JPWO2019177054A1

JPWO2019177054A1 - 腫瘍予防又は治療剤、ｐｄ−ｌ１抑制剤、腫瘍予防又は治療剤のスクリーニング方法及びｐｄ−ｌ１抑制剤のスクリーニング方法

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Publication number: JPWO2019177054A1
Application number: JP2020506622A
Authority: JP
Inventors: 勝実前仲; 喜美子黒木; 愛実 ▲高▼橋
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2021-04-15
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: JP7245541B2; WO2019177054A1; US20210115137A1

Abstract

腫瘍予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との相互作用阻害剤を有効成分とする。

Description

本発明は、腫瘍予防又は治療剤、ＰＤ−Ｌ１抑制剤、腫瘍予防又は治療剤のスクリーニング方法及びＰＤ−Ｌ１抑制剤のスクリーニング方法に関する。

近年、ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＣｅｌｌＤｅａｔｈ１（ＰＤ−１）／ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈＬｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）シグナルをはじめとした免疫チェックポイントシグナルを標的とした抗がん剤の開発が盛んに行われている。がんによって生体内の免疫機構は抑制されている状態にあるが、その免疫機構の本来の活性を復活させるような抗体医薬が、がん治療において重要な位置を占めるようになってきた。

また、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１をはじめとしたＣＤ２８／Ｂ７ファミリーメンバーを中心に、新たな標的分子の探索及び新薬の開発が活発に行なわれている。ＰＤ−Ｌ１は本来、抗原提示細胞上に発現し、Ｔ細胞の活性化調節に関与する細胞表面分子である。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１は、特に予後の悪いがんの腫瘍細胞上に発現すると、がん細胞に対するＴ細胞活性化を抑制するため、腫瘍免疫抑制を誘導する（非特許文献１）。

ニボルマブ（商品名：オプジーボ）及びペムブロリズマブ（商品名：キイトルーダ）は、抗ＰＤ−１抗体薬として上市されており、特定の腫瘍で良好な効果を示すことが報告されている（非特許文献２）。

ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００７Ｆｅｂ２７；１０４（９）：３３６０−５．Ｅｐｕｂ２００７Ｆｅｂ２１．Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ１ｌｉｇａｎｄ１ａｎｄｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＣＤ８＋Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｒｅｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｓｏｆｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ．ＨａｍａｎｉｓｈｉＪ１，ＭａｎｄａｉＭ，ＩｗａｓａｋｉＭ，ＯｋａｚａｋｉＴ，ＴａｎａｋａＹ，ＹａｍａｇｕｃｈｉＫ，ＨｉｇｕｃｈｉＴ，ＹａｇｉＨ，ＴａｋａｋｕｒａＫ，ＭｉｎａｔｏＮ，ＨｏｎｊｏＴ，ＦｕｊｉｉＳ．ＡｎｎＨｅｍａｔｏｌ．２０１８Ｆｅｂ；９７（２）：２２９−２３７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２７７−０１７−３１７６−６．Ｅｐｕｂ２０１７Ｎｏｖ１１．ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１ｉｍｍｕｎｅ−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｂｌｏｃｋａｄｅｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＷａｎｇＹ１，ＷｕＬ１，ＴｉａｎＣ２，ＺｈａｎｇＹ３．

しかしながら、ＰＤ−Ｌ１を直接抑える抗ＰＤ−１抗体薬は、自己免疫系の副作用や抗抗体産生による効果減弱の点で課題を残していた。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｇ２（ＨＬＡ−Ｇ２）と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との間の相互作用の阻害に着目した新規な腫瘍予防又は治療剤、ＰＤ−Ｌ１抑制剤及びそれらのスクリーニング方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る腫瘍予防又は治療剤は、
ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との相互作用阻害剤を有効成分とする。

例えば、前記相互作用阻害剤は、抗ＬＩＬＲＢ２抗体である。

本発明の第２の観点に係るプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抑制剤は、
ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との相互作用阻害剤を有効成分とする。

本発明の第３の観点に係る腫瘍予防又は治療剤のスクリーニング方法は、
被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との結合の度合いを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。

本発明の第４の観点に係るプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抑制剤のスクリーニング方法は、
被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との結合の度合いを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。

本発明によれば、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用の阻害に着目した新規な腫瘍予防又は治療剤、ＰＤ−Ｌ１抑制剤及びそれらのスクリーニング方法を提供することができる。

