JP7231714B2 - 殺有害生物剤を検出するための方法およびキット、ならびに殺有害生物剤を検出するためのプラスミド、バキュロウイルス、細胞、およびそれらを調製する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年10月18日出願の米国仮特許出願第62/747,258号の利益を主張する。
当技術分野における必要性を考慮して、本発明者らは、組換えバキュロウイルスを使用して、細胞、例えば昆虫細胞の表面にAChEを提示させることにより、殺虫剤残留物、例えばOPおよびCBの検査においてきわめて高感受性である細胞ベースの新規検出システムを開発することとした。殺虫剤を機能的に検出するために、AChEは細胞表面に提示されるので、AChEの抽出および精製は不要で、検出システム全体に関する生産時間およびコストは抑制され得る。検出システムを最適化するために、組換えウイルス感染条件および凍結乾燥の効果を分析した。
(a)試料を、アセチルコリンエステラーゼを発現する細胞と接触させること、
(b)アセチルコリンエステラーゼ基質を前記細胞と接触させること、および
(c)前記アセチルコリンエステラーゼ基質に起因する反応生成物を検出すること
を含む方法が本明細書で提供される。
別の態様では、殺有害生物剤を検出するためのキットであって、細胞上で発現されるアセチルコリンエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ基質を含むキットが本明細書で提供される。
好ましくは、方法は、反応生成物に蛍光指示薬を添加するステップをさらに含み得る。
好ましくは、蛍光指示薬は、5,5’-ジチオ-ビス-[2-ニトロ安息香酸](DTNB)、ジチオジニコチン酸(DTNA)、2,2’-ジチオジピリジン(2-PDS)、ヒドロキシルアミン、ペルオキシダーゼと結合したコリンオキシダーゼ/フェノール/アミノアンチピリン、AuCl4存在下でのAu-NPシード、酪酸レゾルフィン、酢酸インドキシル、N-[4-(7-ジエチルアミノ-4-メチルクマリン-3-イル)フェニル]マレイミド、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(Amplex Red試薬)、量子ドット(QD)、チオールグリーン指示薬またはAbRed指示薬を含み得る。
好ましくは、方法は、殺有害生物剤の濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害の標準曲線を参照することにより、殺有害生物剤を定量するステップをさらに含み得る。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、
(i)完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
(ii)グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
(iii)GPI係留部位が欠失しており、バキュロウイルスGP64タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質ドメイン(CTD)に置き換わっている、アセチルコリンエステラーゼ
であり得る。
より好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、または配列番号12のアミノ酸を含む。
好ましくは、方法は、農産物をエッペンドルフチューブ内でペッスルを用いて粉砕するステップ、または農産物をQ-チップを用いてディッピングするステップをさらに含み得る。あるいは、方法は、水、PBS、DMSO、アセトン、またはエタノールを含む抽出溶液中に農産物を浸漬するステップをさらに含み得る。
好ましくは、殺有害生物剤は、アセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物を含み得る。
より好ましくは、殺有害生物剤は有機リン酸エステル系(OP系)またはカルバメート系(CB系)を含み得る。
好ましくは、本方法は、2種以上のアセチルコリンエステラーゼの反応生成物に基づき、殺有害生物剤を同定するステップをさらに含み得る。
より好ましくは、2種以上のアセチルコリンエステラーゼは、異なるアセチルコリンエステラーゼ変異体または異なる生物に由来するアセチルコリンエステラーゼであり得る。あるいは、アセチルコリンエステラーゼは、異なるウェル中の細胞上に様々な発現レベルで独立して提示され得る。
好ましくは、本キットは蛍光指示薬をさらに含み得る。任意に、キットは、テリトレムB、塩酸ドネペジル、またはシクロペニンを含む陽性対照をさらに含み得る。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、細胞表面、バキュロウイルス、またはバキュロウイルスの包埋体上に提示され得る。
