様な技法、例えば米国特許第5,620,850号に概説される方法が既知である。さらに、タンパク質を表面に付着させる方法は既知であり、例えば、Heller,Acc.Chem.Res.23:128(1990)を参照されたい。
本明細書で説明されるように、結合メンバーと検体との間の結合は、例えば、結合メンバーおよび検体が結合対の相補的な部分である場合のように特異的である。ある特定の実施形態では、結合メンバーは、検体に特異的に結合する。「特異的に結合する」または「結合特異性」とは、結合メンバーが、検体分子と試験試料の他の成分または汚染物質とを識別するのに十分な特異性で、検体分子に結合することを意味する。例えば、結合メンバーは、一実施形態によると、検体上のエピトープに特異的に結合する抗体であり得る。抗体は、一実施形態によると、対象となる検体に特異的に結合することが可能な任意の抗体であり得る。例えば、適切な抗体としては、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体(dAb)(例えば、Holt et al.(2014)Trends in Biotechnology 21:484-490に記載されるものなど)、かつ例えば軟骨魚類およびラクダ科動物のように天然に存在するか、または合成、例えばナノボディ、VHH、または他のドメイン構造であるものを含む)、合成抗体(時に抗体ミメティックと称される)、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物(時に「抗体接合体」と称される)、ならびにそれぞれのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。別の例として、検体分子は抗体であり得、第1の結合メンバーは抗原であり得、第2の結合メンバーは標的抗体に特異的に結合する二次抗体であり得るか、または第1の結合メンバーは標的抗体に特異的に結合する二次抗体であり得、第2の結合メンバーは抗原であり得る。
いくつかの実施形態では、結合メンバーは、化学的にプログラムされた抗体(cpAb)(Rader(2014)Trends in Biotechnology 32:186-197に記載)、二重特異性cpAb、抗体動員分子(ARM)(McEnaney et al.(2012)ACSChem.Biol.7:1139-1151に記載)、分岐捕捉剤、例えばトリリガンド捕捉剤(Millward et al.(2011)J.Am.Chem.Soc.133:18280-18288に記載)、モノボディなどの非抗体骨格由来の改変結合タンパク質(ヒトフィブロネクチンの10番目のフィブロネクチンIII型ドメインに由来)、アフィボディ(免疫グロブリン結合タンパク質Aに由来)、DARPins(アンキリンリピートモジュールに基づく)、アンチカリン(リポカリンビリン結合タンパク質およびヒトリポカリン2に由来)、ならびにシステインノットペプチド(ノッチン)(Gilbreth and Koide,(2012)Current Opinion in Structural Biology 22:1-8、Banta et al.(2013)Annu.Rev.Biomed.Eng.15:93-113に記載)、WWドメイン(Patel et al.(2013)Protein Engineering,Design & Selection 26(4):307-314に記載)、別の目的で使用される受容体リガンド、アフィチン(Behar et al.(2013)26:267-275に記載)、ならびに/またはAdhiron(Tiede et al.(2014)Protein Engineering,Design & Selection 27:145-155に記載)であり得る。
検体が生体細胞(例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、他の脊椎動物、昆虫、酵母、細菌、細胞など)である一実施形態によると、結合メンバーは、細胞表面抗原に対して特異的親和性を有するリガンドであってもよい(例えば、細胞表面受容体)。一実施形態では、結合メンバーは、標的細胞型の表面上に発現される細胞接着分子に対する結合特異性を有する、接着分子受容体またはその一部分であり得る。使用中、接着分子受容体は、標的細胞の細胞外表面上の接着分子と結合し、それにより細胞を固定化または捕捉し、次いで、結合した細胞は、第1の結合メンバーと同じであり得る第2の結合メンバーを使用することによって検出され得るか、または細胞の表面上に発現される異なる分子に結合し得る。
いくつかの実施形態では、検体分子と結合メンバーとの間の結合親和性は、非特異的に結合している分子または粒子を除去するための洗浄工程を含むアッセイの条件下で結合したままであるのに十分であるべきである。場合によっては、例えばある特定の生体分子の検出において、検体分子のその相補的結合メンバーに対する結合定数は、少なくとも約104~約106M-1、少なくとも約105~約109M-1、少なくとも約107~約109M-1、約109M-1より大きい、またはそれ以上であり得る。
検出可能な標識:タグおよびシグナル発生物質
本明細書に記載される方法は、検体を分析するためのタグなどの検出可能な標識に結合した特異的結合メンバーを含み得る。組み込まれたタグまたは標識は、反応スキームの実施を実質的に妨げない。例えば、組み込まれたタグまたは標識は、検体とその相補的結合メンバーとの結合定数またはそれらの間の相互作用を妨げない。組み込まれたタグまたは標識のサイズおよび数は、捕捉速度および読み取り速度に関連し得る。捕捉速度および読み取り速度は、組み込まれたタグまたは標識のサイズおよび/または数を増加させることによって増加し得る。組み込まれたタグまたは標識は、結合メンバーの動態、例えば抗体動態、または反応スキームを変更しない。例示的なタグとしては、ポリマー、例えばアニオン性ポリマーまたはカチオン性ポリマー(例えば、ポリヒスチジンまたはポリリジンなどの正味の正電荷を有するポリペプチド)(ポリマーが約5~1000残基長である)、結合メンバーと交差反応しない、かつ/またはアッセイを妨害しないタンパク質(例えば球状タンパク質)、デンドリマー、例えばDNAデンドリマー、および荷電粒子、例えばビーズが挙げられる。ポリマータグは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸などの核酸を含み得る。ポリマータグは、核酸塩基ポリマーを含み得る。ある特定の場合、タグは、DNAまたはRNAアプタマーであり得、アプタマーは、検体に結合しない。ポリマータグまたは粒子(例えばビーズ)は、再現可能なシグナルを発生させるのに十分に大きいものであり得る。アプタマーは、20~220塩基長、例えば20~60塩基長であり得る。粒子(例えばビーズまたはデンドリマー)のサイズは、直径が約1nm~約950nm、例えば10nm~900nm、20nm~800nm、30nm~700nm、50nm~600nm、80nm~500nm、100nm~500nm、200nm~500nm、300nm~500nm、または400nm~500nmの範囲、例えば10nm、20nm、30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、または900nmであってもよい。ある特定の場合、ビーズ/粒子は、正味の負電荷もしくは正電荷を有するか、または正味の負電荷もしくは正電荷を有するように処理され得る材料で作製され得る。例示的なビーズ/粒子としては、有機または無機ポリマーから作製されるものが挙げられる。有機ポリマーとしては、ポリスチレン、炭素、ポリアクリルアミドなどのポリマーが挙げられる。無機ポリマーとしては、シリコンまたは金属ビーズ/粒子が挙げられる。ある特定の場合、ビーズ/粒子は、磁性を有していなくてもよい。
ある特定の場合、タグは、一本鎖DNAまたはRNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、前もってプローブ分子にハイブリダイズされ得る。ある特定の場合、方法は、単一試料中の複数の検体の分析を含み得る。試料中の異なる検体に結合する第2の結合メンバーは、タグとしてそれに付着した異なる一本鎖DNAまたはRNAを含み得、異なる一本鎖DNAまたはRNAは、異なる一本鎖DNAまたはRNAを互いからさらに区別する異なるプローブにハイブリダイズされ得る。他の実施形態では、異なる第2の結合メンバーに付着したタグは、区別可能である異なるヘアピン構造(例えば、ヘアピン構造の長さ)を有してもよい。さらに別の実施形態では、異なる第2の結合メンバーに付着したタグは、区別可能である異なる長さを有してもよく、例えば、タグは、異なる長さ(例えば25bp、50bp、75bp、100bp、150bp、200bp、またはそれ以上)の二本鎖DNAであってもよい。ある特定の場合、異なる第2の結合メンバーに付着したタグは、異なる長さのポリエチレングリコール(PEG)を有してもよく、またはPEGで異なって修飾されたDNAもしくはRNAであってもよい。
タグまたはタグ分子への参照は、単一タグまたは単一タグ分子、ならびに(全てが同一であってもよい)複数のタグを包含することに留意されたい。タグは、任意のサイズまたは形状であってもよい。いくつかの実施形態では、タグは、直径が約10~950nm、例えば20~900nm、30~800nm、40~700nm、50~600nm、60~500nm、70~400nm、80~300nm、90~200nm、100~150nm、200~600nm、400~500nm、2~10nm、2~4nm、または3~4nmのナノ粒子またはナノビーズであり得る。タグは、実質的に球状、例えば球状ビーズもしくはナノビーズ、または半球状であり得る。タグは、サイズが約0.5kDa~約50kDa、例えば約0.5kDa~約400kDa、約0.8kDa~約400kDa、約1.0kDa~約400kDa、約1.5kDa~約400kDa、約2.0kDa~約400kDa、約5kDa~約400kDa、約10kDa~約400kDa、約50kDa~約400kDa、約100kDa~約400kDa、約150kDa~約400kDa、約200kDa~約400kDa、約250kDa~約400kDa、約300kDa~約400kDa、約0.5kDa~約300kDa、約0.8kDa~約300kDa、約1.0kDa~約300kDa、約1.5kDa~約300kDa、約2.0kDa~約300kDa、約5kDa~約300kDa、約10kDa~約300kDa、約50kDa~約300kDa、約100kDa~約300kDa、約150kDa~約300kDa、約200kDa~約300kDa、約250kDa~約300kDa、約0.5kDa~約250kDa、約0.8kDa~約250kDa、約1.0kDa~約250kDa、約1.5kDa~約250kDa、サイズが約2.0kDa~約250kDa、約5kDa~約250kDa、約10kDa~約250kDa、約50kDa~約250kDa、約100kDa~約250kDa、約150kDa~約250kDa、約200kDa~約250kDa、約0.5kDa~約200kDa、約0.8kDa~約200kDa、約1.0kDa~約200kDa、約1.5kDa~約200kDa、サイズが約2.0kDa~約200kDa、約5kDa~約200kDa、約10kDa~約200kDa、約50kDa~約200kDa、約100kDa~約200kDa、約150kDa~約200kDa、約0.5kDa~約100kDa、約0.8kDa~約100kDa、約1.0kDa~約100kDa、約1.5kDa~約100kDa、約2.0kDa~約100kDa、約5kDa~約100kDa、約10kDa~約100kDa、約50kDa~約100kDa、約0.5kDa~約50kDa、約0.8kDa~約50kDa、約1.0kDa~約50kDa、約1.5kDa~約50kDa、約2.0kDa~約50kDa、約5kDa~約50kDa、約10kDa~約50kDa、約10kDa~約90kDa、約10kDa~約80kDa、約10kDa~約70kDa、約10kDa~約60kDa、約20kDa~約90kDa、約20kDa~約80kDa、約20kDa~約70kDa、約20kDa~約60kDa、約40kDa~約90kDa、約40kDa~約80kDa、約40kDa~約70kDa、または約40kDa~約60kDaのタンパク質であってもよい。
ある特定の実施形態では、タグは、ナノ粒子またはナノビーズであってもよい。本明細書に述べられるように、ナノ粒子は、第2の結合メンバーに可逆的に(例えば、開裂可能に)付着してもよい。ある特定の態様では、ナノ粒子は、規定の直径のナノビーズであり得る。ある特定の場合、本開示の方法、システム、およびデバイスは、試料中の複数の異なる検体を同時に分析するために使用され得る。そのような分析のために、各々が同種検体に特異的に結合する複数の第2の結合メンバーが使用され得る。異なる第2の結合メンバーの各々は、第2の結合メンバーを同定するために使用され得る異なるサイズのナノビーズに付着し得る。例えば、異なるナノビーズタグは、1nm、2nm、4nm、6nm、8nm、10nm、12nm、14nm、またはそれ以上、例えば最大20nm、30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、950nm、または990nmなどの異なる直径を有し得る。
本発明の方法においてタグとして使用され得る例示的なナノ粒子は、5nm~950nmの直径の範囲の金ナノ粒子またはポリスチレンナノ粒子を含む。
ある特定の場合、タグは、核酸などのポリマーであってもよい。タグの存在は、ポリマータグのサイズまたは長さに関連するシグナルなどの、タグに特有のシグナルを検出することによって決定され得る。ポリマータグのサイズまたは長さは、細孔またはチャネル内でのその滞留時間を測定することによって、例えば、電流の一時的な遮断の持続時間を測定することによって決定され得る。
タグまたは標識の一部であり得るか、全部であり得るか、それと関連し得るか、またはそれに付着し得る要素としては、ナノ粒子;金粒子;銀粒子;銀、銅、亜鉛、またはは他の金属コーティングまたは堆積物;ポリマー;ドラッグタグ(本明細書で定義されるような);磁性粒子;浮遊性粒子;金属粒子;荷電部分;誘電泳動タグ;不純物(例えば石英、ガラスなど)の有無にかかわらず、二酸化ケイ素;ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA);ポリイミド;窒化ケイ素;金;銀;量子ドット(CdS量子ドットを含む);カーボンドット;フルオロフォア;消光剤;ポリマー;ポリスチレン;ヤヌス粒子;散乱粒子;蛍光粒子;リン光粒子;球体;立方体;絶縁体;導体;バーコードまたは標識付き粒子;多孔質粒子;固体粒子;ナノシェル;ナノロッド;ミクロスフェア;ウイルス、細胞、寄生虫、および生物などの検体;核酸;タンパク質;分子認識要素;スペーサ;PEG;デンドリマー;電荷調整剤;磁性材料;酵素;アプタマー配列を含むDNA;増幅可能なDNA;DNAの反復配列;分子認識要素と検出可能な要素との融合または接合(例えば、改変結合メンバー);抗抗体アプタマー;抗体結合タンパク質に対するアプタマー;吸収または吸着された検出可能な化合物;ヘム;ルシフェリン;蛍光体;アジド、またはアルキン(例えば、端末または非末端アルキン)、あるいは他のクリックケミストリー関与体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、タグは、試料の迅速な分析を可能にするのに十分に高い捕捉速度を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、タグの捕捉速度は、10秒当たり約1事象、5秒当たり1事象、1秒当たり1事象、またはそれ以上であり得る。ある特定の実施形態では、リボースポリマー、デオキシリボースポリマー、オリゴヌクレオチド、DNA、またはRNAなどの線状ポリマータグが使用され得る。
ある特定の場合、線状ポリマーのタグ、例えばリボースポリマー、デオキシリボースポリマー、オリゴヌクレオチド、DNA、またはRNAは、これらのタグの捕捉速度がある特定の用途には低すぎる場合があるため、使用されない可能性がある。半球状、球状、または実質的に球状の形状であり、したがってアッセイ期間を短縮するタグは、より速いタグ計数を必要とする用途において使用され得る。ある特定の場合、球状または半球状のタグのサイズは、アッセイに必要な捕捉速度に基づき選択され得る。例えば、より高い捕捉速度のためには、より大きいサイズの球状または半球状のタグが選択され得る。ある特定の場合、タグは、同じ測定条件下で、DNAタグなどの線状タグに対する捕捉速度よりも約10倍、30倍、50倍、100倍、300倍、500倍、または1000倍速い捕捉速度を有するナノ粒子/ナノビーズなどの球状タグであり得る。
いくつかの実施形態では、タグは、抗体、例えばCPSP抗体接合体に接合され得る。いくつかの実施形態では、タグは、スペーサを有する抗体、例えばスペーサとのCPSP抗体接合体に接合されてもよい。いくつかの実施形態では、タグは、オリゴヌクレオチドおよび抗体、例えばCPSPオリゴヌクレオチド-抗体接合体に接合されてもよい。いくつかの実施形態では、タグは、スペーサを有するオリゴヌクレオチドおよび抗体、例えばスペーサを有するCPSPオリゴヌクレオチド-抗体接合体に接合されてもよい。いくつかの実施形態では、タグは、オリゴヌクレオチド、例えばCPSPオリゴヌクレオチド接合体に接合されてもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物色素原、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、放射性化合物、粒子(ただしそれらが蛍光特性を有することを条件とする)などのシグナル発生物質などの検出可能な標識に結合した特異的結合メンバーを含み得る。標識の例としては、光を発生させる部分、例えばアクリジニウム化合物、および蛍光を発生させる部分、例えばフルオレセインが挙げられる。
当該技術分野で既知の任意の好適なシグナル発生物質が、検出可能な標識として使用され得る。例えば、検出可能な標識は、放射性標識(3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、および153Smなど)、酵素標識(西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼなど(酵素が使用される場合、対応する酵素基質も添加されなければならない))、化学発光標識(アクリジニウムエステル、チオエステル、もしくはスルホンアミド;ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど)、蛍光標識(フルオレセイン(例えば、5-フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン、3’6-カルボキシフルオレセイン、5(6)-カルボキシフルオレセイン、6-ヘキサクロロ-フルオレセイン、6-テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど))、ローダミン、フィコビリタンパク質、R-フィコエリスリン、量子ドット(例えば、硫化亜鉛キャップセレン化カドミウム)、温度測定標識、または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識への導入、標識手順、および標識の検出は、Polak and Van Noorden,Introduction to Immunocytochemistry,2nd ed.,Springer Verlag,N.Y.(1997)、およびHaugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(1996)に見られ、それらは、Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregonによって出版されたハンドブックおよびカタログの組み合わせである。蛍光標識は、FPIAで使用され得る(例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,593,896号、同第5,573,904号、同第5,496,925号、同第5,359,093号、およびv第5,352,803号を参照されたい)。アクリジニウム化合物は、均一化学発光アッセイにおいて検出可能な標識として使用され得る(例えば、Adamczyk et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.16:1324-1328(2006)、Adamczyk et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:2313-2317(2004)、Adamczyk et al.,Biorg.Med.Chem.Lett.14:3917-3921(2004)、およびAdamczyk et al.,Org.Lett.5:3779-3782(2003)を参照されたい)。
一態様では、アクリジニウム化合物は、アクリジニウム-9-カルボキサミドである。アクリジニウム9-カルボキサミドを調製するための方法は、Mattingly,J.Biolumin.Chemilumin.6:107-114(1991)、Adamczyk et al.,J.Org.Chem.63:5636-5639(1998)、Adamczyk et al.,Tetrahedron 55:10899-10914(1999)、Adamczyk et al.,Org.Lett.1:779-781(1999)、Adamczyk et al.,BioconjugateChem.11:714-724(2000)、Mattingly et al.,In Luminescence Biotechnology:Instruments and Applications;Dyke,K.V.Ed.;CRC Press:Boca Raton,pp.77-105(2002)、Adamczyk et al.,Org.Lett.5:3779-3782(2003)、ならびに米国特許第5,468,646号、同第5,543,524号、および同第5,783,699号(これらの各々は、それに関するその教示について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
アクリジニウム化合物の別の例は、アクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルである。式IIのアクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルの例は、10-メチル-9-(フェノキシカルボニル)アクリジニウムフルオロスルホネート(Cayman Chemical,Ann Arbor,MIから入手可能)である。アクリジニウム9-カルボキシレートアリールエステルを調製するための方法は、McCapra et al.,Photochem.Photobiol.4:1111-21(1965)、Razavi et al.,Luminescence 15:245-249(2000)、Razavi et al.,Luminescence 15:239-244(2000)、および米国特許第5,241,070号(これらの各々は、それに関するその教示について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。そのようなアクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルは、シグナルの強度および/またはシグナルの速度に関して、少なくとも1つのオキシダーゼによる検体の酸化で発生する過酸化水素の効率的な化学発光指示薬である。アクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルの化学発光の放出過程は、迅速に、すなわち1秒足らずで完了し、一方、アクリジニウム-9-カルボキサミド化学発光の放出は、2秒に及ぶ。しかしながら、アクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルは、タンパク質の存在下でその化学発光特性を失う。したがって、その使用は、シグナル発生および検出中にタンパク質の非存在を必要とする。試料中のタンパク質を分離または除去するための方法は、当業者に周知であり、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィ、および/または消化を含むが、これらに限定されない(例えば、Wells,High Throughput Bioanalytical Sample Preparation.Methods and Automation Strategies,Elsevier(2003)を参照されたい)。試験試料から除去または分離されたタンパク質の量は、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約80%、約90%、または約95%であり得る。アクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルおよびその使用に関するさらなる詳細は、2007年4月9日に出願された米国特許出願第11/697,835号に記載されている。アクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステルは、脱ガス無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)または水性コール酸ナトリウムなどの任意の好適な溶媒に溶解され得る。
開裂可能なリンカー
本明細書に記載される方法で使用されるタグは、一般的なリンカーによって特異的結合メンバーに付着し得る。開裂可能なリンカーは、タグが除去され得ることを確実にする。一般的なリンカーは、開裂可能なリンカーであり得る。例えば、タグは、開裂可能なリンカーを介して第2の結合メンバーに付着し得る。第1の結合メンバー-検体-第2の結合メンバーの複合体は、開裂可能なリンカーの開裂を媒介する開裂剤に曝露されてもよい。リンカーは、酸、塩基、求核剤、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素などへの曝露を含む任意の適切な方法によって開裂され得る。好適なリンカーは、Greene & Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sonsに開示されるように、標準的な化学保護基から適合され得る。固相合成において使用されるさらなる好適な開裂可能なリンカーは、Guillier et al.(Chem.Rev.100:2092-2157,2000)に開示されている。リンカーは、酸開裂可能、塩基開裂可能、または光開裂可能であり得る。酸化還元反応は、開裂スキームの一部であり得る。開裂可能なリンカーは、荷電ポリマーであり得る。
リンカーは、光開裂可能なリンカー、化学的に開裂可能なリンカー、または熱的に開裂可能なリンカーであり得る。リンカーが光開裂可能な基である場合、開裂剤は、光開裂可能な基を破壊または開裂する適切な波長の光であり得る。多くの実施形態では、光開裂可能な連結基を開裂するために使用される光の波長は、約180nm~400nm、例えば約250nm~400nm、または約300nm~400nmの範囲である。開裂を活性化するのに必要とされる光が、検体の他の成分に影響を及ぼさないことが好ましい。好適なリンカーとしては、O-ニトロベンジル化合物およびニトロベラトリル化合物に基づくものが挙げられる。ベンゾイン化学に基づくリンカーも使用され得る(Lee et al.,J.Org.Chem.64:3454-3460,1999)。
あるいは、開裂リンカーが化学的に開裂可能な基である場合、開裂剤は、基を開裂することが可能な化学剤であり得る。化学的に開裂可能なリンカーは、酸化/還元に基づく開裂、酸触媒による開裂、塩基触媒による開裂、または求核置換によって開裂され得る。例えば、連結基がジスルフィドである場合、タグを放出するためにジチオトレイトールまたはベータメルカプトエタノールが使用され得る。連結基が制限部位であるさらに他の実施形態では、薬剤は、加水分解酵素、制限酵素、または連結基を開裂する別の酵素であり得る酵素などの触媒剤である。例えば、制限酵素は、I型、II型、IIS型、III型、およびIV型制限酵素であり得る。
いくつかの実施形態では、開裂リンカーは、酵素的に開裂可能な配列である。本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、酵素的開裂可能配列は、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長の核酸配列である。一実施形態では、酵素的開裂可能配列は、少なくとも10ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的開裂可能配列は、2~20ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的開裂可能配列は、2~15ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的開裂可能配列は、4~10ヌクレオチドの配列を含む。一実施形態では、酵素的開裂可能配列は、4~15ヌクレオチドの配列を含む。
例えば、開裂可能なリンカーは、アクリジニウム、酸性または軽度の還元条件(例えば、アクリジンおよびスルホンアミドを生成するための過酸化水素)によって開裂され得る、置換ベンジルエーテルもしくはその誘導体などのエーテル(例えば、ベンジルヒドリルエーテル、インダニルエーテルなど)、P-脱離を使用して生成される荷電ポリマー(弱塩基が生成物を放出するのに役立つ)、アセタール(そのチオ類似体を含む。分離は、特に捕捉カルボニル化合物の存在下で弱酸によって達成される)、光解離性連結(例えば、O-ニトロベンゾイル、7-ニトロインダニル、2-ニトロベンズヒドリルエーテルもしくはエステルなど)、または特に酵素が第Xa因子のペプチドまたはエンテロキナーゼなどの特異的配列を認識する場合に酵素加水分解に供されるペプチドリンカーであり得る。リンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸不安定リンカー(ジアルコキシベンジルリンカーを含む)、シーバーリンカー、インドールリンカー、t-ブチルシーバーリンカー、求電子的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能なリンカー、還元条件、酸化条件下での開裂、セーフティキャッチリンカーの使用による開裂、および脱離機構による開裂が挙げられるが、これらに限定されない。
求電子的開裂リンカーは、典型的には、プロトンによって開裂され、酸に感受性の開裂を含む。好適なリンカーとしては、トリチル、p-アルコキシベンジルエステル、およびp-アルコキシベンジルアミドなどの修飾ベンジル系が挙げられる。他の好適なリンカーとしては、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)基およびアセタール系が挙げられる。チオアセタールまたは他の硫黄含有保護基の開裂における、ニッケル、銀、または水銀などのチオフィリック金属の使用もまた、好適なリンカー分子の調製のために考慮され得る。
求核開裂について、水中で不安定であるエステル(すなわち、塩基性pHで単純に切断され得る)、および非水性求核試薬に不安定である基が使用され得る。トリイソプロピルシラン(TIPS)またはt-ブチルジメチルシラン(TBDMS)などの基中のケイ素-酸素結合を開裂するために、フッ化物イオンが使用され得る。
還元開裂を受けやすいリンカーは、ジスルフィド結合還元と同様に使用され得る。パラジウムベースの触媒を使用した接触水素化は、ベンジルおよびベンジルオキシカルボニル基を開裂するために使用されてきた。
酸化ベースのアプローチは、当該技術分野で周知である。これらは、p-アルコキシベンジル基の酸化ならびに硫黄およびセレンリンカーの酸化を含む。ジスルフィドおよび他の硫黄またはセレンベースのリンカーを開裂するための水性ヨウ素もまた使用され得る。
セーフティキャッチリンカーは、二段階で開裂するものである。好ましい系では、第1のステップは、反応性求核中心の生成であり、それに続く第2のステップは、開裂をもたらす分子内環化を伴う。例えば、レブリン酸エステル連結は、ヒドラジンまたは光化学で処理されて活性アミンを放出することができ、次いでこれは、環化されて分子内の他の場所でエステルを開裂することができる(Burgess et al.,J.Org.Chem.62:5165-5168,1997)。
脱離反応もまた使用され得る。例えば、Fmocおよびシアノエチルなどの基の塩基触媒脱離、およびアリル系のパラジウム触媒還元脱離が使用され得る。
一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス
一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスに関するシステム、デバイス、および方法が本明細書に記載される。
ある特定の実施形態では、一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスは、2つのモジュール、試料調製モジュールと検体検出モジュールとを有し得る。ある特定の実施形態では、試料調製モジュールおよび検体検出モジュールは、別々であるか、または別々で隣接している。ある特定の実施形態では、試料調製モジュールおよび検体検出モジュールは、同じ場所に配置されるか、混じり合わされるか、または交互嵌合される。試料調製モジュールは、試料および試薬の液滴の移動、融合、希釈、混合、分離のための一連または複数の電極を含み得る。検体検出モジュールは、検体関連シグナルが検出されるウェルアレイを含み得る。ある特定の場合、検出モジュールはまた、調製された試料の液滴をウェルアレイに移動させるための一連または複数の電極を含み得る。ある特定の実施形態では、検出モジュールは、間隙によって分離された第2の基板(例えば下部基板)の上に配設された第1の基板(例えば上部基板)内のウェルアレイを含み得る。これらの実施形態では、ウェルアレイは、上下逆の配向である。ある特定の実施形態では、検出モジュールは、間隙によって分離された第1の基板(例えば上部基板)の下に配設された第2の基板(例えば下部基板)内のウェルアレイを含み得る。そのような実施形態では、第1の基板および第2の基板は、対向配置にある。液滴は、第1の基板および/または第2の基板に存在する電極(複数可)を使用してウェルアレイに(例えば電気作動によって)移動し得る。ある特定の実施形態では、ウェル間に領域を含むウェルアレイは、疎水性であり得る。他の実施形態では、一連または複数の電極は、試料調製モジュールに限定され得、調製試料の液滴(および/または不混和性流体の液滴)は、他の手段を使用して検出モジュールに移動し得る。
ある特定の実施形態では、試料調製モジュールは、イムノアッセイのステップを行うために使用され得る。任意のイムノアッセイ形式が検出可能なシグナルを発生させるために使用され得、そのシグナルは、試料中の対象となる検体の存在を示し、試料中の検体の量に比例する。例示的なイムノアッセイは、本明細書に記載されている。
ある特定の場合、検出モジュールは、試料中に存在する検体の量に関連するシグナルを測定するために光学的に調査されるウェルアレイを含む。ウェルアレイは、サブフェムトリットル体積、フェムトリットル体積、サブナノリットル体積、ナノリットル体積、サブマイクロリットル体積、またはマイクロリットル体積を有し得る。例えば、ウェルアレイは、フェムトリットルウェルのアレイ、ナノリットルウェルのアレイ、またはマイクロリットルウェルのアレイであり得る。ある特定の実施形態では、アレイ内のウェルは全て、実質的に同じ体積を有し得る。ウェルアレイは、最大100μL、例えば約0.1フェムトリットル、1フェムトリットル、10フェムトリットル、25フェムトリットル、50フェムトリットル、100フェムトリットル、0.1pL、1pL、10pL、25pL、50pL、100pL、0.1nL、1nL、10nL、25nL、50nL、100nL、0.1マイクロリットル、1マイクロリットル、10マイクロリットル、25マイクロリットル、50マイクロリットル、または100マイクロリットルの体積を有し得る。
ある特定の実施形態では、試料調製モジュールおよび検出モジュールは両方とも、単一ベース基板上に存在してもよく、試料調製モジュールおよび検出モジュールの両方は、液滴を移動させるための一連または複数の電極を含み得る。ある特定の実施形態では、そのようなデバイスは、第1の基板と第2の基板とを含み得、第2の基板は、第1の基板上に位置付けられ、間隙によって第1の基板から分離されている。第1の基板は、試料調製モジュールが配置される第1の部分(例えば近位部分)(液滴がデバイス内に導入される場所)と、液滴が移動する第2の部分(例えば遠位部分)(その第2の部分に検出モジュールが配置されている)とを含み得る。「遠位」を考慮した「近位」および「第2」を考慮した「第1」の使用が相対的な用語であり、互いに対して互換的であることが当業者に理解されるであろう。ある特定の実施形態では、第1の部分と第2の部分は、別々であるか、または別々で隣接している。ある特定の実施形態では、第1の部分および第2の部分は、同じ場所に配置されるか、混じり合わされるか、または交互嵌合される。第1の基板は、第1の基板の上部表面上に重ね合わされ、第1の部分から第2の部分まで延在する一連または複数の電極を含み得る。第1の基板は、第1の基板の上部表面に配設され、一連または複数の電極を被覆し、かつ第1の部分から第2の部分まで延在する層を含み得る。第1の層は、誘電体および疎水性材料である材料で作製され得る。誘電性および疎水性である材料の例としては、ポリテトラフルオロエチレン材料(例えばTeflon(登録商標))またはフルオロ界面活性剤(例えばFluoroPel(商標))が挙げられる。第1の層は、実質的に平坦な表面を提供するように堆積され得る。ウェルアレイは、第1の基板の第2の部分に位置付けられ、一連または複数の電極の一部分に重なり合い、検出モジュールを形成し得る。ウェルアレイは、第1の層に位置付けられ得る。ある特定の実施形態では、第1の層内のウェルアレイの製造前または後に、親水性表面を有するウェルアレイを提供するために、親水性層が第1の基板の第2の部分内の第1の層上に配設され得る。第1の基板と第2の基板との間の空間/間隙は、空気または不混和性流体で充填され得る。ある特定の実施形態では、第1の基板と第2の基板との間の空間/間隙は、空気で充填され得る。