（ａ）はＨＬＡ−Ｇ２をゲルろ過クロマトグラフィーに供した結果を示す図であり、（ｂ）は（ａ）のピーク（矢印部分）から分取した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。（ａ）は調製したＰＩＲ−Ｂをゲルろ過クロマトグラフィーに供した結果を示す図であり、（ｂ）は（ａ）のピーク（矢印部分）から分取した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＦＬＡＧ抗体にて検出したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。ＳＰＲによりＨＬＡ−Ｇ２のＰＩＲ−Ｂへの結合を解析した図である。ヒトＰＢＭＣから単球を調製する過程を示す図であり、（ａ）は単球の調製について説明した図であり、（ｂ）はフローサイトメトリーにより生存する単球集団を選択する図であり、（ｃ）は選択した単球上のＬＩＬＲＢ２発現確認を示す図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のヒトＬＩＬＲＢ２発現単球における細胞表面分子について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のヒトＬＩＬＲＢ２発現単球におけるサイトカインについて、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示す図であり、（ａ）はＩＬ−６産生、（ｂ）はＩＬ−１０産生の結果を示す図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のヒトＬＩＬＲＢ２発現単球におけるシグナル活性化について、ウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図である。ＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ２との相互作用をブロックする抗体についての評価結果を示す図であり、（ａ）は２７Ｄ６抗体を３回添加した際のレスポンスを経時的に示す図であり、（ｂ）はＨＬＡ−Ｇ２注入時のＬＩＬＲＢ２単独とＬＩＬＲＢ２に２７Ｄ６抗体が十分結合した状態（ＬＩＬＲＢ２＋２７Ｄ６）に対するレスポンスを比較した図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のヒトＬＩＬＲＢ２発現単球における機能変化に対する２７Ｄ６抗体によるブロッキング効果を示した図であり、（ａ）はシグナル活性化についてウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図であり、（ｂ）はＩＬ−６産生についてＥＬＩＳＡにより解析した図であり、（ｃ）はＩＬ−１０産生についてＥＬＩＳＡにより解析した図である。ＨＬＡ−Ｇ２との６日間のインキュベーション後のＩＬ−４−ＤＣにおける細胞表面分子について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。ＨＬＡ−Ｇ２との３日間のインキュベーション後のＩＬ−４−ＤＣにおけるサイトカインについて、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示す図であり、（ａ）はＩＬ−６産生、（ｂ）はＩＬ−１０産生の結果を示す図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のＩＦＮ−ＤＣにおける細胞表面分子について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後のＩＦＮ−ＤＣにおけるサイトカインについて、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示す図であり、（ａ）はＩＬ−６産生、（ｂ）はＩＬ−１０産生の結果を示す図である。（ａ）はＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いた、ＩＦＮ−ＤＣにおけるオートの混合リンパ球反応実験の概要を表す図であり、（ｂ）はその結果を示す図である。ＰＤ−Ｌ１発現増強に対するＬＩＬＲＢ２−ＨＬＡ−Ｇ２結合阻害実験の概略を説明した図である。（ａ）はＰＤ−Ｌ１発現増強に対するＬＩＬＲＢ２−ＨＬＡ−Ｇ２結合阻害実験の結果を示す図であり、（ｂ）はＭＦＩ比較のグラフ図であり、（ｃ）はＰＤ−Ｌ１陽性細胞減少比較のグラフ図である。ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用をブロックすることにより誘導される腫瘍免疫メカニズムを示す図である。

まず、本実施形態による腫瘍予防又は治療剤について詳細に説明する。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との相互作用阻害剤を有効成分とする。

本明細書において、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用阻害剤を、「ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤」と称する場合がある。

本発明者らは、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間のシグナリングの機能を調べたところ、ヒト末梢血由来単球細胞において、ＨＬＡ−Ｇ２刺激によるＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ発現量の低下に加え、ＰＤ−Ｌ１の明らかな発現増強を確認した。これまでに、ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォーム刺激によるＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ発現低下の報告はあるものの、ＨＬＡ−Ｇ２による研究は初めてのものである。また、ＰＤ−Ｌ１発現増強については、ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームについても、これまでに報告はない。つまり、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｇ２の免疫抑制誘導機能には、免疫活性化分子発現抑制と同時に、ＰＤ−Ｌ１の発現増強が重要であることを新たに見出した。さらに、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｇ２刺激による、Ｔ細胞活性化抑制に関与している細胞内タンパク質Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ−２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１（ＩＤＯ）の発現増強、その上流シグナルであると考えられるＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）発現増強、単球や抗原提示細胞における免疫抑制誘起に関与すると報告のあるＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）の発現増強、ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｅｒａｎｄＡｃｔｉｖａｔｏｒｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３（ＳＴＡＴ３）リン酸化増進を確認した。また、これらの結果の一部についてＬＩＬＲＢ２−ＨＬＡ−Ｇ２相互作用のブロッキング実験を行ったところ、それらの機能回復を確認した。以上より、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用をブロックすることによって、ＰＤ−Ｌ１を介した腫瘍免疫誘起が可能であると考え、本発明に至った。これは、直接ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害するのではなく、腫瘍細胞や抗原提示細胞上の受容体ＬＩＬＲＢ２を介したＰＤ−Ｌ１発現増強を阻害する低分子薬及び抗体薬の開発を目指すものである。

ＨＬＡ−Ｇ２は、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｇのスプライシングアイソフォームのひとつである。ＨＬＡ−Ｇ２について、ＮＣＢＩには、ＮＭ＿００２１２７．５にヒト由来のＨＬＡ−Ｇ全長（＝ＨＬＡ−Ｇ１）の遺伝子配列が記載されており、このうち配列番号１において「１〜９０番目のアミノ酸領域」がα１ドメインのアミノ酸配列に相当し、「９１〜１８０番目のアミノ酸領域」がα３ドメインのアミノ酸配列に相当する。

ＬＩＬＲＢ２は、本来、抗原提示細胞に発現し、リガンドである自己細胞上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩを認識して、自己寛容獲得に関与している受容体分子である。ＬＩＬＲＢ２はリガンドとして、古典的及び非古典的ＨＬＡクラスＩ分子を広範に認識するが、その中でもＨＬＡ−Ｇ２と解離定数ｎＭオーダーの強い結合をすることが明らかとなっている（ＣｕｔｔｉｎｇＥｄｇｅ：ＣｌａｓｓＩＩ−ｌｉｋｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＦｅａｔｕｒｅｓａｎｄＳｔｒｏｎｇＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅＮｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌＨＬＡ−Ｇ２ＩｓｏｆｏｒｍＨｏｍｏｄｉｍｅｒ．ＫｕｒｏｋｉＫ，ＭｉｏＫ，ＴａｋａｈａｓｈｉＡ，ＭａｔｓｕｂａｒａＨ，ＫａｓａｉＹ，ＭａｎａｋａＳ，ＫｉｋｋａｗａＭ，ＨａｍａｄａＤ，ＳａｔｏＣ，ＭａｅｎａｋａＫ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ．２０１７Ｍａｙ１；１９８（９）：３３９９−３４０３．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６０１２９６．Ｅｐｕｂ２０１７Ｍａｒ２７．）。また、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）でＬＩＬＲＢ２が発現しており、ＬＩＬＲＢ２非発現患者よりＬＩＬＲＢ２発現患者の方が予後不良であること（Ｐ．Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５）、ＮＳＣＬＣでＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇとが発現しており、特にダブルポジティブで予後不良であること（Ｙ．Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌ．２０１６．）が報告されている。

ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤は、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用をブロックする機能を有する物質である。例えば、ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤の非存在下での該相互作用の度合いに対して、ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤の存在下での該相互作用の度合いが、例えば１．１倍以上、例えば１．５倍以上、例えば１．８倍以上、例えば２．０倍以上低下した場合、該ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤は、該相互作用をブロックする機能を有する物質であると判断され得る。ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤の非存在下及び存在下での該相互作用の度合いを測定する方法としては、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００を用いたＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）による相互作用解析方法を用いることができる。

ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤は、例えば、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用をブロックする機能を有する低分子化合物、抗体、ペプチド等であってもよく、また、例えば、組換えＬＩＬＲＢ２受容体タンパク質、未同定のＨＬＡ−Ｇ２特異的受容体結合タンパク質を含むタンパク質等であってもよい。ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤は、例えば、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用をブロックする機能を有する抗ＬＩＬＲＢ２抗体であってもよい。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤は、ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤を有効成分とし、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用をブロックすることによる、Ｔ細胞活性化抑制に関与するＩＤＯの発現低下、その上流シグナルであると考えられるＩＬ−１０発現低下、単球や抗原提示細胞における免疫抑制誘起に関与するＩＬ−６の発現低下、そしてＰＤ−Ｌ１の発現抑制を介して、腫瘍免疫を誘起するものである。このように、本実施形態による腫瘍予防又は治療剤は、ＰＤ−Ｌ１の発現抑制の他、ＩＬ−１０、ＩＬ−６発現抑制等が総合的に作用して、腫瘍を予防又は治療するものである。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤は、例えば、乳癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、子宮頚癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等の腫瘍に対して予防又は治療効果を奏する。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤は、医薬上許容可能な担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等）をさらに含んでいてもよい。また、特異的に標的組織へ送達させることを可能にする標識やナノカプセル等を含有してもよい。また、腫瘍の治療に有効な公知の抗癌剤（例えば、フルオロウラシル、タモキシフェン、アナストロゾール、アクラルビシン、ドキソルビシン、テガフール、シクロホスファミド、イリノテカン、シタラビン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、チオテパ、又はこれらの医薬上許容される塩等）等の他の薬効成分をさらに含んでもよく、また、投薬時にこれらの抗癌剤と併用されてもよい。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤の投与経路としては、例えば、経口投与、非経口投与（静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与等）が挙げられ、投与剤形としては、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、懸濁剤噴霧剤等が例示される。具体的には、局所投与の場合、外科手術にて患部を露出し、癌組織に注射器等の手段で本発明の癌治療剤を直接投与することができ、また、非局所投与の場合、腫瘍栄養血管内投与により行うことができる。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤の投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、対象の年齢、体重、性別等により異なり、適宜選択され得る。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤の腫瘍に対する予防又は治療効果は、例えば、投与された哺乳動物の腫瘍形成能、平均寿命、臓器浸潤能等を測定することで、評価可能である。

次に、本実施形態によるＰＤ−Ｌ１抑制剤について詳細に説明する。

本実施形態によるＰＤ−Ｌ１抑制剤は、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用阻害剤を有効成分とする。前記相互作用阻害剤は、例えば、抗ＬＩＬＲＢ２抗体である。

ＰＤ−Ｌ１は本来、抗原提示細胞上に発現し、Ｔ細胞の活性化調節に関与する細胞表面分子である。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１は、特に予後の悪いがんの腫瘍細胞上に発現すると、がん細胞に対するＴ細胞活性化を抑制するため、腫瘍免疫抑制を誘導する。本実施形態によるＰＤ−Ｌ１抑制剤は、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用阻害剤を有効成分とし、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用をブロックすることで、腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を抑制し、腫瘍免疫を誘導するものである。

本実施形態によるＰＤ−Ｌ１抑制剤において、ＨＬＡ−Ｇ２、ＬＩＬＲＢ２、ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用阻害剤、標的疾患、添加剤、投与形態等については、前述同様である。

次に、本実施形態による腫瘍予防又は治療剤のスクリーニング方法について詳細に説明する。

本実施形態による腫瘍予防又は治療剤のスクリーニング方法は、
（ａ）被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との結合の度合いを測定する工程と、
（ｂ）前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
（ｃ）前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。

上記工程（ａ）、（ｂ）おけるＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との結合の度合いを測定する方法としては、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００を用いたＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）による相互作用解析方法を用いることができる。

上記工程（ａ）−（ｃ）における被検物質としては、特に制限されることなく、低分子化合物、抗体、ペプチド、組換えタンパク質等が含まれる。

上記（ｃ）工程において、被検物質の存在下におけるＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との結合の度合いが、被検物質の非存在下における該結合の度合いに対して、例えば１．１倍以上、例えば１．５倍以上、例えば１．８倍以上、例えば２．０倍以上低下した場合に、該被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価することができる。

