CN110646493A - 一种微流控芯片、蛋白检测方法、装置及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白检测系统，以提高痕量蛋白检测的一致性和重复性。该系统包括：微流控芯片，包括呈阵列排布的多个微阱，所述微阱用于捕获被测样品中的固相载体；被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；双极性电极芯片，包括呈阵列排布的多个电极单元，所述电极单元在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；浓度确定组件，根据所述微阱中固相载体的总数量和发光固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。另外，本申请实施例还提供一种微流控芯片、双极性电极芯片、蛋白检测方法及装置。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域，尤其涉及一种微流控芯片、一种双极性电极芯片、一种双极性电极的制作工艺、一种蛋白检测系统、一种蛋白检测装置以及一种蛋白检测方法。
背景技术
随着转化医学和精准医学的快速发展，对细胞、核酸、蛋白等基本生物单元的研究发生了深刻的变革，目前已从传统的对这些单元的系综和平均化响应的研究，转向到了单细胞和单分子水平的研究。特别是在分子诊断领域，需要在单分子层面精确诊断患者的健康水平以及治疗效果，以便早期诊断，大大提前诊疗窗口，达到治未病的效果。因此需要开发与之相适应的高灵敏度、早诊断的生物单元检测方法。
在痕量蛋白检测领域，样品中待检测的蛋白的含量往往在百万分之一以下，且对细胞功能产生重大影响的蛋白质其表达量往往是很低的，由于缺少与聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)媲美的高信号放大方法，其在常规检测方法中很难被检测到。目前对于痕量蛋白检测的主要方法包括生物质谱技术和数字酶联免疫吸附测定(ELISA，enzyme linked immunosorbent assay)技术。生物质谱技术主要应用于科研领域，由于成本高，操作复杂，很难实现临床的大批量应用。数字ELISA技术中，由于免疫反应过程不稳定，不方便进行有效控制，使得痕量蛋白检测的一致性和重复性较差。
发明内容
本发明实施例提供一种微流控芯片、一种双极性电极芯片、一种双极性电极的制作工艺、一种蛋白检测系统、一种蛋白检测装置以及一种蛋白检测方法，以解决现有技术中由于免疫反应过程不稳定，不方便进行有效控制，使得痕量蛋白检测的一致性和重复性较差的问题。
本发明实施例采用下述技术方案：
第一方面，本发明实施例提供了一种蛋白检测系统，包括：
微流控芯片，包括呈阵列排布的多个微阱，所述微阱用于捕获被测样品中的固相载体；被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；
双极性电极芯片，包括呈阵列排布的多个电极单元，所述电极单元在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；
浓度确定组件，根据所述微阱中固相载体的总数量和发光固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的一种可能的实施方式，所述微流控芯片和所述双极性电极芯片可拆卸连接；
所述微流控芯片设置有第一对准结构，所述双极性电极芯片设置有第二对准结构，所述第一对准结构和所述第二对准结构配合以将所述微阱和所述电极单元一一对准。
结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的一种可能的实施方式，所述浓度确定组件，具体包括：
电位控制器，用于控制电极单元两端的电压，以激活所述电极单元；
光学成像模块，用于对所述微流控芯片中的所有固相载体进行扫描成像，以及对微流控芯片中发光的固相载体进行扫描成像；
图像分析模块，用于对扫描成像得到的图像进行分析，得到固相载体总数量和发光的固相载体数量；
浓度确定模块，用于通过泊松分布概率公式，根据固相载体总数量和发光的固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
