JP7179875B2

JP7179875B2 - 神経幹細胞培養液を有効成分として含む抗老化又はしわ抑制用化粧料組成物及びその製造方法

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Publication number: JP7179875B2
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Inventors: ソンホイホン; インシクファン
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Description

本発明は高濃度のＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）、ＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）及び低濃度の多様なマトリクスメタロプロテイナーゼを有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能に優れた神経幹細胞培養液の製造方法に関するもので、より詳しくは真皮内コラーゲンの分解に関与する多様な種類のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現を減少させるとともに活性を抑制することができるＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を高濃度に含む神経幹細胞培養液の製造方法に関するものである。

皮膚は外部環境から人体を保護し、多様な生理的機能を担当する。皮膚は、大別して総３個の層である表皮、真皮及び皮下脂肪層から構成されている。表皮は主に角質を形成する細胞とメラニン色素を生成するメラニン細胞とから構成され、真皮は主にコラーゲン及びエラスチン弾力線維から構成されている結合組織と基質からなっており、筋肉、毛嚢、血管、神経などがその中に含まれる。

皮膚老化の原因はお年の増加につれて発生する内部的原因と外部環境などによって誘発される外部的原因とがある。皮膚しわの形成と密接な連関があるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）は皮膚の線維芽細胞で生成されて真皮の９０％を構成し、年齢及び紫外線のような外部刺激によって減少すると知られている（S.D. Shapiro., Curr. Opin. Cell Biol.,10, 1996; Naylor EC et al., Maturitas,2011）。老化が進行するか外部紫外線に持続的に露出されるとき、コラーゲンを含む結合組織を分解するマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｒｐｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現及び活性の増加によって皮膚の真皮組職内のコラーゲン分解を促進させることがコラーゲンの含量が低下する原因と知られている（A. Mauviel., J Cell. Biochem.,1993; T Quan et al., J Investig Dermatol Symp Proc. 2009）。ここで、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現調節は転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ）ＡＰ－１とＮＦｋＢがマトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子のプローモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に作用すると知られている（G.J. Fisher & J.J. Voorhees., J Investig Dermatol Symp Proc.,1998; K. Abeyama et al., J Clin. Invest. 2000）。また、組職内コラーゲンの恒常性維持の際、マトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制するＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の均衡が重要に作用する。

ＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）は１型、２型、３型、４型が存在し、生体内に存在するマトリクスメタロプロテイナーゼの抑制剤の役割をする。この中で、ＴＩＭＰ－１は、コラゲナーゼタイプＩＶのうち、９２ｋＤａのＭＭＰ－９の潜伏型（ｐｒｏｆｏｒｍ）及びＭＭＰ－１と結合してＭＭＰを非可逆的に抑制すると知られており、ＴＩＭＰ－２は、コラゲナーゼタイプＩＶのうち、７２ｋＤａのＭＭＰ－２の潜伏型（ｐｒｏｆｏｒｍ）と活性型（ａｃｔｉｖｅｆｏｒｍ）と全部結合し、特に全てのマトリクスメタロプロテイナーゼの活性型を抑制すると報告されている（Y.A. Declerck et al., Biochem. J. 1993; W. Bode et al., Ann. NY Acad Sci. 1999）。

また、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）はしわ生成に関与する重要な線維組職であり、コラーゲンとともに皮膚弾力に関与すると知られており、エラスチンの分解はエラスターゼという酵素の影響によって調節されると知られている（J.H. Chung et al., J. Invest. Dermatol., 117, 2001）。

したがって、本発明者らは皮膚しわの改善及び防止と皮膚弾力の増進が可能な組成物を開発しようと鋭意努力した結果、成体幹細胞である神経幹細胞を培養して、皮膚内のコラーゲン合成の阻害及び分解を促進する多様なマトリクスメタロプロテイナーゼの機能を非可逆的に抑制するＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２が高濃度で存在し、多様なマトリクスメタロプロテイナーゼが低濃度で存在する神経幹細胞の培養液組成物を製造することができることを確認し、本発明を完成することになった。

本発明の目的は、コラーゲンの生成を抑制するマトリクスメタロプロテイナーゼを低濃度で含み、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制して、コラーゲンとエラスチンの合成を回復させることができるＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を高濃度で含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法及び前記培養液を含む化粧料組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させる段階と、（ｂ）前記不死化神経幹細胞を非誘導性培地で培養して培養液を収得する段階とを含む、ＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）及びＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）を有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法を提供する。

また、本発明は、ＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液を有効成分として含む皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物を提供する。

また、本発明は、ＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液を用いた皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進方法を提供する。

また、本発明は、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進に使うためのＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液の用途を提供する。

また、本発明は、皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物の製造に使うためのＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液の用途を提供する。