ある特定の実施形態では、試料調製モジュールおよび検出モジュールは両方とも、単一ベース基板を使用して製造され得るが、液滴を移動させるための一連または複数の電極は、試料調製モジュール内にのみ存在し得る。そのような実施形態では、第1の基板は、第1の基板の第1の部分において第1の基板の上部表面上に重ね合わされた一連または複数の電極を含み得、一連または複数の電極は、第1の基板の第2の部分に延在しない。そのような実施形態では、一連または複数の電極は、第1の部分内にのみ位置付けられる。上記のような誘電体/疎水性材料(例えばTeflon)の第1の層は、第1の基板の上部表面上に配設され得、一連または複数の電極を被覆し得る。ある特定の実施形態では、第1の層は、第1の基板の第1の部分上にのみ配設され得る。他の実施形態では、第1層は、第1の部分の第1基板の上部表面ならびに第2の部分上に配設され得る。ウェルアレイは、第1の基板の第2の部分の第1の層に位置付けられ、ウェルアレイの下に存在する一連または複数の電極を含まない検出モジュールを形成し得る。
ある特定の場合、第1の層は誘電体層であり得、疎水性材料の第2の層は誘電体層上に配設され得る。ウェルアレイは、疎水性層に位置付けられ得る。疎水性層内のウェルアレイの製造前または後に、親水性層が第1の基板の第2の部分内の疎水性層上に排泄され得る。
ある特定の実施形態では、第2の基板は、第1の基板の第1および第2の部分上を延在し得る。そのような実施形態では、第2の基板は、少なくともウェルアレイに重なり合う領域内で実質的に透明であり得る。他の場合、第2の基板は、第1の基板の第1の部分上に離間して配設され得、第1の基板の第2の部分上に配設されなくてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、第2の基板は、試料調製モジュール中に存在し得るが、検出モジュール中には存在しない。
ある特定の場合、第2の基板は、電極を形成する導電層を含み得る。導電層は、第2の基板の下部表面上に配設され得る。導電層は、上記のように、誘電体/疎水性材料で作製される第1の層によって被覆され得る。ある特定の場合、導電層は、誘電体層によって被覆され得る。誘電体層は、疎水性層によって被覆されなくてもよい。導電層およびそれを被覆する任意の層(複数可)は、第2の基板の下部表面にわたって配設され得るか、または第2の基板の第1の部分上にのみ存在し得る。ある特定の実施形態では、第2の基板は、第1の基板の第1および第2の部分上を延在し得る。そのような実施形態では、第2の基板およびその上に配設された任意の層(例えば導電層、誘電体層など)は、少なくともウェルアレイに重なり合う領域内で実質的に透明であり得る。
他の場合、第1の基板上の一連または複数の電極は、同一平面上の電極として構成され得、第2の基板は、電極を含まなくてもよい。
ある特定の場合、第1の層および/または第2の層内に存在する電極は、インジウムスズ酸化物、フッ素ドープ酸化スズ(FTO)、ドープ酸化亜鉛などの実質的に透明な材料から製造され得る。
いくつかの実施形態では、試料調製モジュールおよび検出モジュールは、単一のベース基板上で製造され得る。他の実施形態では、試料調製モジュールおよび検出モジュールは、別々の基板上で製造され得、これらの基板は続いて結合されて、一体型マイクロ流体および検体検出デバイスを形成し得る。ある特定の実施形態では、第1および第2の基板は、基板間に位置付けられ得るスペーサを使用して離間されてもよい。
本明細書に記載されるデバイスは、平面的であってもよく、長方形または正方形、角が丸い長方形または正方形、円形、三角形などの任意の形状を有し得る。
液滴ベースのマイクロ流体は、能動的または受動的力を介して液滴を生成し作動させること(移動、融合、分割など)を指す。能動的力の例としては、電界が挙げられるが、これに限定されない。例示的な能動的力技法としては、エレクトロウェッティング、誘電泳動、オプトエレクトロウェッティング、電極媒介、電界媒介、静電作動など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、デバイスは、エレクトロウェッティングなどの液滴ベースのマイクロ流体を介して、またはエレクトロウェッティングと液滴の連続的な流体流動との組み合わせを介して、間隙内の第1の層の上部表面(または存在する場合、第2の層の上部表面)にわたって液滴を作動させ得る。他の例では、デバイスは、試料調製モジュールから検出モジュールに液滴を送達するためのマイクロチャネルを含み得る。他の例では、デバイスは、液滴ベースのマイクロ流体を介した間隙内の疎水性層の表面にわたる液滴の作動に依存し得る。エレクトロウェッティングは、表面に電界を印加すること、および表面上に存在する液滴と表面との間の表面張力に影響を及ぼすことによって、表面の湿潤特性を変化させることを伴い得る。外部の機械的ポンプもしくは一体型の機械的マイクロポンプなどの外部圧力源、または毛管力と動電機構との組み合わせを介して液滴を移動させるために、連続的な流体流動が使用され得る。受動的力の例としては、T字型接合および流動集束法が挙げられるが、これらに限定されない。受動的力の他の例は、第1の基板の表面上の液滴に結合され、表面にわたって液滴を移動させることができる、重油流体などのより高密度の不混和性液体の使用を含む。より高密度の不混和性液体は、水よりも密度が高く、かなりの程度まで水と混合しない任意の液体であり得る。例えば、不混和性液体は、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、極性油、非極性油、フッ素化油、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、1-ヘキサノールなどであり得る。
第1の基板と第2の基板との間の空間は、高さが最大1mm、例えば0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm、140μm、200μm、300μm、400μm、500μm、1μm~500μm、100μm~200μmなどであり得る。本明細書に記載されるデバイス内で生成され移動する液滴の体積は、約10μL~約5picol、例えば10μm~1picol、7.5μL~10picol、5μL~1nL、2.5μL~10nL、または1μL~100nL、800~200nL、10nL~0.5μLの範囲、例えば10μL、1μL、800nL、100nL、10nL、1nL、0.5nL、10picol、またはそれ以下であり得る。
図1Aは、例示的な一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス10を示す。デバイス10は、第1の基板11と第2の基板12とを含み、第2の基板12は、第1の基板11上に位置付けられ、間隙13によって第1の基板から分離されている。図1Aに示されるように、第2の基板12は、第1の基板11と同じ長さである。しかしながら、他の例示的なデバイスでは、第1の基板11および第2の基板12は、異なる長さであり得る。第2の基板は、電極を含んでも含まなくてもよい。第1の基板11は、試料液滴、試薬液滴などの液滴が第1の基板11上に導入される第1の部分15を含む。第1の基板11は、液滴が移動する第2の部分16を含む。第1の部分15はまた、試料調製モジュールとも称され得、第2の部分16は、検体検出モジュールと称され得る。第1の基板11は、第1の基板11の上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極17を含む。誘電体/疎水性材料(例えば、誘電性および疎水性の両方であるTeflon)の層18が第1の基板の上部表面上に配設され、一連または複数の電極17を被覆する。ウェルアレイ19は、第1の基板の第2の部分16上の層18内に位置付けられる。
図1Bは、第1の基板21と第2の基板22とを含む一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス20の別の例を示し、第2の基板22は、第1の基板20上に位置付けられ、間隙23によって第1の基板の上部表面から分離されている。第1の基板21は、液体が第1の基板21上に導入される第1の部分25と、液体が検体関連シグナルの検出のために方向付けられる第2の部分26とを含む。第1の基板21は、第1の基板の上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極27を含む。誘電性材料の層28は、第1の基板21の上部表面上に位置付けられ、一連または複数の電極27を被覆する。この例示的なデバイスでは、一連または複数の電極27は、第1の基板21の第1の部分上にのみ位置付けられる。第2の基板22は、電極を含んでも含まなくてもよい。
図2Aは、別の例示的な一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス30を示す。デバイス30は、第1の基板31と第2の基板32とを含み、第2の基板32は、第1の基板31上に位置付けられ、間隙33によって第1の基板の上部表面から分離されている。第1の基板31は、試料液滴、試薬液滴などの液滴が第1の基板31上に導入される第1の部分35を含む。第1の基板31は、液滴が移動する第2の部分36を含む。第1の部分はまた、試料調製モジュールとも称され得、第2の部分は、検出モジュールと称され得る。第1の基板31は、第1の基板の上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極37を含む。誘電性材料の層38は、第1の基板の上部表面上に配設され、一連または複数の電極37を被覆する。疎水性材料の層34は、誘電体層38上に重ね合わされる。ウェルアレイ39は、第1の基板31の第2の部分上の疎水性層34内に位置付けられる。ウェルアレイは、親水性または疎水性表面を有し得る。
図2Bは、第1の基板41と第2の基板42とを含む一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス40の別の例を示し、第2の基板42は、第1の基板40上に位置付けられ、間隙43によって第1の基板の上部表面から分離されている。第1の基板は、液体が第1の基板41上に導入される第1の部分45と、液体が検体関連シグナルの検出のために方向付けられる第2の部分46とを含む。第1の基板41は、第1の基板の上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極47を含む。誘電性材料の層48は、第1の基板41の上部表面上に位置付けられ、一連または複数の電極47を被覆する。この例示的なデバイスでは、一連または複数の電極47は、第1の基板41の第1の部分45上にのみ位置付けられる。誘電体層48は、第1の基板41の上部表面全体を被覆し、疎水性層44は、誘電体層の上部表面全体を被覆する。ウェルアレイ49は、疎水性層44内に位置付けられ、ウェルアレイ49は、第1の基板41の第2の部分46に重なり合う疎水性層の一部分のみに位置付けられる。この例では、誘電体層48は、第1の基板41の上部表面全体にわたって延在するように示される。他の例では、誘電体層および疎水性層は、第1の部分に限定されてもよく、ウェルは、第1の基板の第2の部分上に位置付けられた親水性層に位置付けられ得る。
いくつかの例では、液体は、液滴アクチュエータ(図示せず)を介して間隙内に導入され得る。他の例では、液体は、流体入口、ポート、またはチャネルを介して間隙に入ってもよい。デバイスの追加の関連構成要素は、図面に示されていない。そのような図面は、試料を保持するためのチャンバ、洗浄緩衝液、結合メンバー、酵素基質、廃液などを含み得る。アッセイ試薬が一体型デバイスの一部として外部リザーバ内に含まれ得、特定のアッセイステップに必要な場合、所定の体積がリザーバからデバイス表面に移動し得る。さらに、アッセイ試薬は、乾燥、印刷、または凍結乾燥試薬の形態でデバイス上に堆積され得、それらは活性を失うことなく長期間保存され得る。そのような乾燥、印刷、または凍結乾燥試薬は、検体分析の前または最中に再水和され得る。
いくつかの例では、第1の基板は、紙(インクジェット印刷電極付き)またはポリマーなどの可撓性材料から作製され得る。他の例では、第1の基板は、例えば、プリント回路基板、プラスチックもしくはガラス、またはシリコンなどの非可撓性材料から作製され得る。いくつかの例では、第1の基板は、単一のシートから作製され、それは次いで、一連または複数の電極を形成するために後続の処理を受け得る。いくつかの例では、複数の一連または複数の電極が第1の基板上で製造され得、それらは切断されて、一連または複数の電極と重ね合わされた複数の第1の基板を形成し得る。いくつかの例では、電極は、一般的な接着剤またははんだを介して導電層の表面に接合され得る。第2の基板は、紙(インクジェット印刷電極の有無にかかわらず)、ポリマー、プリント回路基板などの可撓性材料を含むが、これらに限定されない任意の好適な材料から作製され得る。
いくつかの例では、電極は、金属、金属混合物もしくは合金、金属-半導体混合物もしくは合金、または導電性ポリマーからなる。金属電極のいくつかの例としては、銅、金、インジウム、スズ、インジウムスズ酸化物、およびアルミニウムが挙げられる。いくつかの例では、誘電体層は、低い導電率を有するか、または静電界を維持することが可能である絶縁材料を含む。いくつかの例では、誘電体層は、磁器(例えばセラミック)、ポリマー、またはプラスチックで作製され得る。いくつかの例では、疎水性層は、例えばTeflonおよび一般的なフッ化炭素などの疎水特性を有する材料で作製され得る。別の例では、疎水性材料は、フルオロ界面活性剤(例えばFluoroPel)であり得る。誘電体層上に堆積された親水性層を含む実施形態では、それはガラス、石英、シリカ、金属水酸化物、または雲母の層であり得る。
当業者は、電極のアレイ(例えば一連)が第1の基板の単位面積当たり一定数の電極を含み得、この数が電極のサイズおよび交互嵌合された電極の有無に基づき増減し得ることを理解するであろう。電極は、電極のフォトリソグラフィ、原子層堆積、レーザスクライビングまたはエッチング、レーザアブレーション、フレキソ印刷、およびインクジェット印刷を含む様々なプロセスを使用して製造され得る。
いくつかの例では、特別なマスクパターンが第1の基板の上部表面に配設された導電層に適用され得、露出した導電層のレーザアブレーションが後に続き、第1の基板上に一連または複数の電極を形成する。
いくつかの例では、一連または複数の電極によって発生した電位は、ウェルアレイによって受容されるために、デジタルマイクロ流体デバイスの表面にわたって、一連または複数の電極を被覆する第1の層(または存在する場合、第2の層)の上部表面上に形成された液滴を移す。各電極は、デジタルマイクロ流体デバイスの表面にわたって液滴を独立して移動させることが可能であり得る。
図3Aは、液滴が間隙170内を移動している状態の例示的な一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス100の側面図を示す。デバイス100は、第1の基板110と第2の基板120とを含み、第2の基板120は、第1の基板110上に位置付けられ、間隙170によって第1の基板の上部表面から分離されている。第1の基板110は、試料液滴、試薬液滴などの液滴が第1の基板110上に導入される第1の部分115を含む。第1の基板110は、液滴が移動する第2の部分130を含む。第1の部分はまた、試料調製モジュールとも称され得、第2の部分は、検出モジュールと称され得る。第1の基板110は、第1の基板の上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極145を含む。誘電性材料の層150は、第1の基板の上部表面上に配設され、一連または複数の電極145を被覆する。疎水性材料の層155は、誘電体層150上に重ね合わされる。ウェルアレイ160は、第1の基板110の第2の部分上の疎水性層155内に位置付けられる。ウェルアレイは、親水性または疎水性表面を有し得る。図3Aに示されるように、液滴は、第1の部分115からウェルアレイ160を含む第2の部分130へと作動されるように示される。複数のビーズまたは粒子190を含む液滴180は、一連または複数の電極145を使用して能動的方向性移動を介して第1の部分115にわたって第2の部分130まで移動している。矢印は、液滴の移動方向を示す。ここには示されていないが、液滴を移動させ、ウェルを密封するために分極性油が使用され得る。ここではビーズ/粒子が図示されているが、液滴は、固体支持体の代わりに、またはそれに加えて検体分子を含み得る。
図3Bは、液滴180が間隙170内を第1の部分115からウェルアレイ160を含む第2の部分130に移動している、例示的な一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイス101の側面図を示す。デバイス101は、第1の基板110と第2の基板120とを含み、第2の基板120は、第1の基板110上に位置付けられ、間隙170によって第1の基板の上部表面から分離されている。第1の基板110は、試料液滴、試薬液滴などの液滴が第1の基板110上に導入される第1の部分115を含む。第1の基板110は、液滴が移動する第2の部分130を含む。第1の部分はまた、試料調製モジュールとも称され得、第2の部分は、検出モジュールと称され得る。第1の基板110は、第1の基板の第1の部分115における上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極145を含む。誘電性材料の層150は、第1の基板の上部表面上に配設され、一連または複数の電極145を被覆する。疎水性材料の層155は、誘電体層150上に重ね合わされる。ウェルアレイ160は、第1の基板110の第2の部分上の疎水性層155内に位置付けられる。ウェルアレイは、親水性または疎水性表面を有し得る。デバイスの第1の部分の表面にわたる移動は電極145を介し、次いで液滴180は、191および192によって形成される毛管要素を通る毛管移動などの受動的流体力を使用して第2の部分に移動する。いくつかの例では、毛管要素は、一連または複数の電極によって発生した印加電界がない場合、水性液滴の第1の部分から第2の部分への移動を容易にするための親水性材料を含み得る。いくつかの例では、疎水性材料のストライピングが親水性毛管空間の隣に配設され得る。疎水性材料のストライピングは、デジタルマイクロ流体電極がない場合、不混和性流体の液滴をウェルアレイまで移動させるために使用され得る。疎水性毛管要素を通って流動し得る液体のいくつかの例は、フッ素化油などの重油流体を含み、ウェルアレイ上での液滴の移動を容易にするために使用され得る。他の例では、余分な液滴を除去するために油滴も利用され得る。
水性ベースの流体を移動させることに加えて、有機ベースの不混和性流体などの不混和性流体もまた、電気媒介作動によって移動し得る。液滴の作動は、相互に関連する双極子モーメントおよび比誘電率、ならびに導電率と相関することが理解される。ある特定の実施形態では、不混和性液体は、約0.9Dより大きい分子双極子モーメント、約3より大きい比誘電率、および/または約10-9Sm-1より大きい導電率を有し得る。可動不混和性液体およびその特性の例は、Chatterjee,et al.Lab on Chip,6,199-206(2006)で考察されている。本明細書に開示される検体分析アッセイにおける不混和性液体の使用の例は、水性液滴移動の補助、ウェル上に位置付けられた水性流体の置き換え、ウェルの光学的調査前のウェルからの未堆積ビーズ/粒子/検体分子の置き換え、ウェルの密封などを含む。本明細書に開示されるデバイス内で移動可能である有機ベースの不混和性流体のいくつかの例としては、1-ヘキサノール、ジクロロメタン、ジブロモメタン、THF、およびクロロホルムが挙げられる。上記の基準を満たす有機ベースの油もまた、同様の条件下で移動可能であると予想される。不混和性流体液滴を使用するいくつかの実施形態では、デバイス内の間隙/空間は、空気で充填され得る。
図4Aは、図3Aの一体型デバイスの第2の部分に移動しており、ウェルアレイ160上に位置付けられたビーズまたは粒子190を含む液滴180を示す。液滴は、直線または往復の運動または移動でウェルアレイ上を連続的に移動し得、ウェルアレイ上で一時停止し得る。ウェルアレイ上での液滴の移動および/または液滴の一時停止は、粒子またはビーズ190のウェルアレイ160への堆積を容易にする。ウェルは、1つのビーズ/粒子を含むように寸法決定されている。図4Aに示されるデバイスでは、液滴は、一連または複数の電極145を使用してウェルアレイ上を移動する。ここではビーズ/粒子が図示されているが、検体分子を含む液滴も同様に、かつ不混和性流体がウェルを密封する前に検体分子がウェル内で拡散するのに十分な期間、ウェル上で検体分子を含む液滴を一時停止させることによって移動し得る。ウェルは、1つのビーズ/粒子を含むように寸法決定されている。ウェルはまた、ウェル当たり1つの検体分子を含むように寸法決定され得る。
図4Bは、一連または複数の電極を使用することなく、図3Bの一体型デバイスの第2の部分に移動しており、ウェルアレイ上に位置付けられたビーズまたは粒子190を含む液滴185を示す。図4B中、(不混和性流体などの)疎水性液体195の液滴が、ウェル160内へのビーズ/粒子190の堆積を容易にするためにウェルアレイ上で液滴を移動させるために使用されている。矢印の方向は、液滴185が移動している方向を示す。
図5は、一連または複数の電極57を使用して第1の部分55上を移動している疎水性流体液滴62(例えば、分極性流体)を示す。図示されたデバイス50は、第1の基板51と第2の基板52とを含み、第2の基板52は、第1の基板51上に位置付けられ、間隙53によって第1の基板の上部表面から分離されている。第1の基板51は、試料液滴、試薬液滴などの液滴が第1の基板51上に導入される第1の部分55を含む。第1の基板51は、液滴が移動する第2の部分56を含む。第1の基板51は、第1の基板の第1の部分55における上部表面上に位置付けられた一連または複数の電極57を含む。誘電性材料の層58は、第1の基板の上部表面上に配設され、一連または複数の電極57を被覆する。疎水性材料の層54は、誘電体層58上に重ね合わされる。ウェルアレイ59は、第1の基板51の第2の部分上の疎水性層54内に位置付けられる。ウェルアレイは、親水性または疎水性表面を有し得る。毛管要素60は、第1の基板51および第2の基板52上に疎水性材料の2つのストライプを堆積することによって形成される。疎水性毛管は、第2の部分56内に一連または複数の電極がない場合、疎水性流体液滴62のウェルアレイ59への移動を容易にする。他の実施形態では、毛管要素は、第1の基板51および第2の基板52上に親水性材料の2つのストライプを堆積させることによって形成され得る。親水性材料は、第2の部分56内に一連または複数の電極がない場合、水性液滴のウェルアレイ59への移動を容易にする。ある特定の実施形態では、毛管要素は、一対の疎水性材料のストライプと交互に並ぶ一対の親水性材料のストライプを含み得る。水性液滴は、一対の親水性ストライプが位置付けられる領域に方向付けられ得、不混和性流体の液滴は、一対の疎水性ストライプが位置付けられる領域に方向付けられ得る。
図6は、一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスの別の実施形態を示す。デバイス600は、その上に電極607のアレイが形成される底部層601を含む。電極のアレイは、誘電体層608によって被覆される。疎水性層609は、底部基板の第1の部分605内にのみ配設されている。親水性層610は、底部基板601の第2の部分606上に配設されている。ウェルアレイは、親水性層610内の第2の部分内に配置されている。間隙/空間603によって底部基板から分離された頂部基板602も図示されている。頂部基板602は、底部基板の第1の部分上の頂部基板の底部表面上に配設された誘電体層608を含む。頂部基板は、底部基板の第2の部分の向かいの頂部基板の底部表面上に配設された親水性層610を含む。水性液滴611は、疎水性層を湿潤せず、親水性の第2の部分に達すると、液滴611は、ウェルアレイ619上に広がり、それにより受動的毛管力を介した水相の移動を容易にする。同様に、上記の概念は逆にされて、湿潤およびウェル上の有機ベースの不混和性流体の広がりを容易し得る。この場合、第2の部分上の頂部および底部基板は、疎水性材料/コーティングでコーティングされ、それにより有機ベースの不混和性流体が受動的毛管力を介してウェル上で流動することを可能にし得る。
本明細書で使用される場合、デジタルマイクロ流体は、マイクロ流体デバイス内の液滴を操作する、例えば狭い空間内で液滴を移動させる、液滴を分割する、液滴を融合するための一連の電極の使用を指す。本明細書で使用される場合、「液滴(複数可)」および「流体液滴(複数可)」という用語は、略球状の形状であり、マイクロ流体デバイスの壁または基板に少なくとも一方の側が隣接している個別体積の液体を指すために互換的に使用される。液滴との関連での略球状は、球状、部分的に平坦な球状、例えば円盤形状、スラグ形状、切頭球体、楕円、半球状、または卵形などの形状を指す。本明細書に開示されるデバイス内の液滴の体積は、約10μL~約5pL、例えば10μL~1pL、7.5μL~10pL、5μL~1nL、2.5μL~10nL、または1μL~100nLの範囲、例えば10μL、5μL、1μL、800nL、500nL、またはそれ以下であり得る。
いくつかの例では、ウェルアレイは、複数の個々のウェルを含む。ウェルアレイは、1mm2当たりの数が10~109の範囲であり得る複数のウェルを含み得る。ある特定の場合、約12mm2の面積を被覆する約100,000~500,000ウェル(例えば、フェムトリットルウェル)のアレイが製造され得る。各ウェルは、幅約4.2μm×深さ3.2μm(体積約50フェムトリットル)であり得、単一のビーズ/粒子(直径約3μm)を保持することが可能であり得る。この密度では、フェムトリットルウェルは、互いに約7.4μmの距離離間している。いくつかの例では、ウェルアレイは、10nm~10,000nmの直径を有する個々のウェルを有するように製造され得る。
ウェル内に単一のビーズ/粒子/検体分子を配置することにより、デジタル読み取りまたはアナログ読み取りのいずれかが可能になる。例えば、少数の陽性ウェル(<約70%陽性)については、デジタル形式で検体濃度を定量化するためにポアソン統計が使用され得、多数の陽性ウェル(>約70%)については、シグナル保持ウェルの相対強度が単一のビーズ/粒子/検体分子のそれぞれから発生したシグナル強度と比較され、アナログシグナルを発生するために使用される。デジタルシグナルは、より低い検体濃度に使用され得、一方、アナログシグナルは、より高い検体濃度に使用され得る。デジタルおよびアナログ定量化の組み合わせが使用され得、それは線形ダイナミックレンジを拡大し得る。本明細書で使用される場合、「陽性ウェル」とは、ビーズ/粒子/検体分子の存在に関連するシグナルを有するウェルを指し、そのシグナルは、閾値を上回る。本明細書で使用される場合、「陰性ウェル」とは、ビーズ/粒子/検体分子の存在に関連するシグナルを有し得ないウェルを指す。ある特定の実施形態では、陰性ウェルからのシグナルは、バックグラウンドレベル、すなわち閾値未満であり得る。
ウェルは、平坦な底部表面を有する円筒形、丸みを帯びた底部表面を有する円筒形、立方形、立方体状、円錐台形、逆円錐台形、または円錐形などの様々な形状のうちのいずれかであり得る。ある特定の場合、ウェルは、ウェルアレイ上を移動したマイクロビーズまたは微粒子存在液滴の受容および保持を容易にするように配向され得る、側壁を含み得る。いくつかの例では、ウェルは、第1の側壁と第2の側壁とを含み得、第1の側壁は、第2の側壁の反対側にあり得る。いくつかの例では、第1の側壁は、ウェルの底部に対して鈍角に配向され、第2の側壁は、ウェルの底部に対して鋭角に配向される。液滴の移動は、ウェルの底部と平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向であり得る。
いくつかの例では、ウェルアレイは、成形、圧力、熱、もしくはレーザ、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上によって製造され得る。いくつかの例では、ウェルアレイは、ナノインプリント/ナノスフェアリソグラフィを使用して製造され得る。当技術分野で周知の他の製造方法も使用され得る。
図7A~図7Bは、ウェルのいくつかの例示的な側壁の配向を示す。図7A~Bに示されるように、ウェルは、第2の側壁と反対側の第1の側壁を含む。図7Aは、ウェルアレイ内の個々のウェル460を示す垂直断面図である。図7Aは、第1の側壁401と第2の側壁402とを示す。第1の側壁は、ウェルの底部表面143に対して鈍角であり、第2の側壁は、ウェルの底部表面143に対して鋭角である。矢印は、液滴がアレイにわたって移動する方向を示す。ウェルの側壁のこの配向は、ビーズ/粒子/検体分子490の受容および保持を容易にする。
図7B中、第1の側壁410の頂部部分415は、ウェルの底部412に対して鈍角に配向され、第1の側壁410の底部416は、ウェルの底部412に対して垂直に配向され、第2の側壁411は、ウェルの底部412に対して垂直に配向され、液滴の移動は、ウェルの底部と平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向であり、第1の側壁の頂部部分は、ウェルの開口部にある。
本明細書に記載される一体型デバイスは、多くの方法によって製造され得る。ある特定の場合、方法は、第1の基板、一連または複数の電極、誘電体層、および疎水性層を構成するために、レーザアブレーション、スプレーコーティング、ロールツーロール、フレキソ印刷、およびナノインプリントリソグラフィ(NIL)の組み合わせを伴い得る。
いくつかの例では、複数のローラが第1のロールを巻き出して第1の基板を第1の位置に駆動し得る。次いで、導電材料が第1の基板に適用され得る。導電材料は、一連または複数の電極にパターン化され得る。いくつかの例では、プリンタデバイスは、疎水性または誘電性の材料のうちの少なくとも1つを第1の基板上の少なくとも1つの電極パターンに適用するための1つ以上のコーティングローラを備える。いくつかの例では、コーティングローラは、防汚材料を第1の基板に適用するするためのものである。
いくつかの例では、システムは、第1の基板を第2の基板と整合するためのマージャーをさらに備える。いくつかの例では、マージャーは、2つのローラを備える。また、開示された例のうちのいくつかは、疎水性材料または誘電材料を硬化するための硬化ステーションを含む。開示された例のうちのいくつかはまた、第1の基板の少なくとも第1の部分を第2の基板の少なくとも第1の部分と接合するための接合ステーションを含む。接合部分は、電極パターンを含む。方法はまた、離間した距離で第1の基板および第2の基板を関連付けることを含む。第1の基板と第2の基板との間の空間は、高さが約0.01mm~1mm、例えば、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、20μm、50μm、100μm、140μm、200μm、300μm、400μm、500μm、1μm~500μm、100μm~200μmなどであり得る。
いくつかの例では、方法は、第1の基板をエンボス加工して、第1の基板上に1つ以上の突出部を形成することを含む。そのような例では、突出部は、離間した距離で第1の基板および第2の基板を分離するためのものである。
本開示のデバイスは、手動または自動または半自動で動作し得る。ある特定の場合、デバイスは、検体関連シグナルを発生させ、シグナルを検出するために必要なステップを実施するためのプログラムを実行するプロセッサによって動作し得る。本明細書で使用される場合、「検体関連シグナル(analyte related signal)」または「検体関連シグナル(analyte associated signal)」という語句は、検体の存在を示し、試料中の検体の量に比例するシグナルを指す。シグナルは、蛍光、化学発光、比色、比濁などであり得る。ある特定の場合、読み取りはデジタルであり得、例えば、陽性計数(例えば、ウェル)の数は、陰性計数(例えば、ウェル)の数と比較されてデジタル計数を得る。
図8は、一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスのベース基板を形成するための第1の例示的なシステムまたはアセンブリ500の図である。第1の例示的なアセンブリ500は、第1の例示的なアセンブリ500を通してベース基板508を駆動するように同期回転で動作する、第1のローラ502と、第2のローラ504と、および第3のローラ506とを含む、一連または複数のローラを含む。第1の例示的なアセンブリ500は、ロールツーロール技法を使用して、アセンブリを通してベース基板508を移動させるために、第1~第3のローラ502、504、506に加えてローラを含むことができる。他の例では、コンベヤ、プーリ、および/または任意の他の好適な輸送機構(複数可)を使用し得る。
第1の例示的なアセンブリ500では、第1のローラ502が回転して、いくつかの例においてロール構成の単一シートであるベース基板508を巻き出す。ベース基板508は、第1の層510と第2の層512とを含む。この例では、第1の層510は、例えばプラスチックなどの非導電性可撓性基板またはウェブを含み、第2の層512は、導電材料を含む。第2の層512の導電材料は、例えば金、銀、もしくは銅などの金属、または導電性ポリマーなどの非金属導体であり得る。他の例では、異なる金属(複数可)、または金属(複数可)および/もしくは導電性ポリマー(複数可)の組み合わせ(複数可)が使用され得る。いくつかの例では、ベース基板508は、非導電性の第1の層510と導電性の第2の層512との間に配設された任意の接着剤層513を含む。一例として、接着剤層513は、クロムを含むことができ、導電性の第2の層512を形成するためにクロム接着剤層513の上に金の層が配設される。したがって、図8のベース基板508では、第1のローラ502によって巻き出される前に、非導電性の第1の層510および導電性の第2の層512が予め接着されてベース基板508を形成する。
図8の例示的なベース基板508では、非導電性の第1の層510は、約500nm未満の厚さを有する。以下に記載されるように、そのような厚さは、ベース基板508が複数のローラを介して例示的な第1のアセンブリ500を通して移動することを可能にする。また、いくつかの例では、非導電性の第1の層510の厚さは、導電性の第2の層512の厚さより大きい。一例として、導電性の第2の層512の厚さは、約30nmであり得る。他の例では、導電性の第2の層512の厚さは、約500nm未満である。いくつかの例では、非導電性の第1の層510および/または導電性の第2の層512の厚さは、例えば、第1および/もしくは第2の層510、512の材料、ならびに/またはベース基板508から形成された液滴アクチュエータが使用されるべき動作目的に基づき選択される。
第1のローラ502は、ベース基板508をレーザアブレーションステーション514に駆動する。レーザアブレーションステーション514は、ベース基板508の導電性の第2の層512上に投影されるべきマスターパターン518を含むマスク516を含む。マスク516に関連付けられたマスターパターン518は、解像度(例えば、除去されるベース基板508の面積当たりの電極数)、電極サイズ、電極パターンを画定する線の構成、電極の交互嵌合、電極間の間隙もしくは間隔、および/または電源などの器具に電極を接続するための電気トレースなどの特性に基づき事前定義され得る。いくつかの例では、マスターパターン518の特性は、(例えば、生物学的および/または化学的アッセイで使用するために)ベース基板508が関連付けられるべき液滴アクチュエータの1つ以上の動作上の使用に基づき選択される。また、いくつかの例では、マスターパターン518は、レーザアブレーションステーション514がベース基板508上に異なるパターンを形成することを可能にするように構成可能または再構成可能である。加えて、またはあるいは、いくつかの例では、マスク516は、1つ以上の代替マスクと交換可能である。
レーザアブレーションステーション514は、レンズ520を含む。ローラ(例えば、第1のローラ502)の回転の結果として、ベース基板508がレーザアブレーションステーション514に接触すると、ベース基板508の一部分522は、レンズ520の下を通るか、またはそれを通過する。部分522は、例えば、ベース基板508の面積よりも小さい面積を有し、導電性の第2の層512を含むベース基板508の矩形または正方形の断面であり得る。レンズ520は、マスターパターン518の少なくとも一部分を、部分522に関連する導電性の第2の層512上に撮像または投影する。レーザビーム524は、マスク516およびレンズ520を介して部分522に方向付けられ、これによりレーザビーム524は、投影されたマスターパターン518に基づき導電性の第2の層512を選択的に透過する。いくつかの例では、投影されたマスターパターン518に基づき、非導電性の第1の層500または一部分(例えば、非導電性の第1の層510の厚さの一部)は、レーザビーム524によって透過され得る。マスク516の固体部分は、レーザビーム524を遮断し、マスク516の開放部分は、レーザビーム524がマスク516を通過してベース基板508と接触することを可能にする。レーザビーム524は、例えばエキシマレーザに関連付けられ得る。