第二方面，本发明实施例提供了一种微流控芯片，包括：
固相载体平铺区域，所述固相载体平铺区域包括多条液体导流槽，以及位于液体导流槽底部的微阱，所述微阱在所述微流控芯片上呈阵列排布。
结合第二方面，本发明实施例提供了第二方面的一种可能的实施方式，所述微流控芯片包括位于所述固相载体平铺区域一端的加样区域，以及位于所述固相载体平铺区域另一端的溢流缓冲区域，所述加样区域和所述溢流缓冲区域通过所述导流槽连通。
结合第二方面，本发明实施例提供了第二方面的一种可能的实施方式，每个所述微阱为斜坡结构，斜坡高点为导流槽底部，位于靠近加样区的一侧，斜坡越靠近溢流缓冲区域的一侧越深，每个所述微阱仅能容纳一个固相载体。
第三方面，本发明实施例提供了一种双极性电极芯片，包括：
呈阵列排布的多个电极单元，所述电极单元在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；
所述电极单元的阳极端面积小于阴极端面积。
结合第三方面，本发明实施例提供了第三方面的一种可能的实施方式，所述电极单元平行于电极板的横截面为三角形，所述三角形的一边为阴极，与所述边相对的角的顶点为阳极；
或，所述电极单元平行于电极板的横截面为桃形，所述桃型的顶点为阳极，与所述桃型的顶点相对的边为阴极。
结合第三方面，本发明实施例提供了第三方面的一种可能的实施方式，所述电极单元包括电极修饰层；
所述电极修饰层的电极修饰材料为铂；或，所述电极修饰层的电极修饰材料为铂-氧化铱复合纳米材料。
结合第三方面，本发明实施例提供了第三方面的一种可能的实施方式，单个所述电极单元的粒径为5-30μm，所述双极性电极芯片中电极单元的总数量大于20000个。
第四方面，本发明实施例提供了一种双极性电极的制作工艺，包括；
在衬底基板上形成一层反转胶，通过光刻技术在反转胶上形成电极层图案；
在形成有所述电极层图案的玻璃衬底上形成电极层，所述电极层的材料为钛/铂复合材料；
将所述衬底基板上的反转胶剥离，得到电极阵列；
通过化学电镀的方式，在所述电极阵列表面形成一层电极修饰层，所述电极修饰层的材料为铂或铂-氧化铱复合纳米材料；
在所述电极阵列表面形成一层光刻胶，以保护所述电极阵列，通过光刻技术在电极阵列的两侧形成第二对准结构，然后去除所述电极阵列表面上的光刻胶，露出电极部分。
第五方面，本发明实施例提供了一种蛋白检测装置，包括本发明实施例提供的蛋白检测系统，所述装置还包括抽屉模组和人机交互模组，其中：
所述抽屉模组，用于承载微流控芯片，并将微流控芯片运动至蛋白检测系统的光学成像模块中进行成像；
所述人机交互模块，用于输入检测参数和输出检测结果。
第六方面，本发明实施例提供了一种蛋白检测方法，包括如下步骤：
在微流控芯片的加样区域加入被测样品；所述被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；
将双极性电极芯片盖到所述微流控芯片上，并将所述双极性电极芯片上的微阱和双极性电极芯片上的电极单元一一对准；
在明场条件下，在所述双极性电极芯片两端不施加电压的前提下，对微流控芯片的固相载体平铺区域进行光学扫描成像，得到第一图像，并计算第一图像中固相载体的总数量；
在暗场条件下，对所述双极性电极芯片两端施加电压，对微流控芯片的固相载体平铺区域进行光学扫描成像，得到第二图像，并计算第二图像中发光的固相载体的数量；
通过泊松分布概率公式，根据固相载体的总数量和发光的固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
本发明实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到以下有益效果：
在被测样品中，通过在固相载体上结合电化学发光材料和被测蛋白，微流控芯片上的微阱可以捕获被测样品中的固相载体，双极性电极中的电极单元在被激活时与电学发光材料发生电化学反应并发光，以此即可确定结合有被测蛋白的固相载体的数量，根据结合有被测蛋白的固相载体的数量和微阱中固相载体的总数量，即可确定被测样品中被测蛋白的浓度值。由于电致化学发光是一种非常可控的反应体系，其电压作为反应的启动开关，能有效的消除由于试剂添加或者混合带来的反应不稳定的问题，从而保证反应过程在完全可控的条件下进行。该反应过程具有灵敏度高，线性范围宽，反应时间短，试剂稳定时间长等优势。将电致化学发光检测技术与单分子蛋白检测技术的完美结合，可以充分发挥两个技术的各自优势，实现高灵敏的单分子检测。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例提供的一种蛋白检测系统的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的双极性电极的工作原理示意图；