次に、本実施形態によるＰＤ−Ｌ１抑制剤のスクリーニング方法について詳細に説明する。

本実施形態によるＰＤ−Ｌ１抑制剤のスクリーニング方法は、
（ａ）被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との結合の度合いを測定する工程と、
（ｂ）前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
（ｃ）前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む。

上記工程（ａ）−（ｃ）の詳細については、前述同様である。

以上説明したように、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との間の相互作用の阻害に着目した新規な腫瘍予防又は治療剤、ＰＤ−Ｌ１抑制剤及びそれらのスクリーニング方法が提供される。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
ヒトにおけるＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２シグナリングの機能を調べるために、以下の実験を行った。

（ＨＬＡ−Ｇ２タンパク質の調製）
（１）α１−３連結体を大腸菌で封入体として発現
ｐＧＭＴ７ベクターを制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、ＨＬＡ−Ｇ分子のα１ドメインとα３ドメインとの連結体（α１−３連結体）をコードする遺伝子の改変体（配列番号２）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し、改変型ＨＬＡ−Ｇ［α１−３］−ｐＧＭＴ７を構築した。

なお、改変型ＨＬＡ−Ｇ［α１−３］−ｐＧＭＴ７は、下記の方法で行った。まずＨＬＡ−Ｇ［α１−３］−ｐＧＭＴ７プラスミドを鋳型にして、ＰＣＲ用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｄｅｏｘｙＮＴＰ混合液（ＴＯＹＯＢＯ社製）、５’側プライマー（ａｔｇｇｇｔａｇｔｃａｔａｇｔａｔｇｃｇｔｔａｔｔｔｔａｇｃｇｃｇｇｃｃｇｔｇａｇ：配列番号３）、３’側プライマー（ｃｔｃａｃｇｇｃｃｇｃｇｃｔａａａａｔａａｃｇｃａｔａｃｔａｔｇａｃｔａｃｃｃａｔ：配列番号４）（それぞれ最終濃度０．２μＭ）及びＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、ＰＣＲを行った。その際、反応は変性３０秒（９５℃）、アニール１分（６０℃）、エクステンション８分（６８℃）にて２５サイクル行った。次に、ＰＣＲ産物にＤｐｎＩ（ＮＥＢ社製）を加え、３７℃で１時間反応させ、鋳型を除去し、アガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の存在を確認した。そして、ＤＮＡシークエンサーで塩基配列を確かめ、改変型ＨＬＡ−Ｇ［α１−３］−ｐＧＭＴ７プラスミドを得た。

次に、この改変型ＨＬＡ−Ｇ［α１−３］−ｐＧＭＴ７プラスミドで、大腸菌ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ（ＣｌｅａｒＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を本願の発明者らによりｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌに作り替えたもの）を形質転換することにより、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（０．５％塩化ナトリウム、１．６％トリプトン、１％乾燥酵母エキス（以上、ナカライテスク社製））中で、３７℃で培養した。次に、培養懸濁液がＯＤ６００＝０．４〜０．６に達した時点で、１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４〜６時間発現誘導した。

（２）大腸菌封入体の巻き戻し
ＩＰＴＧを添加して発現誘導した菌体懸濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０，１００ｍＭ塩化ナトリウム）を加え、懸濁し、超音波破砕で菌体を破砕した後、遠心分離して封入体を得た。この封入体をＴｒｉｔｏｎｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭトリスｐＨ８．０，１００ｍＭ塩化ナトリウム）及びＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム）で十分洗浄した後に、６．０ＭＧｕａｎｉｄｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（６．０Ｍグアニジン、５０ｍＭメスｐＨ６．５，１０ｍＭＭＥＤＴＡ）で可溶化した。この時点で、ＨＬＡ−Ｇ［α１−３］溶液を紫外吸光法により測定したところ、Ａ２８０値が約７０であり、ＨＬＡ−Ｇ［α１−３］の発現量はおよそ１００ｍｇ／Ｌであると考えられる。Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．１ＭトリスｐＨ８．０，０．４ＭＬ−アルギニン、５ｍＭＥＤＴＡ、３．７ｍＭシスタミン、６．４ｍＭシステアミン）を用いて一般的な希釈法で４℃、７２時間撹件しながら巻き戻した。そして、これを濃縮した後、下記条件のゲルろ過クロマトグラフィーに供して精製した。
＜ゲルろ過クロマトグラフィー条件＞
カラム：ＨｉＬｏａｄ２６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（６０ｃｍ、ｉｄ２６ｍｍ）
移動相：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）
流速：２．５ｍｌ／ｍｉｎ

ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたクロマトグラムを図１（ａ）に示す。図１（ａ）に示す１６１−１８１ｍＬの部分を分取し、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲル）に供した。その結果を図１（ｂ）に示す。ＨＬＡ−Ｇ２の分子量から、矢印で示すピークがＨＬＡ−Ｇ２の溶出画分であることを確認し、当該画分を回収濃縮してＨＬＡ−Ｇ２とした。

（マウス免疫抑制性レセプターＰＩＲ−Ｂに対する結合性確認）
ヒト免疫抑制性レセプター（ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒＢ）であるＬＩＬＲＢのマウスホモログであるＰＩＲ−Ｂ（Ｐｒｉｅｄ−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒＢ）に対するＨＬＡ−Ｇ２の結合性を、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて評価した。