レーザビーム524への曝露の結果として、部分522の照射された非導電性の第1の層510は、レーザビーム524に関連したエネルギーを吸収する。照射された非導電性の第1の層510は、光化学的解離を受け、その結果、非導電性の第1の層510の構造接合が選択的に分解され、非導電性の第1の層510のフラグメントおよびマスターパターン518に従って照射された非導電性の第1の層510に重なり合う導電性の第2の層512の部分が放出される。いくつかの例では、レーザビーム524がベース基板508を透過する深さ(例えば放射強度)は、非導電性の第1の層510および/または導電性の第2の層512の深さ(例えば厚さ)に基づき事前定義される。いくつかの例では、レーザビーム524の透過深度は、下部の非導電性の第1の層510の断片化の結果として、レーザビーム524が導電性の第2の層512をアブレーションする深さを変化させるように調節可能である。いくつかの例では、この調節は、例示的なシステム500が動作するときに動的である。また、いくつかの例では、ベース基板508は、粒子および/または表面汚染物質を除去するためにレーザビーム524への曝露後に洗浄を受ける。
図8に示されるように、レーザアブレーションステーション514に曝露された後、ベース基板508の部分522は、電極アレイ526を含む。電極アレイ526は、導電性の第2の層512に形成された複数の電極からなる。レーザビーム524への曝露および非導電性の第1の層510の断片化の結果として、導電性の第2の層512の一部分がベース基板508から除去される。電極アレイ526に関連する除去された部分は、マスターパターン518に基づく。いくつかの例では、除去された部分は、マスク516の開放部分と一致する。
図8に戻ると、部分522がレーザアブレーションステーション514でレーザアブレーションを受けて電極アレイ526を形成した後、部分522は、第1~第3のローラ502、504、506の回転を介してプリンタ528に移動する。第1の例示的なアセンブリ500では、プリンタ528は、疎水性および/または誘電性特性を有する材料530の少なくとも1つの層を電極アレイ526に適用することが可能な装置または器具を含む。第1の例示的なアセンブリ500では、プリンタ528は、ウェブベースのコーティング(例えば、プリンタ528に関連するローラを介する)、スロットダイコーティング、スピンコーティング、化学蒸着、物理蒸着、および/または原子層堆積が挙げられるが、これらに限定されない堆積技法を介して、疎水性および/または誘電性の材料530を堆積することができる。プリンタ528はまた、疎水性および/または誘電性の材料530に加えて他の材料(例えば、防汚コーティング、抗凝固剤)を適用することができる。また、プリンタ528は、異なる厚さを有し、かつ/またはベース基板508の異なる部分を被覆する材料(複数可)の1つ以上の層を適用することができる。
上記のように、第1の例示的なアセンブリ500では、第1~第3のローラ502、504、506のうちの少なくとも1つは、疎水性および/または誘電性の材料530を電極アレイ526に適用するために、ベース基板508をプリンタ528に前進させる。いくつかの例では、プリンタ528は、例えばローラコーティング法を介して、疎水性および/または誘電性の材料530を適用する際のプリンタ528の動作の一部として、ベース基板508の送りおよび位置合わせの精度を促進するための複数の位置合わせローラ531を含む。
第1の例示的なアセンブリ500では、疎水性および/または誘電性の材料530が電極アレイ526に適用されて、電極アレイ526を完全にまたは実質的に完全に絶縁する。
いくつかの例では、疎水性および/または誘電性の材料530は、プリンタ528を介して実質的に液体の形態で堆積される。液滴を支持するためにベース基板508上に構造層または処理層532を形成するために、部分522は、硬化ステーション534を通って、ローラ(例えば第1~第3のローラ502、504、506)を介して移動する。硬化ステーション534において、疎水性および/または誘電性の材料は、第1の処理層532を形成するように処理および/または改質される。疎水性および/または誘電性の材料を処理および/または改質することは、材料を硬化させることを含むことができる。例えば、硬化ステーション534において、疎水性および/または誘電性の材料530の硬化を促進するために熱が加えられる。いくつかの例では、部分522は、疎水性および/または誘電性の材料530を硬化させ、処理層532を形成して電極アレイ526を絶縁するために、紫外線に曝露される。他の例では、疎水性および/または誘電性の材料の硬化および/または改質は、熱および/または光子源なしで達成される。いくつかの例では、液滴を操作するために(例えば、電極アレイ526に関連して)電界が印加されると、処理層532は、液滴を支持する。例えば、エレクトロウェッティングプロセス中、処理層532に対する液滴の接触角は、印加電圧の結果として変化し、これは処理表面532上の液滴の表面張力に影響を与える。エレクトロウェッティングは単に例示的なものであり、液滴は、同様に他の力を使用して移動し得る。
硬化ステーション534を通過した後、部分522は、液滴アクチュエータの底部基板として、および/またはデジタルマイクロ流体チップとして機能するように準備される。ベース基板508が、上記に開示されるように、導電性の第2の層512と接合された非導電性の第1の層510を含むため、例えば電極アレイ526の非導電性の第1の層510への追加の接着は、不要である。そのような構成は、処理ステップを低減することによって液滴アクチュエータ用のベース基板508の準備の効率を高める。また、上記のように、部分522がレーザアブレーションステーション514、プリンタ528、または硬化ステーション534のうちのいずれかにあるとき、ベース基板508の他の部分は、第1の例示的なアセンブリ500の対応するステーション514、528、534の他の部分を通ってして同時に移動している。例えば、部分522が硬化ステーション534にあるとき、第1~第3のローラ502、504、506は、例えばレーザアブレーションステーション514および/またはプリンタ528を介して、ベース基板508の1つ以上の他の部分を連続的に、周期的に、または非周期的に前進させている。このようにして、液滴アクチュエータ用のベース基板508の準備は、実質的に連続的な高速自動化プロセスを介して達成される。
硬化ステップ後、パターンローラは、ベース基板の第2の部分上を転がってウェルアレイ540を形成する。アレイウェル540は続いて、親水性材料(図示せず)でコーティングされ得る。
ベース基板508は連続的な部分を含むと考えられ得るが、第1の例示的なアセンブリ500のいくつかの例示的な動作中、連続的な部分が電極アレイ526を形成するための処理(電極パターンを介する)を受け、疎水性および/または誘電性の材料530のコーティングを受けるときに、ベース基板508は、単一シートのままである。したがって、処理されたベース基板508を使用して1つ以上の液滴アクチュエータを形成するために、いくつかの例では、ベース基板508は、以下にさらに開示されるように、切断(例えばダイシング)されて電極アレイ526を含む個々のユニットを形成する。いくつかの例では、ダイシングの前に、部分522を含むベース基板508は、第1のローラ502によって巻き出される前のベース基板508の最初の巻き取り構成と同様の巻き取り構成に巻き戻される。そのような巻き戻しは、ロールツーロール処理の一部として1つ以上のローラを介して達成され得る。そのような例では、ベース基板508は、後にダイシングされ得るか、または別様に分離され得る。他の例では、ローラ(例えば、第2および第3のローラ504、506)は、頂部基板と融合するためにベース基板508を前進させる。
図9は、単一電極を有する液滴アクチュエータの例示的な頂部基板を形成するための第2の例示的なアセンブリ600を示す。第2の例示的なアセンブリ600は、第2の例示的なアセンブリ600を通して頂部基板608を駆動するように同期回転で動作する、第1のローラ602と、第2のローラ604と、および第3のローラ606とを含む、一連または複数のローラを含む。第2の例示的なアセンブリ600は、アセンブリ600を通して頂部基板608を移動させるために、第1~第3のローラ602、604、606に加えてローラを含むことができる。
第2の例示的なアセンブリ600では、第1のローラ602が回転して、いくつかの例においてロール構成のシートである頂部基板608を巻き出す。図9の例示的な頂部基板608は、第1の層610と第2の層612とを含む。例示的なベース基板508と同様に、この例では、頂部基板608の例示的な第1の層610は、例えばプラスチックなどの非導電性材料を含み、例示的な第2の層612は、例えば金、クロム、銀、インジウムスズ酸化物、もしくは銅のうちの1つ以上、ならびに/または任意の他の好適な金属(複数可)、導電性ポリマー(複数可)、または金属(複数可)および/もしくは導電性ポリマー(複数可)の組み合わせを含む金属などの導電材料を含む。いくつかの例では、導電性の第2の層612は、接着剤層(例えばクロム)を介して非導電性の第1の層に接着される。
第2の例示的なアセンブリ600では、第1~第3のローラ602、604、606が回転して頂部基板612をプリンタ614に前進させる。プリンタ614は、導電性の第2の層612を疎水性および/または誘電性の材料616(例えば、Teflon(登録商標)もしくはパリレンC、またはセラミックなどの誘電体)でコーティングする。プリンタ614は、図8の第1の例示的なアセンブリ500のプリンタ528と実質的に同様である。例えば、プリンタ614は、ウェブベースのコーティング、スロットダイコーティング、スピンコーティング、化学蒸着、物理蒸着、原子層堆積、および/または他の堆積技法を介して、疎水性および/または誘電性の材料616を頂部基板608に適用することができる。プリンタ614は、疎水性および/もしくは誘電性の材料616ならびに/または他のコーティング材料の適用中、プリンタ614に対する頂部部基板608の整合を容易にするために位置合わせローラ617を含むことができる。
疎水性および/または誘電性の材料616のコーティングを受けた後、第2のローラ504および第3のローラ506は,部分618を硬化ステーション620に前進させる。図8の硬化ステーション534に関連して開示されるように、第2の例示的なアセンブリ600の硬化ステーション620は、処理層622を形成するための熱を介した疎水性材料の改質(例えば硬化)を容易にする。処理層622は、導電性の第2の層612を完全にまたは実質的に完全に被覆することによって、頂部基板608の単一電極として機能する導電性の第2層612を絶縁する。したがって、部分618の第2の層612をコーティングする際に、頂部基板608の電位伝導部分は、部分618を含む液滴アクチュエータに適用され得る液滴から絶縁される。
硬化ステーション620を通過した後、部分618は、液滴アクチュエータの頂部基板として機能するように準備される。頂部基板608は、導電性の第2の層612に予め接着された非導電性の第1の層610を含むため、例えば、非導電性の第1の層610への電極の追加の接着は不要であり、それにより液滴アクチュエータ用の頂部基板608の準備の効率を高める。
第2の例示的なアセンブリ600では、第1~第3のローラ602、604、606が回転して頂部基板608を前進させ、これにより頂部基板の一部分は、第2の例示的なアセンブリ60のロールツーロール動作の一部として、実質的に連続的、周期的、および/または非周期的に連続して、プリンタ614または硬化ステーション620のうちの1つを通過する。したがって、第2の例示的なアセンブリ600は部分618に関連して説明されているが、頂部基板608の連続部分は、第1~第3のローラ602、604、606の回転の結果として、部分618と実質的に同じ方法で準備される。このようにして、頂部基板308には、頂部基板608の長さに沿って処理層622が設けられる。
例示的な頂部基板608では、導電性の第2の層612が電極として機能する。しかしながら、いくつかの例では、導電性の第2の層612は、レーザアブレーションを受けて1つ以上の電極アレイを形成する。そのような例では、第2の例示的なアセンブリ600は、レーザアブレーションステーションを含む。したがって、疎水性材料616を受容する前に、頂部基板608は、レーザビームに曝露され、それによって照射された導電性の第2の層612に電極パターンが形成される。また、いくつかの例では、電極アレイは、ベース基板の上/中には形成されず、頂部基板608の上/中にのみ形成される。
第2の例示的なアセンブリ600の動作中、頂部基板608の連続部分が疎水性材料616でコーティングされているため、頂部基板は、単一シートのままである。1つ以上の液滴アクチュエータの製造の一部として、頂部基板608は、ベース基板と整合される。いくつかの例では、硬化ステーション620を通過した後、頂部基板は、1つ以上のローラを介して巻き取り構成に巻き戻される。そのような例では、完成したロールは、離間した距離で整合される個々とのユニットにダイシングされるか、または別様に切断および/もしくは分離され、ベース基板の個々のダイシングされたユニットと接着されて、液滴アクチュエータを形成し得る。
他の例では、硬化ステーション620を通過した後、ローラ(例えば第1~第3のローラ602、604、606)は、自動ロールツーロール処理を介して頂部基板608をベース基板と融合するために、頂部基板608を前進させ続ける。そのような例では、ベース基板508との整合のために頂部基板608を準備するために、第1~第3のローラ602、604、606は、ベース基板に対する頂部基板の配向を逆にするように回転し、これによりベース基板508および頂部基板608が平行構成で整合されているとき、ベース基板の処理層は、頂部基板608の処理層622に面する。
図10に示されるように、第3の例示的なアセンブリ650は、ベース基板508および頂部基板608が第3の例示的なアセンブリ650の対応する第1のローラ652および第2のローラ654を介して供給される一対の融合ローラを形成する、第3のローラ656と第4のローラ608とを含む。融合ローラ656、658の各々が回転すると、ベース基板658および頂部基板658は、所定の離間した距離または間隙において平行構成で整合される。
例示的な第3のアセンブリ650は、接合ステーション664を含む。接合ステーション664は、液滴アクチュエータを製造することの一部として、ベース基板508および頂部基板608を結合または接合する。例えば、接合ステーション664において、1つ以上の接着剤が、ベース基板508および/または頂部基板608の所定の部分(例えば、結果として生じる液滴アクチュエータの周囲を画定するベース基板508および/または頂部基板608の一部分)に選択的に適用されて、間隙662を維持しながら、ベース基板508と頂部基板608との間に接合を形成し得る。いくつかの例では、接合ステーション664で基板508、608を接合することは、間隙662を形成することを含む(例えば、接着剤を塗布する前に)。
接着ステーション664で使用され得る接着剤(複数可)の例としては、エポキシ、ホイル、テープ、および/または紫外線硬化接着剤が挙げられる。いくつかの例では、SU-8および/またはポリジメチルシロキサン(PDMS)などのポリマーの層が、基板を接合するためにベース基板508および/または頂部基板608に適用される。また、いくつかの例では、接合ステーション664は、例えば紫外線を介した接着剤(複数可)の硬化を提供する。接合ステーション664は、ベース基板658および頂部基板608を接合するために、例えば熱(例えば熱接合)、圧力、硬化などを伴う1つ以上の方法を適用し得る。
例示的な第3のアセンブリ650では、融合部分660は、選択的に切断、ダイシング、または分離されて、融合部分660によって図10に実質的に表されているように、1つ以上の液滴アクチュエータを形成することができる。例示的な第3のアセンブリ650は、ダイシングステーション666を含む。ダイシングステーション666は、例えば、切断デバイス、スプリッタ、またはより一般的には、連続的な融合部分660を個々の液滴アクチュエータに対応する個別のユニットに分割するための器具であり得る。融合部分660は、例えば、各液滴アクチュエータが電極アレイの設置面積と、電極パターンを介して形成される他の電極とを含むように、電極パターンに基づき個々の液滴アクチュエータに切断され得る。
図11Aは、その上で電極のアレイが第1の部分73および第2の部分74内に存在する底部基板70の上面図を示す。第2の部分上にウェルアレイを製造するステップ71の後の底部基板72が示されている。図11Bは、第1の部分83内にのみ配設された電極のアレイを有する底部基板80の上面図を示す。ウェルアレイが第2の部分84内に形成されるステップ81の後の底部基板82が図示されている。
ウェルアレイは、誘電体/疎水性層、疎水性層(存在する場合)、または親水性層(存在する場合)の上に製造され得る。第1の基板の疎水性層上にウェルアレイを製造するための1つの例示的な方法は、熱または紫外線ナノインプリントリソグラフィを使用する。図12Aは、ウェルアレイ760パターンを形成するために、平坦なナノインプリントモールド770を利用して第1の基板710の第2の部分で疎水性層750に十分な圧力を加えることによって、ウェルアレイを製造するための1つの例示的な方法を示す。この例では、ナノインプリントスタンパは、そのスタンピング輪郭が第2の層の上部表面に対応する平坦なスタンピング要素であり得る。
図12Bは、ウェルアレイのパターンを第1の基板の第2の部分の疎水性層に適用するために、ナノインプリントローラ775が利用され得る別の例示的な方法を示す。ナノインプリントローラは、ローラ775を一方向に前進させることによって、第1の基板710の疎水性層750上にパターンをインプリントし得る。ローラが一方向に前進するにつれて、ローラは、ローラ上のインプリントパターンに対応するウェルアレイ760のパターンのインプリントを残す。一例では、ローラ775が第1の基板710の疎水性層750上にパターンをインプリントすると、ローラ775は、反時計回り方向に回転する。ローラまたはスタンパは、好適な体積のウェルを形成するように変更され得、例えばフェムトリットルローラまたはスタンパがフェムトリットルウェルを形成するために使用され得る。
図12Cは、第1の基板の第2の部分の疎水性層にウェルアレイのパターンを形成する別の例示的方法を示す。この例では、疎水性層750の上部表面をアブレーションするために、レーザが適用され得る。レーザアブレーションステップは、第2の層上にウェルアレイ760パターンを形成することができる。第2の層をアブレーションするのに好適なレーザのいくつかの例は、フェムト秒およびピコ秒レーザを用いたパラメータを含む。いくつかの例では、レーザアブレーションステップは、必要とされるウェルアレイパターンを画定するための特別なマスクの使用を含む。いくつかの例では、レーザ775は、集束要素777(例えばレンズ)を利用して、パターンを正確に目標にしアブレーションする。いくつかの例では、レーザアブレーションステップに続いて、ウェルアレイは、誘電体層および/または疎水性層でコーティングされ得る。
図12Dは、第1の基板710の第2の部分の誘電体層740上にウェルアレイ760のパターンを形成するさらに別の例を示す。図12Dに示されるように、方法は、ロールツーロール製造を利用して、マイクロ流体構成要素およびウェルアレイを別々に製造する。一例では、第1のロール725は、第1の基板710を含むマイクロ流体構成要素を含み、第1の基板は、一連または複数の電極745と、第1の基板の上部表面上に配設され、かつ一連または複数の電極745を被覆する誘電体層740とを備える。第2のロール780は、ウェルアレイ760のパターンがすでに基板上に含まれている基板750を含む。いくつかの例では、基板750上に予め含まれているウェルアレイ760のパターンが、熱またはUVナノインプリントリソグラフィによって適用され得る。他の例では、ウェルアレイのパターンは、レーザアブレーションによって基板上に予め含まれ得る。図12Dに示されるように、インプリントされた第2のロール780はまた、ウェルアレイの基板上にインプリントされた疎水性コーティングを含み得る。別々のロールは、ローラ705および708を介して巻き出され、次いで、ウェル基板をマイクロ流体構成要素基板上に重ね合わせることによって2つのフィルムが一緒に積層されて、ウェルアレイおよびマイクロ流体構成要素の積層構成を形成し得るラミネーションプロセスに供される。
本明細書に記載されるように、「ロールツーロール」は、等価語「リールツーリール」を含み得、例えば毎秒数メートルの速度を含む高速で基板を様々な構成要素を通して移動させることによって動作する。ロールツーロールアセンブリは、ロール状基板の巻き出し、構成要素を通る基板の前進、および処理された基板のロールへの巻き戻しを容易にする。
前述のように、第1および第2の基板の第2の部分によって形成された検出モジュールは、検体関連シグナルを検出するために使用される。いくつかの例では、対象となる検体または生物学的試料の検出は、光シグナル検出を通して起こり得る。例えば、シグナル強度の結果を測定するために励起光(例えばレーザ)を照らす。他の例では、所望の検体は、各ウェルチャンバから発する光シグナルを測定することによって検出され、その結果を定量化することによって定量化され得る。例えば、陽性計数(例えば、ウェル)の数は、デジタル分析を介して陰性計数(例えば、ウェル)の数と比較される。デバイスのウェルからの様々なシグナルが検出され得る。例示的なシグナルとしては、蛍光、化学発光、比色、比濁などが挙げられる。
本明細書に記載されるデバイスは、検体関連シグナルを発生させ、そのシグナルを定量化するために使用され得る。例示的な方法が図15に示されている。図15のデバイスは、電極81のアレイを有する頂部基板80を含む。頂部基板は、デバイスの第2の部分内にウェルアレイ83を含む底部基板82から離間して位置付けられる。粒子またはビーズまたは検体分子(図示せず)を含む液滴84は、電極81を使用してウェルアレイ83に移動し得る。粒子またはビーズまたは検体分子がウェル内に移動するのを可能にするのに十分な期間の後、液滴84は、廃棄物チャンバ/吸収パッドなどに移動し得る。次いで、緩衝液85の液滴がウェルアレイに移動して、ウェル内に堆積していない任意の粒子またはビーズを除去し得る。場合によっては、緩衝液滴は、液滴84を廃棄物チャンバまで押し得る。不混和性流体の液滴86は、ウェルアレイ上で移動し、ウェルを密封し得る。ウェルを光学的に調査する前に、いかなる余分な液滴86も除去され得る。
図16は、デジタルマイクロ流体電極(電極145)が、粒子/ビーズまたは検体分子190を含む液滴180をウェルアレイ160上に位置付ける方法を示す。粒子/ビーズ/検体分子がウェル内に堆積するのに十分な期間の後、液滴は、不混和性液体195(または本明細書で説明されるような不混和性液体)の液滴によって置き換えられる。不混和性液体の液滴は、ウェル内に堆積されていない任意のビーズ/粒子/検体分子を有する液滴180をウェルから離して移動させ、ウェルを被覆するように機能する。
図17は、ウェルに堆積していない任意のビーズを除去するための別の方法を示す。図17中、ビーズを含む液滴を除去した後、ウェル上には多くのビーズ190が残っている。これらのビーズは、水性液滴を使用して洗い流される。水性液滴185を除去した後、ウェルアレイは、堆積したビーズを含む。次いで、不混和性流体195がウェルアレイ上で移動して、ウェルを密封する。
ウェルアレイ上に位置付けられた液滴からウェル内への粒子/ビーズの移動を容易にするために、多く力が利用され得る。そのような力としては、重力、電気力、磁力などが挙げられる。永久磁石または電磁石が磁力源として使用され得る。ある特定の実施形態では、磁石は、一体型マイクロ流体および検出チップ上に配置されていない。検体分子は、拡散を介してウェル内に堆積され得る。
方法およびデバイスの使用の変形形態
試料中に存在する対象となる検体の存在または量を決定する開示された方法、およびマイクロ流体デバイスの使用は、上記の通りであり得る。開示されたマイクロ流体デバイスの方法および使用はまた、検体を分析するための他の方法を考慮して適合され得る。周知の変形形態の例としては、サンドイッチ免疫測定(例えば、酵素検出(酵素免疫測定(EIA)または酵素結合免疫吸着測定アッセイ(ELISA))を含むモノクローナル-ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ)、競合阻害免疫測定(例えば、フォワードおよびリバース)、酵素増幅免疫測定技法(EMIT)、粒子増強比濁阻害免疫測定(PETINIA)、ホモジニアス酵素免疫測定(HEIA)、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)、一段階抗体検出アッセイ、ホモジニアスアッセイ、ヘテロジニアスアッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイなどのイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、以下の説明が上記の方法と重複することがあり、他の場合には、以下の説明が他の可能性を提供し得る。
イムノアッセイ
対象となる検体、および/またはペプチドもしくはそのフラグメントは、イムノアッセイを使用して分析され得る。任意のイムノアッセイが利用され得る。イムノアッセイは、例えば酵素結合免疫測定(ELISA)、フォワードもしくはリバース競合阻害アッセイなどの競合阻害アッセイ、または競合結合アッセイであり得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識(例えば、1つ以上の蛍光標識、(化学的にまたは光開裂によって開裂され得る)開裂可能なリンカーによって付着された1つ以上のタグなど)が、捕捉抗体および/または検出抗体に付着する。
不均一形式が使用され得る。例えば、試験試料が対象から得られた後、第1の混合物が調製される。混合物は、対象となる検体について評価されている試験試料と第1の特異的結合パートナーとを含み、第1の特異的結合パートナーおよび試験試料に含まれる任意の対象となる検体は、第1の特異的結合パートナー-対象となる検体複合体を形成する。好ましくは、第1の特異的結合パートナーは、対象となる抗検体抗体またはそのフラグメントである。混合物を形成するために試験試料および第1の特異的結合パートナーが添加される順序は、重要ではない。好ましくは、第1の特異的結合パートナーは、固相上に固定化される。イムノアッセイに使用される固相(第1の特異的結合パートナーおよび任意に第2の特異的結合パートナーに対する)は、磁性粒子、ビーズ、ナノビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子、微粒子、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスク、またはチップ(例えば、マイクロ流体チップ)などであるが、これらに限定されない当技術分野で既知の任意の固相であり得る。
1の特異的結合パートナー-対象となる検体複合体を含む混合物が形成された後、任意の未結合の対象となる検体は、当技術分野で既知の任意の技法を使用して、複合体から除去される。例えば、未結合の対象となる検体は、洗浄によって除去され得る。しかしながら、望ましくは、第1の特異的結合パートナーは、試験試料中に存在する任意の対象となる検体を超えて存在し、これにより試験試料中に存在する全ての対象となる検体が、第1の特異的結合パートナーによって結合される。
任意の未結合の対象となる検体が除去された後、第2の特異的結合パートナーが混合物に添加されて、第1の特異的結合パートナー-対象となる検体-第2の特異的結合パートナー複合体を形成する。第2の特異的結合パートナーは、好ましくは、第1の特異的結合パートナーによって結合された対象となる検体上のエピトープとは異なる対象となる検体上のエピトープに結合する、対象となる抗検体(抗体など)である。さらに、また好ましくは、第2の特異的結合パートナーは、検出可能な標識(例えば検出可能な標識、開裂可能なリンカーによって付着されたタグなど)で標識されているか、またはそれを含む。
固定化抗体またはそのフラグメントの使用は、イムノアッセイに組み込まれ得る。抗体は、磁性またはクロマトグラフィマトリクス粒子、ラテックス粒子または改質表面ラテックス粒子、ポリマーまたはポリマーフィルム、プラスチックまたはプラスチックフィルム、平面基板、マイクロ流体表面、固体基材材料片などの様々な支持体上に固定化され得る。
サンドイッチ免疫測定
サンドイッチ免疫測定は、2層の抗体(すなわち捕捉抗体(すなわち少なくとも1つの捕捉抗体)および検出抗体(すなわち少なくとも1つの検出抗体))間の抗原の量を測定する。捕捉抗体および検出抗体は、抗原上の異なるエピトープ、例えば対象となる検体に結合する。望ましくは、捕捉抗体のエピトープへの結合は、検出抗体のエピトープへの結合を妨げない。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、サンドイッチ免疫測定における捕捉抗体および検出抗体として使用され得る。
一般に、少なくとも2つの抗体が試験試料中の対象となる検体を分離および定量化するために用いられる。より具体的には、少なくとも2つの抗体は、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成する対象となる検体または対象となる検体フラグメントのある特定のエピトープに結合する。試験試料中の対象となる検体を捕捉するために、1つ以上の抗体が使用され得(これらの抗体はしばしば「捕捉」抗体または複数の「捕捉」抗体と称される)、対象となる検体にも結合する検出可能な標識(例えば蛍光標識、開裂可能なリンカーによって付着されたタグなど)を有する1つ以上の抗体(これらの抗体はしばしば「検出」抗体または複数の「検出」抗体と称される)が、サンドイッチを完了するために使用され得る。いくつかの実施形態では、アプタマーが第2の結合メンバーとして使用され得る。サンドイッチアッセイでは、抗体のそのエピトープへの結合は、望ましくは、アッセイ中の任意の他の抗体の対応するエピトープへの結合によって減少しない。換言すれば、抗体は、対象となる検体を含むことが疑われる試験試料と接触した1つ以上の第1の抗体が、第2の抗体または後続の抗体によって認識されるエピトープの全部または一部に結合しないように選択され、それにより1つ以上の第2の検出抗体が対象となる検体に結合する能力を妨げない。
一実施形態では、対象となる検体を含有することが疑われる試験試料は、同時または順次のいずれかで少なくとも1つの捕捉抗体(または複数の抗体)および少なくとも1つの検出抗体と接触することができる。サンドイッチアッセイ形式では、対象となる検体(対象となる膜結合性検体、対象となる可溶性検体、対象となる膜結合性検体のフラグメント、対象となる可溶性検体のフラグメント、対象となる検体(対象となる膜結合性もしくは可溶性検体)の変異体、またはそれらの任意の組み合わせを含むと疑われる試験試料が最初に、抗体-対象となる検体複合体の形成を可能にする条件下で、特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも1つの捕捉抗体と接触する。2つ以上の捕捉抗体が使用される場合、多重捕捉抗体-対象となる検体複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、抗体、好ましくは少なくとも1つの捕捉抗体は、試験試料中に予想される最大量の対象となる検体または対象となる検体フラグメントのモル過剰量で使用される。
任意に、試験試料を少なくとも1つの第1の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも1つの捕捉抗体は、試験試料からの抗体-対象となる検体複合体の分離を容易にする固体支持体に結合され得る。平面基板またはビーズなどの形態のポリマー材料から作製された固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の固体支持体が使用され得る。抗体(または複数の抗体)は、吸着によって、化学カップリング剤を使用する共有結合によって、または当技術分野で既知の他の手段によって固体支持体に結合され得、これにより結合は、抗体が対象となる検体または対象となる検体フラグメントに結合する能力を妨げない。さらに、必要に応じて、抗体上の様々な官能基との反応性を可能にするために固体支持体が誘導体化され得る。そのような誘導体化は、無水マレイン酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキニル、および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどであるが、これらに限定されないある特定のカップリング剤の使用を必要とする。
対象となる検体を含むことが疑われる試験試料が少なくとも1つの捕捉抗体と接触した後、試験試料は、捕捉抗体(または複数の捕捉抗体)-対象となる検体複合体の形成を可能にするためにインキュベートされる。インキュベーションは、約4.5~約10.0のpH、約2℃~約45℃の温度、および少なくとも約1分~約18時間、約2~6分、または約3~4分の期間で実施され得る。
捕捉抗体(複数の抗体)-対象となる検体複合体の形成後、次いで、複合体は、少なくとも1つの検出抗体と接触する(捕捉抗体(複数の抗体)-対象となる検体-検出抗体(複数の抗体)複合体の形成を可能にする条件下で)。捕捉抗体-対象となる検体複合体が2つ以上の検出抗体と接触する場合、捕捉抗体(複数の抗体)-対象となる検体-検出抗体(複数の抗体)検出複合体が形成される。捕捉抗体と同様に、少なくとも1つの検出(および後続の)抗体が捕捉抗体-対象となる検体複合体と接触したとき、捕捉抗体(複数の抗体)-対象となる検体-検出抗体(複数の抗体)複合体の形成のために、上記の条件と同様の条件下でのインキュベーション期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも1つの検出抗体は、検出可能な標識(例えば、蛍光標識、開裂可能なリンカーによって付着されたタグなど)を含む。検出可能な標識は、捕捉抗体(複数の抗体)-対象となる検体-検出抗体(複数の抗体)複合体の形成の前、それと同時、またはその後に、少なくとも1つの検出抗体に結合され得る。当該技術分野で既知の任意の検出可能な標識、例えば、蛍光標識、本明細書中で考察されるような開裂可能なリンカー、および当該技術分野で既知の他のものが使用され得る。
アッセイのための混合物を形成するために試験試料および特異的結合パートナー(複数可)が添加される順序は、重要ではない。第1の特異的結合パートナーが検出可能に標識されている場合(例えば、蛍光標識、開裂可能なリンカーで付着されたタグなど)、検出可能に標識された第1の特異的結合パートナー-対象となる検体複合体が生じる。あるいは、第2の特異的結合パートナーが使用され、第2の特異的結合パートナーが検出可能に標識されている場合(例えば、蛍光標識、開裂可能なリンカーで付着されたタグなど)、第1の特異的結合パートナー-対象となる検体-第2の特異的結合パートナーの検出可能に標識された複合体が生じる。標識または非標識にかかわらず、任意の未結合の特異的結合パートナーは、洗浄などの当技術分野で既知の任意の技法を使用して混合物から除去され得る。
次に、対象となる検体またはそのフラグメントの存在を示すシグナルが発生する。発生したシグナルのパラメータに基づき、試料中の対象となる検体の量が定量化され得る。任意に、標準曲線は、質量分析法、重量法、および当技術分野で既知の他の技法によって、既知濃度の対象となる検体の段階希釈物または溶液を使用して生成され得る。
生物学的試料中に存在する対象となる検体を測定または検出するための方法が、本明細書に提供される。そのような方法では、対象となる標的検体を含む試料液滴が、試料中に存在する対象となる標的検体に特異的に結合する第1の特異的結合パートナーが付着しているビーズ(磁気ビーズなど)を含む液滴と融合され得る。融合は、試料液滴中に存在する対象となる検体への第1の特異的結合パートナーの結合を可能にするのに十分な時間インキュベートされ得る単一の液滴を生成する。任意に、試料と第1の特異的結合パートナーとの混合を容易にするために、単一の液滴が撹拌され得る。混合は、単一の液滴を前後に移動させること、単一の液滴を複数の電極上で動き回らせること、液滴を分割して次いで融合すること、またはSAWを使用することなどによって達成され得る。次に、単一の液滴は磁力に供されて、ビーズをデバイス内のある位置に保持し得、一方で液滴は、離れて廃棄物チャンバまたはパッドへと移動し、第2の結合メンバーを含む液滴と交換され得る。第2の特異的結合パートナーは、検出可能に標識され得る。標識は、光学的に検出され得る任意の標識であり得る。例えば、標識は、蛍光標識であり得る。第2の結合メンバーを添加する前に、力(例えば磁気)を使用してビーズが保持されている位置に洗浄緩衝液の液滴を移動させることによって、任意の洗浄ステップが行われ得る。ビーズは、洗浄緩衝液に再懸濁してもしなくてもよい。磁気ビーズが使用される場合、磁力が磁気ビーズに加えられ、洗浄緩衝液は、廃棄物場所に輸送される。第2の特異的結合パートナーが第1の結合メンバーに結合した対象となる検体と結合するのに十分な期間の後、第2の特異的結合パートナーを含む液滴は離れて移動し得、一方でビーズは、その位置に保持されている。ビーズは、洗浄緩衝液の液滴を使用して洗浄され得る。洗浄ステップに続いて、第1の結合メンバー、対象となる検体、および第2の結合パートナーの複合体を有する標識ビーズを含む液滴は、検出モジュールまで移動し得る(例えば、磁気ビーズが使用される場合、磁力の除去などにより)。本明細書で説明されているように、イムノアッセイは、試料調製モジュール内で実施され得る。標識ビーズは、検出モジュール内のウェルアレイ内に沈降され得る。ビーズは、重力を使用して、または電気力もしくは磁力を加えることによって沈降し得る。ウェル内に位置していない任意のビーズを除去するための洗浄ステップに続いて、ウェルは、疎水性液体を使用することによって密封され得る。
