JP7197755B2 - 循環血清マイクロrnaバイオマーカー及び方法 - Google Patents
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Description
Pre-miRNAは、Exportin-5によって細胞質に輸送され、RNA誘導型サイレンシング複合体中のTRBP、PACTおよびAgo2とともに第2のRNaseIII酵素であるDICERによって処理され、2本鎖のmiRNAを生じる(Kim VN,Nat Rev Mol Cel Biol,2009; Gregory RI,Nature 2004; MAcRae IJ,PNAS,2008)。2本鎖のmiRNAのガイド鎖は、分離してAgo2と結合し、リボ核粒子へ取り込まれて遺伝子サイレンシングを媒介するRNA誘導型サイレンシング複合体RISCを形成する。miRNAのメカニズムは、mRNAの直接分解またはサイレンシングと翻訳の抑制から転写後の上方調節に及ぶ。(MacRae IJ,PNAS,2008.)
循環miRNAは、細胞溶解またはアポトーシス(細胞自然死)の結果としての損傷組織からの受動的漏出、エキソソームなどの微小胞を介した細胞からの能動輸送、またはRISCタンパク質複合体内での結合に由来すると理解される(Etheridgeら,2011)。小型RNA分子の脳およびCNSへのエキソソームおよび浸透圧ポンプ媒介送達は、miRNAに基づく療法の限界を克服する解決策を提供する(Alvarez-Ervitiら,2011; Kovalら,2013,Hum.Mol.Gen)。miRNAは、きわめて安定であることが実証されたので、潜在的バイオマーカーである有力な候補として存在する(Chenら,2008; Grasso,2014)。
Etheridgeら,2011 Alvarez-Ervitiら,2011 Kovalら,2013,Hum.Mol.Gen Chenら,2008 Grasso,2014発明の概要
本発明の他の目的は、パーキンソン病に罹患している患者を判定する方法を提供することである。
これらの1つの目的および他の目的は、パーキンソン病に罹患している患者を判定するために、単独で、対で、または組み合わせて使用され得るmiRNAバイオマーカーを提供する本発明によって達成される。
PDのための可能なバイオマーカーについてのこの研究では、2段階手順を適用した。最初の発見段階では、16人の患者および8人の対照からの血清をランダムに選択した。残りの164人のPD患者およびこの研究に適格であった182人の対照が、確認のために選択された。
血清サンプルを臨床検査と同じ日に採取し、ドライアイスにより摂氏-70度で凍結保存し、ニューヨークの施設に輸送した。
血清サンプルからのRNA単離およびQC
氷上で解凍した後、24個の血清サンプル(8個の対照、16個のPDサンプル)を3000xgで5分間スピンダウンして破片を除去した。上清を用い、miRCURY RNA Isolation Kit - Biofluids(Exiqon,MA)を使用して小さなRNAの単離を行った。RNA単離の前に、溶解緩衝液を0.267fmol/ulのスパイクインコントロールcel-miR-39-3p(Qiagen,CA)でスパイクした。RNA単離工程の残りの部分は、メーカーのプロトコルに従って実施し、単離したRNAをNanodrop 2000(Thermo Scientific,MA)で定量した。このRNAを用いて、Affymetrix v4マイクロRNAマイクロアレイチップを実施し、その後のcDNA合成およびqPCRも行った。上記のように434の血清サンプル(NYPUM研究の22の対照および42のPD、Park Westプロジェクトの190の対照および180のWD)由来のRNAを単離したが、これらはNanodropによって定量化されなかったが、これらの試料から得られたqPCRデータは、参照用小RNAであるscaRNA17により正規化された。
24の患者の血清サンプルから単離されたRNAを定量し、ゲイルム分析のためのYale Center(http://medicine.y3le.edu keci/ycgaindex.aspx)によってAffymetrix GeneChip(登録商標)miRNA 4.0アレイに供した。Affymetrix Expression Consoleソフトウェアから得られた正規化されたCELファイルは、Partek Genomics Suiteバージョン6.6 Copyright 2012(Partek,MO)にインポートされ、分析された。「マイクロRNA発現ワークフロー」を用い、ANOVAを用いて差異的に発現したmiRNAを検出し、対照との比較でPDコホートにおいて有意に(p <0.05)発現したmiRNAのリストを示した。検出されたmiRNAをさらなるqPCR検証に使用した。
miRNA特異的qPCRのためのcDNAは、qScript(商標)microRNA cDNA Synthesisキット(Quanta Biosciences,MD)を用いてメーカーのプロトコルに従って合成し、次いで各qPCRを、miRNA特異的フォワードプライマー(表#)およびPerfeCTa(登録商標)ユニバーサルPCRプライマー(Quanta Biosciences,MD)を用いて行った。scaRNA17およびU6は、qPCR Cq値を正規化するための参照用小RNAとして使用したが、cel-miR-39-3pはスパイクインコントロールとして使用した。
PeriCTa(登録商標)SYBR(登録商標)GREEN SuperMix for IQ(商標)(Quanta Biosciences,MD)を、MyiQ(商標)単色リアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad、CA)のすべてのqPCRに使用した。cel-miR-39-3pの標準曲線を、R2=0.97882およびPCR効率92.96%の条件でMS Excelで分析した。必要に応じて、テンプレート制御なし(NTC)が暗示された。