神経幹細胞培養液でヒト体細胞を処理するとき、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）がないことをＷＳＴ－１で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによって増加した活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）が減少することを蛍光マイクロプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）で測定した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによって増加した活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）が減少することを蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で分析した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が抑制されることをｑＰＣＲで確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が抑制されることをウェスタンブロット法で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの活性が抑制されることをザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによって減少したコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）が再び増加することを確認した図である。神経幹細胞培養液内でマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制するＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２を確認した図である。組み換えタンパク質ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２及び神経幹細胞培養液をＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２抗体でブロッキングした（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）後、マトリクスメタロプロテイナーゼの活性抑制を確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって増加したしわが再び減少することを肉眼で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって増加したしわが再び減少することをしわ部位面積の測定で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって増加したＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）が減少することを確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって減少した真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）が再び増加することを確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が減少することを免疫蛍光染色で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が抑制されることを確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの活性が抑制されることを確認した図である。神経幹細胞培養液がマトリクスメタロプロテイナーゼの発現を調節する転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ）のうちＮＦｋＢによって調節されることを確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、転写因子の減少によって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の生成が回復されることを確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）をＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって回復することをウェスタンブロット法で確認した図である。神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで確認した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれの老化抑制及びしわ生成抑制の効果を比較したもので、（ａ）は細胞毒性を確認した図、（ｂ）はそれぞれの培養液処理時のマトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子のＲＮＡ発現水準を確認した図である。（ａ）は神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれ内で放出されるＭＭＰ－１の量を比較した図、（ｂ）はそれぞれの培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理した後、マトリクスメタロプロテイナーゼタンパク質の量を確認した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液内に存在する（ａ）全体タンパク質の量及び（ｂ）ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２の量を比較した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、（ａ）はＵＶＢによって生成されたしわの抑制程度を肉眼で確認した図、（ｂ）はしわ部位の面積を測定して比較した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、（ａ）はＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現抑制の比較を示した図、（ｂ）は真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の生成又は復元を比較した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって減少した真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）の増加程度を比較した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現の減少を免疫蛍光染色で確認した図である。神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢに露出された雌性ＳＫＨ－１マウスを処理するとき、（ａ）はＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）をＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって回復することをウェスタンブロット法で比較した図、（ｂ）及び（ｃ）はＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで比較した図である。

他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法は当該技術分野でよく知られて通常的に使われるものである。

本発明では、ヒト脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から抽出した神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＣＳｓ）を培養して収得した外胚葉由来の神経幹細胞培養液で紫外線（ＵＶＢ）に露出されたヒト線維芽細胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とマウスを処理した。その後、紫外線（ＵＶＢ）に露出されたヒト線維芽細胞及びマウス皮膚組職において真皮内コラーゲンの分解に関与するＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）、ＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ９）及びＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）の発現及び活性が神経幹細胞培養液によって抑制されることを確認し、このようなマトリクスメタロプロテイナーゼの抑制によってコラーゲンの合成が復旧又は促進されることを確認した。また、前記コラーゲン合成の復旧及び促進によって皮膚しわの改善又は皮膚弾力の増進のための有効成分としてＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２が高濃度で神経幹細胞培養液に含まれていることを確認した。

したがって、本発明は、一観点で、（ａ）脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させる段階と、（ｂ）前記不死化神経幹細胞を非誘導性培地で培養して培養液を収得する段階とを含む、ＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）及びＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）を有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法に関するものである。

本発明において、前記培養液を製造するための神経幹細胞はその種類に制限されない。好ましくは胎児由来の成体幹細胞であり、本発明の具体的な実施例では、胎児脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から抽出した神経幹細胞を使って神経幹細胞培養液を製造した。

本発明において、神経幹細胞培養液とは、外胚葉幹細胞の一種である神経幹細胞を継代培養して収得した細胞から放出される成分を含む物質である。

本発明において、前記神経幹細胞培養液は、ＴＩＭＰ－３又はＴＩＭＰ－４をさらに含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、ＭＭＰ－３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３）及びＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）の発現又は活性を抑制することを特徴とすることができる。

本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液内のＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２成分がマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現及び活性を阻害して、しわの改善及び防止と皮膚弾力の増進に及ぶ影響を確認するために、神経幹細胞培養液から得た上澄み液をサイトカインアレイ及びウェスタンブロット法で確認した。

また、本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液内のＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２成分が活性型マトリクスメタロプロテイナーゼを抑制して、しわ生成の改善及び皮膚弾力の増進に関与することをゼラチンザイモグラフィー（ｇｅｌａｔｉｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）で確認した。

本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液、組み換えタンパク質ＴＩＭＰ－１又はＴＩＭＰ－２をそれぞれ又は一緒に処理するか、抗体によってそれぞれ又は一緒にブロッキングした後、コラゲナーゼタイプＩＶのうち、９２ｋＤａのＭＭＰ－９及び７２ｋＤａのＭＭＰ－２潜伏型（ｐｒｏｆｏｒｍ）と活性型（ａｃｔｉｖｅｆｏｒｍ）に結合してマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制することを確認した。