フォワード競合阻害
フォワード競合形式では、既知濃度の標識された対象となる検体(例えば、蛍光標識、開裂可能なリンカーで付着されたタグなどを有する検体)のアリコートが使用されて、対象となる検体抗体への結合について、試験試料中の対象となる検体と競合する。
フォワード競合アッセイでは、(抗体などの)固定化された特異的結合パートナーは、順次または同時のいずれかで試験試料、標識された対象となる検体、対象となる検体フラグメント、またはその対象となる検体変異体と接触し得る。対象となる検体ペプチド、対象となる検体フラグメント、または対象となる検体変異体は、開裂可能なリンカーで付着されたタグからなる検出可能な標識を含む任意の検出可能な標識で標識され得る。このアッセイでは、抗体は、固体支持体上に固定化され得る。あるいは、抗体は、微粒子または平面基板などの固体支持体上に固定化されている抗種抗体などの抗体に結合され得る。
生物学的試料中に存在する対象となる検体を測定または検出するための方法が、本明細書に提供される。そのような方法では、対象となる標的検体を含む試料液滴は、試料中に存在する対象となる標的検体に特異的に結合する第1の特異的結合パートナーが付着している磁気ビーズと、検出可能な標識(蛍光標識など)で標識された検体とを含む液滴と融合され得る。任意に、試料と第1の特異的結合パートナーおよび標識された検体との混合を容易にするために、単一の液滴が撹拌され得る。混合は、単一の液滴を前後に移動させること、単一の液滴を複数の電極上で動き回らせること、液滴を分割して次いで融合すること、またはSAWを使用することなどによって達成され得る。次に、単一の液滴は力(磁力など)に供されて、ビーズをデバイス内のある位置に保持し得、一方で液滴は、離れて廃棄物チャンバまたはパッドへと移動し、第2の結合メンバーを含む液滴と交換され得る。磁力を使用してビーズが保持されている位置に洗浄緩衝液の液滴を移動させることによって、任意の洗浄ステップが行われ得る。ビーズは、洗浄緩衝液に再懸濁してもしなくてもよく、ビーズに力(磁気ビーズが使用される場合、磁力など)が加えられ、洗浄緩衝液は廃棄物場所に輸送される。第1の特異的結合パートナーが対象となる検体に結合するのに十分な期間の後、液滴は離れて移動し得、一方でビーズは、その位置に保持されている。任意の洗浄ステップに続いて、第1の結合メンバーおよび対象となる検体の複合体を有する標識ビーズを含む液滴は、検出モジュールまで移動し得る(例えば、磁気ビーズが使用される場合、磁力を除去することなどにより)。本明細書で説明されているように、イムノアッセイは、試料調製モジュール内で実施され得る。標識ビーズは、検出モジュール内のウェルアレイ内に沈降され得る。ビーズは、重力を使用して、または力、例えば電気力もしくは磁力を加えることによって沈降し得る。ウェル内に位置していない任意のビーズを除去するための洗浄ステップに続いて、ウェルは、疎水性液体を使用することによって密封され得る。
標識された対象となる検体、試験試料、および抗体は、サンドイッチアッセイ方式に関連して上に記載された条件と同様の条件下でインキュベートされる。次いで、2つの異なる種の抗体-対象となる検体複合体が生成され得る。具体的には、生成された抗体-対象となる検体複合体のうちの一方は、検出可能な標識(例えば、蛍光標識など)を含み、一方で、他方の抗体-対象となる検体複合体は、検出可能な標識を含まない。抗体-対象となる検体複合体は、検出可能な標識の定量化の前に試験試料の残りから分離され得るが、そうされる必要はない。抗体-対象となる検体複合体が試験試料の残りの部分から分離されるかどうかにかかわらず、次いで、抗体-対象となる検体複合体中の検出可能な標識の量が定量化される。次いで、試験試料中の対象となる検体(対象となる膜結合性検体、対象となる可溶性検体、対象となる可溶性検体のフラグメント、対象となる検体(対象となる膜結合性もしくは可溶性検体)の変異体、またはそれらの任意の組み合わせ)の濃度が、例えば上記のように決定され得る。
リバース競合アッセイ
リバース競合アッセイでは、固定化された対象となる検体が、順次または同時のいずれかで、試験試料および少なくとも1つの標識抗体と接触し得る。
生物学的試料中に存在する対象となる検体を測定または検出するための方法が、本明細書に提供される。そのような方法では、対象となる標的検体を含む試料液滴は、試料中に存在する対象となる標的検体に特異的に結合し、検出可能な標識(蛍光標識など)で標識された第1の特異的結合パートナーと、対象となる検体が付着している磁気ビーズとを含む液滴と融合され得る。融合は、試料液滴中に存在する対象となる検体への第1の特異的結合パートナーの結合を可能にするのに十分な時間インキュベートされ得る単一の液滴を生成する。任意に、試料と第1の特異的結合パートナーとの混合を容易にするために、単一の液滴が撹拌され得る。混合は、単一の液滴を前後に移動させること、単一の液滴を複数の電極上で動き回らせること、液滴を分割して次いで融合すること、またはSAWを使用することなどによって達成され得る。次に、単一の液滴は磁力に供されて、ビーズをデバイス内のある位置に保持し得、一方で液滴は、離れて廃棄物チャンバまたはパッドへと移動し、第2の結合メンバーを含む液滴と交換され得る。磁力を使用してビーズが保持されている位置に洗浄緩衝液の液滴を移動させることによって、任意の洗浄ステップが行われ得る。ビーズは、洗浄緩衝液に再懸濁してもしなくてもよく、磁気ビーズに磁力が加えられ、洗浄緩衝液は廃棄物場所に輸送される。第1の特異的結合パートナーが結合した対象となる検体と結合するのに十分な期間の後、磁力が除去され得、第1の結合メンバー、対象となる検体の複合体を有する標識ビーズを含む液滴は、検出モジュールまで移動し得る。本明細書で説明されているように、イムノアッセイは、試料調製モジュール内で実施され得る。標識ビーズは、検出モジュール内のウェルアレイ内に沈降され得る。ビーズは、重力を使用して、または電気力もしくは磁力を加えることによって沈降し得る。ウェル内に位置していない任意のビーズを除去するための洗浄ステップに続いて、ウェルは、疎水性液体を使用することによって密封され得る。
対象となる検体は、サンドイッチアッセイ形式に関連して上述された固体支持体などの固体支持体に結合され得る。
固定化された対象となる検体、試験試料、および少なくとも1つの標識された抗体は、サンドイッチアッセイ方式に関連して上に記載された条件と同様の条件下でインキュベートされる。次いで、2つの異なる種の対象となる検体-抗体複合体が生成される。具体的には、生成された対象となる検体-抗体複合体のうちの一方は、固定化され、検出可能な標識(例えば蛍光標識など)を含み、他方の対象となる検体-抗体複合体は、固定化されず、検出可能な標識を含む。固定化されていない対象となる検体-抗体複合体および試験試料の残りは、洗浄などの当技術分野で既知の技法によって、固定化された対象となる検体-抗体複合体の存在から除去される。いったん固定化されていない対象となる検体-抗体複合体が除去されると、次いで、固定化された対象となる検体-抗体複合体中の検出可能な標識の量は、タグの開裂後に定量化される。次いで、試験試料中の対象となる検体の濃度は、上記のように検出可能な標識の量を比較することによって決定され得る。
一段階免疫測定または「キャプチャーオンザフライ」
キャプチャーオンザフライ免疫測定では、固体基材が固定化剤でプレコートされる。捕捉剤、検体、および検出剤が一緒に固体基材に添加され、続いて検出前に洗浄ステップが行われる。捕捉剤は検体と結合することができ、固定化剤に対するリガンドを含む。捕捉剤および検出剤は、抗体、または本明細書に記載されている、もしくは当技術分野で既知の捕捉または検出が可能な任意の他の部分であり得る。リガンドは、ペプチドタグを含み、固定化剤は、抗ペプチドタグ抗体を含み得る。あるいは、リガンドおよび固定化剤は、キャプチャーオンザフライアッセイでの捕捉に用いられるために一緒に結合することが可能な任意の対の薬剤(例えば、特異的結合対、および当技術分野で既知のものなど)であり得る。2つ以上の検体が測定され得る。いくつかの実施形態では、固体基材は、抗原でコーティングされ得、分析される検体は、抗体である。
ある特定の他の実施形態では、一段階免疫測定または「キャプチャーオンザフライ」において、固定化剤(ビオチン、ストレプトアビジンなど)でプレコートされた固体支持体(微粒子など)、ならびに少なくとも第1の特異的結合メンバーおよび第2の特異的結合メンバー(それぞれ捕捉試薬および検出試薬として機能する)が使用される。第1の特異的結合メンバーは、固定化剤に対するリガンドを含み(例えば、固体支持体上の固定化剤がストレプトアビジン(strepativdin)である場合、第1の特異的結合メンバー上のリガンドは、ビオチンであり得る)、対象となる検体にも結合する。第2の特異的結合メンバーは、検出可能な標識を含み、対象となる検体に結合する。固体支持体ならびに第1および第2の特異的結合メンバーは、試験試料に添加され得る(順次にまたは同時のいずれかで)。第1の特異的結合メンバー上のリガンドは、固体支持体上の固定化剤に結合して、固体支持体/第1の特異的結合メンバー複合体を形成する。試料中に存在する任意の対象となる検体は、固体支持体/第1の特異的結合メンバー複合体に結合して、固体支持体/第1の特異的結合メンバー/検体複合体を形成する。第2の特異的結合メンバーは、固体支持体/第1の特異的結合メンバー/検体複合体に結合し、検出可能な標識が検出される。検出前に任意の洗浄ステップが用いられ得る。ある特定の実施形態では、一段階アッセイにおいて、2つ以上の検体が測定され得る。ある特定の他の実施形態では、3つ以上の特異的結合メンバーが用いられ得る。ある特定の他の実施形態では、複数の検出可能な標識が付加され得る。ある特定の他の実施形態では、複数の対象となる検体が検出され得る。
キャプチャーオンザフライアッセイの使用は、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で既知のような様々な形式で行われ得る。例えば、形式は、上記のようなサンドイッチアッセイであり得るが、あるいは競合アッセイであり得、単一の特異的結合メンバーを用いることができるか、または既知ような他の変形形態を使用することができる。
組み合わせアッセイ(Ag/Abによる微粒子の同時コーティング)
組み合わせアッセイでは、微粒子などの固体基材が抗原および抗体で同時コーティングされて、それぞれ試料から抗体および抗原を捕捉する。固体支持体は、2つ以上の異なる抗原で同時コーティングされて、試料から2つ以上の異なる抗体を捕捉し得る。固体支持体は、2つ以上の異なる抗体で同時コーティングされて、試料から2つ以上の異なる抗原を捕捉し得る。
さらに、本明細書に記載される方法は、アッセイ化合物のうち、特異的または非特異的のいずれかの結合反応(例えば、HAMA問題)を防止するために、ブロッキング剤を使用し得る。いったん薬剤(および任意に、任意の対照)が支持体上に固定化されると、薬剤の残りの結合部位は、支持体上で遮断され得る。当業者に既知の任意の好適なブロッキング試薬が使用され得る。例えば、ウシ血清アルブミン(「BSA」)、PBS中のカゼインのリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)溶液、Tween 20(商標)(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo.)、または他の好適な界面活性剤、ならびに他のブロッキング試薬が用いられ得る。
本開示から明らかなように、変形形態を含む本明細書に開示される方法およびデバイスは、疾患、障害、または状態を有すると疑われる対象における疾患、障害、または状態を診断するために使用され得る。例えば、試料分析は、癌マーカー、心臓状態のマーカー、毒素、病原体、例えばウイルス、細菌、またはそれらの一部分などの疾患マーカーを検出するのに有用であり得る。方法およびデバイスはまた、生物学的試料中に存在する検体を測定するために使用され得る。方法およびデバイスはまた、標的検体を検出するための血液スクリーニングアッセイにおいても使用され得る。血液スクリーニングアッセイは、血液供給をスクリーニングするために使用され得る。
表面弾性波デバイス、システム、および方法
一体型表面弾性波(SAW)試料調製および検体検出デバイスに関連するシステム、デバイス、および方法が、本開示によって提供される。
一例では、デバイスは、試料調製構成要素、例えば音響力による操作を介して液体または流体がその表面にわたって伝播することを可能にする表面を有する基板を含む。同じ例では、デバイスは、伝播した液体を受容し、受容した液体に対して検体検出を行うように構成された検体検出要素を含む。
本明細書で使用される「表面弾性波(SAW)」およびその文法的等価物は、概して、表面に沿った方向に音波を伝播することを指す。「進行表面弾性波」(TSAW)は、表面弾性波の液体への結合を可能にする。いくつかの例では、結合は、表面弾性波の液体への透過または漏れの形態であり得る。いくつかの例では、表面弾性波は、レイリー波である。表面弾性波の伝播は、表面弾性波を液体中に流すことによって行われ得る。表面弾性波の伝播は、一連または複数の電極などのトランスデューサによって電位を発生させることを含む、様々な異なる方法で、かつ様々な材料を使用することによって実施され得る。
電極は、平面基板上にパターン化されてもよい。いくつかの例では、平面基板は、圧電層であり得る。いくつかの例では、電極は、標準的なリソグラフィおよびリフトオフ/ウェットエッチングプロセスを使用して圧電層上に製造され得る。電極の構造、電極間の間隔、基板上の電極の数(すなわち解像度)は異なり得る。いくつかの例では、交互嵌合(IDT)トランスデューサまたは電極が使用される。いくつかの例では、試料調製構成要素は、液体を含み得る。いくつかの例では、複数の層が存在し得る。異なる層は、表面弾性波を散乱させるための散乱構造の異なる配置または構成を有し得る。結果として、異なる層にわたる液滴の移動は、存在する様々な散乱構造のために異なり得る。
いくつかの例では、SAWは、単一のトランスデューサまたは電極が活性化したときに伝播される。他の例では、基板表面上に製造された複数(例えば、一対)の電極は、互いに向かって伝播する2つの進行SAWを発生させ得る。いくつかの例では、SAW変位は、無線周波数(RF)範囲が電極に印加されたときに活性化される。活性化されると、電極またはトランスデューサは、基板の表面にわたって電位を放出し、基板は、機械的応力に供される。機械的応力の例は、基板の表面の連続的な収縮および膨張である。基板のこの連続的な変形の結果として、表面弾性波が表面にわたって伝播される。
表面弾性波は、振幅および周波数に従って測定され得る。したがって、電極によって発生した電位の周波数および振幅は、SAWの振幅および周波数の原因となる。
SAWの伝播は、線形方向であり得る。いくつかの例では、SAWは、基板表面の長手方向の長さにわたって伝播し得る。他の例では、SAWは、基板表面の幅にわたって伝播し得る。他の例では、SAWの伝播は、非線形の方向および運動であり得る。流体は散逸系であるため、SAWを介した高調波力に対する応答は必ずしも高調波ではない場合がある。
TSAWが液体に接触すると、液体は、SAWのエネルギーの一部を吸収し、それを縦波の形態で屈折させ得る。屈折した音響エネルギーの吸収は、基板の表面にわたる流体の流動または伝播を誘発する。表面弾性波が試料調製構成要素の表面に沿って伝播すると、SAWは、液体と接触し得る。液体がSAWと相互作用する結果として、SAWは、液体中に移される。SAWは、「非接触操作」によって流体を操作し、これは、液体中に漏れるか、または透過する音波によって、液体が検出要素に伝播されることを意味する。結果として、生物学的試料または検体の外部汚染が最小限に抑えられる。
いくつかの例では、例示的な駆動流体作用は、ポンピング、混合、噴射などを含む。結果として、液体は、試料調製構成要素の表面に沿って伝播される。
いくつかの例では、液体は、SAW電極の活性化の前に試料調製構成要素の表面上に作動される液滴として分注され得る。液滴作動は、液滴を位置付け、液滴を試料調製構成要素上に分注するために使用され得る。
他の例では、液滴ベースのマイクロ流体の代わりに、液体を開放表面上に送り込むために、SAW駆動ポンプが使用され得る。いくつかの例では、流体は、囲まれたチャネルを通して送り込まれ得る。
液体は、任意の対象となる検体を含むか、または含むことが疑われる任意の試験試料であり得る。本明細書で使用される場合、「検体」、「標的検体」、「対象となる検体」とは、本明細書に開示される方法およびデバイスにおいて測定される検体を指す。液滴は、水溶液中の粒子またはビーズも指し得る。試料は、例えば血液、血漿、血清、唾液、汗などの体液試料を含み得る。
いくつかの例では、液体は、単一粒子として配置され得る。他の例では、液体は、一群の粒子(例えば数千の粒子)として配置され得る。液滴は、広範囲の長さスケール、サイズ(nm~mm)、ならびに形状に従って異なり得る。
表面弾性波の伝播はまた、試料調製プラットフォームの表面上にパターン化されたフォノニック構造の存在によって影響を受ける可能性がある。これらのフォノニック構造は、音波の伝播を制御し得る。例えば、フォノニック構造は、SAWの方向、移動、速度を制御し得、したがって強化された機能を提供する。フォノニック構造は、これらのフォノニック構造を形成するための基板の標準的なリソグラフィ、リフトオフ/ウェットエッチングプロセス、エンボス加工/ナノインプリントリソグラフィ、ならびにマイクロマシニング、圧力、熱、およびレーザ改質を使用して、基板上に製造され得る。これらのフォノニック構造は、同様に様々な形状およびサイズをとり得る。いくつかの例では、フォノニック構造は、基板内に格子を形成する柱、円錐、または穴であり得る。
表面弾性波試料調製構成要素
本明細書で使用される場合、「試料調製構成要素」およびその文法的等価物は、その上に液滴が最初に分散され、本明細書に記載されるイムノアッセイのステップが実施され得る、略平面の表面を指す。いくつかの例では、基板は、高い音響反射を有する材料で作製され得る。
いくつかの例では、試料調製構成要素は、基板に連結されたスーパーストレートを含む。いくつかの例では、スーパーストレートは、基板に取り外し可能に連結される。他の例では、スーパーストレートは、永久的に基板に連結される。いくつかの例は、ポリマーベースまたは紙の材料から基板を作製することを含む。基板が水性流体に対して不透過性になるように、ポリマーベースの基板は、疎水性コーティングで処理され得るか、またはポリマーベースの基板上に、もしくは別の基板と共に疎水性層を追加し得る。
いくつかの例では、試料調製構成要素は、スーパーストレート上に含まれるアッセイ試薬も含み得る。試料調製構成要素は、基板に連結されたスーパーストレートをさらに含む。
さらに別の例では、試料調製構成要素は、スーパーストレート上に含まれる一連の散乱構造を含み得る。散乱構造の例は、フォノニック構造を含み得、これは以下により詳細に記載される。
いくつかの例では、基板は、圧電材料であり得る。圧電層は、単結晶ニオブ酸リチウム(LiNbO3)などの複合層から作成され得る。スーパーストレートは、一連または複数の電極またはトランスデューサをさらに含み得る。いくつかの例では、電極またはIDTによって発生した表面弾性波もまたスーパーストレートに連結され得る。
いくつかの例では、スーパーストレートは、プラスチック(例えばPET、PCなど)などの様々な材料から作製され得る。
いくつかの例では、スーパーストレートは、比較的高い電気機械結合係数を有する材料で製造され得る。いくつかの例では、電極は、圧電材料上に製造され得る。一例では、LiNbO3は、SAWマイクロ流体用途において電極をパターン化するための基板として使用され得る。別の例では、電極をパターン化するために、シリコンが基板材料として使用され得る。SAW発生基板を製造するために適用可能な材料の他の例としては、多結晶材料、微結晶材料、ナノ結晶材料、アモルファス材料、または複合材料が挙げられる。SAW発生基板を製造するのに適用可能な材料の他の例としては、強誘電体材料、焦電材料、圧電材料、または磁歪材料が挙げられる。
本明細書に記載されているように、基板は、表面弾性波を発生させ、音波を伝播することが可能な材料である。
分析される検体または生物学的試料に加えて、試料調製構成要素は、緩衝液または洗浄液も含み得る。いくつかの例では、これらの緩衝液または洗浄液は、試料調製構成要素にわたる、および検出要素上への液体の伝播を容易にし得る。他の例では、これらの流体は、いったんそれらがウェルアレイ内に位置付けられると、任意の残っている液体または生物学的試料を洗い流すために使用され得る。そのような流体の例としては、空気、不活性ガス、疎水性液体、親水性液体、油、有機ベースの溶媒、および高密度水溶液が挙げられる。ある特定の場合、デバイスは、空気、不活性ガス、疎水性液体、親水性液体、油、有機ベースの溶媒、および高密度水溶液であり得る充填剤流体で充填され得る。
いくつかの例では、SAWによって誘発された流体の移動は、小さい染料または粒子を液滴に導入することによって可視化され得る。
試料調製表面は、液体が表面に沿って伝播され得る表面を有する。試料調製表面の表面は、平面または非平面配座の任意の便利な表面であり得る。表面は、表面に沿った液体の移動を容易にするために疎水性材料でコーティングされ得る。いくつかの例では、疎水性材料は、オクタデシルトリクロロシラン(OTS)を含み得る。他の例では、表面は、液体の移動を容易にするためにパターン化され得る。
いくつかの例では、試料調製表面の基板は、弾性または可撓性であり得る。表面がその上に形成される基板は弾性であり得、これにより表面は、表面にわたる表面弾性波の伝播を容易にするように変形することが可能である。
ある特定の実施形態では、基板の表面は、流体の伝播を容易にするためにマイクロ流体チャネルを含み得る。他の実施形態では、流体を基板内に伝達するために、マイクロ流体チャネルが基板の内部に含まれる。
いくつかの例では、カバーシールが、試料調製構成要素の基板の上部表面上に提供され得る。ある特定の例では、カバーシールは、表面の液体内容物の汚染を防止し得る。他の例では、カバーシールは、液体不透過層であり得る。他の例では、カバーシールは、プラスチック、シリコン、または他の種類のゴムなどの可撓性材料から作製され得る。他の例では、カバーシールは、ガラスまたは他の非可撓性材料などの非可撓性材料から作製され得る。いくつかの例では、カバーシールは、表面または表面上に存在する液体内容物のいずれかの変形を防止するために、熱、紫外線、または他の電磁放射に対して不透過性であり得る。
いくつかの例では、好適なスペーサが基板とカバーシールとの間に位置付けられ得る。本明細書で使用される場合、「好適なスペーサ」とは、試料調製構成要素の基板とカバーシールとの間に位置付けられた要素を指す。いくつかの例では、好適なスペーサは、液滴が表面とカバーシールとの間を移動することを容易にし得る。他の例では、好適なスペーサは、進行表面弾性波と表面との間の連結を低減し得る。
第1の例示的な試料調製構成要素において、第1の基板は、比較的高い電気機械結合係数を有し、かつ可撓性かつ変形可能な表面を有する材料を組み込む。例えば、第1の基板は、圧電材料またはシリコンであり得る。
いくつかの例では、電極は、表面上に配置されるか、または圧電層内に埋め込まれる。この文脈で使用される場合、「電極」という用語は、電極、一連または複数の(例えば2つ以上の)電極、トランスデューサを含む電気回路を指す。電極はまた、圧電層にパターン化され得る。いくつかの例では、電極は、標準的なリソグラフィおよびリフトオフ/ウェットエッチングプロセスを使用して基板上に製造され得る。電極の構造、電極間の間隔、基板上の電極の数(すなわち解像度)は異なり得る。いくつかの例では、交互嵌合(IDT)トランスデューサまたは電極が使用される。IDTは、一連または複数の電極と、一連または複数の電極が上に含まれる圧電層との組み合わせとして定義される。いくつかの例では、トランスデューサ電極構造は、圧電層上に形成される。他の例では、トランスデューサ電極構造は、圧電層内に埋め込まれる。
いくつかの例では、単一のトランスデューサまたは電極が活性化されたときに表面弾性波が伝播される。他の例では、基板表面上に製造された複数(例えば、一対)の電極は、互いに向かって伝播する2つの進行表面弾性波を発生させ得る。いくつかの例では、表面弾性波変位は、無線周波数(RF)範囲が電極に印加されたときに活性化される。活性化されると、電極またはトランスデューサは、基板の表面をにわたって電位を放出し、材料は、機械的応力に供される。機械的応力の例は、基板の表面の連続的な収縮および膨張である。基板のこの連続的な変形の結果として、表面弾性波が表面にわたって伝播される。
いくつかの例では、表面弾性波の波長は、トランスデューサ(IDT)のピッチまたは一連もしくは複数の電極に依存する。
一例では、試料調製構成要素は、スーパーストレートの表面上に含まれる一連のフォノニック構造を含み得る。フォノニック構造は、音波の伝播を制御し得る。例えば、フォノニック構造は、表面弾性波の方向、移動、速度を制御し得る。フォノニック構造は、同様に様々な形状およびサイズをとり得る。いくつかの例では、フォノニック構造は、基板内に格子を形成する柱、円錐、または穴であり得る。スーパーストレートの表面上のフォノニック構造のパターンは、解像度(例えば、表面上の面積当たりの電極数)、電極サイズ、電極の交互嵌合、および/または電極間の間隙もしくは間隔などの特性に基づき事前定義され得る。いくつかの例では、パターンの特性は、(例えば、生物学的および/または化学的アッセイで使用するために)SAW試料調製構成要素が関連付けられるべき液滴アクチュエータの1つ以上の動作上の使用に基づき選択される。他の構成では、電極のパターンは、異なるパターンが異なる用途に適することを可能にするように再構成可能であり得る。いくつかの例では、一連もしくは複数の電極または各個々の電極のサイズまたは寸法の増加はまた、隣接する電極間に適用される疎水性材料の量を低減し得る。したがって、電極パターンの特徴は、SAWプラットフォームの表面積を最大にし得る。さらに、一連または複数の電極/トランスデューサの交互嵌合の増加は、それらの電位の操作を介して液体が表面にわたって伝播される容易さを促進する。
第1の例示的なの試料調製構成要素では、疎水性材料は、一連または複数の電極および基板の表面に適用されて、スーパーストレートを水溶液に対して不透過性にし得る。疎水性材料の結果として、液滴または流体ポンプを通して作動される液体は、ビーズ状構成であり、基板の表面の疎水性層と接触角を形成する。動作中、SAW音波は、例えば液体に透過するかまたは漏れることによって、液体に連結する表面にわたって伝播する。SAW音波の振幅または周波数は、移動液体の結果として生じる周波数および運動を制御し得る。
ある特定の実施形態では、表面弾性波は、基板の表面に沿って伝播し、次いでスーパーストレートに連結される。その後、表面弾性波は伝播し続け、スーパーストレート内に形成され得るフォノニック構造によって誘導される。
いくつかの例では、SAW音波が2つ以上の電極によって発生する場合、結果として生じる表面弾性波に連結される液体の方向を制御することをもたらし得る。伝播する液体の方向は、線形方向または非線形方向であり得る。いくつかの例では、液滴の伝播は、転がり運動であり得る。他の例では、液滴の伝播は、表面にわたる摺動運動であり得る。いくつかの例では、表面上にフォノニック構造が欠如している場合、SAWの伝播および結果として生じる液滴の伝播は、同じ方向である。他の例では、表面上にフォノニック構造が存在する場合、SAWの伝播および結果として生じる液滴の伝播は、反対方向または異なる方向である。
いくつかの例では、疎水性材料は、スーパーストレートの表面に適用されたポリテトラフルオロエチレン材料(例えばTeflon(登録商標))またはフルオロ界面活性剤(例えば、FluoroPel(商標))である。
検体検出要素
いくつかの実施形態では、検体検出要素は、分子、粒子、ビーズ、または細胞が検体または生物学的試料の検出目的のために単離され得るウェルアレイを含み得る。TSAW(進行表面弾性波)は、表面上で音響流を発生させ、流体チャネルにわたって流体(液滴または細胞のいずれか)をウェルアレイに向かって押す。
ウェルの形状および幾何学的形状は、必要とされる処置または用途の種類に応じて異なり得る。いくつかの例では、ウェルは、深いチャンバであることから浅いチャンバであることの間で異なり得る。ウェルは、平坦な底部表面を有する円筒形、丸みを帯びた底部表面を有する円筒形、立方形、立方体状、円錐台形、逆円錐台形、または円錐形などの様々な形状のうちのいずれかであり得る。ある特定の場合、ウェルは、ウェルアレイ上を移動した液滴中に存在するマイクロビーズまたは微粒子の受容および保持を容易にするように配向され得る、側壁を含み得る。いくつかの例では、ウェルは、第1の側壁と第2の側壁とを含み得、第1の側壁は、第2の側壁の反対側にあり得る。いくつかの例では、第1の側壁は、ウェルの底部に対して鈍角に配向され、第2の側壁は、ウェルの底部に対して鋭角に配向される。液滴の移動は、ウェルの底部と平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向であり得る。ウェルアレイは、サブフェムトリットル体積、フェムトリットル体積、サブナノリットル体積、ナノリットル体積、サブマイクロリットル体積、またはマイクロリットル体積を有し得る。例えば、ウェルアレイは、フェムトリットルウェルのアレイ、ナノリットルウェルのアレイ、またはマイクロリットルウェルのアレイであり得る。ある特定の実施形態では、アレイ内のウェルは全て、実質的に同じ体積を有し得る。ウェルアレイは、最大100μL、例えば約0.1フェムトリットル、1フェムトリットル、10フェムトリットル、25フェムトリットル、50フェムトリットル、100フェムトリットル、0.5pL、1pL、10pL、25pL、50pL、100pL、0.1nL、1nL、10nL、25nL、50nL、500nL、0.1マイクロリットル、1マイクロリットル、10マイクロリットル、25マイクロリットル、50マイクロリットル、または100マイクロリットルの体積を有し得る。
ある特定の場合、試料調製構成要素および検体検出要素は、例えば連続ウェブ供給製造プロセスを使用して単一の平面表面から製造され得る。そのような例では、試料調製構成要素およびデジタル検体検出要素は、互いに隣接して位置付けられ得る。
いくつかの例では、試料調製構成要素は、試料入口を含み得る。本明細書で使用される場合、「試料入口」とは、試料調製構成要素に液体を導入するための管状部材、チャネル、またはパイプを指す。例えば、試料入口は、生物学的試料を基板の表面上に導入し得る。他の例では、試料入口は、生物学的試料を基板の内部に導入し得る。
他の例では、試料調製構成要素およびデジタル検体検出要素は、液滴操作のための空間によって分離された、積層構成で互いの上に位置付けられ得る。積層構成で検体検出要素上に位置付けられている試料調製構成要素またはその逆(検体検出要素が試料調製構成要素上に位置付けられている)の例では、入口またはチャネルが2つの構成要素間に位置付けられ得る。入口またはチャネルは、2つの構成要素間に試料または検体を方向付け得る。
フォノニック構造は、試料調製構成要素のスーパーストレート上に製造されるか、または含まれ得る。ある特定の場合、フォノニック構造は、スーパーストレート上にインプリントまたはエンボス加工される。そのような例では、フォノニック構造のエンボス加工またはインプリンティングは、単一ステップである。他の例では、それは、複数のステップであり得る。フォノニック構造のインプリンティングまたはエンボス加工は、モールド、マスク、またはパターンの存在下での圧力、熱、または紫外線の適用の組み合わせによるものであり得る。一例では、モールドからスーパーストレート上に誘発された圧力は、スーパーストレートの表面の変形を誘発し得る。
フォノニック構造がスーパーストレート上に含まれた後、それは、フォノニック構造の硬化または変形を可能にするのに十分な期間硬化させられ得る。さらに、フォノニック構造は、フォノニック構造の物理的特性を改質する試薬に供され得る。
いくつかの例では、検体検出用の試薬は、一体型試料調製および検体検出デバイスの製造中に脱水形態で印刷され得る。試薬の再水和は、試料または緩衝液の使用を通して起こる。
いくつかの例では、ウェルアレイは、個々のウェルチャンバを含み、各ウェルチャンバは、第1の端部と第2の端部とを有する。一例では、ウェルの第1の端部は、開放していてもよく、ウェルの第2の端部は、閉鎖している。他の例では、ウェルの第1の端部およびウェルチャンバの第2の端部の両方が閉鎖している。ウェルチャンバの第1の端部の閉鎖は、永久的閉鎖機構および一時的閉鎖機構の両方によるものであり得る。本明細書で使用される場合、「永久的」とは、閉鎖機構がウェルのチャンバの固定具のままであることを意図していることを意味する。本明細書で使用される場合、「一時的」とは、閉鎖機構の構造、完全性、または剛性に影響を与えることなく、閉鎖機構が取り外され得ることを意味する。いくつかの態様では、ウェルチャンバの第1の端部の閉鎖は、永久的閉鎖機構および一時的閉鎖機構の組み合わせによるものであり得る。一例では、一時的閉鎖機構は、ウェルチャンバの第1の端部を充填し得る油性流体などの液体であり得る。ある特定の例では、検体、生物学的試料、または検体関連の検出可能な標識が予めウェル内に堆積された後に、油滴が第1のウェル端を充填し得る。他の例では、油滴は、ウェル内の検体または生物学的試料の存在にかかわらず、ウェルの第1の端部を閉鎖するものであり得る。
ウェルアレイは、複数の標識、ビーズ、標識ビーズ、タグなどを受容するのに好適なウェルチャンバのパターン(例えば、アレイ中のウェルの形成)を有する。ウェルアレイのパターンは、解像度およびウェルチャンバ間の間隔に従って異なり得る。
いくつかの例では、ウェルアレイのパターンは、ナノインプリントリソグラフィを使用して製造され得る。他の例では、ウェルアレイのパターンは、成形、圧力、熱、またはレーザのうちのいずれか1つの組み合わせによって製造され得る。
ウェルアレイのサイズは、異なり得る。いくつかの例では、ウェルアレイは、100nmの直径および500nmの周期性を有する個々のウェルチャンバを有するように製造され得る。
いくつかの例では、ウェルアレイは、実質的にデジタルマイクロ流体および検出モジュールに関するセクションに記載されている通りであり得る。
いくつかの例では、対象となる検体または生物学的試料の検出は、光シグナル検出を通して起こり得る。例えば、シグナル強度の結果を測定するために励起光(例えばレーザ)を照らす。他の例では、所望の検体は、各ウェルチャンバから発する光シグナルを測定することによって検出され、その結果を定量化することによって定量化され得る。例えば、陽性計数(例えば、ウェル)の数は、デジタル計数を得るために陰性計数(例えば、ウェル)の数と比較される。あるいは、または加えて、検体濃度と相関があるシグナルが測定され得る(アナログ定量化)。デバイスのウェルからの様々なシグナルが検出され得る。例示的なシグナルとしては、蛍光、化学発光、比色、比濁などが挙げられる。
試料調製および検体検出デバイスの隣接構成
いくつかの実施形態では、ウェルアレイは、試料調製構成要素と同じスーパーストレート上に位置付けられる。いくつかの例では、スーパーストレートおよびウェルアレイは、第1の基板上に位置付けられ得る。第1の基板は、分析される液滴が最初に配置される第1の部分と、検体検出のために液滴が移動する第2の部分とに分割され得る。スーパーストレートは、第1の基板の第1の部分上に存在してもよく、ウェルアレイは、第1の基板の第2の部分上に位置付けられ得る。したがって、試料調製構成要素を形成するスーパーストレート、および検体検出要素を形成するウェルアレイは、直接隣接していてもよい。本明細書で使用される場合、「直接隣接する」という用語は、試料調製構成要素およびウェルアレイを分離または分割する物体がないことを意味する。試料調製構成要素およびウェルアレイが互いに直接隣接している例では、試料調製構成要素の表面にわたる液滴の伝播は、ウェルアレイの表面上に途切れなく移行する。他の例では、ウェルアレイは、試料調製構成要素に間接的に隣接して位置付けられる。本明細書で使用される場合、「間接的に隣接する」という用語は、試料調製構成要素を分離または分割する物体または要素があることを指す。
いくつかの例では、液体の移動を容易にし、個々のウェルチャンバへの液滴の位置精度を向上させるために、試料調製構成要素の基板表面は、親水性材料でパターン化またはコーティングされ得る。他の例では、ウェルアレイを密封するために、油およびエマルジョンなどの試薬が使用され得る。
図13Aは、検体検出要素に隣接して位置付けられた試料調製構成要素の側面図を示す。図13Aに示されるように、試料調製構成要素は、スーパーストレート810を含む。スーパーストレート810は、一連のフォノニック構造830を含む。フォノニック構造のサイズ、形状、および寸法は、異なり得る。図13Aに示されるように、試料調製構成要素は、ウェルアレイ860を含む検体検出要素に直接隣接するように位置付けられる。これらの構成要素が互いに隣接して位置付けられる場合、スーパーストレート810の表面にわたって伝播した液体は、ウェルアレイ860上の個々のウェルチャンバに収集され得る。この特定の例では、試料入口チャネル840がスーパーストレート810とカバー870との間に位置付けられる。スーパーストレート810およびカバー870は、液滴が操作(例えば、融合、分割、撹拌など)される空間を画定する空間/間隙850によって分離されている。しかしながら、他の例では、試料入口チャネルは、含まれていない。試料入口チャネルのサイズ、寸法、および変形形態は、異なり得る。例えば、試料入口チャネルは、スーパーストレート810の表面上に流体を導入し得る。他の例では、試料入口チャネルは、スーパーストレート810の内部に流体を導入し得る。