PD診断に関する各miRNAの識別能力は、IBM SPSS Statistics、バージョン21を用いたROC分析から評価した。miRNAの組み合わせについて、試験変数は、結果としてのPD診断(yes/no)へのロジスティック回帰から予測された確率とした。適合(fit)に及ぼす異常値の影響を最小限に抑えるために、対数変換したmiRNA値を用いてロジスティック回帰を行った。
hsa-miR-548ac, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-548x-3p, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-548ae, hsa-miR-3910-1, hsa-miR-4708-3p, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-603, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-4797-5p, hsa-miR-548aj-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-548ap-3p, hsa-miR-1184, hsa-miR-2277-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548aa, hsa-miR-548t-3p, hsa-miR-221-5p, hsa-miR-190a-3p, hsa-miR-6873-5p, hsa-miR-155-3p, hsa-miR-510-5p, hsa-miR-4313, hsa-miR-3616, hsa-miR-8075, hsa-miR-4306, hsa-miR-6776, hsa-miR-6075, hsa-miR-8052, hsa-miR-532, hsa-miR-4791, hsa-miR-320b-1, hsa-miR-548y, hsa-miR-7973, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-606, hsa-miR-500a-3p, hsa-miR-4788, hsa-miR-4769-3p, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-4431, hsa-miR-6749-5p, hsa-miR-138-2-3p, hsa-miR-1289-2, hsa-miR-548au, hsa-miR-6850, hsa-miR-561, hsa-miR-34b-5p, hsa-miR-3934-5p, hsa-miR-6739-5p, hsa-miR-4325, hsa-miR-4672, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-4685-5p, hsa-miR-3160-1, hsa-miR-3160-2, hsa-miR-6793-5p, hsa-miR-8089, hsa-miR-6081, hsa-miR-892b, hsa-miR-936, hsa-miR-548ag, hsa-miR-345, hsa-miR-548k, hsa-miR-3188, hsa-miR-18lb-5p, hsa-let-7e, hsa-miR-4487, hsa-miR-509-3p, hsa-miR-3689a-3p, hsa-miR-4771, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-3150b, hsa-miR-6782-5p, hsa-miR-937-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-6865-3p, hsa-miR-4749-5p, hsa-miR-378b, hsa-miR-7706, hsa-miR-4445 及び hsa-miR-2355-5p
hsa-miR-548ac, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-548x-3p, hsa-miR-548ae, hsa-miR-4708-3p, hsa-miR-16-2-3p, hsa-miR-603, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-4797-5p, hsa-miR-548aj-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-548ap-3p, hsa-miR-1184, hsa-miR-2277-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548aa, hsa-miR-548t-3p, hsa-miR-221-5p, hsa-miR-190a-3p, hsa-miR-6873-5p, hsa-miR-155-3p, hsa-miR-510-5p, hsa-miR-4313, hsa-miR-4306, hsa-miR-8052, hsa-miR-4791, hsa-miR-7973, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-606, hsa-miR-500a-3p, hsa-miR-4769-3p, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-6749-5p, hsa-miR-138-2-3p, hsa-miR-34b-5p, hsa-miR-3934-5p, hsa-miR-6739-5p, hsa-miR-4325, hsa-miR-215-5p, hsa-miR-4685-5p, hsa-miR-6793-5p, hsa-miR-936, hsa-miR-548ag, hsa-miR-548k, hsa-miR-18lb-5p, hsa-let-7e, hsa-miR-509-3p, hsa-miR-3689a-3p, hsa-miR-4771, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-6782-5p, hsa-miR-937-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-6865-3p, hsa-miR-4749-5p, hsa-miR-378b 及び hsa-miR-2355-5p
hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-3910-1, hsa-miR-3616, hsa-miR-8075, hsa-miR-6776, hsa-miR-6075, hsa-miR-532, hsa-miR-320b-1, hsa-miR-548y, hsa-miR-4788, hsa-miR-4431, hsa-miR-1289-2, hsa-miR-548au, hsa-miR-6850, hsa-miR-561, hsa-miR-4672, hsa-miR-3160-1, hsa-miR-3160-2, hsa-miR-8089, hsa-miR-6081, hsa-miR-892b, hsa-miR-345, hsa-miR-3188, hsa-miR-4487, hsa-miR-3150b, hsa-miR-7706 及び hsa-miR-4445
これらの差異的に発現した各miRNAの配列を、対照として用いた参照/ハウスキーピング小RNAであるcel-miR-39-3p U6およびScaRNA17とともに、以下の表1-1から1-5に示す。Cel-miR-39-3pはスパイクイン対照で、RNA試料の安定性を実証する。U6およびScaRNA17は、残りのmiRNA又は候補miRNAの読み取り値を正規化するための内部対照として用いられる。
hsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3pおよびhsa-miR-6865-3pの各PARKmiRについて、PD患者と健常対照との間の平均比率(mean fold change)を下記の表2に示し、図1に示す。
実施例2のqPCR技術を用いて潜在的な診断バイオマーカーを同定した。hsa-miR-335-5pとhsa-miR-6865-3pの組み合わせはPD診断の予測可能性が高いことが、判明した。hsa-miR-335-5pおよびhsa-miR-6865-3pを有するモデルの、アウトカム=PD(YES/NO)、n=(164の患者+182の対照)における結果を、以下の表3に示す。
実施例3のプロトコルに従って分析し、hsa-miR-335-5pおよびhsa-miR-3613-3pの組み合わせもPD診断の高い予測可能性を示すことが判明した。hsa-miR-335-5pおよびhsa-miR-3613-3pのモデルの、アウトカム=PD(YES/NO)、n=(164の患者+182の対照)における結果を、上記の表3に示す。
上記の表3は、hsa-miR-335-5pが、アウトカム=PD(YES/NO)、n=(164の患者+182の対照)においてPD診断の高い予測可能性を示すことを示している。
hsa-miR-3613-3pもまた、上記の表3に示すように、PD診断の高い予測可能性を示す。モデルからの確率と真の疾患状態との比較に基づくROC分析は、図4に示すように強い識別能力を示す。図4の曲線下側の面積を上記表3に示す。
同様に、hsa-miR-6865-3pはまた、上記の表3に示すように、PD診断の高い予測可能性を示す。モデルからの確率に基づくROC分析および強い識別能力を示す真の疾患状態との比較を図5に示す。図5の曲線下側の面積を表3に示す。
実施例2のqPCR技術を用いて、実施例2の診断バイオマーカーを検証した。hsa-miR-335-5pおよびhsa-miR-6865-3pの組み合わせは、PD診断の予測可能性が高いことが判明した。 hsa-miR-335-5pおよびhsa-miR-6865-3pのモデルについて、アウトカム= PD(YES/NO)、n=(42の患者+22の対照)の場合の結果を、以下の表4に示す。
実施例3のプロトコルに従って分析し、hsa-miR-335-5pとhsa-miR-3613-3pの組み合わせもPD診断の高い予測可能性を示すことが判明した。hsa-miR-335-5pおよびhsa-miR-3613-3pのモデルの、アウトカム=PD(YES/NO)、n=(42の患者+22の対照)における結果を表4に示す。
実施例3のプロトコルに従って分析し、hsa-miR-3613-3pおよびhsa-miR-6865-5pの組み合わせもPD診断の高い予測可能性を示すことが判明した。hsa-miR-3613-3pおよびhsa-miR-6865-5pのモデルの、アウトカム=PD(YES/NO)、n=(42の患者+22の対照)における結果を表4に示す。
実施例3のプロトコルに従って分析し、hsa-miR-hsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3pおよびhsa-miR-6865-5pの組合せもPD診断の高い予測可能性を示すことが判明した。hsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3pおよびhsa-miR-6865-5pのモデルの、アウトカム=PD(YES/NO)、n=(42の患者+22の対照)における結果を、上記の表4に示す。