（１）ＰＩＲ−Ｂの調製
ＰＩＲ−Ｂの細胞外ドメインをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、これを１％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで７２時間培養した。ＰＩＲ−Ｂの細胞外ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号５及び６に示す。なお、ＰＩＲ−Ｂの全長のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＮＭ＿０１１０９５において公表されており、ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインはこのうちドメイン１〜６にあたる部分である。

次いで、培養物から上清を回収し、ＮｉアフィニティクロマトグラフィーによりＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインを精製し、これを濃縮した後、下記条件のゲルろ過クロマトグラフィーに供して精製した。
＜ゲルろ過クロマトグラフィー条件＞
カラム：ＨｉＬｏａｄ２６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（６０ｃｍ、ｉｄ２６ｍｍ）
移動相：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）
流速：２．５ｍｌ／ｍｉｎ

ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたクロマトグラムを図２（ａ）に示す。図２（ａ）に示すように、２つのピークが検出された。各ピーク画分を分取し、各画分を非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミドゲル）に供した。その結果を図２（ｂ）に示す。ＰＩＲ−Ｂの分子量から、矢印で示すピークがＰＩＲ−Ｂの溶出画分であることを確認し、当該画分を回収濃縮してＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインとした。

精製したＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインを、Ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＤ−ｂｉｏｔｉｎ、ｌ００ｍＭＡＴＰ、１５μＭＢｉｒＡ）に１５μＭとなるように溶解し、ビオチン化した。ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）によりＲｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒからビオチン化ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインを分離し精製した。

（２）ＨＬＡ−Ｇ２のＰＩＲ−Ｂ（細胞外ドメイン）への結合性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅ）を使用し、ＨＬＡ−Ｇ２と上記で調製したＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインとの結合性を表面プラズモン共鳴実験により評価した。まず、研究用センサーチップ上に、ストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そのストレプトアビジンを介して、ビオチン化ＰＩＲ−Ｂ細胞外ドメインとネガティブコントロールであるＢＳＡを固定化した。次に、ランニングバッファーであるＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭへペスｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３．４ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）に溶解したＨＬＡ−Ｇ［α１−３］ダイマーを５μＬ／分で流した。各濃度での結合応答は、サンプルフローセルにおける応答から対照フローセルにおいて測定された応答を減算することによってカイネティクス測定を行った。解析にはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：４．１．１（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。

図３は、各濃度ＨＬＡ−Ｇ２（０．１０μＭ、０．２０μＭ、０．３９μＭ、０．７８μＭ、１．５６μＭ）に対するＰＩＲ−Ｂの反応を示す図である。図３の結果から、１：１結合モデルを用いた解析によるみかけの解離定数（Ｋｄ値）は１４２ｎＭであった。この結果から、ＨＬＡ−Ｇ２は、ヒトＬＩＬＲＢ２に相当するマウスのＰＩＲ−Ｂの細胞外ドメインに結合することが確認された。

（実施例２）
ＨＬＡ−Ｇ２タンパク質のヒト末梢血由来細胞に対する機能を明らかにするために、受容体ＬＩＬＲＢ２を発現する単球をＣＤ１４ポジティブセレクションによってヒトＰＢＭＣから調製した。

図４に、ＬＩＬＲＢ２を発現する単球の調製について示す。ＰＢＭＣ（ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌｓ：末梢血単核細胞）を密度勾配遠心分離法（ＤｅｎｓｉｔｙＧｒａｄｉｅｎｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ：ＤＧＣ）により単離した。ＣＤ１４ポジティブセレクションを行った。

ＬＩＬＲＢ２発現ヒト単球の調製方法について説明する。採血した末梢血をＰＢＳで希釈後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、ジアトリゾ酸ナトリウム、ポリサッカライドからなる溶液）に重層し、遠心した。血漿、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ層の間にＰＢＭＣ層が形成され、これを回収した。回収したＰＢＭＣを、ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いたＭＡＣＳ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、磁気細胞分離法）により、ＣＤ１４ポジティブなＰＢＭＣを単球として回収した。図４（ｃ）は、回収した単球がＬＩＬＲＢ２を発現していることを示す。回収した細胞は、フィコエリスリン（ＰＥ）標識の抗ＬＩＬＲＢ２抗体（４２Ｄ１）で染色され、更に測定１０分前に７−ＡＡＤで処理された。解析には、７−ＡＡＤで染色されなかった細胞（Ｒ１ゲート）であり、かつＦＳＣ−ＳＳＣドットブロットで単球が現れる部分に存在する細胞（Ｒ２ゲート）を使用した（図４（ｂ））。抗ＬＩＬＲＢ２抗体と同じアイソタイプの抗体（ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌＡｎｔｉｂｏｄｙ）で染めた場合のヒストグラム（灰色）が含まれないＭ１範囲内に、抗ＬＩＬＲＢ２抗体で染めた場合には平均８２．２％の細胞が含まれ、ＣＤ１４ポジティブ単球はＬＩＬＲ２を発現していることが示された。

上記の通り調製したＬＩＬＲＢ２発現単球を、ＨＬＡ−Ｇ２とともに２日間インキュベーションした後、フローサイトメトリーによって細胞表面分子であるＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定した。

ＬＩＬＲＢ２発現単球に、ＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＭ）又はコントロールとしてＰＢＳを加えて、３７℃、５％ＣＯ_２で、１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０において培養した。２日後に上清を収集し、細胞溶解物を調製し、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングを行った。