いくつかの例では、カバーシールが試料調製構成要素の表面上に提供され得る。ある特定の例では、カバーシールは、表面の液体内容物の汚染を防止し得る。他の例では、カバーシールは、液体不透過層である。他の例では、カバーシールは、プラスチック、シリコン、または他の種類のゴムなどの可撓性材料から作製される。他の例では、カバーシールは、ガラスまたは他の非可撓性材料などの非可撓性材料から作製される。いくつかの例では、カバーシールは、試料調製構成要素の表面または表面上に存在する液体内容物のいずれかの変形を防止するために、熱、紫外線、または他の電磁放射に対して不透過性であり得る。
いくつかの例では、基板の表面にわたる表面弾性波の発生によって発生した熱を放散させるために、ヒートシンクが提供され得る。
試料調製および検体検出デバイスの積層構成
いくつかの実施形態では、ウェルアレイ(検出要素)は、液滴が操作される空間によって分離された試料調製構成要素上に位置付けられる。いくつかの例では、入口またはチャネルが2つの構成要素間に位置付けられ得る。入口またはチャネルは、2つの構成要素間に試料または検体を方向付け得る。
いくつかの例では、ウェルアレイは、第1の基板上にインプリントまたはエンボス加工され得、フォノニック構造は、第1の基板から離間して位置付けられたスーパーストレート上に存在し得る。スーパーストレートは、第2の基板によって支持され得る。
いくつかの例では、ウェルアレイを含む第1の基板をスーパーストレートと連結するステップは、接合剤、接着剤、テープ、のり、はんだ付け、またはスーパーストレートへのウェルアレイの連結が可能な他の固定剤を使用して容易にされ得る。他の例では、ウェルアレイを試料調製構成要素のフォノニック構造上に連結するステップは、機械的締結具、固定具、ボルト、およびラッチなどの他の機械的構成要素を使用することによって達成され得る。他の例では、ウェルアレイを試料調製構成要素のフォノニック構造上に連結するステップは、試料調製構成要素のフォノニック構造上にウェルアレイを設定し位置付けることによって起こり得る。いくつかの例では、基板のフォノニック構造は、ウェルアレイ構成要素に対して平行配向であり得る。
スーパーストレートのフォノニック構造とウェルアレイとの間の間隔は、行われる適用の種類、基板の表面上に作動される液滴のサイズ、フォノニック構造のサイズ、形状、および配置、試料チャネル/入口のサイズ、ならびに表面にわたって伝播する表面弾性波の振幅に従って異なり得る。
図13Bは、スーパーストレートおよびウェルアレイ構成要素の積層構成の側面図を示す。図13Bに示されるように、スーパーストレート810は、一連のフォノニック構造830を含む。フォノニック構造830は、反復構造要素のアレイ内に配置される。フォノニック構造のサイズ、形状、および寸法は、異なり得る。この例では、ウェルアレイ860も存在する。この例では、ウェルのアレイ860は、スーパーストレートの真上に位置付けられる。図13Bに示されるように、ウェルの開口部は、フォノニック構造の正反対にあり得る。この特定の例では、試料入口チャネル840がウェルアレイとスーパーストレートとの間に位置付けられる。しかしながら、他の例では、試料入口チャネルは、含まれていない。試料入口チャネルのサイズ、寸法、および変形形態は、異なり得る。例えば、試料入口チャネルは、スーパーストレート810の表面上に流体を導入し得る。他の例では、試料入口チャネルは、スーパーストレート810の内部に流体を導入し得る。ウェルアレイ860を含む基板820は、スーパーストレート810から離間して付けられ、間隙/空間850によってスーパーストレート810から分離されている。
図13A~Bに示されるようなウェルアレイは、サイズおよび/または形状が異なり得る。例えば、ウェルアレイは、実質的に浅いかまたは深いものであり得る。ウェルアレイの解像度は、各ウェルチャンバ間の間隔によって影響を受ける。例えば、ウェルチャンバ間の最小間隔は、より多くのウェルがより多くの検体または生物学的試料を収集することを可能にする。いくつかの例では、基板をアブレーションすることによってウェルアレイが形成され得る。ウェルアレイのパターンは、特殊なパターンまたは特殊なマスクを使用し、そのマスクをレーザアブレーションに供することによって形成され得る。
表面弾性波試料調製および検出デバイスの製造
図14A~図14Bは、上記のセクションに開示されたSAWデバイスを別々に製造するための例示的な方法を示す。図14Aは、単一のベース基板上にフォノニック構造およびウェルアレイを製造することによって、試料調製構成要素およびウェルアレイ構成要素が互いに隣接して位置付けられることを示す。スーパーストレート(例えば、図13A、スーパーストレート810を参照)がアセンブリライン900上に配置される。アセンブリライン900に沿ったスーパーストレートの伝播は、一連のローラを利用するコンベヤベルト状機構によって促進される。スーパーストレートのロール914は広げられ、エンボス加工ユニット910に供され、エンボス加工ユニット910は、スーパーストレート上に、またはモールドを使用してスーパーストレート内に埋め込まれる、フォノニック構造を形成するために、材料を強い熱、圧力、または紫外線に供する。ウェルアレイは、レーザアブレーション924を使用して形成される。その後、スーパーストレートは、複数のローラを通って、スーパーストレートの特性を改質する表面処理構成要素920に移る。その後、スーパーストレートは、スーパーストレート上にアッセイ試薬を堆積するインクジェットプリンタ930を通過する。いくつかの例では、結果として生じる構造は、硬化ステップに供され得る。他の例では、結果として生じる構造は、例えばアッセイプロトコルに必要な官能化試薬を組み込むなど、それらの物理的特性を改質するために表面処理に供され得る。次いで、カバー(例えば、図13A、カバー870)がスーパーストレート上に積層される(940)。カバーはロール905として提供され得、これは広げられ、にローラを使用して移動する。カバーをスーパーストレート上に配置する前に、好適なスペーサがスーパーストレートとカバーとの間に配置されて、液滴が2つの表面間を移動することを可能にする。組み立てられた構造は、個々のデバイスを生成するためにダイシングされ得る(950)。
図14Bは、図13Bに図示されたデバイスを製造するための例示的な方法を示す。スーパーストレートのロール914(例えば、図13B、スーパーストレート810を参照)は、エンボス加工ユニット910を使用した製造プロセスに供され、エンボス加工ユニット910は、モールドの存在下で、フォノニック構造の反復構造要素を形成するために、スーパーストレートを強い熱、圧力、または紫外線に供する。その後、スーパーストレートは、表面処理構成要素920を通過してスーパーストレート表面の特性を改質する。その後、スーパーストレートは、インクジェットプリンタ930を通過してアッセイ試薬をその場で堆積させる。ウェルアレイを含む検出モジュールを形成するために、第1の基板(例えば、図13B、基板820を参照)のロール906は、レーザアブレーション924に供される。ラミネーションユニット940において、スーパーストレートおよび第1の基板を含むウェルアレイの両方が一緒に組み合わされ、続いて離間した構成で接合される。結果として、スーパーストレートおよび基板は、積層構成内で垂直に整合される。その後、積層基板は、例えば個々のデバイスを生成するためにダイシング構成要素950に供される。
液滴作動を伝播する本明細書に記載されるデバイス、システム、および方法はまた、液滴作動に影響を与える様々な他の力を含み得る。例えば、表面にわたる液滴の移動は、電界媒介力、静電作動(例えば電気作動)、エレクトロウェッティング、誘電泳動、電界勾配、または電極媒介力を含み得る。表面弾性波およびデジタルマイクロアレイ電極の組み合わせが液滴操作のために使用される実施形態では、本明細書に記載されるSAWデバイスは、一連または複数の電極を含み得る。
本明細書に開示される一体型デバイスは、対象となる検体の検出のために、生物学的試料などの様々な試料を調製するために使用され得る。ある特定の場合、デバイスは、デジタル免疫測定を実施し、検体の有無に相関する粒子/ビーズの有無を検出するために使用され得る。
キットおよびカートリッジ
開示されるデバイスの有無にかかわらず、上記の方法の実施で使用するためのキットもまた本明細書に提供される。キットは、開示されるデバイスを用いて検体を分析するための説明書を含み得る。キットに含まれる説明書は、包装材料に貼られてもよく、または添付文書として含まれてもよい。説明書は、資料または印刷物であってもよいが、それらに限定されない。そのような説明書を保存し、それらをエンドユーザに伝達することが可能な任意の媒体が本開示によって企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えばCD-ROM)などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「説明書」は、その説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
キットは、上記のように、内蔵検体検出を有するマイクロ流体モジュールを含むカートリッジを含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体および検体検出は、可逆的一体化を一緒にするための別々の構成要素であり得るか、または完全にまたは不可逆的にカートリッジ内に一体化され得る。カートリッジは、使い捨てであり得る。カートリッジは、上に開示された方法を行うのに有用な1つ以上の試薬を含み得る。カートリッジは、1つ以上の別々の組成物として、または任意に試薬の適合性が可能にする場合の混合物として、試薬を保持する1つ以上の容器を含み得る。カートリッジはまた、緩衝液(複数可)、希釈剤(複数可)、標準物質(複数可)(例えば、較正物質および対照)、ならびに/または試料処理、洗浄、もしくはアッセイの任意の他のステップを実施するのに有用な任意の他の材料などの、ユーザの観点から望ましくあり得る他の材料(複数可)を含み得る。カートリッジは、上記の特異的結合メンバーのうちの1つ以上を含み得る。
あるいは、または加えて、キットは、較正物質または対照、例えば精製され、かつ任意に凍結乾燥された対象となる検体、またはカートリッジ上もしくは別々の液体、ゲル、もしくは別の形態、および/または少なくとも1つの容器(例えば管、マイクロタイタープレート、もしくはストリップ、および/またはアッセイ緩衝液もしくは洗浄緩衝液などの緩衝液(それらのうちのいずれか1つは、濃縮溶液として提供され得る)を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイを行うために必要である全ての構成要素、すなわち試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。説明書はまた、標準曲線を生成するための説明書を含み得る。
キットは、対象となる検体を定量化するための参照標準をさらに含み得る。参照標準は、対象となる検体濃度の内挿および/または外挿のための標準曲線を確立するために用いられ得る。キットは、濃度レベルに関して異なる参照標準を含み得る。例えば、キットは、高濃度レベル、中濃度レベル、または低濃度レベルのいずれかを有する1つ以上の参照標準を含み得る。参照標準の濃度範囲に関して、これはアッセイごとに最適化され得る。参照標準の例示的な濃度範囲としては、例えば、約10fg/mL、約20fg/mL、約50fg/mL、約75fg/mL、約100fg/mL、約150fg/mL、約200fg/mL、約250fg/mL、約500fg/mL、約750fg/mL、約1000fg/mL、約10pg/mL、約20pg/mL、約50pg/mL、約75pg/mL、約100pg/mL、約150pg/mL、約200pg/mL、約250pg/mL、約500pg/mL、約750pg/mL、約1ng/mL、約5ng/mL、約10ng/mL、約12.5ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約40ng/mL、約45ng/mL、約50ng/mL、約55ng/mL、約60ng/mL、約75ng/mL、約80ng/mL、約85ng/mL、約90ng/mL、約95ng/mL、約100ng/mL、約125ng/mL、約150ng/mL、約165ng/mL、約175ng/mL、約200ng/mL、約225ng/mL、約250ng/mL、約275ng/mL、約300ng/mL、約400ng/mL、約425ng/mL、約450ng/mL、約465ng/mL、約475ng/mL、約500ng/mL、約525ng/mL、約550ng/mL、約575ng/mL、約600ng/mL、約700ng/mL、約725ng/mL、約750ng/mL、約765ng/mL、約775ng/mL、約800ng/mL、約825ng/mL、約850ng/mL、約875ng/mL、約900ng/mL、約925ng/mL、約950ng/mL、約975ng/mL、約1000ng/mL、約2μg/mL、約3μg/mL、約4μg/mL、約5μg/mL、約6μg/mL、約7μg/mL、約8μg/mL、約9μg/mL、約10μg/mL、約20μg/mL、約30μg/mL、約40μg/mL、約50μg/mL、約60μg/mL、約70μg/mL、約80μg/mL、約90μg/mL、約100μg/mL、約200μg/mL、約300μg/mL、約400μg/mL、約500μg/mL、約600μg/mL、約700μg/mL、約800μg/mL、約900μg/mL、約1000μg/mL、約2000μg/mL、約3000μg/mL、約4000μg/mL、約5000μg/mL、約6000μg/mL、約7000μg/mL、約8000μg/mL、約9000μg/mL、または約10000μg/mLが挙げられるが、これらに限定されない。
キット内で提供される任意の特異的結合メンバーは、標識、例えばフルオロフォア、酵素、デンドリマー、ビーズ、ナノ粒子、ナノビーズ、微粒子、マイクロビーズ、ポリマー、タンパク質、ビオチン/アビジン標識などを組み込み得るか、あるいはキットは、特異的結合メンバーを標識するための試薬、または特異的結合メンバーを検出するための、かつ/もしくは検体を標識するための試薬、または検体を検出するための試薬を含むことができる。必要に応じて、キットは、1つ以上の異なるタグまたは標識を含むことができる。キットはまた、開裂媒介試薬などの開裂を誘発するための構成要素を含み得る。例えば、開裂媒介試薬は、ジチオトレイトール(DTT)またはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)TCEPなどの還元剤を含み得る。特異的結合メンバー、較正物質、および/または対照は、別々の容器で提供され得るか、または適切なアッセイ形式もしくはカートリッジに予め分注され得る。
キットは、例えば、多重化アッセイにおいて試料中の1つ以上の標的検体を検出するための1つ以上の特異的結合メンバーを含み得る。キット内の異なる種類の特異的結合メンバーの数は、キットの使用目的に応じて広範囲にわたり得る。キット内の特異的結合メンバーの数は、1~約10、またはそれ以上の範囲であり得る。例えば、キットは、1~10個の特異的結合メンバー、1~9個の特異的結合メンバー、1~8個の特異的結合メンバー、1~7個の特異的結合メンバー、1~6個の特異的結合メンバー、1~5個の特異的結合メンバー、1~4個の特異的結合メンバー、1~3個の特異的結合メンバー、1~2個の特異的結合メンバー、2~10個の特異的結合メンバー、2~9個の特異的結合メンバー、2~8個の特異的結合メンバー、2~7個の特異的結合メンバー、2~6個の特異的結合メンバー、2~5個の特異的結合メンバー、2~4個の特異的結合メンバー、3~10個の特異的結合メンバー、3~9個の特異的結合メンバー、3~8個の特異的結合メンバー、3~7個の特異的結合メンバー、3~6個の特異的結合メンバー、3~5個の特異的結合メンバー、3~4個の特異的結合メンバー、4~10個の特異的結合メンバー、4~9個の特異的結合メンバー、4~8個の特異的結合メンバー、4~7個の特異的結合メンバー、4~6個の特異的結合メンバー、5~10個の特異的結合メンバー、5~9個の特異的結合メンバー、5~8個の特異的結合メンバー、5~7個の特異的結合メンバー、5~6個の特異的結合メンバー、6~10個の特異的結合メンバー、6~9個の特異的結合メンバー、6~8個の特異的結合メンバー、6~7個の特異的結合メンバー、7~10個の特異的結合メンバー、7~9個の特異的結合メンバー、7~8個の特異的結合メンバー、8~10個の特異的結合メンバー、8~9個の特異的結合メンバー、または9~10個の特異的結合メンバーを含み得る。1つ以上の特異的結合メンバーの各々は、異なる標的検体に結合し得、各特異的結合メンバーは、異なる検出可能な標識で標識され得る。例えば、キットは、第1の標的検体に結合する第1の特異的結合メンバー、第2の標的検体に結合する第2の特異的結合メンバー、第3の標的検体に結合する第3の特異的結合メンバーなどを含み得、第1の特異的結合メンバーは第1の検出可能な標識で標識され、第2の特異的結合メンバーは第2の検出可能な標識で標識され、第3の特異的結合メンバーは第3の検出可能な標識で標識されるなどである。1つ以上の特異的結合メンバーに加えて、キットは、好適な緩衝媒体などの1つ以上のさらなるアッセイ構成要素をさらに含み得る。最後に、キットは、本発明に従った検体検出の方法において特異的結合メンバーを使用するための説明書を含み得、使用のためのこれらの説明書は、キット包装および/または添付文書上に存在し得る。
任意に、キットは、品質管理構成要素(例えば、感度パネル、較正物質、および陽性対照)を含む。品質管理試薬の調製は、当技術分野で周知であり、様々な免疫診断製品のための挿入シートに記載されている。感度パネル部材は、アッセイ性能特性を確立するために任意に使用され、さらに任意に、キット試薬の完全性およびアッセイの標準化の有用な指標である。
キットはまた、任意に、診断アッセイを実施するか、または緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの品質管理評価を容易にするために必要な他の試薬を含むことができる。試験試料の単離および/または処理のための緩衝液および溶液などの他の構成要素(例えば前処理試薬)もキット内に含まれ得る。キットはさらに、1つ以上の他の対照を含むことができる。キットの構成要素のうちの1つ以上は、凍結乾燥され得、その場合、キットは、凍結乾燥構成要素の再構成に好適な試薬をさらに含むことができる。構成要素のうちの1つ以上は、液体形態であり得る。
キットの様々な構成要素が、任意に、必要に応じて好適な容器内に提供される。キットは、試料を保持または保存するための容器(例えば、尿、唾液、血漿、脳脊髄液、もしくは血清試料用の容器もしくはカートリッジ、または組織吸引物を作るために組織を保存、輸送、もしくは処理するための適切な容器)をさらに含むことができる。適切な場合、キットは任意に、反応槽、混合槽、および試薬または試験試料の調製を容易にする他の構成要素も含むことができる。キットはまた、試験試料を得ることを補助するための1つ以上の試料収集/取得器具、例えば、様々な血液採取/輸送デバイス、例えばマイクロサンプリングデバイス、マイクロニードル、または他の低侵襲無痛採血法;採血管(複数可);ランセット;毛管採血管;他の単一の指先穿刺採血法;口腔スワブ、鼻腔/咽頭スワブ;16ゲージまたは他のサイズの針、パンチ生検用の円形ブレード(例えば1~8mm、または他の適切なサイズ)、外科用ナイフまたはレーザ(例えば、特に手持ち式)、試料を取得、保存、または吸引するための注射器、滅菌容器、またはカニューレなども含むことができる。キットは、関節吸引、錐体生検、パンチ生検、微細針吸引生検、画像誘導経皮針吸引生検、気管支肺胞洗浄、内視鏡生検、および腹腔鏡生検を補助するための1つ以上の器具を含むことができる。
タグまたは検出可能な標識が、少なくとも1つのアクリジニウム化合物であるか、またはそれを含む場合、キットは、少なくとも1つのアクリジニウム-9-カルボキサミド、少なくとも1つのアクリジニウム-9-カルボキシレートアリールエステル、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。タグまたは検出可能な標識が少なくとも1つのアクリジニウム化合物であるか、またはそれを含む場合、キットはまた、緩衝液、溶液、および/または少なくとも1つの塩基性溶液などの過酸化水素源を含むことができる。必要に応じて、キットは、磁性粒子、ビーズ、膜、足場分子、フィルム、濾紙、ディスク、またはチップなどの固相を含むことができる。
必要に応じて、キットは、感染症、心臓病、代謝性疾患、甲状腺疾患などの疾患状態または障害のバイオマーカーなどのバイオマーカーであり得る、別の検体のための試験試料をアッセイするための、単独で、または説明書とさらに組み合わせて1つ以上の構成要素をさらに含むことができる。
本発明は、本明細書に提供される非限定的な実施例によって例示される複数の態様を有する。
一体型DMF-電気化学/電気/光検出チップ、デバイス、およびシステム
前のセクションで述べられたように、検体検出チップを動作させて試験試料を調製し、かつ検体検出チップ内の調製された試験試料からの検体関連シグナルを検出するように構成された検体検出デバイスが開示される。検体検出チップは、重なり合ってもよく、または空間的に隔絶されていてもよい、デジタルマイクロ流体(DMF)領域と検体検出領域とを含んでもよい。ある特定の実施形態では、検体検出領域は、検体が試料中に存在するときに生成される電気化学種を検出するための電極を含み得る。他の実施形態では、検体検出領域は、検体が試料中に存在するときに発生する光シグナルを検出するように構成され得る。DMF領域は、液滴が光学的または電気的に分析される領域に分析用の液滴を移すために使用され得る。光検出は、比色検出、濁度検出、蛍光検出、および/または画像分析であり得る。画像分析は、検体検出カートリッジからの光シグナルの検出を含み得る。光シグナルは、比色、濁度、または蛍光シグナルなどの光シグナルであり得る。光シグナルは、空間的に隔絶されたビーズを有するウェルの検出および検体分子が捕捉されているビーズの割合を決定するために利用されるものなどの画像および比色または蛍光シグナル検出の組み合わせであり得る。電気化学的検出は、電流測定、クーロメトリ、電位差測定、ボルタンメトリ、インピーダンス、またはそれらの組み合わせを伴い得る。いくつかの実施形態では、本開示の器具は、DMF電極とウェルアレイとを含むカートリッジ、DMF電極と電気化学的感知用電極とを含むカートリッジ、および/またはDMF電極と光シグナルを検出するための光学的に調査可能な領域とを含むカートリッジのうちの1つ以上を動作させる。他の実施形態では、本開示の器具は、多機能カートリッジ(例えば、臨床化学、例えば電気化学種または発色反応産物の検出のための検出領域、および液滴の一部分を空間的に隔絶するためのウェルアレイを含む検出領域を含むカートリッジ)を動作させる。
ある特定の場合、臨床化学は、基質に対する酵素の作用によって生成される電気化学種または発色基質の検出を伴い得る。例えば、基質は、試料中に存在する検体であり得、酵素は、検体に特異的であり得、基質に作用することによって電気化学種または着色反応産物を生成し得る。他の場合では、臨床化学は、第1の結合メンバーを使用して検体を捕捉して、検体と第1の結合メンバーとを含む第1の複合体を生成することと、複合体を、検体に結合する第2の結合メンバーと接触させて、検体と、第1の結合メンバーと、第2の結合メンバーとを含む第2の複合体を生成することとを伴い得る。第2の結合メンバーは、好適な基質への曝露時に電気化学種または発色反応産物を生成する酵素に接合されている。
「検体検出チップ」、「検体検出カートリッジ」という語句、ならびに「チップ」および「カートリッジ」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、本明細書に開示される検体検出久具と適合する使い捨てまたは再使用可能な試料処理デバイスを指す。本明細書に開示される検体検出器具はまた、本明細書に提供されるチップ内の試料を処理するために使用される検体検出デバイスとも称される。ある特定の実施形態では、検体検出チップは、第1の基板と第2の基板とを含み、第2の基板は、第1の基板上に位置付けられ、間隙によって第1の基板から分離されている。第1または第2の基板は、複数のDMF電極を含み得る。複数のDMF電極は、活性化および非活性化のために個々に制御可能である一連の電極であり得る。複数のDMF電極は、DMF電極を電気的に絶縁するために絶縁材料で覆われ得る。ある特定の実施形態では、第1の基板と第2の基板との間の空間/間隙は、空気で、または油などの不活性流体で充填され得る。ある特定の実施形態では、DMF電極は、本明細書の前のセクションに記載されるように配置され得る。例示的な実施形態では、一連のDMF電極は、第1の基板上に排泄され得、単一の電極が、第1の基板上の一連の電極と対向構成で第2の基板上に排泄され得る。一連の電極および単一電極は、絶縁層で被覆され得る。他の場合、第1の基板上の一連または複数の電極は、同一平面上の電極として構成され得、第2の基板は、電極を含まなくてもよい。DMF電極の様々な構成は、ウェルアレイを含む一体型マイクロ流体および検体検出デバイスを説明する前のセクションに記載されている。DMF電極のこれらの構成のいずれも、本明細書に開示されている追加のカートリッジ内に存在することができる。
前のセクションに記載されたように、第1の層および/または第2の層内に存在する電極は、インジウムスズ酸化物、フッ素ドープ酸化スズ(FTO)、ドープ酸化亜鉛などの実質的に透明な材料から製造され得る。さらに、一方または両方の基板が、光学的調査を容易にするために実質的に透明であり得る。
検体検出デバイスは、デバイスに挿入された検体検出チップ内の光シグナル、電気化学、電気シグナルを検出するための光学的、電気化学的、および/または電気的手段を含み得る。さらに、検体検出デバイスは、検体検出チップ内に存在するDMF電極を動作させるための手段を含む。本明細書に開示される検体検出デバイスは、本明細書に開示されるカートリッジと相互作用するための1つまたは複数のインターフェースを含み得る。ある特定の場合、カートリッジインターフェースは、挿入スロットであり得る。他の場合では、インターフェースは、カートリッジを受容するための凹部であり得、ドアまたは蓋によって囲まれ得る。検体検出デバイスは、複数の検体検出チップと互換性があり得る単一のインターフェースを含み得る。例えば、挿入スロットは、電気化学シグナルを検出する検体検出チップ、光シグナルを検出する検体検出チップ、および/または電気シグナルを検出する検体検出チップと互換性があり得る。ある特定の実施形態では、検体検出デバイスは、例えば複数のチップを使用して異なる試料中の同じ検体を検出するため、または複数の異なるチップを使用して同じ試料中の複数の異なる検体を同時に検出するために、複数の検体検出チップを同時に動作させるように構成され得る。そのような実施形態では、デバイスは、挿入領域などの複数のインターフェースを含み得る。
本開示の検体検出チップは、血漿分離構成要素を任意に含み得る。ある特定の実施形態では、血漿分離構成要素は、全血試料中に存在する細胞を捕捉し、血漿を濾過して、処理して分析のための試料液滴(複数可)にすることのために使用可能にするフィルタを含み得る。他の実施形態では、血漿分離構成要素は、流体分離要素であり得る。検体検出チップの実施形態は、以下に開示される。以下に記載される検体検出チップのいずれも、任意に血漿分離構成要素を含み得る。ある特定の場合、血漿分離構成要素は、市販の膜であり得る。ある特定の実施形態では、International Point of Care,Inc.(例えば、Primecare(商標)Hydrophilic Asymetric Membranes)またはPall Corporation(例えば、Vivid(商標)Plasma Separation Membrane)から入手可能なものなどの市販の膜が、血漿の分離に使用され得る。ある特定の場合、膜は、本開示のカートリッジに一体化され得る。他の実施形態では、本開示のチップ、器具、およびシステムは、全血試料中の検体を検出するように構成され得る。
i.DMF-電気化学検出カートリッジ
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるカートリッジは、重なり合うかまたは空間的に隔絶され得る、DMF領域と検体検出領域とを含む。DMF領域は、液滴が電気化学的に分析される検出領域に分析用の液滴を移すために使用され得る。電気化学分析は、試料中の検体の存在によって生成される電気活性種によって発生する電気シグナルを検出する作用電極を利用することによって行われる。電気シグナルは、試料中に存在する検体の量に比例するため、検出された電気シグナルは、定量化されて、試料中の検体の存在または濃度を決定し得る。電気化学的検出は、電流測定、クーロメトリ、電位差測定、ボルタンメトリ、インピーダンス、またはそれらの組み合わせを伴い得る。
ある特定の実施形態では、電気化学種は、検体に対する検体特異的酵素の作用によって生成され得る。他の実施形態では、電気化学種は、基質に対する酵素の作用によって生成され得る。そのような実施形態では、酵素は、検体に特異的ではない。むしろ、酵素は、検体に特異的に結合する結合メンバーに接合されている。ある特定の実施形態では、電気化学種によって発生した電気シグナルを増幅するために、酸化還元媒体が含まれ得る。検体特異的酵素および酸化還元媒体は周知であり、所望の感度および/または特異性に基づき選択され得る。
電気化学種を検出するための電極は、多くの構成で提供され得る。そのような電極は、DMF電極とは別であり得るか、または電気化学的感知用に電極に改質されたDMF電極であり得る。DMF電極と電気化学的感知用の電極とを含む検体検出チップの例示的な構成は、以下にさらに記載される。
図31A~31Fは、本開示のチップ内に存在する電極の概略図である。図31Aは、チップのセンサ領域311に液滴を移すために使用されるDMF電極310を示す。センサ領域311は、作用電極312と参照電極313とを含む。図31Bは、センサ領域311上に位置付けられた液滴314を示す。図31Cは、センサ領域311、作用電極312、および参照電極313を示し、電極は半円であり、同一平面構成で配設されている。ここには示されていないが、電極のうちの一方は、他方の電極と対向構成で配置され得る。そのような実施形態では、電気化学的検出用のセンサ領域は、作用電極と参照電極とを分離する間隙を含み得、電極は、液滴がセンサ領域内に位置を変えると電気的に接続される。作用電極および参照電極は、リード315を介して導体パッド316および317に接続されている。導体パッドは、チップを動作させるデバイスに動作可能に接続されている。対象となる検体の電気化学的検出のための電極の追加の構成は、図31D~31Eに示されている。図31D中、作用電極312が円形である一方で、参照電極313は弧状であり、作用電極と同心であり、作用電極を取り囲んでいる。図31E中、センサ領域は、3つの電極、作用電極312、参照電極313、および対電極318を含む。液滴および電極は、液滴が作用電極および参照電極の両方(ならびに存在する場合、対電極)と接触するようにサイズ決定される。図31Fは、液滴および作用電極の相対的サイズ、ならびに電極(複数可)のサイズおよび形状が液滴サイズに一致するように構成されていることを示す。この実施形態では、参照電極が作用電極に対して対向構成で存在することに留意されたい。作用電極313は、第2の直径Bを有する液滴314よりも小さい第1の直径(A)を有する。第1の直径Aは、約50μm~1.9mmであり得る。第2の直径Bは、約100μm~2mmであり得る。液滴直径に対する電極直径の他の比率もまた、本開示のチップにおいて使用され得る。作用電極および参照電極(ならびに存在する場合、対電極)が同一平面構成である実施形態では、電極の総面積(電極間のいかなる間隙も含む)は、液滴の直径に一致するようにサイズ決定され得る(図31Bを参照)。
ある特定の実施形態では、図31A~図31Fに示されるものなどの電気化学センサは、単一の頂部電極などのDMF表面とは反対側の表面上にあり得る。このようにして、DMF電極は、試料液滴を移動させて電気化学センサと接触させることができ、試料液滴は、DMF電極とも接触しながら調査され得る。
図32A~図32Cは、DMF電極が電気化学的検出に好適な感知電極(310A、310B、または310C)に改質されている、DMF電極(310)を含む検体検出チップを示す。図32A中、DMF電極310Aは、DMF電極上に配設された絶縁層内に開口部を形成することによって修正され、開口部は、電気化学的感知のために、液滴と改質されたDMF電極310Aとの間の接触のための領域を提供する。図32B中、改質されたDMF電極310Bは、液滴と改質されたDMF電極との間の接触のために、DMF電極を被覆する絶縁層内に複数のピンホール開口部を含む。図32C中、DMF電極は、光への曝露によって除去可能である絶縁層で被覆されている。1つ以上のDMF電極が光311に曝露されて絶縁層を除去し、それにより絶縁層によって被覆されない、したがって液滴に接触することができる改質されたDMF電極を形成し得る。図32C中、電極310Cは、光に曝露されて感光性絶縁層を除去し、電極を露出する。DMF電極310に対して対向構成で配設されたDMF電極もまた、露出されて参照電極を提供し得る。例えば、DMF電極は、電極310A、310B、または310Cと対向構成の領域に1つの開口部または複数の開口部を含むように改質され得る。
別の実施形態では、DMF電極は、第1の基板上に配設され得、電気化学的感知用の電極のうちの少なくとも1つが第2の基板上に配設され得る。いくつかの実施形態では、DMF電極は、第1の基板上に配設され得、電気化学的感知用の作用電極および参照電極は、第2の基板上に配設され得る。
ある特定の実施形態では、DMF-電気化学チップは、毛管領域を含み得、電気化学的感知用の電極は、毛管領域内に配設され得る。毛管領域は、電気化学的感知の毛管領域への液滴の移動を容易にし得る。
ある特定の実施形態では、本開示の検体検出チップは、米国特許第5,200,051号に開示されるような感知領域を含み得る。米国特許第5,200,051号に記載されるように、対象となる検体の存在および/または濃度を決定するために有用な感知電極が提供された。感知電極は、検体に対する酵素の作用によって検体に応答して生成された電気化学種を検出する。感知電極は、作用電極とも称される。文献で知られているように、電気化学種の生成は、酸化還元媒体の使用を含み得る。さらに、酵素および/または酸化還元媒体は、感知電極に局在する試薬混合物中に存在し得る。他の場合では、酵素および/または酸化還元媒体は、チップに接続されたデポから酵素および/または酸化還元媒体を含む液滴を輸送するために、DMF電極を使用してチップに導入され得る。
他の実施形態では、イムノアッセイが利用され得る。簡潔に、例示的なイムノアッセイにおいて、検体は、検体に結合する第1の結合メンバー(例えば受容体、アプタマー、または抗体)によって捕捉され得る。任意の洗浄ステップ後、複合体を形成するために、検体に結合する第2の抗体が使用され得る。第2の結合メンバー(例えば、抗体またはアプタマー)は、酵素に接合され得、酵素は、基質に作用して、作用電極によって検出される電気化学種を生成し得る。ある特定の場合、酵素は、基質を加水分解し得る。次いで、加水分解された基質は、本開示の検体検出チップを用いて電気化学的に検出される電気活性種(例えば二酸素および過酸化水素)の濃度の変化を生じる反応を受けることができる。そのようなイムノアッセイはまた、第2の結合メンバーに接合されたアルカリホスファターゼによって例示される。アルカリホスファターゼは、基質(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシルホスフェート)と反応して、DMF-電気化学検出チップを用いて電気化学的に検出される電気活性種(二酸素および過酸化水素)の濃度の変化を生じる。サンドイッチアッセイおよび競合アッセイの両方が、米国特許第5,200,051号に記載されている手順を使用して達成され得る。これらのアッセイにおいて、DMF電極に加えて、作用(または感知)電極および任意の参照電極が含まれ得る。生物活性層は、作用電極上に固定化され得、その生物活性層は、対象となる検体に結合する第1の特異的結合メンバー(例えば受容体または抗体)を含む。他の実施形態では、試料は、DMF電極を使用して処理され、電気化学種の検出のために作用/参照電極に輸送され得る。
本開示の一実施形態では、電気化学種を含む液滴を調製するために、検体検出チップが使用され得る。例えば、試料液滴を、検体に作用する酵素を含む液滴と混合して電気化学種を形成するステップは、チップのDMF電極、ならびに電気化学種の検出および任意に測定用の作用電極および参照電極に移動した電気化学種を含む液滴(またはその一部分)によって行われ得る。
他の実施形態では、DMF電極は、試料液滴を、磁気ビーズに接合された第1の結合メンバー(例えば受容体または抗体)を含む液滴と混合するステップを行い得る。結果として生じる液滴は、酵素に接合された第2の抗体を含む別の液滴と混合され得る。次いで、結果として生じる液滴は、緩衝液滴と混合されて任意の未結合の第2の抗体を洗い流し得、液滴は、酵素の基質を含む液滴と混合され得、結果として生じる液滴は、基質に対する酵素の作用によって生成された電気化学種の検出用の作用/参照電極に移動し得る。そのような実施形態では、作用電極は、結合メンバー(例えば、検体に結合する受容体、アプタマー、または抗体)の付着によって官能化される必要がないため、検出/測定されている検体に特異的な結合メンバーを含む液滴を単に装填することによって、同じ検体検出チップが異なる種類の検体を検出するために使用され得る。前のセクションに記載されているものなどの任意のイムノアッセイ形式が使用され得る。DMF電極は、前のセクションに記載された方法などで、イムノアッセイのための試料調製を行うために利用され得る。
