JP7245541B2 - Pd-l1抑制剤、及びpd-l1抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
HLA-G2と白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との相互作用阻害剤を有効成分とするプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)抑制剤であって、
前記相互作用阻害剤は、抗LILRB2抗体である。
被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、HLA-G2と白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との結合の度合いを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。
(a)被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、HLA-G2とLILRB2との結合の度合いを測定する工程と、
(b)前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
(c)前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。
(a)被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、HLA-G2とLILRB2との結合の度合いを測定する工程と、
(b)前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
(c)前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。
ヒトにおけるHLA-G2-LILRB2シグナリングの機能を調べるために、以下の実験を行った。
(1)α1-3連結体を大腸菌で封入体として発現
pGMT7ベクターを制限酵素NdeIおよびHindIIIで切断した後、HLA-G分子のα1ドメインとα3ドメインとの連結体(α1-3連結体)をコードする遺伝子の改変体(配列番号2)を、T4DNAリガーゼを用いて挿入し、改変型HLA-G[α1-3]-pGMT7を構築した。
IPTGを添加して発現誘導した菌体懸濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、Resuspension buffer(50mM トリスpH8.0,100mM 塩化ナトリウム)を加え、懸濁し、超音波破砕で菌体を破砕した後、遠心分離して封入体を得た。この封入体をTriton wash buffer(0.5% TritonX-100、50mM トリスpH8.0,100mM 塩化ナトリウム)及びResuspension buffer(50mM トリスpH8.0、100mM 塩化ナトリウム)で十分洗浄した後に、6.0M Guanidine solution(6.0M グアニジン、50mM メスpH6.5,10mM MEDTA)で可溶化した。この時点で、HLA-G[α1-3]溶液を紫外吸光法により測定したところ、A280値が約70であり、HLA-G[α1-3]の発現量はおよそ100mg/Lであると考えられる。Refolding buffer(0.1M トリスpH8.0,0.4M L-アルギニン、5mM EDTA、3.7mM シスタミン、6.4mM システアミン)を用いて一般的な希釈法で4℃、72時間撹件しながら巻き戻した。そして、これを濃縮した後、下記条件のゲルろ過クロマトグラフィーに供して精製した。
<ゲルろ過クロマトグラフィー条件>
カラム:HiLoad 26/60、Superdex 75(60cm、id 26mm)
移動相:20mM Tris-HCl、100mM NaCl buffer(pH8)
流速:2.5ml/min
ヒト免疫抑制性レセプター(Leukocyte Immunoglobulin-Like Receptor B)であるLILRBのマウスホモログであるPIR-B(Pried-Immunoglobulin-like Receptor B)に対するHLA-G2の結合性を、表面プラズモン共鳴(Surface plasmon resonance)を用いて評価した。
PIR-Bの細胞外ドメインをHEK293T細胞にトランスフェクションし、これを1%FBS-DMEMで72時間培養した。PIR-Bの細胞外ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号5及び6に示す。なお、PIR-Bの全長のアミノ酸配列はNCBIのNM_011095において公表されており、PIR-B細胞外ドメインはこのうちドメイン1~6にあたる部分である。
<ゲルろ過クロマトグラフィー条件>
カラム:HiLoad 26/60、Superdex 75(60cm、id 26mm)
移動相:20mM Tris-HCl、100mM NaCl buffer(pH8)
流速:2.5ml/min
BIAcore(登録商標)3000(GE healthcare社のBIAcore)を使用し、HLA-G2と上記で調製したPIR-B細胞外ドメインとの結合性を表面プラズモン共鳴実験により評価した。まず、研究用センサーチップ上に、ストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そのストレプトアビジンを介して、ビオチン化PIR-B細胞外ドメインとネガティブコントロールであるBSAを固定化した。次に、ランニングバッファーであるHBS-EP(10mM へペスpH7.5,150mM 塩化ナトリウム、3.4mM EDTA、0.005% Surfactant P20)に溶解したHLA-G[α1-3]ダイマーを5μL/分で流した。各濃度での結合応答は、サンプルフローセルにおける応答から対照フローセルにおいて測定された応答を減算することによってカイネティクス測定を行った。解析にはBIAevaluation version:4.1.1(GE Healthcare)を用いた。
HLA-G2タンパク質のヒト末梢血由来細胞に対する機能を明らかにするために、受容体LILRB2を発現する単球をCD14ポジティブセレクションによってヒトPBMCから調製した。
・フローサイトメトリー
抗体:抗HLA-DR抗体(Immu-357)、抗CD86抗体(2331(FUN-1)) 及び抗PD-L1抗体(29E.2A3)
・ELISA
キット:DuoSet ELISA human IL-6 and IL-10(R&D Systems)
・ウェスタンブロッティング
抗体:抗STAT3抗体(79D7)、抗Tyr705リン酸化STAT3抗体(ポリクローナル)、抗IDO抗体(D5J4E)及び抗βアクチン抗体(8H10D10)
次に、LILRB2とHLA-G2との相互作用をブロックすることでどのような現象が起こるか検証した。LILRB2とHLA-G1との相互作用をブロックする抗LILRB2抗体として、27D6( CD85d(ILT4)モノクローナル抗体(27D6)、functional grade、eBioscience(Thermo Fisher Scientific))の使用を検討した。27D6は、LILRB2へのHLA-G1の結合をブロックする抗LILRB2抗体である(J Exp Med.1999 Apr 5;189(7):1149-56.Tetrameric complexes of human histocompatibility leukocyte antigen(HLA)-G bind to peripheral blood myelomonocytic cells.Allan DS et al)。まず、27D6がLILRB2とHLA-G2との相互作用をブロックするか検証した。