好ましくは、細胞は凍結乾燥され得る。好ましくは、細胞は懸濁物、チューブ、チップ、またはプレート内にあり得る。任意に、プレートはシングルまたはマルチウェルプレートであり得る。
(i)完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
(ii)グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
(iii)GPI係留部位が欠失しており、バキュロウイルスGP64タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質ドメイン(CTD)に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼ、
をコードするヌクレオチド配列、
hr1-hsp70およびp10デュエルプロモーター、および
ミツバチメリチンシグナルペプチド(HM)および/または六量体ヒスチジンタグ(6H)
を含むプラスミドが本明細書で提供される。
1つの態様では、
(i)完全長のアセチルコリンエステラーゼ、
(ii)グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)係留部位が欠失しているアセチルコリンエステラーゼ、または、
(iii)GPI係留部位が欠失しており、バキュロウイルスGP64タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質ドメイン(CTD)に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼ
を細胞表面に発現する細胞であって、
前記アセチルコリンエステラーゼが、配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、または配列番号12のアミノ酸を含む細胞が本明細書で提供される。
好ましくは、アセチルコリンエステラーゼは、ミバエ、イエバエ、ヒト、マウス、ラット、ツマジロクサヨトウ、ミジンコ、ニワトリ、ガ、アブラムシ、ミツバチ、小エビ、またはサカナ由来であり得る。
好ましくは、ヌクレオチド配列は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ヒト(Homo sapiens)、ラット(Rattus norvegicus)、セイヨウミツバチ(Apis mellifera)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、オオミジンコ(Daphnia magna)、またはミカンコミバエ(Bactrocera dorsalis)に由来し得る。
好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号1のアミノ酸をコードする配列番号2、または配列番号3のアミノ酸をコードする配列番号4であり得る。
好ましくは、プラスミドはレポーター遺伝子をさらに含み得る。より好ましくは、レポーター遺伝子はEGFP遺伝子およびpagプロモーターを含み得る。
好ましくは、プラスミドは、配列番号5または配列番号6の配列を含み得る。
好ましくは、バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcMNPV)またはカイコガ(Bombyx mori)核多角体病ウイルス(BmNPV)であり得る。
好ましくは、AcMNPVは、スポドプテラ・フルギペルダIPLB-Sf21(Sf21)細胞内で繁殖する。
好ましくは、細胞は鱗翅目の細胞である。
好ましくは、細胞は、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)BTI-TN-5B1-4 High Five(Hi5)昆虫細胞である。
好ましくは、AcMNPVの感染多重度(MOI)は、0.1~10、0.2~5、または0.5~2である。
本明細書で使用する場合、用語「~を含む(comprises)」、「~を含むこと(comprising)」、「~を含む(includes)」、「~を含むこと(including)」、「~を有する(has)」、「~を有すること(having)」、「~を含有する(contains)」、「~を含有すること(containing)」、「~により特徴付けられる(characterized by)」、またはその任意の他の変形形態は、非排他的な包含を網羅するように意図されており、明確に示されたあらゆる制限の対象となる。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、または方法は、必ずしもそのような要素にのみ限定されるわけではなく、明示的に列挙されないまたはそのような組成物、混合物、プロセス、または方法に固有のその他の要素を含み得る。