検体が酵素の作用によって直接検出される開示された検体検出チップによって、同様の利点が実現される。例えば、酵素(および酸化還元媒体などの追加の試薬)を作用/感知電極上に局在化させる代わりに、試薬を含有する液滴が試料液滴と混合され得、結果として生じる液滴が、検体が試料中に存在するときに酵素によって生成された電気化学種の検出用の作用/感知電極に移動し得る。したがって、検出/測定されている検体に作用する酵素を含む液滴を単に装填することによって、同じチップが異なる検体を検出するために使用され得る。例えば、グルコースの検出のためにグルコースオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼ、乳酸塩の検出のために乳酸デヒドロゲナーゼ、クレアチンの検出のためにクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチナーゼ、またはクレアチンキナーゼなどの酵素が使用され得る。いくつかの例では、グルコースデヒドロゲナーゼは、ニコチンアミドジヌクレオチドグルコースデヒドロゲナーゼ(NAD-GDH)、ピロールキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(PQQ-GDH)、またはフラビン-アデニンジヌクレオチドグルコースデヒドロゲナーゼ(FAD-GDH)であり得る。他の例において、検体は、ベータ-ヒドロキシブチレート(ケトン)であり得、酵素は、ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼであり得る。
電気化学種の検出に必要な電極(例えば作用電極および参照電極)のサイズおよび形状は、経験的に決定され得るか、または文献に基づくことができる。例えば、電極は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,200,051号に開示されているものと同様であり得る。電極の材料は、電気化学的感知を助長する任意の材料であり得る。例示的な電極材料としては、炭素、白金、金、銀、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、水銀、パラジウム、およびオスミウムが挙げられる。ある特定の場合、作用電極は、銀から作成され得、参照電極は、銀/ハロゲン化銀(例えば塩化銀)であり得る。
ある特定の実施形態では、作用電極(および任意の参照電極)は、選択的透過性層で被覆され得る。選択的透過性層は、約120kDa以上の分子量を有する分子を実質的に排除しながら、約50kDa以下の分子量を有する分子の自由透過を可能にし得る。
ある特定の実施形態では、米国特許第5,200,051号に記載されている選択的透過性シラン層を用いることによって、所望の閾値を超える(例えば120kDaを超える)分子量を有する干渉電気活性種が、作用電極表面との相互作用から効果的に除外され得る。しかしながら、そのような選択透過性層は、二酸素および過酸化水素のようなより低分子量の電気活性種が下部の電極表面との酸化還元反応を受けることを可能にする。そのような選択透過性層は、電流測定において特に有用であり得る。
電位差測定において、ある特定のイオノフォア化合物のさらなる組み込みを助長する官能基および化学的性質を有するポリマー材料は、検体検出チップの作用電極上に確立される半透過性イオン感受性フィルムとして使用され得る。電極-フィルム界面における電位の発生は、平衡状態で確立された、いくつかの予め選択されたイオン種の電荷密度に依存する。そのようなイオン種の同一性は、半透過性フィルムに組み込まれたイオノフォアの選択によって決定される。次に、本明細書に記載されるバイオレイヤー中に固定化されている酵素は、予め選択されたイオン種への試料中に存在する特定の検体の変換を触媒する。本明細書に述べられるように、酵素は、バイオレイヤー中に固定化されなくてもよく、むしろ酵素を含む液滴を試料液滴に輸送するDMF電極、および2つの液滴の融合によって、検体に近接させられ得る。
別の態様では、本開示の検体検出チップは、試料液滴の輸送および任意の処理に使用されるDMF電極と、イオン、例えばNa2+、K+、Ca2+などの検体の検出に使用される改質されたDMF電極とを含み得る。試料中のイオンを検出するために、改質されたDMF電極は、DMF電極を被覆するイオン不透過性絶縁層の代わりにイオン選択性膜で被覆され得る。
酸化還元媒体
本開示のチップ内に存在し得るか、または液滴を介して本開示のチップ内に導入され得る酸化還元媒体の代表例としては、フェロセンを含むメタロセンなどの有機金属酸化還元種、またはヘキサシアノ鉄酸塩、ルテニウムヘキサミンなどの無機酸化還元種が挙げられる。本発明のセンサにおける酸化還元媒体として使用可能な追加の好適な電子移動剤は、1つ以上のリガンドを有するオスミウム遷移金属錯体であり、各リガンドは、2,2’-ビピリジン、10-フェナントロリン、1-メチル、2-ピリジルビイミダゾール、またはそれらの誘導体などの窒素含有複素環を有する。電子移動剤はまた、ポリマー中に共有結合した1つ以上のリガンドを有し得、各リガンドは、ピリジン、イミダゾール、またはそれらの誘導体などの少なくとも1つの窒素含有複素環を有する。電子移動剤の一例としては、(a)ピリジンまたはイミダゾール官能基を有するポリマーまたはコポリマー、および(b)2つのリガンドと錯体化されたオスミウムカチオンが挙げられ、各リガンドは、2,2’-ビピリジン、1,10-フェナントロリン、またはそれらの誘導体を含み、その2つのリガンドは、必ずしも同じではない。オスミウムカチオンとの錯体化のための2,2’-ビピリジンのいくつかの誘導体としては、4,4’-ジメトキシ-2,2’-ビピリジンを含む、4,4’-ジメチル-2,2’-ビピリジン、ならびにモノ-、ジ-、およびポリアルコキシ-2,2’-ビピリジンが挙げられるが、これらに限定されない。オスミウムカチオンとの錯体化のための1,10-フェナントロリンの誘導体としては、4,7-ジメチル-1,10-フェナントロリン、ならびにモノ、ジ、およびポリアルコキシ-1,10-フェナントロリン、例えば4,7-ジメトキシ-1,10-フェナントロリンが挙げられるが、これらに限定されない。オスミウムカチオンとの錯体化のためのポリマーとしては、ポリ(1-ビニルイミダゾール)(「PVI」と称される)およびポリ(4-ビニルピリジン)(「PVP」と称される)のポリマーおよびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリ(1-ビニルイミダゾール)の好適なコポリマー置換基としては、アクリロニトリル、アクリルアミド、および置換または四級化N-ビニルイミダゾール、例えば、ポリ(1-ビニルイミダゾール)のポリマーまたはコポリマーに錯体化したオスミウムを有する電子移動剤が挙げられる。実施形態は、標準カロメル電極(SCE)に対して約-200mV~約+200mVの範囲の酸化還元電位を有する電子移動剤を用い得る。
酵素
本開示の検体検出チップと併用される酵素は、検出されている検体または利用されている基質に基づき選択され得る(例えば、イムノアッセイにおいて)。酵素の非限定的な例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、NADHオキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレアチニナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、クレアチナーゼ、クレアチンキナーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼ、L-グルタミン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ジアホラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、およびそれらの混合物のうちの1つ以上が挙げられる。
ii.DMF-光チップ
ある特定の実施形態では、チップによってアッセイされている試料中の検体の存在を示す光シグナルを発生させるために、検体検出チップが使用され得る。光シグナルは、例えば、比色シグナル、濁度シグナル、および/または蛍光シグナルであり得る。光シグナルの大きさは、検体の量に比例してもよく、試料中の検体の存在または濃度を決定するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、検体検出チップの基板のうちの少なくとも1つは、光シグナルの検出を容易にするために透明であり得る。さらに、DMF電極は、透明であり得る。
試料中の検体の存在を示す光シグナルの発生のために試料液滴を処理するために、DMF電極が使用され得る。光シグナルは、基質に対する酵素の作用によって発生し得る。比色アッセイ(例えば、検体特異的酵素の作用により生成された発色反応産物を検出する)、イムノアッセイ、サンドイッチ免疫測定(例えば、酵素検出(酵素免疫測定(EIA)または酵素結合免疫吸着測定アッセイ(ELISA))を含むモノクローナル-ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ)、競合阻害免疫測定(例えば、フォワードおよびリバース)、酵素増幅免疫測定技法(EMIT)、粒子増強比濁阻害免疫測定(PETINIA)、ホモジニアス酵素免疫測定(HEIA)、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)、一段階抗体検出アッセイ、ホモジニアスアッセイ、ヘテロジニアスアッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイなどの任意のアッセイ形式が、光シグナルの発生のために利用され得る。これらおよび他のアッセイ形式は、前のセクションで詳細に記載されている。
本明細書に提供されるカートリッジは、DMF領域と、光学分析のために分子を空間的に隔絶するための複数のウェルを含む領域とを含み得る。そのようなカートリッジは、核酸試験(NAT)に使用され得る。例えば、DMF領域は、試料中に存在し得る標的核酸を増幅することによって試料を処理し得る。いくつかの実施形態では、NATは、試料中に存在し得る複数の異なる標的核酸をアッセイし得る。
測定され得る光シグナルは、蛍光、化学発光、比色、比濁などを含む。ある特定の実施形態では、光シグナルは、分光光度計を使用して検出され得る。例えば、光シグナルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Anal Bioanal Chem(2015)407:7467-7475に記載されているように検出され得る。この技法では、カスタムマニホールドが光ファイバをデジタルマイクロ流体チップと整合し、デバイスの面内で光学測定が行われることを可能にする。デバイス上の液滴の幅対厚さがより大きいため、この技法の面内整合は、デジタルマイクロ流体(DMF)デバイス上の垂直吸光度測定の感度を上回ることを可能にする。他の実施形態では、光シグナルは、チップに垂直な平面で測定され得る。
ある特定の実施形態では、DMF-光カートリッジは、カートリッジ内の液滴を照明するための内蔵または別個の構成要素を含み得る。照明された液滴からの光を検出するために、内蔵または別個の構成要素が使用され得る。例えば、カートリッジ内の液滴を照明するために、導波管が使用され得る。液滴からの光シグナルを検出するためにも導波管が使用され得る。ある特定の場合、DMF-光カートリッジの領域は、導波管材料から製造され得る。ある特定の場合、DMF-光カートリッジの一方または両方の基板は、導波管であり得る。最小限の損失で光を伝播することができる任意の好適な導波管が、そのようなカートリッジに使用され得る。
光シグナル発生は、光源を用いて液滴を照明することと、分光計またはCMOS検出器などの検出器を使用して液滴からの光を測定することとを伴い得る。
酵素の作用によって発生したシグナルの光学的検出のための例示的なチップは、Anal Bioanal Chem(2015)407:7467-7475の図7に示されている。図7は、本明細書では図33として再現されている。図33に示されるように、DMFチップは、検体が吸収されるPPMディスク331を含む。DMFチップを使用して、反応ゾーンにおいてPPMディスクから検体フルオレセインを抽出し、検出ゾーンに移動させ、光ファイバに隣接して位置付けた。レーザを使用して、フルオレセインを励起し、光ファイバを使用してその発光を測定した。
ある特定の実施形態では、DMF-光チップは、光ファイバを用いて構成されなくてもよい。これらの実施形態では、液滴は、垂直方向から調査され得、液滴からの反射光、放射光、または吸光度のいずれかが測定され得る。
iii.DMF-撮像チップ
画像分析のために構成されたDMFチップもまた本明細書に提供される。DMFチップは、第1の基板上に(個別にまたは集合的にエネルギー供給可能な)電極のアレイを含み得、その電極は、絶縁層で被覆されている。第1の基板は、第2の基板から離間していてもよい。ある特定の場合、第2の基板は、電極のアレイに対して対向構成で接地電極を含み得る。
2つの基板は、間隙によって分離されている。ある特定の場合、基板は、1μmなど、約5μm以下の狭い間隙によって分離されている。ある特定の場合、DMFチップの一部分は、1μmなど、約5μm以下の狭い間隙によって基板が分離されている領域を含み得る。例えば、試料が導入される領域における基板間の間隙は、比較的広くてもよく(約100μm)、一方で、試料液滴(または処理された試料液滴)が撮像されるべき間隙は、より狭い。より小さい間隙の高さは、撮像および分析され得る単層の粒子の形成をもたらし、したがって単一粒子の分析をより直接的にする。
図34Aは、赤血球(RBC)が楕円によって表される、考えられる表現を示す。間隙の高さは、RBCが間隙内に複数の層を形成することを制限する。DMFチップ上に配置された画像センサは、分析のための光データを収集するために使用される。この実施形態では、照明は、画像センサと同じ場所に配置されている。頂部基板は、照明および撮像に対して光学的に透明でなければならない。DMFチップから面外には、分析のための光データを収集するために使用される撮像検出器がある。イメージャ技術としては、CMOSおよびCCD技術が挙げられ得るが、これらに限定されない。
図34Bは、DMF-撮像チップを示し、チップの一部分は、粒子を単一層に分散させるように寸法決定された間隙を有する毛管流動領域に接続されたより大きい間隙によって分離された基板を含む。チップのDMF部分は、流体流動を能動的に制御し、流体を混合し、チップ上の異なる活性試薬領域または分析動作(希釈など)に有用である他の作用に粒子を移動させるか、または分離するのに有用であり、一方で、毛管流動領域は、毛管力によるチップのDMF部分上に存在する液滴から狭い毛管間隙への流動間隙遷移によって、粒子単層を形成するチャネルである。これにより、液滴中に存在する物質が、毛管流動領域上に位置付けられ集束される撮像検出器を介して分析されることが可能になる。チップのDMF部分は、流体を制御し、毛管流動領域は、比色、吸光度、透過率、蛍光粒子計数、および撮像(細胞など)のための分析領域を作り出す。毛管チャネル内の計数および撮像は、粒子の静止位置を用いるか、または粒子がチャネルを通って流動するときのいずれかで行われ得る。
図34Bのチップ内のDMF領域内の間隙は、粒子状物質の単層に対して間隙の高さに制約される必要はなく、むしろ、撮像検出器が毛管流動領域に集束されるため、毛管流動領域の間隙は、複数の層が形成されるのを防止する値に保持される。撮像検出器アセンブリは、毛管チャネル内の内容物に焦点を合わせるか、または異なる毛管の高さに適応するために、レンズの複数の被写界深度および移動を有することができる。
図42Aおよび42Bは、一体型試料調製および試料分析カートリッジの実施形態を示す。DMF要素と撮像チャンバとを有するカートリッジ1000の概略図が、図42Aに提供される。DMF電極1003を含む第1の基板1001は、第2の基板1002から離間して配設されている。第1基板と第2基板との間の空間は、カートリッジの第1の領域が高さh1を有する第1のチャンバを含み、第2の領域が高さh2を有する第2のチャンバを含むように変化する。図42Aに示されるように、h1は、h2よりも大きい。ある特定の実施形態では、h1は、20~200μm(ミクロン)、例えば50~200ミクロン、75~200ミクロン、100~200ミクロン、125~200ミクロン、100~175ミクロンの範囲、例えば150ミクロンであり得、h2は、2~10μm(ミクロン)、例えば2~8ミクロン、2~6ミクロン、3~6ミクロンの範囲、例えば4ミクロンであり得る。開示されたカートリッジ1000の態様は、第1のチャンバが、第1のチャンバ内の血液液滴を移動させるように試料液滴、例えば血液試料を作動させ、これにより液滴が第1のチャンバ内に配設された試薬に接触し、それにより第2のチャンバにおける後続の分析のための試料の処理および調製を容易にするように構成された、実施形態を含む。例えば、第1のチャンバは、血液試料中に存在する細胞を染色して、細胞の検出/計数、全血算、ならびに/または他の血液学的測定、例えば細菌、RBC、WBC、および/もしくは血小板の染色、計数、および/もしくは形態分析を容易にするための試薬を含み得る。本明細書に開示されるように、DMF電極は、乾燥形態または液滴の形態で配置された試薬(例えば染色試薬、例えば核酸に結合する染料、例えばアクリジンオレンジ、臭化エチジウム、TOTO、TO-PRO、またはSYTOX)を有する第1のチャンバ内の領域に、試料液滴を移動させるように動作し得る。試料液滴は、試料液滴中の試薬の均一な分布を提供するために試薬と混合され得る。染色試薬の少なくとも80%が試料液滴内に均一に分布されるまで、試料液滴を分割および融合することによって混合が行われ得る。第2のチャンバは、第1のチャンバから第2のチャンバに移された試料の光学的分析を容易にするために、少なくとも撮像領域1004において透明であり得る。示されるように、第2のチャンバは、単層として試料中に存在する細胞の分布を容易にし、細胞の光学的分析においてエラーを引き起こす傾向がある重なり合う細胞を回避するように構成され得る。第2の基板1002は、第1の平面領域と、第2の平面領域を基準にして第1の平面領域の平面の高さを変化させるためにショルダまたはステップ要素1006を導入する傾斜領域によって分離された第2の平面領域とを含み得る。2段の第2の基板は、高さの異なる2つのチャンバを含むカートリッジを提供するために実質的に平坦である第1の基板上に配設される。本明細書で考察されるように、試料は、毛管作用、DMF電極、SAW、または他の方法によって第1のチャンバから第2のチャンバへ移動し得る。
図42Bは、高さh3を有するスペーサによって離間した、第1の基板2002および第2の基板2003によって画定された第1のチャンバ2001を含むカートリッジ2000の一実施形態の概略図を提供する。カートリッジ2000はまた、高さh4を有するビーズ2007によって離間した、第3の基板2006および第4の基板2005によって画定された第2のチャンバ2004を含む。本明細書に記載されるように、DMF電極は、第2の基板上または両方の基板上に存在してもよいが、第1の基板は、DMF電極2008と共に図示される。図42Aのカートリッジと同様に、第1のチャンバは、第2のチャンバの高さよりも大きい高さを有する。ある特定の実施形態では、h3は、20~200μm(ミクロン)、例えば50~200ミクロン、75~200ミクロン、100~200ミクロン、125~200ミクロン、100~175ミクロンの範囲、例えば150ミクロンであり得、h4は、2~10μm(ミクロン)、例えば2~8ミクロン、2~6ミクロン、3~6ミクロンの範囲、例えば4ミクロンであり得る。図42Bに示されるカートリッジは、単層としての細胞の分布を容易にするために第2のチャンバ内で均一な高さを画定するために、第3の基板と第4の基板との間に分散されたポリスチレンビーズを含む。第2のチャンバの少なくとも一部分は、光デバイス2010による調査を容易にするために透明であり得る。図42Aのカートリッジと同様に、第1のチャンバは、第2のチャンバ内での分析のための調製(例えば、染色試薬と混合することによる)のために、試料2012を作動させる。第2のチャンバ内の単層中に分散された細胞2015もまた図示されている。光デバイスは、第3または第4の基板を通して試料を調査するように位置付けられ得る。ある特定の実施形態では、第1の基板2002および第3の基板2006が単一の基板から形成され得、これによりカートリッジが共通の底部基板を有する。第1および第2のチャンバは、毛管作用、DMF電極、SAW、または他の方法を利用して、試料が第1のチャンバから第2のチャンバへ移動することを可能にするように構成され得る。
DMFチャンバおよび撮像チャンバのための追加の構成は、図42C~42Eに示される実施形態を含む。カートリッジは、撮像チャンバに動作可能に接続された試料調製(例えば、試料液滴を染色試薬と混合すること)のためのDMF電極を含むDMFチャンバを含み得る。図42Aおよび42Bの説明で述べられたように、DMFチャンバの高さ(h1)は、20~200μm(ミクロン)、例えば50~200ミクロン、75~200ミクロン、100~200ミクロン、125~200ミクロン、100~175ミクロンの範囲、例えば150ミクロンであり得、撮像チャンバの高さ(h2)は、2~10μm(ミクロン)、例えば2~8ミクロン、2~6ミクロン、3~6ミクロンの範囲、例えば4ミクロンであり得る。図42Cは、第2の基板1102上に配設された第1の基板1101によって画定されたDMFチャンバを含むカートリッジ1100aを示す。DMF電極は図示されておらず、第1および/または第2の基板上に存在し得る。第2の基板1102は、第2の基板1102および第3の基板1104によって画定された撮像チャンバまで延在する。スペーサ1103は、DMFチャンバの遠位端を画定する。スペーサ1103は、第1の基板1101の下部表面および基板1104の上部表面に接触し得る。図42Dは、撮像チャンバが2つの部分からなるスペーサ1103a~1103bを介してDMFチャンバに動作可能に接続されているカートリッジ1100bを示し、スペーサの第1の部分(1103a)は、第1の基板1101と第3の基板1104との間に配設され、スペーサの第2の部分(1103b)は、第2の基板1102と第4の基板1105との間に配設されている。図42Eは、撮像チャンバがDMFチャンバの遠位領域に配設されているカートリッジ1100cを示す。DMFチャンバは、基板1101および1102によって画定されている。撮像チャンバは、基板1101および基板1104によって画定されている。スペーサ1103は、基板1104を支持する。
本明細書に述べられるように、DMFチャンバは、検体検出領域(電気化学的検出、電気的検出、光学的検出など)に可逆的に連結されて、一体型または半一体型カートリッジを形成し得る。DMFチャンバと検体検出領域との連結は、本明細書に記載されているように行われ得る。
ある特定の実施形態では、カートリッジは、血液試料の分析のための試薬を含み得、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,004,821号または米国特許第8,367,012号に開示されるように構成され得る。ある特定の実施形態では、DMF電極および試料調製用チャンバは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、WO2016/161400、WO2016/161402、またはUS2015/0298124に開示されているように構成され得る。DMF電極の代わりに、またはそれに加えて、カートリッジがSAWによって試料液滴を作動させるように構成され得ることが理解される。
iv.複数の検出領域を有するDMFチップ
複数の分析および技法が単一のDMFチップ上で利用されることを可能にするDMFチップもまた本明細書に提供される。図35は、単一の検出技術を利用するのではなく、むしろ検出技術自体のために構成されたゾーンを形成する、特定の検出ゾーンが形成されたDMFチップのレイアウトを示す。例えば、ゾーン350aは、電気化学的検出を可能にするように形成および構成され得、ゾーン350bは、撮像分析に特有であり、ゾーン350cは、吸光度に基づく測定のためのものである。
図35に示されるチップは、異なる検出技術を利用する複数の典型的な診断テストが実施され得るコンパクトなDMFチップを提供する。例えば、血液学的測定は、典型的には撮像分析に依存し、一方で、臨床化学的またはイムノアッセイは、典型的には電気化学または光学に基づく検出に依存する。このチップを使用して、ユーザは、複数の診断分析デバイスにわたって単一の血液採取を利用し、したがって診断プロセスおよびユーザに対する結果取得までの時間を大いに単純化することができる。
図36は、撮像、光子、および電気化学的感知からなるDMFチップレイアウトを示す。DMF構成は、診断要件に応じて、任意の組み合わせおよび/または数の感知ゾーンであり得る。CMOS技術などの撮像センサが利用され得る。より高い感度が必要とされる場合、CCDまたは強化CCD(eCCD)が使用され得る。CMOS検出器は、それらが適切なコーティングを有する電気化学センサとして使用され得るように汎用的である。高感度光子感知が必要な場合、光電子増倍管(PMT)、またはアバランシェフォトダイオード検出器(APD)、またはフォトダイオードが使用され得る(最高から最低まで列挙される)。照明は、発光ダイオード(LED)またはソリッドステート型レーザを使用することによって達成され得る。示されている照明構成は、明視野および蛍光励起の両方に対処する。二色性またはビームスプリッタは、蛍光励起波長を反射し、発光波長を透過させる。二色性のバンドパス波長は、透過した明視野波長がセンサに伝達されることを可能にする。二色性光学構成要素は、透過した光の分析に必要ではなく、蛍光のみが必要である。異なるアッセイのために追加の励起および発光フィルタが必要とされ得、対応する光路に含まれ得る。そのようなチップに適合する検体検出器具は、光シグナルおよび電気シグナルを検出するための手段を含むように構成され得る。例えば、検体検出器具は、CMOS、CCDまたは強化CCD(eCCD)カメラ、PMT、APDなどの撮像センサを含み得る。さらに、検体検出器具は、LED、レーザなどの試料照明用の手段を含み得る。
複数の検出領域を有するDMFチップの一実施形態が図37に示される。図37のチップは、20~80μLの全血試料がチップ上に装填され、試料が最大1/2時間以上存在し得る再懸濁領域に直ちに移される、試料取得ポートを含む。再懸濁領域は、血液が0.5~1μLの体積の5つのアリコートに分配される前に血液を再懸濁するために使用される。再懸濁は、流体路が血液の完全な反転を可能にするように血液試料を往復運動させることによって達成され、流体路は、血液スラグの長さの2倍以上である。
再懸濁された血液は移され、いくつかのアリコートに分割される。個々に、各アリコートは、細胞を染色、球状化または溶解するための試薬セクションを通過する感知/撮像領域に移される。この領域内でのアリコートの往復運動によって混合が達成される。この図は、血液学的測定用の異なる試薬および撮像領域を示す。消耗品中の全ての試薬が乾燥している。流体路内の他のコーティングは、液体を操作するための疎水性表面および親水性表面を提供する。電気化学的感知および光学的感知を実施するための代替構成が含まれ得る。血小板(PLT)、網状赤血球(RETC)、および有核赤血球(NRBC)は、赤血球(RBC)および白血球(WBC)と同じ撮像領域で撮像され得る。DMFは、取得ポートに試料を収集し、試料を再懸濁するために使用され得、任意にアリコート分割を含み、試料全体を染色する。そのようなチップは、例えば、血液型を決定することなど、血液凝集をアッセイするために使用され得る。
図38および図39は、電気化学的および光学的検出が可能なDMFチップを示す。20~80μLの全血試料が充填ポートにおいて患者から取得され、試料が最大1/2時間以上存在することができる再懸濁領域に直ちに移される。再懸濁領域は、血液が分配される前に血液を再懸濁するために使用される。再懸濁は、流体路が血液の完全な反転を可能にするように血液試料を往復運動させることによって達成され、流体路は、血液スラグの長さの2倍以上である。試料が移され、2つのアリコートに分割され、一方は血漿分離用、他方は全血分析用である。血漿分離は、分離媒体、すなわち濾過を用いて、またはDMFの能力を利用する流体的方法によって達成され得る。消耗品は、図37の血液学的構造と同じ撮像センサレイアウトを利用する。各撮像領域は、試薬混合のための対応する領域を有する。「染色および混合領域」内の全ての試薬が乾燥している。試料の洗浄を提供するために、洗浄用の試薬パックが流体設計に追加され得る(図39)。
v.検体検出デバイス
本明細書に述べられるように、検体検出チップと相互作用するためのカートリッジインターフェースを含む検体検出デバイスが提供される。ある特定の実施形態では、検体検出デバイスは、1種類のみの検体検出チップと適合し得る。そのような検体検出デバイスは、単一のカートリッジインターフェース、例えば単一の挿入スロットを含み得、スロットに挿入された単一のチップ上で動作し得る。他の実施形態では、検体検出デバイスは、複数のカートリッジインターフェース、例えば複数のチップ(異なる試料が装填された同じ種類の)を動作させるために使用され得る挿入スロットを含み得る。さらに他の実施形態では、検体検出器具は、単一の検体検出チップが挿入され得る単一のスロットを含み得る。しかしながら、検体検出デバイスは、複数の異なる種類の検体検出チップ、例えばDMF-電気化学検出チップ、DMF-光検出チップ(DMF-NAT検出チップを含むDMF-ナノウェル検出チップ、DMFおよび光検出領域が本明細書に記載されるように隣接、部分的に一体化、または完全に一体化しているDMF-撮像チップ)、DMF-電気チップ、ならびに複数の検出領域を有するDMFチップのうちの2つ以上の上で動作することができる多機能器具または汎用器具であり得る。いくつかの実施形態では、汎用器具は、異なる検体検出チップごとに別個の挿入スロットを含み得る。他の実施形態では、汎用器具は、異なる種類の検体検出チップと適合する単一の挿入スロットを有し得る。多機能または汎用検体検出器具は、光検出および電気検出ユニットを含み得る。
検体検出デバイスは、電源とDMF電極を作動させるための回路とを含み得る。デバイスが動作する検体検出チップに応じて、検体検出デバイスは、(電気化学的検出のために)作用電極からの電気シグナルを検出するための回路、光シグナルを検出するためのセンサと、撮像のためのカメラ(複数可)とを含み得る光学的検出、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。検体検出デバイスは、メモリを含み得るか、または検体検出チップの動作のための命令を記憶するメモリに動作可能に接続され得る。ある特定の場合、デバイスは、検体関連シグナルを発生させ、シグナルを検出するために必要なステップを実施するためのプログラムを実行するプロセッサによって動作し得る。検体検出デバイスはまた、検出された電気または光シグナルに基づき検体の濃度を計算するためのアルゴリズム(複数可)を含み得る。
本明細書に開示される検体検出デバイスはまた、PCT/US2016/025785に開示されているものなどのDMF-ナノウェルカートリッジ上で動作するように構成され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるカートリッジのDMF部分(例えば、DMF-電気化学検出チップ、DMF-光検出チップなど)は、PCT/US2016/025785またはPCT/US2016/025787に開示されるように構成および形成され得る。
図40Aおよび図40Bは、検体検出デバイスを示す。図40Aの検体検出デバイス410aは、単一の種類の検体検出チップと適合する。図40Aのデバイス410aは、単一の種類の検体検出チップ用の単一スロット411aなどの単一のインターフェースを含み得る。ある特定の場合、図40Aのデバイス410aは、それぞれが同じ種類の検体検出チップを受容するスロット(411a、411b、4111c、411d)などの複数のインターフェースを含み得る。図40Aのデバイス410aは、検体の存在について複数の試料を同時に分析するために使用され得る。ある特定の実施形態では、図40Aのデバイスは、検出チップを使用するためのプログラミングを含むメモリに動作可能に接続されたプロセッサ413を含む筐体を含み得る。スロット411aおよび追加のスロット(存在する場合)は全て、筐体内に収容され得る。他の実施形態では、筐体はプロセッサのみを含んでもよく、任意にスクリーンまたはモニタ、ならびにスロット411a~411dなどの1つ以上のスロットを備える別個のデバイスに接続し、それを動作させるのに十分なハードウェアおよびソフトウェアを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、デバイスのオペレーティングシステムは、カートリッジが配置されるスロットから物理的に分離可能であり得る。
図40Bのデバイス410bは、複数のスロット412a、412b、412c、および412dを含む。スロット412aは、DMF-電気化学検出チップと適合する。スロット412bは、DMF-光検出チップと適合する。スロット412cおよび412dは、それぞれDMF-ナノポアおよびDMF-ナノウェルチップと適合する。デバイス410aおよび410bはまた、検出チップを使用するためのプログラミングを含むメモリに動作可能に接続されているプロセッサ413を含む。デバイス410aと同様に、デバイス410bは、プロセッサ413を収容する筐体と、任意のスクリーンまたはモニタと、スロットスロット412a~412dを含み得るか、筐体は、スロット412a~412dを含まなくてもよく、それらは、デバイス410bに接続された別個のデバイス(複数可)内に存在し得る。
図40Cは、図40Aおよび図40Bに示される検体検出デバイスと適合する検体検出チップを示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、単一のスロットを異なる種類のカートリッジに適合させるために利用され得るカートリッジアダプタ(複数可)を含み得る。例えば、カートリッジアダプタ1は、スロット1に接続するための第1のインターフェースと、カートリッジ1に接続するための第2のインターフェースとを含み得、カートリッジアダプタ2は、スロット1に接続するための第1のインターフェースと、カートリッジ2に接続するための第2のインターフェースとを含み得る。カートリッジアダプタおよびカートリッジアダプタと適合するカートリッジは、図40Dおよび図40Eに示される。図40Dは、プロセッサを含むかまたはプロセッサに(物理的に、または無線で)接続可能であるデバイス内に存在するスロットと適合するピン5810aと5810bとを備える第1のインターフェースを含むカートリッジアダプタ5812aを示し、プロセッサは、カートリッジのDMF領域内で試料を調製すること、および/または調製された試料を分析すること(例えば、検体関連シグナルを検出すること)に必要なステップを行うための命令を有する。カートリッジアダプタ5812aの第2のインターフェースは、カートリッジ5814(例えば、免疫測定カートリッジ)上に存在するピン5813と噛合するポート5811を含む。図40Eは、ピン5810aおよび5810bの存在により、カートリッジアダプタ5812aと適合したものと同じスロットと適合するカートリッジアダプタ5812bを示す。しかしながら、カートリッジアダプタ5812bの第2のインターフェースは、カートリッジ5815(例えば、血液学カートリッジ)を収容し、それに接続可能であるが、カートリッジ5814には接続可能ではない空洞を含む。したがって、スロットを適合させて複数の異なる種類のカートリッジと接続するために、カートリッジアダプタが使用され得る。
図41Aは、本明細書に記載される方法に従って試料の分析を実施するために使用され得る検体検出チップを示す。検体検出チップは、遠位領域に開口部を含み、この開口部は、試料を検体検出チップに導入するための入口(図41Aの矢印で印が付けられた)を提供する。本明細書に述べられるように、ある特定の場合、試料は、全血試料であり得る。ある特定の実施形態では、試料は、検体検出チップの開口部にピペットで移され得る。他の実施形態では、試料液滴は、指先などの皮膚のランセット切開領域から検体検出チップに直接装填され得る。検体検出チップの遠位領域は、試料中に存在する1つ以上の検体を検出するために、試料を処理し、かつ/または試料を検体検出チップ内の適切な領域に移すための要素を含み得る。検体検出チップの近位領域は、試料分析用の検体検出デバイスに挿入可能である。ある特定の場合、検体検出チップは、カバーを含み得、チップの近位領域におけるカバーの一部は、近位領域の内部を露出するように移動可能である。カバーの可動部分は、チップのカバーにヒンジで取り付けられてもよく、チップの内部を露出させるために上方に枢動し得る。他の場合では、カバーの可動部分は、近位領域でチップの内部を露出させるために、遠位領域に向かって摺動可能であり得る。ある特定の場合、検体検出チップは、図41Bに示される検体検出デバイスと適合し得る。本明細書に述べられるように、チップは、ナノポアおよび/またはナノウェルを含み得る。さらに、チップは、電極、例えばデジタルマイクロ流体用の電極のアレイを含み得る。
図41Bは、本明細書に記載される検体検出チップと適合する検体検出デバイスを示す。例えば、検体検出デバイスは、図41Aに示される検体検出チップと適合する。図41Bの検体検出デバイスは、検体検出チップの少なくとも近位領域が挿入される単一の挿入スロット(矢印で示される)を含む。ある特定の場合、チップ全体または実質的に全体が挿入スロットに挿入される。場合によっては、この検体検出デバイスはまた、複数の挿入スロットなどの複数のインターフェースを含むように構成され得る。図41Bに示されるように、検体検出デバイスは、約12インチの範囲内の高さを有するベンチトップデバイスにとって理想的なサイズを有する。