細胞培養実験手順及び細胞溶解物調製方法について説明する。ＬＩＬＲＢ２発現単球に、ＰＢＳ中に溶解したＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＭ）又は同じ量のＰＢＳ（コントロール）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で、ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液（Ｗａｋｏ）を添加した１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０において培養した。２日後に、細胞を回収してフローサイトメトリーを行った。培養上清は、ＥＬＩＳＡに使用された。また、同様に処理された細胞（約２×１０^６ｃｅｌｌｓ）を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、プロテアーゼインヒビターカクテルｃＯｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）、フォスファターゼインヒビター（Ｗａｋｏ））中で溶解し、細胞溶解液を調製した。

フローサイトメトリー（ＦＣＭ）の手順について説明する。細胞をＦＣＭ緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムＰＢＳ溶液）に懸濁し、それぞれにＰＥ又はＦＩＴＣ標識抗体を加え、１５分室温、遮光でインキュベーションした後、２回ＦＣＭ緩衝液で洗浄して測定に供した。細胞を測定１０分前に、７−ＡＡＤで処理した。前述同様にゲートを設定し、得られたヒストグラムの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較した。

ＥＬＩＳＡ手順について説明する。Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社のＥＬＩＳＡキットＤｕｏＳｅｔを用いて、添付文書通り測定した。Ｃａｐｔｕｒｅ抗体を一晩、室温で９６ウェルプレートに固定し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。１％ＢＳＡＰＢＳ溶液で１時間ブロッキング後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、細胞上清をウェルに添加した。２時間後ＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を加えて２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液を加えて２０分インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え１５〜２５分インキュベートした後に、２Ｎ硫酸を加え反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した（５４０ｎｍの吸収をリファレンス波長として差し引いた）。各サイトカインの標準試薬を用いて検量線を作成し、細胞培養上清中のサイトカイン量を定量した。細胞培養上清は、適宜１％ＢＳＡＰＢＳ溶液で希釈して使用した。

ウエスタンブロッティングの手順について説明する。１２．５％又は１０％アクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより細胞溶解液を電気泳動した。細胞溶解液には、５％メルカプトエタノール含有サンプル緩衝液（最終濃度：６３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）を加えた。ゲル中に展開されたタンパク質は、ＰＶＤＦ膜に転写され、５％スキムミルクＴＢＳ溶液でブロッキングされた。その後、ウエスタンブロッティングに用いられた抗体の添付文書に従い、膜を抗体で処理した。検出バンドは、ＥＣＬｐｒｉｍｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉで化学発光検出された。

フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングの条件を以下に示す。
・フローサイトメトリー
抗体：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｉｍｍｕ−３５７）、抗ＣＤ８６抗体（２３３１（ＦＵＮ−１））及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２９Ｅ．２Ａ３）
・ＥＬＩＳＡ
キット：ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡｈｕｍａｎＩＬ−６ａｎｄＩＬ−１０（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）
・ウェスタンブロッティング
抗体：抗ＳＴＡＴ３抗体（７９Ｄ７）、抗Ｔｙｒ７０５リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（ポリクローナル）、抗ＩＤＯ抗体（Ｄ５Ｊ４Ｅ）及び抗βアクチン抗体（８Ｈ１０Ｄ１０）

フローサイトメトリーの結果を図５に示す。ヒトＬＩＬＲＢ２発現単球において、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲの発現低下と、ＰＤ−Ｌ１の顕著な発現増強と、が認められた。このように、ヒトＬＩＬＲＢ２発現単球において、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、免疫抑制的なフェノタイプが観察された。

ＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。ヒトＬＩＬＲＢ２発現単球において、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生誘導が確認された。

ウェスタンブロッティングの結果を図７に示す。ヒトＬＩＬＲＢ２発現単球において、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、細胞内タンパク質ＳＴＡＴ３リン酸化増強及びＩＤＯ発現増強が確認された。

（実施例３）
次に、ＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ２との相互作用をブロックすることでどのような現象が起こるか検証した。ＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ１との相互作用をブロックする抗ＬＩＬＲＢ２抗体として、２７Ｄ６（ＣＤ８５ｄ（ＩＬＴ４）モノクローナル抗体（２７Ｄ６）、ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒａｄｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の使用を検討した。２７Ｄ６は、ＬＩＬＲＢ２へのＨＬＡ−Ｇ１の結合をブロックする抗ＬＩＬＲＢ２抗体である（ＪＥｘｐＭｅｄ．１９９９Ａｐｒ５；１８９（７）：１１４９−５６．Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃｃｏｍｐｌｅｘｅｓｏｆｈｕｍａｎｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｇｂｉｎｄｔｏｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＡｌｌａｎＤＳｅｔａｌ）。まず、２７Ｄ６がＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ２との相互作用をブロックするか検証した。

ＳＰＲ解析手順について説明する。ＣＡＰチップ、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、２５℃で測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液をランニング緩衝液として使用した。まず、ビオチン化したＬＩＬＲＢ２を２つのフローセルのチップ上に約７００ＲＵずつ固定化した。１つのフローセルにのみ、２７Ｄ６抗体（１０ｎＭ）を、結合が飽和に達するまで、３回添加した。２つのＬＩＬＲＢ２固定フローセルにＨＬＡ−Ｇ２（３．６μＭ）を流し、レスポンスを比較した（コントロールには、ＢＳＡを固定したフローセルのレスポンスを用いた）。
抗ＬＩＬＲＢ２抗体（２７Ｄ６）：１０ｎＭ
ＨＬＡ−Ｇ２：３．６μＭ
ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液：１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０
測定機器：ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥ）

結果を図８に示す。ＨＬＡ−Ｇ２を注入すると、ＬＩＬＲＢ２＋２７Ｄ６では、ＬＩＬＲＢ２単独に比してレスポンスの値が低下することが確認された（図８（ｂ））。以上より、２７Ｄ６は、ＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ２との相互作用をブロックすることが確認された。