图3为本发明实施例提供的一种微流控芯片的结构示意图；
图4为本发明实施例提供的一种双极性电极芯片的结构示意图；
图5为本发明实施例提供的另一种双极性电极芯片的结构示意图；
图6为本发明实施例提供的一种双极性电极制作工艺的流程示意图；
图7为本发明实施例提供的一种蛋白检测装置的结构示意图；
图8为本发明实施例提供的一种蛋白检测系统的结构示意图；
图9为本发明实施例提供的一种蛋白检测方法实现流程示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。
实施例1
为解决现有技术中由于免疫反应过程不稳定，不方便进行有效控制，使得痕量蛋白检测的一致性和重复性较差的问题，本发明实施例1提供一种蛋白检测系统10，请参见图1，该蛋白检测系统10包括微流控芯片101、双极性电极芯片102和浓度确定组件103，其中：
微流控芯片101，包括呈阵列排布的多个微阱，所述微阱用于捕获被测样品中的固相载体；被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；
双极性电极芯片102，包括呈阵列排布的多个电极单元，所述电极单元在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；
浓度确定组件103，根据所述微阱中固相载体的总数量和发光固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
本说明书实施例中，在被测样品中，会加入固相载体，固相载体具备较好的蛋白吸附能力，可以与被测蛋白相结合，优选的，固相载体可以是以聚苯乙烯制成磁珠，磁珠也可以称为磁微粒等。当然固相载体也可以是由其它能结合被测蛋白的材料制成，例如，氯乙酰化，本发明对此不作限定。
另外，结合了被测蛋白的固相载体也结合了电化学发光材料，优选的，电化学发光材料可以是三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)。被测样品中还包括有电化学反应溶液，优选的，电化学反应溶液可以是三丙胺(TPrA)。加入微流控芯片的样本中抗原抗体已经完成免疫结合反应，并且磁分离了未结合的游离态蛋白。
将被测样品加入微流控芯片上后，微流控芯片上的微阱可以捕获被测样品中的固相载体，双极性电极中的电极单元在被激活时与电学发光材料发生电化学反应并发光，以此即可确定结合有被测蛋白的固相载体的数量，根据结合有被测蛋白的固相载体的数量和微阱中固相载体的总数量，即可确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
图2为双极性电极的工作原理示意图，双极性电极装置主要是由连接到直流电源上的驱动导体202和浸在电化学反应溶液203中的高密度电极阵列组成。电极阵列包含多个电极单元102-1，电极阵列可以是铁丝、铜片、金属纳米颗粒等任何形状和任何尺寸的导电材料。当直流电源201施加足够高的驱动电压(Etot)驱动导体时，尽管驱动导体和高密度电极阵列没有直接接触，在电极两端的附近溶液也能发生电化学反应。双极性电极阵列靠近导体负极的一端带正电，成为双极性电极的阳极102-1-2，双极性电极阵列靠近导体正极的一端带负电，成为双极性电极的阴极102-1-1。在双极性电极阵列的阳极表面，三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)和三丙胺(TPrA)同时失去电子发生氧化反应，从而触发循环的电化学发光反应，电极单元102-1两端形成电势差ΔEelec。
本说明书提供的蛋白检测系统，尤其适用于对痕量蛋白进行检测，由于电致化学发光是一种非常可控的反应体系，其电压作为反应的启动开关，能有效的消除由于试剂添加或者混合带来的反应不稳定的问题，从而保证反应过程在完全可控的条件下进行。该反应过程具有灵敏度高，线性范围宽，反应时间短，试剂稳定时间长等优势。将电致化学发光检测技术与单分子蛋白检测技术的完美结合，可以充分发挥两个技术的各自优势，实现高灵敏的单分子检测。