本明細書に開示されるチップ、デバイス、およびシステムは、試料分析の分野において多くの利点を提供する。これらのチップおよびデバイスは、少量の試料に対してさえ信頼性が高く、他の試料分析デバイスに代わる低コストの代替品である。デバイスの設置面積が小さいことに加えて、これらのデバイスは使い易く、イムノアッセイおよび/または臨床化学を含む複数の中心的臨床試験を行うために使用され得る。本明細書で説明されるように、開示されたチップ、デバイス、およびシステムは、少量の試料の分析を可能にする高感度を提供する。さらに、チップおよびデバイスの構成は、最小限のユーザ入力を必要とし、最小限の訓練を受けたユーザが試料を分析するためにデバイスおよびチップを動作させることを可能にする。本開示のチップおよびデバイスは、可動部品を全く有しないか、最小限有し、それは、デバイスの寿命を延ばすと同時に、製造および/またはメンテナンスコストも低減する。
検体検出器具は、CMOS、CCDまたは強化CCD(eCCD)カメラ、PMT、APDなどの撮像センサを含み得る。さらに、検体検出器具は、LED、レーザなどの試料照明用の手段を含み得る。検体検出器具はまた、DMFチップを動作させるため、およびDMF-電気化学/電気チップを動作させるための電気回路を含み得る。
いくつかの実施形態では、検体検出は、一定レベルの感度を必要とし得る。所望の感度に応じて、DMF-光チップ(例えばDMF-ウェルアレイチップ)またはDMF-電気化学チップもしくはDMF-電気チップが利用され得る。検体検出のためのさらに他のアッセイでは、例えば、DMF電極上に存在する液滴が(例えば分光光度計を使用して)光学的に調査されるDMF-撮像チップが使用され得る。
vi.検体検出システム
検体検出チップとチップと適合する検体検出デバイスとを備えるシステムもまた本明細書に開示されている。本開示に述べられるように、器具は、単一の多機能チップを使用して、または異なるチップを使用して、複数のアッセイを行うことができる。例えば、器具は、電気シグナル(DMF-電気化学チップ内の作用電極および参照電極と接触している電気化学種からのもの、またはDMF-ナノポアチップ内のナノポアを横断する分子からのものなど)、ならびに光シグナルを検出することができ、DMF-ウェルアレイチップ上のウェルアレイを撮像すること、ウェルアレイからの検体関連シグナルを検出すること、および/またはDMF-撮像チップ上の液滴を撮像することを含む。本明細書に述べられるように、DMF-電気化学チップでは、DMF電極は、単一基板上の作用電極および参照電極に隣接していてもよく、または作用電極および参照電極は、DMF電極が配設されているチップの領域に流体的に接続された毛管内に配設され得る。場合によっては、DMF電極のアレイを基準としたDMF^光チップ上のウェルアレイの位置は、前のセクションで説明された通りであり得る。
本開示のシステムは、試料中の検体(複数可)の分析のための試験のメニューを実行するようにプログラムされ得る。例えば、器具は、器具内に配置されたチップの種類を検出してもよく、チップ上で行われるアッセイを選択してもよい。器具は、DMF電極を活性化および不活性化して試料液滴(複数可)を処理し、電気的または光学的に調査され得る液滴を生成し得る。例えば、器具は、液滴中の電気化学種および/または液滴中の光学活性分子(例えば発色分子、蛍光分子など)を検出し得る。加えて、器具は、例えば、(例えば、単一の検体が各ウェル内に存在するように)ウェルアレイにわたって液滴を分割することによって、液滴をより小さい部分に分離し、ウェルを光学的に調査し得る。
システムは、DMF電極を制御するため、および電気化学的検出または光学的検出などに使用される電極を制御するために、システムに含まれる(例えばデバイスに含まれる)プロセッサ上で実行される命令を有するメモリをさらに含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示の検体検出システムは、試料液滴/緩衝液滴/試薬液滴などの移動のためにDMF電極を最初に活性化するための命令でプログラムを実行するためのプロセッサを含む、検体検出デバイスを含み得る。命令は、DMF電極を非活性化することと、試料中の検体の存在に応答して生成された電気化学種を検出するための作用電極からの電気シグナルを測定することとをさらに含み得る。システムは、例えば、検体の濃度を決定する前にノイズを除去するために、チップから記録されたシグナルを正規化するためのアルゴリズムをさらに含み得る。アルゴリズムは、検体濃度を決定するのを補助するための較正曲線を含み得る。
本明細書に開示されるシステムは、電気シグナル(例えば、電気化学種からの)および/または試料中の検体の存在を示す光シグナルを発生させるために試料液滴を処理するために使用され得る。電気および/または光シグナルは、基質に対する酵素の作用によって発生し得る。試料は、本開示に記載される任意のアッセイ形式を利用して処理され得る。例えば、試料は、光シグナルの発生のために処理され得る。ある特定の場合、アッセイは、比色アッセイ(例えば、検体特異的酵素の作用により発色反応産物を生成する)、イムノアッセイ、サンドイッチ免疫測定(例えば、酵素検出(酵素免疫測定(EIA)または酵素結合免疫吸着測定アッセイ(ELISA))を含むモノクローナル-ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ)、競合阻害免疫測定(例えば、フォワードおよびリバース)、酵素増幅免疫測定技法(EMIT)、粒子増強比濁阻害免疫測定(PETINIA)、ホモジニアス酵素免疫測定(HEIA)、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)、一段階抗体検出アッセイ、ホモジニアスアッセイ、ヘテロジニアスアッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイなどであり得る。これらおよび追加の例示的なアッセイ形式は、前のセクションで詳細に記載されている。
本開示のシステムは、試料中の検体の電気化学的検出のための方法に使用され得る。方法は、(a)試料をカートリッジに導入することであって、カートリッジが第1の基板と、第2の基板と、第2の基板から第1の基板を分離する間隙と、液滴に対する電気作動力を発生させるための複数の電極と、作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域とを備える、導入することと、(b)複数の電極を作動させて、検体を含む第1の液滴を提供することと、(c)複数の電極を作動させて、検体に特異的な酵素を含む第2の液滴を提供することと、(d)複数の電極を作動させて、第1および第2の液滴を融合して混合物を形成することと、(e)複数の電極を作動させて、混合物の全部または一部分を電気化学感知領域に移動させることと、(f)作用電極および参照電極を介して、検体に対する酵素の作用によって発生した電気化学種の電気シグナルを検出することとを含み得る。
場合によっては、第2の液滴は、酸化還元媒体も含み得る。場合によっては、システムは、電気シグナルに基づき検体の濃度を決定し得る。場合によっては、電気化学感知領域は、カートリッジ内の毛管領域内に配置される。
ある特定の実施形態では、方法は、(a)試料をカートリッジに導入することであって、カートリッジが第1の基板と、第2の基板と、第1の基板から第2の基板を分離する間隙と、液滴に対する電気作動力を発生させるための複数の電極と、作用電極および参照電極を含む電気化学種感知領域とを備える、導入することと、(b)複数の電極を作動させて、検体を含む第1の液滴を提供することと、(c)複数の電極を作動させて、検体に特異的に結合する第1の結合メンバーを含む固体基材を含む第2の液滴を提供することと、複数の電極を作動させて、第1および第2の液滴を融合して混合物を形成することと、(e)複数の電極を作動させて、混合物の全部または一部分を、検体に特異的に結合する第2の結合メンバーを含む第3の液滴と融合ことと、(f)複数の電極を作動させて、いかなる未結合の検体および/または第2の結合メンバーも除去しながら、固体基材を所定の位置に保持することと、(g)複数の電極を作動させて、固体基材を、第2の結合メンバーに接合された酵素に対する基質分子と接触させることと、(h)作用電極および参照電極を介して、基質分子に対する酵素の作用によって生成された電気化学種の電気シグナルを検出することとを含み得る。
場合によっては、方法は、ステップ(g)および(h)の前に、ステップ(f)からの第2の固体基材を含む液滴を電気化学感知領域に移動させることを含み得る。他の場合では、方法は、ステップ(g)からの第2の固体基材および酵素基質を含む液滴を電気化学感知領域に移動させることを含み得る。
場合によっては、第2の液滴は、酸化還元媒体も含み得る。場合によっては、システムは、電気シグナルに基づき検体の濃度を決定し得る。場合によっては、電気化学感知領域は、カートリッジ内の毛管領域内に配置される。
本明細書に述べられるように、システムおよび器具は、多機能カートリッジ(複数可)を使用して、または複数の別個の単一アッセイカートリッジを使用して、2つ以上の別々のアッセイを行い得る。ある特定の場合、システムはまた、単一のカートリッジ(例えば、臨床化学のために、かつウェルアレイを有して構成された)、または異なるカートリッジを使用して、試料に対してイムノアッセイを実施することを含む方法も行う。方法は、単一分子を空間的に隔絶すること、および任意に、隔絶された単一分子を光学的に検出して試料中の検体の存在を検出することを伴い得る。
ある特定の実施形態では、器具を使用して検体検出を行うための方法が開示されている。方法は、1つ以上の検体検出カートリッジに動作可能に接続するためのカートリッジインターフェースを備える検体検出器具を提供することと、液滴に対する電気作動力を発生させるための複数の電極を有する複数のカートリッジを提供することと、第1のカートリッジを器具とインターフェース接続し、カートリッジ内の液滴から検体関連シグナルを検出することと、第2のカートリッジを器具とインターフェース接続し、空間的に隔絶された単一分子からの、および/またはカートリッジ内の空間的に隔絶された分子からの検体関連シグナルを検出することとを含み得る。
ある特定の場合、システムは、それが複数の器具とインターフェース接続することを可能にするプログラミングを含み得、複数の器具のそれぞれが複数のアッセイを実施し、複数の器具が異なるか、または同一である。例えば、図43Aに示されるようなシステムは、複数のデバイス411に動作可能に接続されたプロセッサ413を含み得、複数のデバイスはそれぞれ、カートリッジが挿入され、プロセッサによって動作され得る少なくとも1つのスロット(411a~411d)を含み得る。デバイス411は同一であってもよく、同時に処理され得る試料の数を増加させるための手段を提供し得る。ある特定の実施形態では、システムは、プログラミングを含んでもよく、またはそれらが利用可能になったときに追加のまたは代替の器具とインターフェース接続することを可能にするプログラミングを含むようにアップグレードされ得る。図43Bに示されるようなシステムは、複数の異なるデバイス414a~414dに動作可能に接続されたプロセッサ413を含み得、複数のデバイスはそれぞれ、異なる種類のカートリッジが挿入され、プロセッサによって動作され得る少なくとも1つのスロット(412a~411d)を含み得る。例えば、第1のデバイスは、イムノアッセイを実施するように構成され得、第2のデバイスは、電気化学的アッセイを実施するように構成され得、第3のデバイスは、血液学的アッセイを実施するように構成され得るなどである。そのような実施形態では、デバイスおよびそのデバイスと適合するカートリッジは、(試料分析のための)試料調製および検体関連シグナルの検出のための手段を含み得る。プロセッサ413によって実行されるプログラミングは、DMF電極の作動または試料調製のためのSAWの発生、および調製された試料からのシグナルを検出するためのカメラ、顕微鏡、電気化学センサなどの検出モジュールの制御など、アッセイを実施するために必要なステップを実行するためのデバイスに通信される命令を含み得る。システムは、アッセイ結果を提供する前に収集されたデータを分析するためのアルゴリズムをさらに含み得る。システムは、システムに無線で接続された遠隔デバイス上でアッセイ結果を提供するために無線通信用に装備されてもよい。ある特定の場合、遠隔デバイスは、リアルタイムで結果を受信し得る。ある特定の場合、アッセイ結果のプリントアウトを提供するために、プリンタもまたシステムに接続され得る。
図43Aおよび図43Bに示されるシステムのモジュール性は、例えばポイントオブケア施設で消費者に柔軟性を提供するために、システムの機能性に追加すること、またはそれから取り除くことを可能にする。
検体
本明細書に提示される方法、チップ、器具、および方法によって分析され得る検体の非限定的なリストは、血液試料(またはその一部分、例えば血清もしくは血漿)などの生物学的試料中に存在する分子を含む。対象となる例示的な検体としては、核酸、以下のうちの1つ以上、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、コレステロール、トリグリセリド、グルコース、ヘモグロビン(Hb)、HbA1c、アルブミン、ミクロアルブミン、全タンパク質、ナトリウム(Na+)、カリウム(K+)、塩化物(Cl-)、二酸化炭素、酸素、クレアチニン、カルシウム(Ca2+)、血中尿素窒素(BUN)、pH、乳酸塩、ケトン体、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルカリホスファターゼ(ALP)、ビリルビン、フェリチン、アルコール(血中アルコール)、アンフェタミン、メタンフェタミン、大麻、アヘン剤、バルビツレート、ベンゾジアザピン、三環酸、コカイン、およびフェンシクリジン(PCP)が挙げられる。本明細書に開示されるDMF-電気化学/電気/光検出チップを使用して検出および任意に測定され得る追加の検体は、前のセクションにおいて検出される検体の1つ以上を含む。本開示の方法、デバイス、およびシステムを使用して検出および測定され得る検体のさらなる例としては、血球、インフルエンザウイルス、連鎖球菌、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、単核症、結核、B-HCG、HIV、HCV、HBV、梅毒、ヘルペス、トロポニン、BNP、CK-MB、ミオグロビン、D-ダイマー、PSA、TSH、T3、T4、FSH、LH、エストラジオール、テストステロン、ビタミンD、B12、H.Pyloriが挙げられる。
検体が検出されている試料は、血液、固形組織、別の体液、例えば尿、痰、唾液、脳脊髄液などの本明細書に開示される任意の試料、ならびに環境試料、例えば水、土壌、食品試料などであり得る。
実施例1:
低コストDMFチップの製造
電極パターン化のためのウェットリフトオフプロセスと組み合わせたロールツーロール(R2R)フレキソ印刷を使用して、低コストの可撓性DMFチップを製造した。製造プロセスの概略図が図18に示される。DMF電極印刷用の出発物質として、Melinex ST506ポリエチレンテレフタレート(PET)5.0ミル基板(1)のロールを使用した。Aniloxローラアセンブリ上で、3.8mL/m2のインク転写量を使用して、10m/分の速度で、厚さ1.14mmの印刷版(Flint MCO3)を使用して、黄色のインク(Sun Chemical)の層をPET基材上にフレキソ印刷した(2)。DMF電極パターンのネガ像は、フレキソ印刷ステップから生じる(3)。金属堆積の前に、インクを熱風炉で2回(2×100℃)乾燥させた。EVA R2R金属エバポレータを使用して、印刷されたPET基板上に銀の金属層を堆積させ、厚さ80nmの銀の均一なコーティングを形成した(4)。1m/分の速度で、超音波処理槽内のアセトン+超音波の組み合わせを使用して、金属化インク-フィルム基板(5)をウェットリフトオフプロセスに供した(6)。この化学的/物理的処理により、銀のみの層を無傷に保ちながら、銀-インク層が溶解することが可能になる。インク-銀層を除去すると、50または140μmのいずれかの電極間隙間隔を有する80個の作動電極(2.25×2.25mm)からなるDMF印刷電極パターンが得られた(7)。QCチェックとして、単一ロールからの合計80~90個のランダムチップを電極間隙間隔およびコネクタリード幅変動について目視検査した。許容できる間隙仕様を有すると判定されたチップの典型的な収率は、100%に近かった。単一の製造された可撓性チップが図19に示されている。製造された可撓性チップは、3”×2”あり、電極、リザーバ、導体パッド、およびリードを含む。
回転スクリーン印刷またはグラビア印刷のいずれかを使用することによって、誘電体コーティングを電極およびリザーバに適用した。回転スクリーン印刷については、2m/分の印刷速度および50%のUV硬化速度で、Gallus NF(400L)スクリーンを用いて印刷することによって、Henkel EDAC PF-455Bを、誘電体コーティングとして使用した。典型的な誘電体の厚さは、10~15μmであった。グラビア印刷については、50mL/m2のインク量を使用して2m/分の速度で、IPD-350(Inkron)などの高粘度誘電体インクを印刷するようにシリンダを設計した。グラビア印刷のための典型的な誘電体の厚さは、7~8μmであった。グラビアシリンダ(140~180L)および8m/分の印刷速度を用いたAvalon 87またはCytonix Fluoropel PFC 804 UCのいずれかのコーティング、続いて4つの連続炉乾燥ステップ(4×140OC)を使用して、最終的な疎水性層を印刷した。典型的な疎水性の厚さは、40~100nmであった。
あるいは、個々のチップの小バッチについては、誘電性コーティングおよび疎水性コーティングは、それぞれ化学蒸着(CVD)およびスピンコーティングを使用して適用され得る。
実施例2:
低コストDMFチップの機能試験
上の実施例1で概説されたように製造した3”×2”のPETベースのDMF底部チップを作動能力について試験した。図20は、厚さ0.7mmのガラス基板(3)をその上に位置付けた3”×2”のPETベースのDMFチップ(1)を示す。ガラス基板(3)は、ガラス基板の下部表面上の透明なインジウムスズ酸化物(ITO)電極と、ITO電極上のTeflonコーティングとを含む。DMFチップは、8個の緩衝液リザーバと共に、直線縁部の電極設計および電極間の50μmの間隙を有する80個の銀作動電極を含む(上の実施例1を参照)。
底部電極を、それぞれCVDコーティングおよびスピンコーティングによって、誘電体パリレン-Cの層(厚さ6~7μm)およびTeflonの最終コーティング(厚さ50nm)で、コーティングした。0.1%界面活性剤を有する約50μLのPBS緩衝液(2)を底部DMFチップ上の4つの隣接するリザーバにピペットで移した。液滴サイズは、700~1500nL(1滴または2滴)の範囲であり、混合に必要な円形掃引パターンに加えて、垂直および水平の両方の横方向の移動について調べた(4)。90Vrmsの電圧を使用して液滴作動を達成した。チップ上の作動電極の約90%を試験し、完全に機能的であることがわかった。
実施例3:
低コストDMFチップ上のTSH免疫測定
上の実施例2に記載されているようにガラス基板と重ね合された3’×2’のPETベースのDMFチップを、化学発光検出を使用して、甲状腺刺激ホルモン(TSH)免疫測定を実施するその能力について試験した。模擬試料は、ブロッキング剤と界面活性剤とを含むTBS緩衝液にスパイクしたTSH較正物質を含んだ。3つの試料、0、4、40μIU/mLを試験した。5μmの磁性微粒子(3×108粒子/mL)上にコーティングされた2μLの抗ベータTSH捕捉抗体を、微粒子リザーバからDMF電極アレイの中央に分注した。DMFチップの下にネオジム磁石棒を係合することによって、磁性微粒子を緩衝液から分離した(図21A)(厚さ3インチ×1/2インチ×1/4インチ、比透磁率μr=1.05、残留磁界強度Br=1.32T)。5μLの試料を微粒子スラグに移動させ、続いて微粒子懸濁液(図21B)を4電極正方形構成で5分間混合した。微粒子を磁石によって試料から分離し、上清を廃棄物リザーバに移動させた(図21Cおよび21D)。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に接合した2μLの1μg/mL抗TSH検出抗体を微粒子スラグに移動させ、2分間混合した。微粒子を磁石で分離し、上清を廃棄物リザーバに移動させた。免疫測定サンドイッチ複合体を含む微粒子を、0.1%界面活性剤を含む4×2μLのPBS洗浄緩衝液で合計4回洗浄した。各洗浄ステップからの洗浄緩衝液を、ステップが完了した後に廃棄物に移動させた。化学発光基質は、1μLのSuperSignal H2O2および1μLのルミノール(ThermoFisher Scientific)からなり、これを微粒子スラグに移動させ、続いて6分間混合した。5VのDC源を備えた一体型Hamamatsu H10682-110 PMTを使用して、427nm発光(347nm励起)で、化学発光シグナルを測定した。用量反応曲線を相対発光に対してプロットした(図21Eを参照)。
実施例4:
DMF頂部電極チップおよびウェルアレイの製造および設計
頂部電極設計:
ウェルアレイを含む低コストの可撓性DMF頂部電極チップを、ロールツーロール(R2R)グラビア印刷およびUVインプリンティングを使用して製造した。図22を参照すると、基本設計(1)は、DMFチップのための頂部電極として使用したポリエチレンテレフタレート(PET)の可撓性基板上に印刷された2組のウェルアレイを組み込んだ。設計は、Melinex ST504 PET基板(2)(Solutia,OC50 ST504)上に印刷された厚さ100nmのインジウムスズ酸化物(ITO)の層(3)からなった。PEDOT:PSSプライマー(4)のコーティングを使用して、最終ウェルアレイを含んだUVエンボス加工レジスト(5)の接着性を改善した。
頂部電極のロールツーロール製造:
図22Bは、DMF頂部電極の製造プロセスの概略図を示す。グラビア印刷(8)を使用して、粘度を低減するためにイソプロパノールで希釈した20nm厚のPEDOT:PSS(7)(Clevios VP AI4083)のプライマー層を、5ミルのMelinex ST504 PET基板(6)上にコーティングした。ロールサイズは、250m×200mm×125μmであり、印刷速度は、10m/分であった。結果として生じるプライマーコーティングITO電極(9)を、第2のR2R印刷ラインに移し、そこでUVレジスト層(10)をグラビアコーティング(11)で適用して、UVエンボス加工用前駆体材料(13)を形成した。ナノアレイモールドと接触させ、続いてUV硬化させると、切断する準備が整った最終的なR2R頂部電極フィルム(14)が得られた。
ウェル設計:
ウェル設計が図23に示される。ITO共通電極を含む頂部チップを、底部チップ(17)上の2つの外部作動電極と整合するように位置付けられた2つのナノ寸法ウェルアレイ(16)をそれぞれ含む3”×1.4”ストリップ(15)に切断されるように設計した。底部チップ上に頂部電極を配置することにより、最終DMFチップアセンブリ(18)が得られた。各アレイは、約60,000ウェル(245×245)を含んだ。
図24Aおよび図24Bを参照すると、初期設計では、六角形(19)および直線の列(20)の2つの異なるウェル間隔形式を使用した。さらに、2つのシム設計を使用して、2つの異なるウェルサイズ(21)、ピッチが8.0μmで幅4.2μm×深さ3.0μm、ピッチが8.0μmで4.5μm×3.2μmを印刷した。ウェルサイズおよび幾何学的間隔の変更を、直径2.7μmのビーズのその後の微粒子充填について最適化するために行った。適切なウェル間隔、サイズ、および完全性をチェックするために、様々なR2R実行で製造後のQCを実施した。変形したウェルが観察された場合、またはウェル間隔および/もしくはサイズが不正確だった場合は、新しいシムを製造し、アレイを再印刷した。図25は、六角形(22)および直線の列(23)アレイについての200倍の倍率での光学画像を示す。
実施例5:
ウェルアレイを含むDMF頂部電極チップのアセンブリ
DMFプラスチックチップアセンブリ:
図26は、上の実施例4に記載されているように、DMF頂部電極チップおよびナノ寸法ウェルアレイからの一体型DMF-ウェルデバイスのアセンブリを概略的に説明する。DMFチップは、底部DMFチップ(25)の両側に2×2片の90μm両面テープ(24)(3M)を配置することによって組み立てられる。埋め込まれたアレイ(26)を含む頂部電極は、底部チップの上部の中心にあり、これにより2つのアレイの位置は、2つの下部の作動電極と整合する。最終的に組み立てられたチップ(27)は、180μmの間隙高さ(2×90μmテープ)を有する。
実施例6:
低コストDMF-ウェル一体型チップに対するTSH免疫測定
TSHについてのイムノアッセイは、DMF、マイクロ寸法ウェルアレイ、および蛍光基質のデジタル検出の組み合わせを使用して記載される(図27A~27G)。DMFチップ(頂部電極および底部電極)には、(1)に示されるようにイムノアッセイ(IA)試薬が予め装填される(図27A)。アッセイは、充填剤流体として空気を使用してDMFチップ上で行われる。試料は、全血、血清、血漿、尿、痰、間質液、または同様のマトリクスなどの生物学的試料であり得る。捕捉微粒子は、2×107~2×108粒子/mLの密度で抗ベータTSH抗体を用いてコーティングされた固相磁性微粒子の懸濁液からなる。約1~2μLの試料がDMFチップ上に移動し、1~2μLの微粒子と混合され、続いてDMFチップのゾーン1(2)内で混合される(図27B)。ゾーン1は、磁性微粒子上にTSHの捕捉複合体を形成するために試料を組み合わせ、混合し、かつ洗浄するために貯蔵された16個のDMF電極からなる。インキュベーション時間は、1~10分の範囲であり得、続いて洗浄緩衝液1リザーバからの1~2μLの洗浄緩衝液(PBS、0.1%界面活性剤)で1~3回洗浄する。上清は、DMFチップの下に磁石を係合し、上清を廃棄物リザーバ1に移動させることによってIA複合体から除去される。
固相上に捕捉されたTSH抗原を含む微粒子スラグが、ビオチン(PBS中40pMの濃度のストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ複合体)で標識された1~2μLの抗ベータTSH検出接合体抗体に再懸濁される。混合物は、4×4電極にわたって混合しながら、DMF電極アレイ(3)上のゾーン2内で1~10分間インキュベートさせられる(図27C)。磁石は、磁性微粒子を捕獲するために係合され、上清は、リザーバ廃棄物1へ除去される。スラグは、洗浄緩衝液2リザーバからの1~2μLの洗浄緩衝液(PBS、0.1%界面活性剤)で1~3回洗浄される。上清は、DMFチップの下の磁石を係合し、上清を廃棄物リザーバ2に移動させることによってIA複合体から除去される。1~2μLの100μM検出基質(4)(レゾルフィン-β-D-ガラクトピラノシド、RGP)を移動させることによって、免疫測定サンドイッチ複合体を含む微粒子スラグが再懸濁される(図27D)。混合物は、1~3分間インキュベートされて、RGPの酵素代謝回転(β-ガラクトシダーゼによるRGPの酵素代謝回転から生成される蛍光生成物)を可能にする。
図27Eに示されるように、混合物は、底部基板または上部基板のいずれかの上の、フェムトリットルウェルのアレイ(6)を含むDMFチップ上のスポットに移動する(5)。フェムトリットルウェルサイズのサイズは、アッセイに使用されている微粒子のサイズよりわずかに大きい。ウェルの数は、1,000~2,000,000の範囲であり得る。微粒子は、重力(受動的負荷)または磁石(能動的負荷)のいずれかを使用することによってウェル内に堆積される。過剰な上清は、廃棄物3リザーバに移動する。
フェムトリットルウェルは、誘電体上のエレクトロウェッティング、誘電泳動(DEP)力、または表面弾性波(SAW)を使用して、図27Fおよび27Gに示されるように、1~5μLの分極性不混和性流体(すなわち有機溶媒、油など)をアレイ位置(7、8)に移動させ、これによりウェルを密封することによって密閉される。好適な分極性不混和性流体のいくつかの例としては、シリコーン油、フルオロシリコーン油、鉱油、1-ヘキサノール、THF、m-ジクロロベンゼン、クロロホルムなどが挙げられる(S.Fan,et al.,Lab On Chip,9,1236,2009、D.Chatterjee,et al.,Lab On Chip,6,199,2006)。アッセイ全体のための充填剤流体は、空気である。
ウェル内の総粒子数は、広視野顕微鏡/CCDカメラを用いて白色光を照明し、続いて検出標識を含むビーズ数を決定するために574nm/615nm励起/発光(露光時間=3~10秒)で撮像することによって決定される。最終TSH濃度は、TSHキャリブレータを使用して実行した標準曲線から決定される。デジタル定量化は、ポアソン方程式、および陽性ビーズ対陰性ビーズの比率を使用することによって決定される。
実施例7:
分極性流体を用いたナノ寸法ウェル頂部装填
一般的なイムノアッセイ形式:
3’×2”のPETベースのDMFチップは、ウェルアレイにおけるデジタル蛍光検出と組み合わせて、ELISAベースのサンドイッチ免疫測定を実行するために使用され得る。図28を参照すると、分析される特定の抗原を含む試料(3)が、捕捉抗体(1)でコーティングされ、所望の抗原の免疫捕捉を可能にするために混合された磁性微粒子(2)と混合される。洗浄後、捕捉された抗原(4)は、検出部分(6)で標識された第2の検出抗体(5)と混合される。サンドイッチ免疫測定複合体(7)を含むビーズ混合物は、再度洗浄されて未結合の検出抗体を除去する。水性液滴をアレイに移動させ、磁石を適用してビーズをウェルに引き込むことによって、微粒子は、ウェルアレイの頂部基板に装填される。DMF力を使用してウェル上に分極性不混和性流体の液滴を移動させることによって、ウェルが密封される。CCDカメラは、アレイを撮像して、陽性および陰性微粒子の数を決定する。試料は、ポアソン統計を使用して定量化される。全てのイムノアッセイ処理ステップは、充填剤流体として空気を使用してDMFチップ上で実施される。
TSH免疫測定-DMF:
2.7の磁性微粒子(3×108粒子/mL)上にコーティングされた1~2μLの抗ベータTSH捕捉抗体が、DMFチップ上の微粒子リザーバからDMF電極アレイの中央に分注される。磁性微粒子は、DMFチップの下に配置された磁石を係合し、上清を廃棄物リザーバに移動させることによって緩衝液から分離される。1μLの水性試料がDMF試料リザーバから引き出され、微粒子スラグに移動し、続いて、液滴が1~5分間、いくつかの電極上に移動する混合ステップが行われる。底部磁石を適用することによって微粒子が試料から分離され、続いて上清が廃棄物リザーバに除去される。β-ガラクトシダーゼ(β-gal)に接合された1~2μLの抗TSH検出抗体(0.5μg/mL)は、微粒子スラグに移動し、2~5分間混合される。微粒子は、底部磁石を使用して分離され、上清は、廃棄物リザーバに移動する。免疫測定サンドイッチ複合体を含む微粒子は、0.1%界面活性剤を含む4×2μLのPBS洗浄緩衝液で合計4回洗浄される。各洗浄ステップからの洗浄緩衝液は、ステップが完了した後に廃棄物に移動する。1μLの100μMレゾルフィン-β-D-ガラクトピラノシド(RGP)は、RGPリザーバから取り出され、微粒子スラグに移動し、続いて15~30秒間混合される。ここで、ビーズは、ウェルアレイへの堆積の準備が整っている。
TSH免疫測定-デジタルアレイ検出:
図29に示されるように、アレイへの微粒子のDMFによる頂部装填のための基本的な構成要素は、80nm厚の銀電極を備えた底部PETベース電極チップ(8)(電極間隙100μm未満、2.25mm×2.25mm)と、厚さ5~10μmの誘電体/疎水性層(9)と、ウェルアレイ(14)(わずか1個の微粒子を保持するように構成されている)および2.7μmの磁性微粒子(12)を含む水性液滴(11)を含む頂部PETベースITO電極(10)チップとを含む。充填剤流体は、空気(13)である。頂部電極と底部電極との間の間隙高さは、約180μmである(2片の90μm両面テープから)。
輸送および密封は、シリコーン油などの水性および不混和性流体を移動させるためにDMF力(EWOD、DEP、および/または電解力)の組み合わせを使用することによって達成される。同じDMFチップ上で水性液滴および油滴の両方を移動させるためには異なる駆動電圧が必要であることが以前に示されている(S-K Fan,et al.,Lab on Chip,9,1236,2009)。
免疫測定複合体を含む水性液滴への蛍光基質RGPの添加後(図30A)、液滴は、20~50Vrms(1KHz)の電圧を使用して、約60,000個のウェルを含むウェルアレイ(245×245アレイ、直径4.2μm、付加さ3.0μm、ピッチ8.0μm)の下に位置付けられた電極に移動する。頂部磁石(15)が係合されて、ウェルへの微粒子の効率的な装填を促進し(図30B)、総堆積時間は、30~60秒である。頂部磁石が係合解除されると、水性液滴は離れて移動し、堆積および表面結合したビーズの薄層が後に残る(図30C)。シリコーン油の液滴が、200~300V(DC)の電圧を使用してリザーバから移動し、アレイの下に位置付けられた電極に移動し(図30D)、それによりウェル内に含まれる微粒子を密封しながら、いかなる表面結合した微粒子も洗い流す。RGPのレゾルフィンへの酵素代謝回転から発生した蛍光は、574/615nm(励起/発光)において、CCDカメラによって監視される。「オン」微粒子の「オフ」微粒子に対する比が決定される。試料中のTSH濃度は、TSH較正曲線からの内挿によって決定される。
最後に、本発明の様々な態様および特徴が本明細書の様々な実施形態および具体的な実施例に関して説明されてきたが(それらは全て、従来通りに作製または実施され得る)、本発明が添付の特許請求の範囲の全範囲内の保護を受ける権利を有することが理解されるであろう。
上記の詳細な説明および添付の実施例は単なる例示であり、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが理解される。
開示された実施形態に対する様々な変更および修正が当業者には明らかであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合物、または使用方法に関するものを含むが、これらに限定されないそのような変更および修正は、その精神および範囲から逸脱することなく行われ得る。
完全を期すために、本発明の様々な態様は、以下の番号を付けられた節に示される。
1.デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスであって、
第1の基板および第2の基板であって、第2の基板が、間隙によって第1の基板から分離され、第1の基板が液滴に対する電気作動力を発生させるための複数の電極を含む、第1の基板および第2の基板と、
液滴の一部分を保持するように寸法決定されたウェルのアレイであって、ウェルアレイの少なくとも一部分が、複数の電極のうちの1つ以上と間隙との間に位置付けられる、ウェルアレイと、を備える、デバイス。
2.複数の電極が第1の基板の表面上に位置付けられる、節1に記載のデバイス。
3.第1の基板の表面上に配設され、複数の電極を被覆する第1の層をさらに備える、節1または節2に記載のデバイス。
4.第1の基板が、液滴が導入される第1の部分と、液滴が移動する第2の部分とを含む、節1~3のいずれか1つに記載のデバイス。
5.複数の電極および第1の層が、第1の基板の第1の部分から第2の部分まで延在する、節4に記載のデバイス。
6.ウェルアレイが、第1の基板の第2の部分に位置付けられる、節5に記載のデバイス。
7.第2の基板が第1の部分と第2の部分とを含み、第1の部分が第1の基板の第1の部分と対向配置にあり、第2の部分がウェルのアレイと対向配置にある、節4に記載のデバイス。
8.第2の基板の第2の部分が、ウェルアレイの光学的調査を容易にするために実質的に透明である、節7に記載のデバイス。
9.第1の層の表面上に配設された第2の層をさらに備える、節3に記載のデバイス。
10.第2の層が、第1の基板の第1および第2の部分上に延在する、節9に記載のデバイス。
11.第1の層が誘電体層であり、第2の層が疎水性層である、節9または節10に記載のデバイス。
12.ウェルアレイが、第2の層に位置付けられる、節9~11のいずれか1つに記載のデバイス。
13.ウェルアレイが、第1の層に位置付けられる、節3のいずれか1つに記載のデバイス。
14.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節1~13のいずれか1つに記載のデバイス。
15.ウェルアレイが、ウェルアレイ上を移動する液滴中に存在するビーズまたは粒子の受容および保持を容易にするように配向された側壁を含む、節1~14のいずれか1つに記載のデバイス。
16.ウェルアレイが、第2の側壁と反対側の第1の側壁を含み、第1の側壁が、ウェルの底部に対して鈍角に配向され、第2の側壁が、ウェルの底部に対して鋭角に配向され、液滴の移動が、ウェルの底部に平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向である、節15に記載のデバイス。
17.ウェルアレイが、円錐台形状のより狭い部分がウェルアレイの開口部を提供する円錐台形状を有する、節15に記載のデバイス。
18.ウェルアレイが、第2の側壁と反対側の第1の側壁を含み、第1の側壁の頂部部分が、ウェルの底部に対して鈍角に配向され、側壁の底部部分が、ウェルの底部に対して垂直に配向され、液滴の移動が、ウェルの底部に平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向であり、第1の側壁の頂部部分が、ウェルの開口部にある、節15に記載のデバイス。
19.デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスであって、
デバイスを画定する第1の基板と第2の基板とを備え、第2の基板が、第1の基板から間隙によって分離され、デバイスが、第1の部分と第2の部分とを備え、
第1の部分が、生物学的試料からの対象となる検体を含む第1の液滴と、少なくとも1つのビーズを含む第2の液滴との組み合わせを作動させるための複数の電極を含み、