移行句「~から実質的になる(consisting essentially of)」は、組成物、方法(材料、ステップ、特性、コンポーネント、または要素を、文言上開示されたものに付加して含む)を定義するのに使用されるが、ただしこれらの追加の材料、ステップ、特性、コンポーネント、または要素が、請求項に係る発明の基本的且つ新規の特徴に対して顕著に影響を及ぼさないことを前提とする。 用語「~から実質的になる(consisting essentially of)」は、「~を含むこと(comprising)」と「~からなる(consisting of)」の間の中間的な位置を占める。
本明細書で使用する場合、用語「約」は、数値には、例えば数値を決定するために採用された測定デバイス、方法が有する固有の誤差変動、または試験対象において存在するばらつきが含まれることを表すのに使用される。一般的に、該用語は、状況に応じておよそ1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、もしくは20%またはそれ未満の変動を含むように意図されている。
別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で引用されるすべての公開資料、特許出願、特許、およびその他の参考資料は、参考資料が提示されている文および/またはパラグラフに関連する教示に関して参考としてそのまま組み込まれている。
1つの実施形態では、置換用の残基の選択は、Biosymソフトウェアを備えるEvansおよびSutherland PS390プラットフォーム上で、Sussmanらにより公表されたAChEの結晶構造を使用する分子モデルに基づく。
本出願の反応生成物の蛍光または色を分析することにより、様々なクラスの殺有害生物剤または殺虫剤、例えばアセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物、例えば有機リン酸エステル(OP)またはカルバメート(CB)等について、それらを区別する方法が記載される。
本出願はキットも提供する。そのようなキットは、細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ基質を含む。細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼは、懸濁液、チューブ、プレート、ガラスバイアル、またはジャー、プラスチックパック等中にあり得る。1つの実施形態では、細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼは、懸濁液、チューブ、チップ、またはプレート中にあり得る。細胞上で発現されたアセチルコリンエステラーゼは、凍結乾燥され得るが、またマイクロタイタープレートまたはチップ内に収納され得る。例えば、固定化の方法として、Taylorら(米国特許第5,192,507号)に記載されるような方法を挙げることができるが、ただしこれに限定されない。その他の実施形態では、本キットは、酵素を収納するプラスチック、ガラス製のコンテナ、または金属チューブを含み得るが、またチューブは、一方の端部にインレット手段および他方の端部にアウトレット手段を有し得る。
それに加えて、本キットは、別紙指示書または任意のコンテナ手段または任意のその他の包装を含み得る。これらの指示書は、検出方法を実施するための条件、例えば混合比、量、インキュベーション時間等、およびスペクトルチャートを含む、本方法の結果を評価するための基準を通常定める。
一態様では、2種以上の細胞のセット内で異なる量のAChEを発現させるために、2種以上の細胞のセットが異なるバキュロウイルスクローンを用いて構築される。例えば、1つの細胞のセットがバキュロウイルスAクローンを用いて構築され、他の細胞のセットがバキュロウイルスBクローンを用いて構築され、バキュロウイルスAを用いて構築された細胞のセットはバキュロウイルスBを用いて構築された細胞のセットよりも多くのAChEを発現する。
別の態様では、2種以上の細胞のセット内で異なるAChEを発現させるために、異なるAChEを用いて2種以上の細胞のセットが構築される。例えば、異なるAChEは、感受性または非感受性AChEであり得る、あるいは異なるAChEは、異なる起源、例えば脊椎動物もしくは無脊椎動物、またはミバエ、イエバエ、ヒト、マウス、ラット、ツマジロクサヨトウ、ミジンコ、ニワトリ、ガ、アブラムシ、ミツバチ、小エビ、もしくはサカナに由来し得る。
さらなる苦労を労せずとも、当業者は、上記説明に基づき、本発明をその全体について利用することができると考えられる。下記の具体例は、したがって単に例証的であり、またどのようなことがあっても本開示の残りの部分を制限するものではないと解釈される。本明細書で引用されたすべての公開資料は参照により組み込まれている。
化学物質および試薬
アセチルコリンエステラーゼアッセイキット(標準AChE)をAbcam社から購入した。殺有害生物剤残留物の迅速バイオアッセイ試薬キット(Rapid Bioassay of Pesticides Residues Reagent Kit)(市販AChE)をSichen社から購入した。