双极性电极是置于电解质溶液中的电子导体(或半导体)，在其两端通过驱动电极以非直接欧姆接触的方式施加电压形成电场，引起电子导体内部电子的重排形成电势差，当驱动电极两端施加的电压足够大，电子导体两极就能够发生氧化还原反应。双极性电极具有无线连接的特质和易于集成化制备和控制的特点。因此，双极性电极为电致化学发光在单分子痕量蛋白检测的应用提供了一种解决方案。
一种较佳的实施方式，在本发明实施例1提出的技术方案中，微流控芯片和双极性电极芯片可拆卸连接，这样可以实现双极性电极的重复使用，使用完成后可以清洗后重复利用。在完成一次检测后，可以用三丙胺缓冲液将双极性电极冲洗干净，并与要测试的微流控芯片定位对准即可进行下一个样本测试。
所述微流控芯片设置有第一对准结构，所述双极性电极芯片设置有第二对准结构，所述第一对准结构和所述第二对准结构配合以将所述微阱和所述电极单元一一对准。通过该对准结构，微流控芯片和双极性电极芯片可以实现快速对准。
一种较佳的实施方式，在本发明实施例1提出的技术方案中，所述浓度确定组件，具体包括：
电位控制器，用于控制电极单元两端的电压，以激活所述电极单元；
光学成像模块，用于对所述微流控芯片中的所有固相载体进行扫描成像，以及对微流控芯片中发光的固相载体进行扫描成像；
图像分析模块，用于对扫描成像得到的图像进行分析，得到固相载体总数量和发光的固相载体数量；
浓度确定模块，用于通过泊松分布概率公式，根据固相载体总数量和发光的固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
本申请实施例中，在被测样品中，通过在固相载体上结合电化学发光材料和被测蛋白，微流控芯片上的微阱可以捕获被测样品中的固相载体，双极性电极中的电极单元在被激活时与电学发光材料发生电化学反应并发光，以此即可确定结合有被测蛋白的固相载体的数量，根据结合有被测蛋白的固相载体的数量和微阱中固相载体的总数量，即可确定被测样品中被测蛋白的浓度值。由于电致化学发光是一种非常可控的反应体系，其电压作为反应的启动开关，能有效的消除由于试剂添加或者混合带来的反应不稳定的问题，从而保证反应过程在完全可控的条件下进行。该反应过程具有灵敏度高，线性范围宽，反应时间短，试剂稳定时间长等优势。将电致化学发光检测技术与单分子蛋白检测技术的完美结合，可以充分发挥两个技术的各自优势，实现高灵敏的单分子检测。
实施例2
本发明实施例2提供了一种微流控芯片，请参阅图3，包括：
固相载体平铺区域101-1，所述固相载体平铺区域101-1包括多条液体导流槽，以及位于液体导流槽底部的微阱，所述微阱在所述微流控芯片上呈阵列排布。
固相载体平铺区域设计为两层结构，上层为液体导流槽结构，导流宽度为5-50μm，导流深度为10-30μm，加样区域的液体能够通过此导流结构的毛吸力将液体在平铺区域内自由铺展开来，并且定向匀速流动。下层是微阱阵列结构，每一个微阱只能容纳一个磁珠位置。液体在蒸发效应作用下，液体中的磁珠会均匀地进入到微阱中被捕获，其捕获的磁珠总数量不小于20000个。
微流控芯片结构可以采用纳米压印方式制备，可以批量生成。
一种较佳的实施方式，在本发明实施例2提出的技术方案中，所述微流控芯片包括位于所述固相载体平铺区域一端的加样区域101，以及位于所述固相载体平铺区域另一端的溢流缓冲区域，所述加样区域和所述溢流缓冲区域通过所述导流槽连通。加样区域的容积为20-50μL。
一种较佳的实施方式，在本发明实施例2提出的技术方案中，每个所述微阱为斜坡结构，斜坡高点为导流槽底部，位于靠近加样区的一侧，斜坡越靠近溢流缓冲区域的一侧越深，每个所述微阱仅能容纳一个固相载体。斜坡结构也可称为楔形结构。该结构可让磁珠顺利平稳地进入到微阱中，实现对磁珠的快速捕获。
本发明实施例2中的微流控芯片可应用于本发明其它一个或多个实施例中，可以实现蛋白检测时对固相载体的定向捕获和阵列化。
实施例3
本发明实施例3提供了一种双极性电极芯片102，请参阅图4，包括：
呈阵列排布的多个电极单元102-1，所述电极单元102-1在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；
所述电极单元的阳极端102-1-2面积小于阴极端102-1-1面积。