複数の生物情報学ツールを用いたhsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3pおよびhsa-miR-6865-3p標的の分析から、とりわけ、LRRK2およびParkinがhsa-miR-335-5pの予測標的であり、SNCAがhsa-miR-3613-3pの予測標的であることが示される。hsa-miR-335-5pレベルの調節の結果としてのSHSY-5Y細胞におけるLRRK2発現の調節は、ウェスタンブロット分析によって確認された。hsa-miR-335-5pを、神経芽腫細胞に導入(transfect)されたhsa-miR-335-5pの模倣物およびアンタゴミルを用いて過剰発現させ(図6A)、阻害した(図6A)。導入(transfection)の48時間後に細胞を溶解し、ウェスタンブロット分析に使用した。hsa-miR-335-5p模倣物はLRRK2の下方調節を示し、hsa-miR-335-5pアンタゴミアはLRRK2の上方調節を示した(図6B,C)。hsa-miR-3613-3pは、適度にSH-SY5Y細胞におけるSNCA発現を調節した。hsa-miR-335-5pと同様の実験的アプローチがhsa-miR-3613-3p(図6D)に適用され、その結果、タンパク質レベル(図6E,F)および転写レベル(図6G)において、hsa-miR-3613-3p模倣物で中程度のSNCA上方調節を示し、 miR-3613-3pアンタゴミルで中程度のSNCA下方調節を示した。
a.hsa-miR-335-5p調節の結果としての異なる発現パターンを有するタンパク質としては、acadsb,slc4a7,lnp/kiaa1715,supt5h,sdhd,Wdr1,cmpk1,slc25a1,hmgcs1,twf2,ppp1r18,exoc8,tm9sf4,kif16b,dnajc2,selll,hectd1,gmppbなどがある。
b.hsa-miR-3613-3p調節の結果としての異なる発現パターンを有するタンパク質としては、wdr1,gmppb,hmbs,eml4,hebp1,apmap/c20orf3,sord,pcyt2,stat3,top2a,skiv212,cdc20,myo1e,ttll12,atad2,carm1,arfgap1,ppp4r1,nde1/nde11などがある。
c.hsa-miR-6865-3p調節の結果としての異なる発現パターンを有するタンパク質としては、wdr1,ppplr18,ppp4r1,ube2h,ube3c,stx16,ube4h,gtf2f1,map1b,ube2a,dusp3,arhgap1,nsun2,acox1,fkbp10,fam107b,pofut1,tomm22,hspb8,sbdsなどがある。
患者からの血清中の2つ以上のmiRNAの組み合わせのレベルの測定は、潜在的なPD患者と健常者とを明確に区別するのを助けることができる。PDの疑いのある患者から採取した血液から血清サンプルを得る。血清は、全マイクロRNA単離および濃縮のために使用される。次いで、このRNAをqPCRを用いて試験して、実施例1に記載の85個のmiRNAのいずれか2個以上、または実施例5~7に記載の3個のmiRNAのいずれか1個のレベルを測定する。85種のmiRNAのうちの2種以上、または3種のmiRNAのいずれか1種が検出可能なレベルである場合、患者がPDを有することを確認する。必要に応じて、血漿、静脈または動脈血、または腰椎穿刺によって採取されたCSF試料を含む他の試料液を利用することができる。そのような血漿、血液またはCSF試料は上記のように処理される。2つ以上のmiRNAを組み合わせて、または試験マトリックスで使用される組み合わせのセットを測定することにより、望ましくはPD診断の精度が向上することが理解されよう。
診断のためにmiRNAの組み合わせを使用することができるので、コホートに基づく変異を排除するために全ての候補を試験することが望ましい場合がある。関連miRNAのいずれかが検出可能な量存在する場合、PD病理を示すことが理解される。しかしながら、当業者であれば、診断のための人工的閾値を設定するために164v 182サンプルの値を使用することが臨床的に有用であり得ることを認識している。特異的miRNAレベルは、診断および臨床試験で臨床医が使用できる診断バイオマーカーキットを開発するために使用できる。この研究では、血清からのmiRNAの存在および定量は、RNAを増幅および定量するqRT-PCRによって判定された。当業者に公知の他の適切な技術、例えば標識されたアンチセンス配列および標識された抗体の使用など、を代替的に利用してもよい。適切な抗体は、2つの分子間の結合反応、典型的には測定条件下でバックグラウンド分子会合の10~100倍を超える、を参照して優先的に選択可能である。したがって、所定の免疫学的測定条件で、指定された抗体は特定のmiRNA配列に結合し、それによってその存在を同定する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のmiRNAに対するその特異性のために選択される抗体を必要とする。例えば、特定のmiRNAに対して産生された抗体は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって選択することができる。様々な免疫学的フォーマットを使用して、特定のmiRNAと特異的に免疫反応する抗体を選択することができ、例えば、固相ELISA免疫学的検定が用いられる(特定の免疫反応を判定するために用いられ得る免疫学的フォーマットと条件についての記載は、例えば、Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)を参照のこと)。2つの分子が特異的に相互作用するかどうかを判定する方法がここに開示されており、結合親和性および特異性を判定する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988);Friedelder,"Physical Biochemistry:Applications to biochemistry and molecular biology”(W.H.Freeman and co.1976)参照)。