阻害アッセイ用の有機リン酸エステル化合物(パラオキソンエチル、マラオキソン、クロルピリホス、およびエチオン)、およびカルバメート化合物(カルバリル、カルボフラン、およびメトミル)を、Sigma-Aldrich社から購入した。4化合物すべてを、ジメチルスルホキシド(DMSO)(Ameresco社)中、1mMのストック溶液として使用する前に調製した。アッセイ内の異なる濃度の各化合物溶液を、最終DMSO濃度を2%未満に維持しつつ、DMSO中での連続希釈によりさらに調整した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)をCorning社から購入した。使用される化学物質は、いずれも分析グレードのものであった。
組換えバキュロウイルス(AcMNPV)生成用のスポドプテラ・フルギペルダIPLB-Sf21(Sf21)細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するTC100昆虫培地(US Biological社)中、26℃で増殖させた。最大組換えタンパク質発現用のイラクサギンウワバBTI-TN-5B1-4 High Five(Hi5)細胞を、ESF921(商標)昆虫細胞培養培地(Expression Systems社)中、26℃で増殖させた。vAChE-FL、vAChE-6MC、またはAChE cDNAを有さない対照ウイルス(vCont)を含む組換えバキュロウイルスを、TransIT(登録商標)-昆虫トランスフェクション試薬(Insect Transfection Reagent)(Mirus社)を使用して、FlashBAC(商標)で改変されたAcMNPVゲノム(Mirus社)を、トランスファーベクタープラスミドと共にSf21細胞中に同時トランスフェクトすることにより生成させた。組換え体を繁殖させ、連続希釈により単離した。定量的PCR(qPCR)および50%組織培養感染量(TCID50)の両方により、ウイルスクローン力価を測定した。
AChE配列は、変異Y408F[11]を有するキイロショウジョウバエ[10]に由来し、その配列はBio Basic Inc.社により合成された。プラスミドpABEGhhp10は、アミノ末端にミツバチメリチンシグナルペプチドおよびカルボキシル末端にGP64膜貫通ドメインおよびCTDドメインを有するトランスファーベクターである(6MC)。プラスミドpABEGhhp10は、EGFP蛍光タンパク質の発現を推進するpagプロモーターを担持し、p10プロモーターの下流に外来配列の挿入を可能にする。AChE Y408F配列を、KODホットスタートマスターミックス(Hot Start Master Mix)(Merck社)および2つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅させた。6MCを有さないFLコード領域挿入断片を増幅するのに使用したプライマーはHAChEifp(5’-CACCATCACCATCACGTCATCGATCGCCTGGTT-3’、配列番号13)、およびAChE2rp(5’-CGGATCAATTAATTAGAACACGCGCTTAGTTCTC-3’、配列番号14)であった。C末端GPI係留トランケート化AChE 6MCコード領域挿入断片を増幅するのに使用したプライマーは、HAChEifp(5’-CACCATCACCATCACGTCATCGATCGCCTGGTT-3’、配列番号13)、およびAChEdeGPIrp(5’-ATGACCAAACATGAAATCTCCGTCACATGTGCC-3’、配列番号15)であった。プラスミドpABEGhhp10を、KODホットスタートマスターミックス(Merck社)および2つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅させた。FLコード領域ベクター断片を増幅するのに使用したプライマーは、pABhhp10HM6H2fp(5’-ACTAAGCGCGTGTTCTAATTAATTGATCCGGGTTATTAGTACATTTAT-3’、配列番号16)、およびHAChEvrp(5’-CAGGCGATCGATGACGTGATGGTGATGGTGATGC-3’、配列番号17)であった。6MCコード領域ベクター断片を増幅するのに使用したプライマーは、pABhhp10HM6Hfp(5’-ACATGTGACGGAGATTTCATGTTTGGTCATGTAGTTAACTTTGT-3’、配列番号18)、およびHAChEvrp(5’-AGGCGATCGATGACGTGATGGTGATGGTGATGC-3’、配列番号17)であった。In-fusion HD Cloning Kit(Takara Bio USA,Inc.社)を使用することにより、挿入断片をベクター断片と融合させた。変換およびコロニー採集の後、プラスミドを増幅、抽出し、配列分析により検証した。得られた完全長AChE、AChE-6MCを含有するプラスミド、およびAChE挿入を有さない対照ウイルスを、FL、6MC、およびContとしてそれぞれ省略した。