第2の部分が、液滴の一部分を保持するように寸法決定されたウェルアレイを含む、デバイス。
20.複数の電極がデバイスの第1の部分にのみ位置付けられる、節19に記載のデバイス。
21.複数の電極が第1の基板の表面上に位置付けられる、節19または節20に記載のデバイス。
22.第1の基板の表面上に配設され、複数の電極を被覆する第1の層をさらに備える、節19~21のいずれか1つに記載のデバイス。
23.第1の基板が、液滴が導入される第1の部分と、液滴が移動する第2の部分とを含む、節19~22のいずれか1つに記載のデバイス。
24.複数の電極および第1の層が、第1の基板の第1の部分から第2の部分まで延在する、節23に記載のデバイス。
25.ウェルアレイが、第1の基板の第2の部分に位置付けられる、節24に記載のデバイス。
26.第2の基板が第1の部分と第2の部分とを含み、第1の部分が第1の基板の第1の部分と対向配置にあり、第2の部分がウェルのアレイと対向配置にある、節23に記載のデバイス。
27.第2の基板の第2の部分が、ウェルアレイの光学的調査を容易にするために実質的に透明である、節26に記載のデバイス。
28.複数の電極が、間隙内に配置された液滴をデバイスの第2の部分に向かって移動させるように構成され、デバイスが、第1の部分を第2の部分に流体的に接続する毛管部分を含み、毛管が、電気力の非存在下での、毛管部分を介した第1の部分から第2の部分への液滴の移動を容易にするための親水性材料を含む、節19~27のいずれか1つに記載のデバイス。
29.第2の層が、第1の層の上部表面上に配設されている、節22のいずれか1つに記載のデバイス。
30.第2の層が、第1の基板上に延在する、節29に記載のデバイス。
31.第1の層が誘電体層であり、第2の層が疎水性層である、節29または節30に記載のデバイス。
32.複数のウェルが、第2の層に位置付けられる、節29~31のいずれか1つに記載のデバイス。
33.ウェルアレイが、第1の層に位置付けられる、節22に記載のデバイス。
34.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節19~33のいずれか1つに記載のデバイス。
35.ウェルが、ウェルアレイ上を移動する液滴中に存在するナノビーズまたはナノ粒子の受容および保持を容易にするように配向された側壁を含む、節19~34のいずれか1つに記載のデバイス。
36.ウェルが、第2の側壁と反対側の第1の側壁を含み、第1の側壁が、ウェルの底部に対して鈍角に配向され、第2の側壁が、ウェルの底部に対して鋭角に配向され、液滴の移動が、ウェルの底部に平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向である、節35に記載のデバイス。
37.ウェルが、円錐台形状のより狭い部分がウェルの開口部を提供する円錐台形状を有する、節36に記載のデバイス。
38.ウェルアレイが、第2の側壁と反対側の第1の側壁を含み、第1の側壁の頂部部分が、ウェルの底部に対して鈍角に配向され、側壁の底部部分が、ウェルの底部に対して垂直に配向され、液滴の移動が、ウェルの底部に平行、かつ第1の側壁から第2の側壁への方向であり、第1の側壁の頂部部分が、ウェルの開口部にある、節35に記載のデバイス。
39.表面弾性波マイクロ流体および検体検出デバイスであって、
第1の基板と第2の基板とを備え、第2の基板が、第1の基板から間隙によって分離され、デバイスが、第1の部分と第2の部分とを備え、
第1部分が、表面弾性波発生構成要素に連結されたスーパーストレートを含み、
第2の部分が、第1の基板または第2の基板上に位置付けられた複数のウェルを含む、デバイス。
40.スーパーストレートが、スーパーストレートの上部表面上にフォノニック構造を含む、節39に記載のデバイス。
41.スーパーストレートが、圧電結晶層を覆う、節39または節40に記載のデバイス。
42.第2の基板が、実質的に透明である、節39または節40に記載のデバイス。
43.表面弾性波マイクロ流体および検体検出デバイスであって、
第1の基板と第2の基板とを備え、第2の基板が、第1の基板から間隙によって分離され、
第1の基板が、複数のウェルを含み、
第2の基板が、フォノニック構造を含み、複数のウェルおよびフォノニック構造が、互いに向かい側に位置する、デバイス。
44.第2の基板が、スーパーストレートである、節43に記載のデバイス。
45.スーパーストレートが、第2の基板上に配設され、フォノニック構造が、スーパーストレート上に配置されている、節43に記載のデバイス。
46.第1の基板、第2の基板、およびスーパーストレートが、実質的に透明である、節43~45のいずれか1つに記載のデバイス。
47.液滴中の対象となる検体を検出する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
(b)対象となる検体に結合する特異的結合メンバーを含む少なくとも1つの固体支持体を含む第2の液滴を提供することと、
(c)第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることであって、アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する、移動させることと、
(e)混合物の一部分をウェルアレイに移動させる前または後のいずれかに、検出可能な標識を混合物に付加することと、
(f)ウェル内の対象となる検体を検出することと、を含む、方法。
48.少なくとも1つの固体支持体が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節47に記載の方法。
49.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させる前に混合物に検出可能な標識を付加することをさらに含む、節47または48のいずれか1つに記載の方法。
50.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させた後に検出可能な標識を混合物に付加することをさらに含む、節47または48のいずれか1つに記載の方法。
51.検出可能な標識が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節47~50のいずれか1つに記載の方法。
52.検出可能な標識が、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む、節47~51のいずれか1つに記載の方法。
53.結合メンバーが受容体または抗体である、節47~52のいずれか1つに記載の方法。
54.エネルギーが、電気作動力または音響力である、節47~53のいずれか1つに記載の方法。
55.電気作動力が、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、または吸引である、節54に記載の方法。
56.音響力が、表面弾性波である、節54に記載の方法。
57.第1の液滴が分極性液体であるか、第2の液滴が分極性液体であるか、混合物が分極性液体であるか、または第1の液滴および第2の液滴が両方ともそれぞれ分極性液体である、節47~56のいずれか1つに記載の方法。
58.電気作動力を使用して、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節47~55のいずれか1つに記載の方法。
59.混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節47~58のいずれか1つに記載の方法。
60.固体支持体が磁性固体支持体である、節47~59のいずれか1つに記載の方法。
61.電気作動力および磁場が、混合物の少なくとも一部分に対して反対方向から加えられる、節60に記載の方法。
62.混合物を前後に移動させること、混合物を円形パターンで移動させること、混合物を2つ以上の副混合物に分割すること、および副混合物を融合することによって、混合物を混合することをさらに含む、節47~61のいずれか1つに記載の方法。
63.混合物が、水性液体である、節47~62のいずれか1つに記載の方法。
64.混合物が、不混和性液体である、節47~62のいずれか1つに記載の方法。
65.液滴が、疎水性液滴である、節47~64のいずれか1つに記載の方法。
66.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節47~65のいずれか1つに記載の方法。
67.ウェルアレイが、疎水性表面を有する、節47~65のいずれか1つに記載の方法。
68.方法が、第1と第2の基板とを備えるデバイスにおいて行われ、少なくとも1つの基板が、親水性表面を含む、節47~67のいずれか1つに記載の方法。
69.方法が、第1と第2の基板とを備えるデバイスにおいて行われ、少なくとも1つの基板が、疎水性表面を含む、節47~67のいずれか1つに記載の方法。
70.複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、混合物をウェルアレイに移動させてウェルに装填することをさらに含む、節47~69のいずれか1つに記載の方法。
71.アレイの1つ以上のウェルに、少なくとも1つの固体支持体が装填される、節47~70のいずれか1つに記載の方法。
72.装填が、アレイの1つ以上のウェル内への少なくとも1つの固体支持体の移動を容易にするために磁場を印加することを含む、節71に記載の方法。
73.装填後にアレイのウェルに装填されていないいかなる固体支持体も除去することをさらに含む、節72に記載の方法。
74.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離まで移動させることを含む、節73に記載の方法。
75.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、水性洗浄液滴をウェルアレイにわたって移動させることを含む、節74に記載の方法。
76.電気作動力を発生させることが、交流を発生させることを含む、節75に記載の方法。
77.交流が、10V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有する、節75に記載の方法。
78.交流が、無線周波数範囲内の周波数を有する、節75または節76に記載の方法。
79.方法が、マイクロ流体デバイス、デジタルマイクロ流体デバイス(DMF)、表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイス(SAW)、一体型DMFおよび検体検出デバイス、一体型SAWおよび検体検出デバイス、またはロボティクスベースのアッセイ処理ユニットを使用して行われる、節47または節48に記載の方法。
80.液滴中の対象となる検体を検出する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
(b)対象となる検体に結合する特異的結合メンバーを含む検出可能な標識を含む第2の液滴を提供することと、
(c)第1の液滴および第2の液滴を操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることと、
(e)ウェル内の対象となる検体を検出することと、を含む、方法。
81.検出可能な標識が、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む、節80に記載の方法。
82.エネルギーが、電気作動力または音響力である、節80または節81に記載の方法。
83.電気作動力が、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、または吸引である、節82に記載の方法。
84.音響力が、表面弾性波である、節83に記載の方法。
85.第1の液滴が分極性不混和性液体であるか、第2の液滴が分極性液体であるか、混合物が分極性液体であるか、または第1の液滴および第2の液滴が両方ともそれぞれ分極性液体である、節80~83のいずれか1つに記載の方法。
86.電気作動力を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節80~83および節85のいずれか1つに記載の方法。
87.混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節80~86のいずれか1つに記載の方法。
88.混合物を前後に移動させること、混合物を円形パターンで移動させること、混合物を2つ以上の副混合物に分割すること、および副混合物を融合することによって、混合物を混合することをさらに含む、節80~87のいずれか1つに記載の方法。
89.混合物が、水性液体である、節80~88のいずれか1つに記載の方法。
90.混合物が、不混和性液体である、節80~88のいずれか1つに記載の方法。
91.液滴が、疎水性液滴である、節80~90のいずれか1つに記載の方法。
92.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節80~91のいずれか1つに記載の方法。
93.ウェルアレイが、疎水性表面を有する、節80~91のいずれか1つに記載の方法。
94.方法が、第1と第2の基板とを備えるデバイスにおいて行われ、少なくとも1つの基板が、親水性表面を含む、節80~93のいずれか1つに記載の方法。
95.方法が、第1と第2の基板とを備えるデバイスにおいて行われ、少なくとも1つの基板が、疎水性表面を含む、節80~93のいずれか1つに記載の方法。
96.複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、混合物をウェルアレイに移動させてウェルに装填することをさらに含む、節80~95のいずれか1つに記載の方法。
97.アレイの1つ以上のウェルに、少なくとも1つの検出可能な標識が装填される、節80~96のいずれか1つに記載の方法。
98.装填後にアレイのウェルに装填されていないいかなる検出可能な標識も除去することをさらに含む、節97に記載の方法。
99.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離まで移動させることを含む、節98に記載の方法。
100.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、水性洗浄液滴をウェルアレイにわたって移動させることを含む、節99に記載の方法。
101.電気作動力を発生させることが、交流を発生させることを含む、節100に記載の方法。
102.交流が、10V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有する、節101に記載の方法。
103.交流が、無線周波数範囲内の周波数を有する、節100または節101に記載の方法。
104.方法が、マイクロ流体デバイス、デジタルマイクロ流体デバイス(DMF)、表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイス(SAW)、一体型DMFおよび検体検出デバイス、一体型SAWおよび検体検出デバイス、またはロボティクスベースのアッセイ処理ユニットを使用して行われる、節80~103のいずれか1つに記載の方法。
105.液滴中の対象となる検体を測定する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
(b)対象となる検体に結合する特異的結合メンバーを含む少なくとも1つの固体支持体を含む第2の液滴を提供することと、
(c)第1の液滴を第2の液体と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることであって、アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する、移動させることと、
(e)混合物の一部分をウェルアレイに移動させる前または後のいずれかに、検出可能な標識を混合物に付加することと、
(f)ウェル内の検出可能な標識を測定することと、を含む、方法。
106.少なくとも1つの固体支持体が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節105に記載の方法。
107.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させる前に混合物に検出可能な標識を付加することをさらに含む、節105または106のいずれか1つに記載の方法。
108.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させた後に検出可能な標識を混合物に付加することをさらに含む、節105または節106に記載の方法。
109.検出可能な標識が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節105~108のいずれか1つに記載の方法。
110.検出可能な標識が、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む、節105~109のいずれか1つに記載の方法。
111.結合メンバーが受容体または抗体である、節105~109のいずれか1つに記載の方法。
112.エネルギーが、電気作動力または音響力である、節105~109のいずれか1つに記載の方法。
113.電気作動力が、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、または吸引である、節112に記載の方法。
114.音響力が、表面弾性波である、節112に記載の方法。
115.第1の液滴が分極性液体であるか、第2の液滴が分極性液体であるか、混合物が分極性液体であるか、または第1の液滴および第2の液滴が両方ともそれぞれ分極性液体である、節105~114に記載の方法。
116.電気作動力を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節105~112および節115のいずれか1つに記載の方法。
117.混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節105~116のいずれか1つに記載の方法。
118.固体支持体が磁性固体支持体である、節105~117のいずれか1つに記載の方法。
119.電気作動力および磁場が、混合物の少なくとも一部分に対して反対方向から加えられる、節118に記載の方法。
120.混合物を前後に移動させること、混合物を円形パターンで移動させること、混合物を2つ以上の副混合物に分割すること、および副混合物を融合することによって、混合物を混合することをさらに含む、節105~119のいずれか1つに記載の方法。
121.混合物が、水性液体である、節105~120のいずれか1つに記載の方法。
122.混合物が、不混和性液体である、節105~121のいずれか1つに記載の方法。
123.液滴が、疎水性液滴である、節105~122のいずれか1つに記載の方法。
124.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節105~123のいずれか1つに記載の方法。
125.ウェルアレイが、疎水性表面を有する、節105~123のいずれか1つに記載の方法。
126.方法が、第1と第2の基板とを備えるデバイスにおいて行われ、少なくとも1つの基板が、親水性表面を含む、節105~124のいずれか1つに記載の方法。
127.方法が、第1と第2の基板とを備えるデバイスにおいて行われ、少なくとも1つの基板が、疎水性表面を含む、節105~124のいずれか1つに記載の方法。
128.複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、混合物をウェルアレイに移動させてウェルに装填することをさらに含む、節105~128のいずれか1つに記載の方法。
129.アレイの1つ以上のウェルに、少なくとも1つの固体支持体が装填される、節105~128のいずれか1つに記載の方法。
130.装填が、アレイの1つ以上のウェル内への少なくとも1つの固体支持体の移動を容易にするために磁場を印加することを含む、節129に記載の方法。
131.装填後にアレイのウェルに装填されていないいかなる固体支持体も除去することをさらに含む、節130に記載の方法。
132.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離まで移動させることを含む、節131に記載の方法。
133.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、水性洗浄液滴をウェルアレイにわたって移動させることを含む、節132に記載の方法。
134.電気作動力を発生させることが、交流を発生させることを含む、節133に記載の方法。
135.交流が、10V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有する、節134に記載の方法。
136.交流が、無線周波数範囲内の周波数を有する、節134または節135に記載の方法。
137.方法が、マイクロ流体デバイス、デジタルマイクロ流体デバイス(DMF)、表面弾性波ベースのマイクロ流体デバイス(SAW)、一体型DMFおよび検体検出デバイス、一体型SAWおよび検体検出デバイス、またはロボティクスベースのアッセイ処理ユニットを使用して行われる、節105~136のいずれか1つに記載の方法。
138.測定が、アレイのウェル内の固体支持体の総数を決定することを伴う、節105~137のいずれか1つに記載の方法。
139.測定が、検出可能な標識を含むアレイのウェル内の固体支持体の数を決定することを伴う、節138に記載の方法。
140.測定が、アレイのウェル内の固体支持体の総数から検出可能な標識を含む固体支持体の数を減算して、検出可能な標識を含まないアレイのウェル内の固体支持体の数を決定することを伴う、節139に記載の方法。
141.検出可能な標識を含まない固体支持体の数に対する検出可能な標識を含む固体支持体の比を決定することを伴う、節140に記載の方法。
142.ウェルに粒子を装填する方法であって、
(A)複数の電極を用いて電界を発生させて、微粒子を含む液滴をウェルアレイに移動させることであって、ウェルアレイの1つ以上のウェルが、その中に粒子を装填するのに十分大きいサイズを有する、移動させることと、
(b)1つ以上のウェルに粒子を装填することと、
(c)複数の電極を用いて電界を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させてウェルアレイを密封することと、を含む、方法。
143.電界を使用してウェル液滴をアレイ上で操作することをさらに含む、節142に記載の方法。
144.液滴のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、液滴をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節142または節143に記載の方法。
145.粒子が、磁気ビーズである、節142~144のいずれか1つに記載の方法。
146.装填が、アレイの1つ以上のウェル内への1つ以上の磁気ビーズの移動を容易にするために磁場を印加することを含む、節142に記載の方法。
147.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節142~146のいずれか1つに記載の方法。
148.ウェルアレイが、疎水性表面を有する、節142~146のいずれか1つに記載の方法。
149.電界を発生させることが、交流を発生させることを含む、節142~148のいずれか1つに記載の方法。
150.交流が、10V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有する、節149に記載の方法。
151.交流が、無線周波数範囲内の周波数を有する、節149または節159に記載の方法。
152.デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスを形成する方法であって、
第1の基板を含む第1のロールを巻き出して、第1の基板の第1の部分を第1の位置に位置付けることと、
第1の位置において第1の基板の第1の部分上に複数の電極を形成することと、
第2の位置において第1の基板の第2の部分上にウェルアレイを形成することと、を含む、方法。
153.
ウェルアレイを形成する前に、第1のロールを巻き出して、第1の基板の第1の部分に隣接する第2の部分を第2の位置に位置付けること、をさらに含む、節152に記載の方法。
154.
第2の基板を含む第2のロールを巻き出して、第3の基板の第3の部分を第3の位置に位置付けることと、
第2の基板を第1の基板から離間して位置付けるのに十分な方法で、第2の基板を第3の位置で第1の基板と接合することと、をさらに含む、節152または節153に記載の方法。
155.一体型デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスを形成する方法であって、
第1の基板を含む第1のロールを巻き出して、第1の基板の第1の部分を第1の位置に位置付けることと、
第1の位置において第1基板の第1部分上に複数の電極を形成することと、
第1位置において第1の基板の第1の部分上に複数の電極を形成することと、
第2の位置において第2の部分上にウェルアレイを形成することと、
第2の基板を第1の基板から離間して位置付けるのに、かつ
第2の部分を第1部分の上、または第1の基板の第1の部分に隣接する第3の部分の上に位置付けるのに十分な方法で、第2の基板を第1の基板と接合することと、を含み、
ウェルアレイが、第1の基板に面する、方法。
156.ウェルアレイを形成することが、熱または紫外線ナノインプリントリソグラフィ、ナノインプリントローラ、レーザアブレーションを使用すること、またはウェルアレイを含むプレハブ基板を第1の基板の第1の部分上に接合することを含む、節152~155のいずれか1つに記載の方法。
157.第1の基板を強烈な熱、圧力、または紫外線に供して、モールドを使用して第1の基板の上または内部にフォノニック構造を形成することをさらに含む、節152~156のいずれか1つに記載の方法。
158.プリンタデバイスを使用して一連の電極上に疎水性および/または誘電性の材料を適用することをさらに含む、節152~157のいずれか1つに記載の方法。
159.疎水性および/または誘電性の材料が、硬化材料を含む、節158に記載の方法。
160.熱または紫外線を適用して、適用された疎水性および/または誘電性の材料を硬化させることをさらに含む、節159に記載の方法。
161.第1および第2の基板をダイシングして、第1および第2の部分を含む接合基板を生成することをさらに含む、節152~160のいずれか1つに記載の方法。
162.液滴中の対象となる検体を検出する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
(b)特異的結合メンバーおよび標識された検体を含む第2の液滴を提供することであって、結合メンバーが少なくとも1つの固体支持体上に固定化され、特異的結合メンバーが対象となる検体に特異的に結合し、標識された検体が検出可能な標識で標識された対象となる検体である、提供することと、
(c)第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることであって、アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する、移動させることと、を含む、方法。
163.液滴中の対象となる検体を検出する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
固定化された検体および少なくとも1つの特異的結合メンバーを含む第2の液滴を提供することであって、固定化された検体が、少なくとも1つの固体支持体上に固定化された対象となる検体であり、少なくとも1つの特異的結合メンバーが、対象となる検体に特異的に結合し、少なくとも1つの特異的結合メンバーが、検出可能な標識で標識されている、提供することと、
(c)第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための力を及ぼすエネルギーを使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることであって、アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する、移動させることと、
(e)ウェル内の対象となる検体を検出することと、を含む、方法。
164.液滴中の対象となる検体を検出する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
(b)対象となる検体に結合する特異的結合メンバーを含む少なくとも1つの固体支持体を含む第2の液滴を提供することであって、
第1および第2の液滴が、デジタルマイクロ流体および検体検出デバイスに提供され、デバイスが、
第1の基板および第2の基板であって、第2の基板が、間隙によって第1の基板から分離され、第1の基板が液滴に対する電気作動力を発生させるための複数の電極を含む、第1の基板および第2の基板と、
液滴の一部分を保持するように寸法決定されたウェルのアレイであって、ウェルアレイの少なくとも一部分が、複数の電極のうちの1つ以上と間隙との間に位置付けられる、ウェルアレイと、を備える、提供することと、
(c)第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための電気作動力を使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることであって、アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する、移動させることと、
(e)混合物の一部分をウェルアレイに移動させる前または後のいずれかに、検出可能な標識を混合物に付加することと、
(f)ウェル内の対象となる検体を検出することと、を含む、方法。
165.少なくとも1つの固体支持体が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節164に記載の方法。
166.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させる前に混合物に検出可能な標識を付加することをさらに含む、節164または165のいずれか1つに記載の方法。
167.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させた後に検出可能な標識を混合物に付加することをさらに含む、節164または166のいずれか1つに記載の方法。
168.検出可能な標識が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節164~167のいずれか1つに記載の方法。
169.検出可能な標識が、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む、節164~168のいずれか1つに記載の方法。
170.結合メンバーが受容体または抗体である、節164~168のいずれか1つに記載の方法。
171.電気作動力が、液滴作動、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電作動、電界媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィ、遠心分離、または吸引である、節164~170のいずれか1つに記載の方法。
172.第1の液滴が分極性液体であるか、第2の液滴が分極性液体であるか、混合物が分極性液体であるか、または第1の液滴および第2の液滴が両方ともそれぞれ分極性液体である、節164~171のいずれか1つに記載の方法。
173.電気作動力を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節164~171のいずれか1つに記載の方法。
174.混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節164~173のいずれか1つに記載の方法。
175.固体支持体が磁性固体支持体である、節164~174のいずれか1つに記載の方法。
176.電気作動力および磁場が、混合物の少なくとも一部分に対して反対方向から加えられる、節175に記載の方法。
177.混合物を前後に移動させること、混合物を円形パターンで移動させること、混合物を2つ以上の副混合物に分割すること、および副混合物を融合することによって、混合物を混合することをさらに含む、節164~176のいずれか1つに記載の方法。
178.混合物が、水性液体である、節164~176のいずれか1つに記載の方法。
179.混合物が、不混和性液体である、節164~176のいずれか1つに記載の方法。
180.液滴が、疎水性液滴である、節164~179のいずれか1つに記載の方法。
181.ウェルアレイが、親水性表面を有する、節164~180のいずれか1つに記載の方法。
182.ウェルアレイが、疎水性表面を有する、節164~180のいずれか1つに記載の方法。
183.基板が、親水性表面を含む、節164~182のいずれか1つに記載の方法。
184.基板が、疎水性表面を含む、節164~182のいずれか1つに記載の方法。
185.複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、混合物をウェルアレイに移動させてウェルに装填することをさらに含む、節164~184のいずれか1つに記載の方法。
186.アレイの1つ以上のウェルに、少なくとも1つの固体支持体が装填される、節164~185のいずれか1つに記載の方法。
187.装填が、アレイの1つ以上のウェル内への少なくとも1つの固体支持体の移動を容易にするために磁場を印加することを含む、節186に記載の方法。
188.装填後にアレイのウェルに装填されていないいかなる固体支持体も除去することをさらに含む、節187に記載の方法。
189.除去が、複数の電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、混合物の少なくとも一部分をウェルアレイからある距離まで移動させることを含む、節188に記載の方法。
190.除去が、電極を用いて電気作動力を発生させて、分極性流体液滴をウェルアレイに移動させて、水性洗浄液滴をウェルアレイにわたって移動させることを含む、節189に記載の方法。
191.電気作動力を発生させることが、交流を発生させることを含む、節190に記載の方法。
192.交流が、10V以上の二乗平均平方根(rms)電圧を有する、節191に記載の方法。
193.交流が、無線周波数範囲内の周波数を有する、節191または節192に記載の方法。
194.液滴中の対象となる検体を検出する方法であって、
(a)対象となる検体を含む第1の液滴を提供することと、
(b)対象となる検体に結合する特異的結合メンバーを含む少なくとも1つの固体支持体を含む第2の液滴を提供することであって、
第1および第2の液滴が、表面弾性波マイクロ流体および検体検出デバイスに提供され、デバイスが、
第1の基板と第2の基板とを備え、第2の基板が、第1の基板から間隙によって分離され、デバイスが、第1の部分と第2の部分とを備え、
第1部分が、表面弾性波発生構成要素に連結されたスーパーストレートを含み、
第2の部分が、第1の基板または第2の基板上に位置付けられた複数のウェルを含む、提供することと、
(c)第1の液滴を第2の液滴と共に操作するための表面音響力を使用して、混合物を作ることと、
(d)混合物の全部または少なくとも一部分をウェルアレイに移動させることであって、アレイの1つ以上のウェルが、少なくとも1つの固体支持体を収容するのに十分なサイズを有する、移動させることと、
(e)混合物の一部分をウェルアレイに移動させる前または後のいずれかに、検出可能な標識を混合物に付加することと、
(f)ウェル内の対象となる検体を検出することと、を含む、方法。
195.少なくとも1つの固体支持体が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節194に記載の方法。
196.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させる前に混合物に検出可能な標識を付加することをさらに含む、節194または195のいずれか1つに記載の方法。
197.混合物の少なくとも一部分をウェルアレイに移動させた後に検出可能な標識を混合物に付加することをさらに含む、節194または196のいずれか1つに記載の方法。
198.検出可能な標識が、対象となる検体に特異的に結合する少なくとも1つの結合メンバーを含む、節194~197のいずれか1つに記載の方法。
199.検出可能な標識が、クロマジェン、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、または放射性化合物を含む、節194~198のいずれか1つに記載の方法。
200.結合メンバーが受容体または抗体である、節194~199のいずれか1つに記載の方法。
201.第1の液滴が分極性液体であるか、第2の液滴が分極性液体であるか、混合物が分極性液体であるか、または第1の液滴および第2の液滴が両方ともそれぞれ分極性液体である、節194~200のいずれか1つに記載の方法。
202.混合物のウェルアレイへの移動を容易にするように構成された毛管要素を使用して、混合物をウェルアレイ上で操作することをさらに含む、節194~201のいずれか1つに記載の方法。
203.固体支持体が磁性固体支持体である、節194~202のいずれか1つに記載の方法。
204.方法が、ウェルアレイを疎水性液体で密封することをさらに含む、節70に記載の方法。
205.方法が、ウェルアレイを疎水性液体で密封することをさらに含む、節96に記載の方法。
206.方法が、ウェルアレイを疎水性液体で密封することをさらに含む、節185に記載の方法。