双极性电极的阳极端面积较小，而阴极端面积大，由于电极电荷总量呈中性，使得阳极的电流密度将更高，发光强度将更强。
一种较佳的实施方式，在本发明实施例3提出的技术方案中，所述电极单元平行于电极板的横截面为三角形，如图4所示，所述三角形的一边为阴极，与所述边相对的角的顶点为阳极；
或，所述电极单元平行于电极板的横截面为桃形，所述桃型的顶点为阳极，与所述桃型的顶点相对的边为阴极，如图5所示。
为了进一步提高电化学反应的化学发光效率和强度，一种较佳的实施方式，在本发明实施例3提出的技术方案中，所述电极单元包括电极修饰层；
所述电极修饰层的电极修饰材料为铂；或，所述电极修饰层的电极修饰材料为铂-氧化铱复合纳米材料。
电极修饰层可通过在电极修饰工艺得到，主要是在电极表面修饰纳米铂结构以及铂-氧化铱复合纳米结构，实现了更大反应的比表面积，从而极大地增加电化学活性，增加电化学发光效率和强度。
一种较佳的实施方式，在本发明实施例3提出的技术方案中，单个所述电极单元的粒径为5-30μm，所述双极性电极芯片中电极单元的总数量大于20000个。
双极性电极芯片还包括第二对准结构102-2。
本发明实施例3中的双极性电极芯片可应用于本发明其它一个或多个实施例中，双极性电极芯片中的电极单元在被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光，可以实现蛋白检测时对携带有蛋白的固相载体的标记。
实施例4
本发明实施例4提供了一种双极性电极的制作工艺，请参阅图6，该工艺包括如下步骤：
步骤S401，磁控溅射制备电极层图案；
步骤S402，电极纳米修饰；
步骤S403，电极保护步骤；
步骤S404，制备芯片定位与对准区。
具体来说，步骤S401具体包括：
S401-1，在衬底基板上形成一层反转胶，通过光刻技术在反转胶上形成电极层图案；
具体来说，可在衬底基板上通过旋涂的方式形成一层反转胶，反转胶可以是AZ5214光刻胶，然后通过光刻、曝光、显影等流程，形成电极层图案。
该衬底基板具体可以是玻璃衬底。
S401-2，在形成有所述电极层图案的玻璃衬底上形成电极层，所述电极层的材料为钛/铂复合材料；
S401-3，将所述衬底基板上的反转胶剥离，得到电极阵列；
具体可采用丙酮剥离衬底基板上的反转胶。
通过上述步骤S401，即可得到高密度的电极阵列。
步骤S402中，具体可以通过化学电镀的方式，在所述电极阵列表面形成一层电极修饰层，所述电极修饰层的材料为铂或铂-氧化铱复合纳米材料。
通过化学电镀的方式，可以在电极表面生成致密、比表面积极大的多种纳米结构，用于实现高效电化学发光。
步骤S403中，具体可以在所述电极阵列表面形成一层光刻胶，以保护所述电极阵列，通过光刻技术在电极阵列的两侧形成第二对准结构，然后去除所述电极阵列表面上的光刻胶，露出电极部分。
制备完成后，可通过步骤S405，通过第二对准结构，将双极性电极芯片与微流控芯片进行对齐，以进行蛋白检测。
实施例5
本发明实施例5提供了一种蛋白检测装置50，包括本发明实施例提供的蛋白检测系统，所述装置还包括抽屉模组501和人机交互模组502，如图7所示，其中：
所述抽屉模组，用于承载微流控芯片101，并将微流控芯片运动至蛋白检测系统的光学成像模块中进行成像；
所述人机交互模块，用于输入检测参数和输出检测结果，该人机交互模块为触摸屏。
实施例6
本发明实施例6提供了一种蛋白检测系统，该蛋白检测系统可应用于实施例5中，请参阅图8，该系统主要包括：电动移动平台601、样本检测系统602、控制电路603、图像分析系统604、电位控制器605以及微流控芯片101。
其中，电动移动平台用于驱动微流控芯片分别运动至样本加样区域606和样本检测区域607。加样区域用于手动使用移液器608向微流控芯片中加入待检测样品。加样完成后将芯片运输至样品检测区域，并驱动芯片进行逐级扫描成像。