得られたプラスミドをpAChE-FL(配列番号5)、pAChE-6MC(配列番号6)、およびpCont-Bacと命名し、また得られた組換えバキュロウイルスをvAChE-FL、vAChE-6MC、およびCont-Bacと命名した。一実施形態では、AChE-FLは配列番号1のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、AChE-FLは、配列番号2のヌクレオチド配列によりコードされる。別の実施形態では、AChE-6MCは配列番号3のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、AChE-6MCは配列番号4のヌクレオチド配列によりコードされる。
一次ウイルスストック(V0)を、flashBAC(商標)ULTRA(Mirus Bio社)およびDNA-Cellfectin(登録商標)(Invitrogen社)混合物を用いたSf21細胞のトランスフェクションから取得し、単一ウイルス(V1)の力価をストックウイルス溶液の連続希釈により改善し、またプラーク精製により単離した。繁殖させた単一ウイルス(V2)を、Sf21細胞のV1ウイルス感染を用いて増幅させた。96ウェルマイクロプレート中のHi5細胞(細胞4×105個/mL)をV2ウイルスに感染させ、26℃で3~4日間増殖させた。Hi5細胞を、0.1~10、好ましくは1~5、0.2~5、または0.5~2の感染多重度(MOI)で感染させた。例えば、MOIは、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり得る。バイオマーカーとして蛍光、例えばEGFPレポーターの発現を使用することにより、AChEを発現する組換えバキュロウイルスをスクリーニングした。AChEの発現をAChE活性により決定した。感染から3日後に、細胞スクレーパーにより感染細胞を培養プレートまたはフラスコから削り取り、DPBSに懸濁した。細胞カウンターにより細胞数をカウントし、いくつかの異なる濃度に稀釈した。好ましい実施形態では、AChE提示細胞の種類に関する96ウェルプレートアッセイにおいて使用される最終濃度は、細胞5×103個、1.5×104個、および4.5×104個/ウェルであり得る。さらに、AChE提示細胞を収集する場合、培地を96ウェルマイクロプレートから慎重に除去した。マイクロプレート中の感染細胞は、残留する湿気を取り除くために、5時間凍結乾燥プロセスに置かれた。乾燥したマイクロプレートを密閉し、4℃に保った。
AChE活性をエルマン法により決定した。各96ウェルに対して、3mMのATChを50μlおよび3mMのエルマン試薬DTNB溶液を50μl添加した。室温で10分インキュベートした後、412nmにおける平均吸収を決定した。各殺有害生物剤によるAChE活性の阻害を決定するために、殺有害生物剤、例えばクロルピリホス、エチオン、カルバリル、カルボフラン、およびメトミル等のストック溶液を、1%のDMSOを含むDPBS中で10-3M~10-9Mの範囲の濃度に稀釈した。次に稀釈した溶液を、7つの組換えウイルス(vDmAChE、vHsAChE、vRnAChE、vAmAChE、vSfAChE、DamAChE、およびvBdAChE)に感染させたHi5細胞を含む96ウェルマイクロプレート中に個別に添加した。10分間インキュベートした後、基質ATChおよびDTNB溶液を反応混合物に添加した。室温で10分インキュベートした後、残留活性を、マイクロプレートリーダーを用いて412nmにおいて決定した。
AChE活性阻害(%)=〔(ΔA0-ΔAS)/ΔA0〕×100
式中、ΔA0は、陽性対照の吸収の変化を表し、ΔASは、殺有害生物剤を適用してインキュベートした溶液の吸収の変化を表わす。阻害活性曲線により確立された直線式に基づき、AChEのIC50の数値(活性を50%阻害するのに必要とされる濃度)を計算した[12]。
多重種AChE検出プラットフォームに適用された殺有害生物剤および濃度を区別するために、Extreme Gradient Boosting(XGBoost)モデルを開発した。XGBoostモデルを訓練およびテストするために、所定の濃度を有する殺有害生物剤毎に多重種AChE検出から得られた光学濃度データを、7つのAChEに由来する読み取りおよび3つの細胞濃度を含む21パラメーターデータセットに編成した。実験を3回繰り返して得られた合計120個のデータセットを、訓練セット(106)とテストセット(14)に分割した。サイキット・ラーン(scikit-learn)を使用するPython内でモデルを構築するために、106個の訓練セットを使用した。テストデータセットを使用してアウトカムモデルを確認し、同定の正確性を評価した。
昆虫細胞表面発現用として高感受性AChE変異体および異なる種に由来する7つのAChEを合成した