次に、ＨＬＡ−Ｇ２処理単球のブロッキング分析を行った。２７Ｄ６（４μｇ）と３０分間インキュベーションした後、ＨＬＡ−Ｇ２とともに２日間インキュベーションした。より具体的には、２７Ｄ６抗体（４μｇ）（コントロールとしてアイソタイプが一致する抗体を同量用いた）と３０分インキュベーションした後、ＰＢＳ中に溶解したＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＭ）または同じ量のＰＢＳ（コントロール）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で、ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液（Ｗａｋｏ）を添加した１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０において２日間培養した。細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。ウエスタンブロッティングなど、これ以降の操作については前述同様に行った。

結果を図９に示す。２７Ｄ６とともにインキュベーションすることで、ＩＤＯの発現が抑制された（図９（ａ））。また、２７Ｄ６とともにインキュベーションすることで、ＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生が抑制された（図９（ｂ）、（ｃ））。以上より、２７Ｄ６は、ＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ−Ｇ２との相互作用をブロックすることにより、ＩＤＯの発現及びＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生を抑制することが示唆された。

（実施例４）
次に、ヒト単球由来の樹状細胞であるＩＬ−４−ＤＣを用いて、ＬＩＬＲＢ２へのＨＬＡ−Ｇ２結合によって引き起こされる現象について検討した。

ＩＬ−４−ＤＣを、１０００Ｕ／ｍＬＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍＬＩＬ−４添加培地で６日間インキュベーションすることで得た。得られたＩＬ−４−ＤＣをＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＬ）又はコントロールとしてのＰＢＳとともに、３７℃、５％ＣＯ_２で、培地（１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質添加）＋１０００Ｕ／ｍＬＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍＬＩＬ−４）中で培養した。培養開始３日後に、培地を交換し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡに供した。培養開始６日後に、上清を収集し、フローサイトメトリーを行った。

フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングの条件を以下に示す。
・フローサイトメトリー
抗体：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｉｍｍｕ−３５７）、抗ＣＤ８６抗体（２３３１（ＦＵＮ−１））及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２９Ｅ．２Ａ３）
・ＥＬＩＳＡ
キット：ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡｈｕｍａｎＩＬ−６ａｎｄＩＬ−１０（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）

フローサイトメトリーの結果を図１０に示す。ＩＬ−４−ＤＣにおいて、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、ＣＤ８６の発現低下と、ＰＤ−Ｌ１の顕著な発現増強と、が認められた。このように、ＩＬ−４−ＤＣにおいても、ＨＬＡ−Ｇ２との６日間のインキュベーション後、免疫抑制的なフェノタイプが観察された。

ＥＬＩＳＡの結果を図１１に示す。ＩＬ−４−ＤＣにおいても、ＨＬＡ−Ｇ２との３日間のインキュベーション後、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生誘導が確認された。

（実施例５）
次に、ヒト単球由来の樹状細胞であるＩＦＮ−ＤＣを用いて、ＬＩＬＲＢ２へのＨＬＡ−Ｇ２結合によって引き起こされる現象について検討した。

ＥｘｐＤｅｒｍａｔｏｌ．２０１５Ｊａｎ；２４（１）：３５−４１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｅｘｄ．１２５８１．Ｅｐｕｂ２０１４Ｄｅｃ８．ＮｉｅｄａＭｅｔａｌに基づきＩＦＮ−ＤＣを培養し、培養開始２日後に、ＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＬ）又はコントロールとしてのＰＢＳとともに、３７℃、５％ＣＯ_２で、培地（１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質添加）＋１０００Ｕ／ｍＬＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−α）中で培養した。培養開始４日後に、培地を交換し、上清を収集し、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡを行った。

フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングの条件を以下に示す。
・フローサイトメトリー
抗体：抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｉｍｍｕ−３５７）、抗ＣＤ８６抗体（２３３１（ＦＵＮ−１））及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２９Ｅ．２Ａ３）
・ＥＬＩＳＡ
キット：ＯｐｔＥＩＡＥＬＩＳＡｈｕｍａｎＩＬ−６ａｎｄＩＬ−１０（ＢＤ）

フローサイトメトリーの結果を図１２に示す。ＩＦＮ−ＤＣにおいて、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、ＨＬＡ−ＤＲの発現低下と、ＰＤ−Ｌ１の顕著な発現増強と、が認められた。このように、ＩＦＮ−ＤＣにおいても、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、免疫抑制的なフェノタイプが観察された。

ＥＬＩＳＡの結果を図１３に示す。ＩＦＮ−ＤＣにおいても、ＨＬＡ−Ｇ２との２日間のインキュベーション後、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生誘導が確認された。

（実施例６）
次に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いて、ＩＦＮ−ＤＣについてオートの混合リンパ球反応実験を行った（図１４（ａ））。