样本检测系统主要用于对微流控芯片进行光学成像检测，其检测系统设计为一个暗室环境，主要包括物镜602-1、反光镜602-2、电荷耦合器件(Charge Coupled Device，CCD)相机602-3和明场光源602-4。优选的，物镜放大倍数为4～10倍，能自动调节焦距；优选的，CCD相机为电子倍增器CCD(ElectronMultiplier CCD，EM-CCD)，该相机能够在数据传输时放大光学信号而不增加噪声，在超暗的光线下也不需要较长的曝光时间。明场光源用于给磁珠提供明场照明，其明场亮度可以进行调整。在光学成像检测时，首先打开明场光源，关闭电位控制器电源，采用一维多位置的扫描成像，并对所采集到的图像进行拼接和分析，得到在明场环境下所有磁珠的总数量。然后关闭明场光源，形成一个暗室环境，打开电位控制器的电源，控制电动移动往回运动，每扫描一个位置，电位控制器开关一次，并依次完成所有位置的图像扫描，将扫描的图像再次进行拼接处理，计算得到在暗室环境下所有发光磁珠的总数量。最后按照泊松分布概率公式“概率密度＝-ln(1-发光磁珠数量/总磁珠数量)”计算得到发光磁珠的概率密度，从而得到被测对象的浓度值。
实施例7
本发明实施例7提供了一种蛋白检测方法，该方法的实现流程图如图9所示，包括如下步骤：
步骤S801：在微流控芯片的加样区域加入被测样品；所述被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；
以固相载体为磁珠为例，使用移液器将完成免疫反应产物的样品溶液手动加入到微流控芯片的加样区域，含有磁珠的溶液会在微流控芯片上快速进行自动平铺，等待1-2min即可完成磁珠平铺和捕获。
步骤S802：将双极性电极芯片盖到所述微流控芯片上，并将所述双极性电极芯片上的微阱和双极性电极芯片上的电极单元一一对准；
具体可借助光学显微观测系统，将双极性电极芯片盖到微流控芯片上，实现定位和对准。
再将微流控芯片放置到检测装置的抽屉模组上，微流控芯片被运输至样品检测区域后，执行以下步骤进行分析测试。
步骤S803：在明场条件下，在所述双极性电极芯片两端不施加电压的前提下，对微流控芯片的固相载体平铺区域进行光学扫描成像，得到第一图像，并计算第一图像中固相载体的总数量；
具体来说，打开明场光源，关闭电位控制器电源，采用一维多位置扫描成像，对所采集到的图像进行拼接和分析，得到明场环境下所有磁珠的总数量。
步骤S804：在暗场条件下，对所述双极性电极芯片两端施加电压，对微流控芯片的固相载体平铺区域进行光学扫描成像，得到第二图像，并计算第二图像中发光的固相载体的数量；
具体来说，关闭明场光源，形成一个暗室环境，打开电位控制器电源，控制电动移动往回运动，每扫描一个位置，电位控制器开关一次，并依次完成所有位置的图像扫描。
步骤S805：通过泊松分布概率公式，根据固相载体的总数量和发光的固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
检测装置完成测试，计算得到痕量蛋白的浓度值后，微流控芯片自动弹出，测试结果完成。
本发明主要是针对当前的单分子痕量蛋白检测方案的不足，提出一种基于平面微流控技术的仿生结构芯片，微流控芯片无需任何泵阀，仅依靠微结构、液体蒸发及表面张力的作用，在数十秒之内能够快速的液体定向铺展，分散成数以万计的磁珠阵列，并浸润在电化学发光液中，通过设计特异性的双极性电极结构和对电极进行纳米修饰，可实现对单分子痕量蛋白的高灵敏、自动化和低成本检测。
同时设计一种非对称结构的高密度双极性电极芯片及其加工工艺，实现该电极的重复使用，并对电极进行修饰，增大其比表面积，实现高强度的化学发光信号。最后搭建一整套化学发光检测系统，实现自动化的光学检测。该发明将可以实现单分子的痕量蛋白的高灵敏和自动化检测。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (13)
1.一种蛋白检测系统，其特征在于，包括：
微流控芯片，包括呈阵列排布的多个微阱，所述微阱用于捕获被测样品中的固相载体；被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；
双极性电极芯片，包括呈阵列排布的多个电极单元，所述电极单元在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；
浓度确定组件，根据所述微阱中固相载体的总数量和发光固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微流控芯片和所述双极性电极芯片可拆卸连接；
所述微流控芯片设置有第一对准结构，所述双极性电极芯片设置有第二对准结构，所述第一对准结构和所述第二对准结构配合以将所述微阱和所述电极单元一一对准。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述浓度确定组件，具体包括：