キイロショウジョウバエ由来のAChEを、本出願における酵素として選択し、この酵素をコードするオリゴヌクレオチド(バキュロウイルス-昆虫系に対してコドン最適化されている)を合成した。酵素感受性を高めるためにY408F変異を合成遺伝子に導入したが、それは酵素感受性の最大12倍の増加を示した[11]。この組換え酵素を発現させるために2つのコンストラクトを生成した(図1)。コンストラクトpAChE-FLは、完全長AChE(Y408F)、タンパク質分泌用のN末端ミツバチメリチンシグナルペプチド(HM)、および六量体ヒスチジンタグ(6H)を含み、これらはいずれも、hr1-hsp70(すなわち、hr1エンハンサー配列と融合したhsp70プロモーター)およびp10プロモーターを含有するデュエルプロモーターの下に置かれる(図1、パート(a))。C-末端GPI係留部位が欠失し、バキュロウイルスGP64タンパク質由来のTMおよびCTDと融合し、同一の発現ベクターpABEGhhp10(図1、パート(c))の下に置かれている他のコンストラクト、pAChE-6MC(図1パート(b))も生成される。GP64のTMおよびCTDで置換すれば、バキュロウイルスのエンベロープおよび昆虫細胞の表面への組換えタンパク質の係留が改善することが報告されている12-14。
2つの組換えバキュロウイルスvAChE-FLおよびvAChE-6MCをそれぞれ生成して、AChE-FLおよびAChE-6MCを発現させた。空ベクターpABEGhhp10も、陰性対照として組換えウイルスを生成するのに使用され、Cont-bacと命名された(図1、パート(c))。High Five(Hi5)細胞は一般的に使用される昆虫細胞においてより高レベルの組換えタンパク質を発現することができたので、Hi5昆虫細胞を酵素発現用として使用した。さらに、細胞を無血清培地内で順応させ、したがって、最終酵素反応は血清干渉がない状態で実施され得る。96ウェルプレート内で、0.5のMOIを用いてHi5細胞を感染させるために、20個の単一ウイルスのそれぞれをvAChE-FLおよびvAChE-6MCから選択し、4つの単一ウイルスをCont-bac用として選択し、感染後3日目(dpi)にそのAChE活性をアッセイした。酵素活性の標準曲線を確立するために、AChE標準溶液を0~1000mU/mLの範囲に稀釈した(図2、パート(a))。Cont-bac感染細胞は基質アセチルコリンおよび発色剤DTNB溶液(図2、パート(b))と反応した後、ほとんど透明な色を呈したように、vAChE-FL(図2、パート(c))およびvAChE-6MC(図2、パート(d))単一ウイルスに感染した細胞は、いずれも目視可能な黄色を呈し、平均60~80mU/mLの酵素活性にそれぞれ変換された。各コンストラクトにおいて最高活性を示す1つの単一ウイルスを次の実験用として選択した。
細胞表面に提示されたAChEは高い酵素活性を示したが、細胞含有培地は輸送に不便である。この問題を解決するために、培地を除去し、なおもウェルに付着している細胞を凍結乾燥プロセスに付した。本発明者らの細胞表面発現型AChEが凍結真空乾燥プロセスに耐えることができるか知るために、Hi5細胞を、0.5のMOIを用いて、AChE-FL、AChE-6MC、またはCont-Bacをそれぞれ発現するウイルスに3日間感染させ、次に96ウェルプレート上の細胞試料を凍結乾燥に付した。凍結乾燥の前後両方において、顕微鏡検査により細胞形態を観察した。3つのウイルスコンストラクト、vAChE-FL、vAChE-6MC、およびCont-Bacのすべては、EGFPレポーター遺伝子を駆動するpagプロモーターを含有するので、これら3ウイルスに感染した細胞は、模擬的感染細胞が蛍光を示さないのに対して緑色蛍光を示す(図3、パート(a))。凍結乾燥の後、該細胞試料のいずれも収縮した細胞形態を示したが、しかしこれら3つの感染細胞はなおも強い緑色蛍光を維持した(図3、パート(a))。これら細胞試料のAChE活性を分析し、凍結真空乾燥プロセスは、AChE-FLおよびAChE-6MCについて酵素活性を失活させることもなく、またCont-Bacのバックグラウンドの読み取りを増加させることもなかったことが判明した(図3、パート(b))。
凍結乾燥条件を決定した後、本発明者らのAChE発現細胞試料についてウイルス感染条件の最適化を目指した。Hi5細胞を、組換えウイルスvAChE-FL、vAChE-6MC、およびCont-Bacに、0.1、0.5、1、2、および10のMOIを用いて、三重で個別に感染させた。3dpiにおいて、すべての感染細胞試料を凍結乾燥に付し、次にAChEの活性を決定した(図4、パート(a))。vAChE-FLに感染した細胞試料のいずれも、vAChE-6MCに感染した試料よりもわずかに高いAChE活性を示したが、両ウイルスに関する感染細胞は、MOIが高いほどAChE活性は減少するという傾向を示し、これはvAChE-6MCに感染した細胞に特に当てはまる(図4、パート(b))。Cont-bac感染細胞の場合、決定されたすべてのMOIは活性において有意差を示さなかった(図4、パート(b))。これらの結果に基づき、MOI=0.1を、AChEを提示させるための標準的感染条件として使用した。