用語「抗体」は、本明細書では、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体、例えば、一本鎖抗体、キメラ、二官能性及びヒト化抗体、ならびに、これらの抗原結合フラグメント(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、FvおよびrIgG)を含む。Pierceカタログおよびハンドブック、1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)も参照されたい。また、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York(1998)も参照されたい。 このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えにより産生することができ、または、例えばHuseら,Science,Vol.246(1989)1275-81に記載のように、様々な重鎖と様々な軽鎖からなる組み換えライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。例えば、キメラ、ヒト化、CDR移植、一本鎖および二官能性抗体を作製するためのこれらおよび他の方法は、当業者に周知である(Winter and Harris,Immunol.Today,Vol.14(1993)243-46;Wardら、Nature,Vol.341 (1989)544-46、HarlowおよびLane,supra,1988;Hilyardら,Protein Engineering:A practical approach(IRL Press 1992); Borrabeck,Antibody Engineering,第2版(Oxford University Press 1995))。同定されたRNA配列から単クローン性抗体および多クローン性抗体の両方を産生する方法は、当技術分野で周知である。
多くの神経変性疾患は、症状および病理学的マーカーに関して、互いに密接に関連している。1つの神経変性疾患の循環診断マーカーは、他の疾患の診断に有用であり得る。レヴィ―小体認知症(DLB)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、多系統萎縮症(MSA)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上麻痺(PSP)などの他の神経変性疾患を診断する方法も、上記の候補の類似のmiRNA測定を用いて開発することができる。疾患特異的キットは、[0037]に列挙されたものと同様に、[0019]に列挙されたmiRNAの様々な組み合わせを用いて開発することができる。
1つまたは複数の組み合わせで検出されたmiRNAは、細胞内のいくつかのタンパク質を調節することができる。これらのマイクロRNAおよびその組み合わせを使用して、PDの新規タンパク質標的を見出すことができる。 PD病因におけるこれらのタンパク質の関与をさらに確証して、治療のためにそれらを標的とすることができる。
本発明者らは、ドーパミン作動性ニューロン細胞系におけるhsa-miR-335-5pによるLRRK2の予測される調節およびhsa-miR-3613-3p によるSNCAの予測される調節を、実験により確認した。言及された新規標的を調節するための治療的介入は、RNA干渉技術によって達成することができる。
[0019]に記載されたmiRNAに由来する小さな核酸分子は、PD脳における遺伝子を特異的に標的化することによって治療的に介入して、完全または部分的治療を達成するように設計される。[0040]に示される効果は、脳細胞における正確な標的化のために達成されるであろう。
Claims (7)
- 体液のサンプルにおけるパーキンソン病疾患の判定を補助する方法であって、
前記サンプル中において配列番号2~86からなる群から選択される少なくとも3つのmiRNA の存在を示すレベルを判定するステップであって、前記3つのmiRNAのうち少なくとも2つは配列番号22,25および77からなる群から選択されるステップと、
前記少なくとも2つのmiRNAのうち少なくとも1つのmiRNAの存在を示す前記レベルが健常な対照と比較して1.2倍以上である場合にパーキンソン疾患のリスクが高いと判定するステップと、を含む、方法。 - 体液のサンプルにおけるパーキンソン病疾患の判定を補助する方法であって、
前記サンプル中において配列番号22,25および77からなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAの存在を示すレベルを判定するステップと、
前記少なくとも2つのmiRNAのうち少なくとも1つのmiRNAの存在を示す前記レベルが健常な対照と比較して1.2倍以上である場合にパーキンソン疾患のリスクが高いと判定するステップと、を含む、方法。 - 前記サンプルが血清、血漿または全血である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記miRNAの存在がqRT-PCRを用いて判定される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記miRNAの存在が、標識されたアンチセンスヌクレオチド配列を用いて判定される、 請求項1又は2に記載の方法。
- 前記miRNAの存在が、マイクロアレイプロファイリングを使用して判定される、請求項2に記載の方法。
- 前記miRNAの存在が、ハイスループットNGS配列決定を用いて決定される、請求項2に記載の方法。
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