电位控制器，用于控制电极单元两端的电压，以激活所述电极单元；
光学成像模块，用于对所述微流控芯片中的所有固相载体进行扫描成像，以及对微流控芯片中发光的固相载体进行扫描成像；
图像分析模块，用于对扫描成像得到的图像进行分析，得到固相载体总数量和发光的固相载体数量；
浓度确定模块，用于通过泊松分布概率公式，根据固相载体总数量和发光的固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
4.一种微流控芯片，其特征在于，包括：
固相载体平铺区域，所述固相载体平铺区域包括多条液体导流槽，以及位于液体导流槽底部的微阱，所述微阱在所述微流控芯片上呈阵列排布。
5.如权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括位于所述固相载体平铺区域一端的加样区域，以及位于所述固相载体平铺区域另一端的溢流缓冲区域，所述加样区域和所述溢流缓冲区域通过所述导流槽连通。
6.如权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，每个所述微阱为斜坡结构，斜坡高点为导流槽底部，位于靠近加样区的一侧；
斜坡越靠近溢流缓冲区域的一侧越深，每个所述微阱仅能容纳一个固相载体。
7.一种双极性电极芯片，其特征在于，包括：
呈阵列排布的多个电极单元，所述电极单元在所述被测样品中被激活时，与电化学发光材料发生电化学反应并发光；
所述电极单元的阳极端面积小于阴极端面积。
8.如权利要求7所述双极性电极芯片，其特征在于，所述电极单元平行于电极板的横截面为三角形，所述三角形的一边为阴极，与所述边相对的角的顶点为阳极；
或，所述电极单元平行于电极板的横截面为桃形，所述桃型的顶点为阳极，与所述桃型的顶点相对的边为阴极。
9.如权利要求8所述双极性电极芯片，其特征在于，所述电极单元包括电极修饰层；
所述电极修饰层的电极修饰材料为铂；或，所述电极修饰层的电极修饰材料为铂-氧化铱复合纳米材料。
10.如权利要求7所述双极性电极芯片，其特征在于，单个所述电极单元的粒径为5-30μm，所述双极性电极芯片中电极单元的总数量大于20000个。
11.一种双极性电极的制作工艺，包括；
在衬底基板上形成一层反转胶，通过光刻技术在反转胶上形成电极层图案；
在形成有所述电极层图案的玻璃衬底上形成电极层，所述电极层的材料为钛/铂复合材料；
将所述衬底基板上的反转胶剥离，得到电极阵列；
通过化学电镀的方式，在所述电极阵列表面形成一层电极修饰层，所述电极修饰层的材料为铂或铂-氧化铱复合纳米材料；
在所述电极阵列表面形成一层光刻胶，以保护所述电极阵列，通过光刻技术在电极阵列的两侧形成第二对准结构，然后去除所述电极阵列表面上的光刻胶，露出电极部分。
12.一种蛋白检测装置，其特征在于，包括如权利要求1-3任一权项所述的蛋白检测系统，所述装置还包括抽屉模组和人机交互模组，其中：
所述抽屉模组，用于承载微流控芯片，并将微流控芯片运动至蛋白检测系统的光学成像模块中进行成像；
所述人机交互模块，用于输入检测参数和输出检测结果。
13.一种蛋白检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
在微流控芯片的加样区域加入被测样品；所述被测样品中包括：结合了被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、未结合被测蛋白及电化学发光材料的固相载体、电化学反应溶液；
将双极性电极芯片盖到所述微流控芯片上，并将所述双极性电极芯片上的微阱和双极性电极芯片上的电极单元一一对准；
在明场条件下，在所述双极性电极芯片两端不施加电压的前提下，对微流控芯片的固相载体平铺区域进行光学扫描成像，得到第一图像，并计算第一图像中固相载体的总数量；
在暗场条件下，对所述双极性电极芯片两端施加电压，对微流控芯片的固相载体平铺区域进行光学扫描成像，得到第二图像，并计算第二图像中发光的固相载体的数量；
通过泊松分布概率公式，根据固相载体的总数量和发光的固相载体的数量，确定被测样品中被测蛋白的浓度值。
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