本出願の一実施形態に基づく細胞ベースのAChEがOP系およびCB系殺虫剤を判別するその能力を評価するために、2つのOP系(例えば、パラオキソンエチルおよびマラオキソン)および2つのCB系(例えば、カルボフランおよびカルバリル)殺虫剤化合物を本発明者らの系においてテストし、検出能力を標準として用いた精製AChE(Abcam社)と比較した(図5)。組換えバキュロウイルスvAChE-FLおよびvAChE-6MCによりAChEを細胞表面提示させた場合、それらはAChEを細胞上に適切に提示でき、正確且つ容易にOP系およびCB系殺有害生物剤を検出するのに好都合であることが明らかとなった。比較する際には、Sichen Inc.社より販売されている台湾において最も一般的なAChE殺虫剤診断キットを使用した試験結果も含まれ、すべてのテスト試料のIC50についても計算した(表1)。Sichen社の場合、AChEをハエから得ており、また測定にはキュベット(1mL)も使用しなければないので、したがって多量のAChEが使用されるはずである。さらに、Sichen社は、分光光度計を使用して発色反応を測定するように提案している。しかしながら、本出願においては、ハエを飼育する必要がなく、またAChEを精製する必要もない。検出には、100μLの溶液しか必要とせず、且つ取扱いが容易な96ウェルプレートが適用され、残留殺有害生物剤を検出する場合、肉眼により読み取り可能である。
6つのAChE(vHsAChE、vRnAChE、vAmAChE、vSfAChE、vDamAChE、およびvBdAChE)に関する組換えバキュロウイルスを生み出した後、Hi5細胞をvDmAChEおよびこれらのウイルスにそれぞれ感染させた。感染から3日後、感染細胞を細胞スクレーパーにより培養プレートまたはフラスコから削り取り、DPBSに懸濁した。AChE酵素濃度を調整するために、各96ウェルに添加される細胞数を変化させた。最初の細胞数を細胞カウンターによりカウントし、希釈または濃縮により3つの異なる細胞濃度を調整した。図7では、細胞5×103個、1.5×104個、および4.5×104個/ウェルの細胞濃度を使用した結果を示した。殺有害生物剤を添加した後、AChE活性が阻害されれば、黄色の発色(412nmにおける吸収により決定可能である)の減少を引き起こす。異なる初期濃度を有する7つのAChEは、クロルピリホスおよびエチオンを含むOP、ならびにカルバリル、カルボフラン、およびメトミル殺有害生物剤を含むCBに対して様々な感受性を示した(図7)。
多重種AChEはテストされた殺有害生物剤に対して異なる感受性を示したので、所定の濃度を有する殺有害生物剤に関するアウトカム光学濃度データは、7つのAChEおよび3つの細胞濃度から得られる21の読み取りを含む同定パネルとなり得る(図8、パート(a))。殺有害生物剤同定モデルを開発するために、実験を3回繰り返して得られた合計120個のデータセットを使用した。XGBoostにより構築されたモデルを訓練するために、106個の訓練セットをアルゴリズムにインプットし、同定の正確性を評価するために14個のテストセットを使用した(図8、パート(b))。モデルは、より多くの決定要素をインプットすること、および正確性を改善することにより継続して訓練され得る。
OP系およびCB系殺虫剤は、農学品種に適用される一般的な化学殺有害生物剤であり、作物汚染を頻繁に引き起こし、またヒトの健康を脅す。本出願において、バキュロウイルスを使用して、OP系およびCB系殺虫剤に対して高感受性のAChE変異体を細胞表面に提示させることにより、これら殺虫剤を好都合に検出するための、測定を支援する分光光度計の必要の有無にかかわらない新規決定プラットフォームが、開発された。いくつかの条件、例えばウイルス感染のためのMOIおよび凍結乾燥等も、システムを最適化するために検討された。注目すべきことには、GP64のTMおよびCTDに置き換えることで、殺虫剤残留物に対する表面提示型AChEの感受性が改善することが判明した。
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以下に列挙するおよび本明細書で引用された参考資料は、本明細書が明示的に別途規定しない限り、本明細書により参考として本明細書に組み込まれている。
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Claims (21)
- 殺有害生物剤を検出するin vitroの方法であって、
(a)試料を、細胞表面に発現しているアセチルコリンエステラーゼと接触させること、
(b)アセチルコリンエステラーゼ基質を、前記細胞と接触させること、および
(c)前記アセチルコリンエステラーゼ基質に起因する反応生成物を検出すること、
を含み、
前記アセチルコリンエステラーゼが、