２日間ＨＬＡ−Ｇ２又はＰＢＳ（コントロール）とインキュベーションされたＩＦＮ−ＤＣを、一晩、Ｍａｒｔ１（Ａ２７Ｌ）ペプチドで処理した。Ｍａｒｔ１（Ａ２７Ｌ）ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ：配列番号７）は、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ１という黒色腫関連抗原由来のペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に提示される。２７番目のアミノ酸であるアラニンをロイシンに置換することで、よりＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるよう改変されたペプチドである。ＩＦＮ−ＤＣと非接着性ＰＢＭＣ（リンパ球として使用）とを、１：１０となるように混合し、３日毎に継代を繰り返しながら、１００Ｕ／ｍＬＩＬ−２存在下、１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０培地中で１４日間培養した。その後、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体とＰＥ標識Ｍａｒｔ１（Ａ２７Ｌ）ペプチド４量体とで染色し、フローサイトメトリーで解析した。フローサイトメトリーは、ＨＬＡ−Ａ２／Ｍａｒｔ１（Ａ２７Ｌ）テトラマー（ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＳＡ使用）とａｎｔｉ−ＣＤ８（Ｂ９．１１）−ＦＩＴＣ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）との２重染色により行われた（使用機器：ＥｐｉｃｓＸＬＭＣＬ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）。

結果を図１４（ｂ）に示す。ＨＬＡ−Ｇ２非存在下では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は活性化されていたが、ＨＬＡ−Ｇ２処理によって、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化の抑制が観察された。以上より、ＨＬＡ−Ｇ２によって腫瘍免疫が抑制され、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用をブロックすることにより腫瘍免疫が活性化されることが示唆された。

（実施例７）
次に、ＰＤ−Ｌ１発現増強に対するＬＩＬＲＢ２−ＨＬＡ−Ｇ２結合阻害実験を行った。実験の概要を図１５に示す。ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ１，２（Ｄｏｎｏｒ１，２）由来のＬＩＬＲＢ２発現ヒト単球と、２７Ｄ６（又はコントロールの抗体）と、を３０分間インキュベートした。２７Ｄ６を、ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ１では１０μｇ、ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ２では７μｇ使用した。コントロールとしてアイソタイプが一致する抗体を同量用いた。なお、ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ１，２からのＬＩＬＲＢ２発現ヒト単球の調製方法については、実施例２と同様である。その後、ＰＢＳ中に溶解したＨＬＡ−Ｇ２（２．３μＭ）または同じ量のＰＢＳ（コントロール）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で、ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液（Ｗａｋｏ）を添加した１０％ＦＢＳＲＰＭＩ−１６４０において２日間培養した。その後、ＰＥ標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析した。フローサイトメトリーは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２９Ｅ．２Ａ３）を用いて行われた。ＰＥ標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色された細胞のヒストグラムの平均蛍光強度とＰＤ−Ｌ１^＋細胞の割合（％）を比較し、２７Ｄ６抗体存在、非存在時のＰＤ−Ｌ１発現の増加率を評価した。

結果を図１６（ａ）−（ｃ）に示す。図１６（ｂ）は、Ｄｏｎｏｒ１（ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ１）及びＤｏｎｏｒ２（ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ２）におけるＭＦＩ（ＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ：平均蛍光強度のアイソタイプコントロールとの差）を示し、図１６（ｃ）は、Ｄｏｎｏｒ１（ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ１）及びＤｏｎｏｒ２（ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ２）におけるＰＬＤ１陽性細胞の減少率を示す。図１６（ｂ）、（ｃ）において、「Ｇ２」は「ＨＬＡ−Ｇ２」、「ＩＣ」は「ｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ」を示す。Ｄｏｎｏｒ１（ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ１）及びＤｏｎｏｒ２（ＨｅａｌｔｈｙＣｏｎｔｒｏｌ２）の両方において、２７Ｄ６によって、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用がブロックされ、ＰＤ−Ｌ１発現が抑制されていることが示された。

図１７に、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用をブロックすることにより誘導される腫瘍免疫メカニズムについて説明する。ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２相互作用をブロックすることで、Ｔ細胞活性化抑制に関与するＩＤＯの発現低下、その上流シグナルであると考えられるＩＬ−１０発現低下、単球や抗原提示細胞における免疫抑制誘起に関与するＩＬ−６の発現低下、そしてＰＤ−Ｌ１の発現抑制を介して、腫瘍免疫が誘起される。このように、ＨＬＡ−Ｇ２とＬＩＬＲＢ２との相互作用をブロックすることにより、ＰＤ−Ｌ１の発現抑制の他、ＩＬ−１０、ＩＬ−６発現抑制等が総合的に作用して、腫瘍免疫の効果を奏する。

今後、ＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２シグナルにより誘導される腫瘍免疫抑制を解除する、低分子化合物、抗体等のスクリーニング法の開発、最終的にはＨＬＡ−Ｇ２−ＬＩＬＲＢ２シグナルを標的とした新規抗がん剤開発が期待される。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。

本出願は、２０１８年３月１３日に出願された、日本国特許出願２０１８−０４６０２４号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１８−０４６０２４号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものと
する。

Claims

ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との相互作用阻害剤を有効成分とする腫瘍予防又は治療剤。
前記相互作用阻害剤は、抗ＬＩＬＲＢ２抗体である、
ことを特徴とする請求項１に記載の腫瘍予防又は治療剤。
ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との相互作用阻害剤を有効成分とするプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抑制剤。
前記相互作用阻害剤は、抗ＬＩＬＲＢ２抗体である、
ことを特徴とする請求項３に記載のＰＤ−Ｌ１抑制剤。
被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との結合の度合いを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含む腫瘍予防又は治療剤のスクリーニング方法。
被検物質の存在下及び前記被検物質の非存在下で、ＨＬＡ−Ｇ２と白血球Ｉｇ様受容体Ｂ２（ＬＩＬＲＢ２）との結合の度合いを測定する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いと、前記被検物質の非存在下における前記度合いと、を比較する工程と、
前記被検物質の存在下における前記度合いが、前記被検物質の非存在下における前記度合いより低い場合に、前記被検物質を腫瘍予防又は治療剤と評価する工程と、
を含むプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抑制剤のスクリーニング方法。