抗LILRB2抗体(27D6):10nM
HLA-G2:3.6μM
HBS-EP緩衝液:10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween-20
測定機器:BIACORE3000(GE)
次に、ヒト単球由来の樹状細胞であるIL-4-DCを用いて、LILRB2へのHLA-G2結合によって引き起こされる現象について検討した。
・フローサイトメトリー
抗体:抗HLA-DR抗体(Immu-357)、抗CD86抗体(2331(FUN-1)) 及び抗PD-L1抗体(29E.2A3)
・ELISA
キット:DuoSet ELISA human IL-6 and IL-10(R&D Systems)
次に、ヒト単球由来の樹状細胞であるIFN-DCを用いて、LILRB2へのHLA-G2結合によって引き起こされる現象について検討した。
・フローサイトメトリー
抗体:抗HLA-DR抗体(Immu-357)、抗CD86抗体(2331(FUN-1))及び抗PD-L1抗体(29E.2A3)
・ELISA
キット:OptEIA ELISA human IL-6 and IL-10(BD)
次に、CD8+T細胞を用いて、IFN-DCについてオートの混合リンパ球反応実験を行った(図14(a))。
次に、PD-L1発現増強に対するLILRB2-HLA-G2結合阻害実験を行った。実験の概要を図15に示す。Healthy Control 1,2(Donor 1,2)由来のLILRB2発現ヒト単球と、27D6(又はコントロールの抗体)と、を30分間インキュベートした。27D6を、Healthy Control 1では10μg、Healthy Control 2では7μg使用した。コントロールとしてアイソタイプが一致する抗体を同量用いた。なお、Healthy Control 1,2からのLILRB2発現ヒト単球の調製方法については、実施例2と同様である。その後、PBS中に溶解したHLA-G2(2.3μM)または同じ量のPBS(コントロール)を添加し、37℃、5%CO2で、ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液(Wako)を添加した10% FBS RPMI-1640において2日間培養した。その後、PE標識抗PD-L1抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析した。フローサイトメトリーは、抗PD-L1抗体(29E.2A3)を用いて行われた。PE標識抗PD-L1抗体で染色された細胞のヒストグラムの平均蛍光強度とPD-L1+細胞の割合(%)を比較し、27D6抗体存在、非存在時のPD-L1発現の増加率を評価した。
する。
Claims (2)
- HLA-G2と白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との相互作用阻害剤を有効成分とするプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)抑制剤であって、
前記相互作用阻害剤は、抗LILRB2抗体である、
ことを特徴とする、PD-L1抑制剤。 - 被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、HLA-G2と白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との結合の度合いを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含むプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)抑制剤のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (3)
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---|---|---|---|
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JP2018046024 | 2018-03-13 | ||
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---|---|
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- 2019-03-13 JP JP2020506622A patent/JP7245541B2/ja active Active
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Patent Citations (2)
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WO2016144728A2 (en) | 2015-03-06 | 2016-09-15 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Anti-lilrb antibodies and their use in detecting and treating cancer |
Non-Patent Citations (4)
Title |
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ALLAN, David S.J. et al.,Tetrameric Complexes of Human Histocompatibility Leukocyte Antigen (HLA)-G Bind to Peripheral Blood,J. Exp. Med.,1999年,Vol.189, No. 7,pp.1149-1155 |
KUROKI, Kimiko et al.,Cutting Edge: Class II-like Structural Features and Strong Receptor Binding of the Nonclassical HLA-,The Journal of Immunology,2017年,Vol.198,pp.3399-3403 |
LIU, Xiaoye et al.,ANGPTL2/LILRB2 signaling promotes the propagation of lung cancer cells,Oncotarget,2015年,Vol.6, No.25,pp.21004-21015 |
ZHANG, Pei et al.,Immunoglobulin-like transcript 4 promotes tumor progression and metastasis and up-regulates VEGF-C e,Oncotarget,2015年,Vol.6, No.15,pp.13550-13563 |
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