GPI係留部位が欠失しており、バキュロウイルスGP64タンパク質由来の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質ドメイン(CTD)に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼである、前記方法。 - アセチルコリンエステラーゼ基質が、アセチルコリン、アセチルチオコリン(ATCh)、プロピオニルチオコリン、またはアセチル-3-メチルコリンを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)の前に、反応生成物を形成させるために蛍光指示薬を添加することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 蛍光指示薬が、5,5’-ジチオ-ビス-[2-ニトロ安息香酸](DTNB)、ジチオジニコチン酸(DTNA)、2,2’-ジチオジピリジン(2-PDS)、ヒドロキシルアミン、ペルオキシダーゼと結合したコリンオキシダーゼ/フェノール/アミノアンチピリン、AuCl4の存在下でのAu-NPシード、レゾルフィンブチレート、酢酸インドキシル、N-[4-(7-ジエチルアミノ-4-メチルクマリン-3-イル)フェニル]マレイミド、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(Amplex Red試薬)、量子ドット(QD)、チオールグリーン指示薬またはAbRed指示薬を含む、請求項3に記載の方法。
- 蛍光指示薬がDTNBであるという条件で、反応生成物が2-ニトロ-5-チオ安息香酸(TNB)である、請求項4に記載の方法。
- 殺有害生物剤の濃度に対するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害の標準曲線を参照することにより、前記殺有害生物剤を定量することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- アセチルコリンエステラーゼが配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 殺有害生物剤が、アセチルコリンエステラーゼをリン酸化またはカルバモイル化する化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 殺有害生物剤が有機リン酸エステル(OP)またはカルバメート(CB)を含む、請求項8に記載の方法。
- 2種以上のアセチルコリンエステラーゼが異なるウェル中の細胞上に独立に提示される、請求項1に記載の方法。
- 2種以上のアセチルコリンエステラーゼの反応生成物に基づき、殺有害生物剤を同定することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 2種以上のアセチルコリンエステラーゼが異なるアセチルコリンエステラーゼ変異体または異なる生物に由来するアセチルコリンエステラーゼである、請求項10に記載の方法。
- フィンガープリントライブラリーとして異なる殺有害生物剤の発色パターンを記録することをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- フィンガープリントライブラリーを比較することにより、未知の殺有害生物剤の濃度および種を同定することをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 機械学習により、異なる発色パターンを有する殺有害生物剤の濃度および種を同定することをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 機械学習が、ロジスティック回帰分析、デシジョンツリー(Decision Tree)、サポートベクターマシン(Support Vector Machine)、RandomまたはeXtreme Gradient Boostingを含むソフトウェアにより実施される、請求項15に記載の方法。
- アセチルコリンエステラーゼが異なるウェル中の細胞上に様々な活性で独立に提示される、請求項1に記載の方法。
- 様々な活性を有するアセチルコリンエステラーゼを発現させるために異なる細胞濃度が使用される、請求項17に記載の方法。
- 殺有害生物剤を検出するためのキットであって、
細胞上で発現されるアセチルコリンエステラーゼ、および
アセチルコリンエステラーゼ基質
を含み、
前記アセチルコリンエステラーゼが、GPI係留部位が欠失しており、バキュロウイルスGP64タンパク質由来の膜貫通ドメイン(TM)および細胞質ドメイン(CTD)に置き換わっているアセチルコリンエステラーゼである、
前記キット。 - 蛍光指示薬をさらに含む、請求項19に記載のキット。
- 殺有害生物剤が有機リン酸エステル(OP)またはカルバメート(CB)を含む、請求項19に記載のキット。
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