本発明では、神経幹細胞培養液内のＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２成分のしわ生成改善及び皮膚弾力増進の効果を確認するために、雌性ＳＫＨ－１マウスの背中に、１週から４週まではＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ）を３回／１週で処理した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）及び神経幹細胞培養液を背中にそれぞれ２００μｌ（ｖ／ｖ）ずつ塗布した。その後、５週から１２週まではＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ）を１回／１週で処理した後、ＰＢＳ及び神経幹細胞培養液を２００μｌ（ｖ／ｖ）ずつ塗布した。

本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とすることができる。

本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を抑制するか又はＤＮＡ損傷を復旧することを特徴とすることができる。

本発明で使う用語、‘しわ改善’は皮膚のしわ及び弾力に係る能力を維持又は強化させることを意味する。皮膚の構造のうち真皮層に存在する膠原線維（ｃｏｌｌａｇｅｎ：コラーゲン）と弾力線維（ｅｌａｓｔｉｎ：エラスチン）がその役割をする主要タンパク質であり、皮膚弾力を担う。コラーゲンの生合成は皮膚の内外的影響を受けることになる。具体的に、皮膚内的要因としては、自然老化によって細胞活性が減少し、コラーゲン線維が減少し、外的要因としては、紫外線の過量照射及びストレスなどによって生成された活性酸素種がタンパク質のチオール基（ｔｈｉｏｌ：－ＳＨ）と反応して酵素の活性を阻害するか、コラーゲン、エラスチンなどを分解させる酵素（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１：ＭＭＰ－１）であるコラゲナーゼの発現を増加させて皮膚のしわを増加させるとともに弾力を減少させる結果を引き起こす。

本発明の神経幹細胞培養のための培地は当該分野に知られた基本培地を制限なしに使うことができる。基本培地は人為的に合成して製造することができ、商業的に製造された培地を使うこともできる。商業的に製造される培地の例を挙げれば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、α－ＭＥＭ（α－ＭｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ－ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）及びＩｓｏｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍなどがあるが、これに限定されるものではなく、最も好ましくはＤＭＥＭ培地であることができる。

また、前記基本培地は５～１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むことが好ましく、本発明の具体的な実施例ではＤＭＥＭ培地で培養した。

本発明において、前記非誘導性培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含むことを特徴とすることができる。

本発明の組成物は通常的に使われるどの方法でも製造することができ、神経幹細胞を単離、培養及び分離する過程は本発明の方法に限定されず、当該分野で通常的に行われる方法で実施することができる。

上述したように、本発明による外胚葉由来の神経幹細胞培養液はＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２を有効成分として含むので、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性型マトリクスメタロプロテイナーゼを抑制して、しわの改善及び防止と皮膚弾力の増進のための組成物として使うことができる。

したがって、本発明は、他の観点で、ＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）及びＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）を含む神経幹細胞の培養液を有効成分として含む皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用の化粧料組成物に関するものである。

本発明において、前記神経幹細胞の培養液は、ＴＩＭＰ－３又はＴＩＭＰ－４をさらに含むことを特徴とすることができる。

また、前記神経幹細胞の培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、ＭＭＰ－３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３）、ＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）、ＭＭＰ－７（Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、ＭＭＰ－１０（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）及びＭＭＰ－１３（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を低濃度で含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記神経幹細胞は脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞を不死化させて得る細胞である。本発明の具体的な実施例では、胎児の脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を用い、これを不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌ）させて細胞を得た。これをＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）、及び１％ペニシリンストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地で培養して非接着性細胞を除去した。前記過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を継代培養する過程で培養液を収得し、これを遠心分離し、上澄み液を濾過して収得した。

本発明において、前記神経幹細胞の培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、ＭＭＰ－３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３）及びＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）の発現又は活性を抑制することを特徴とすることができる。

また、本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を抑制するか又はＤＮＡ損傷を復旧することを特徴とすることができる。

前記ＤＮＡ損傷の復旧は、神経幹細胞培養液によってＤＮＡ回復酵素であるＲａｄ５０、Ｒａｄ５１又はＸＲＣＣ４の活性が向上することによってＤＮＡ損傷を復旧することができる。また、神経幹細胞培養液は、ｇａｍｍａＨ２ＡＸをＤＮＡ損傷程度を把握するマーカーとして使うことを特徴とする。

本発明において、‘化粧料組成物’は前記神経幹細胞培養液又は神経幹細胞抽出物を含む組成物であり、その剤形はどの形態でも可能である。このような剤形の例として、前記化粧料組成物を用いて製造した化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ及び噴霧剤からなる群から選択されるいずれか１種の剤形であることを特徴とすることができる。

本発明の目的を達成するために、このような剤形の中でどの剤形にも製造されて商用化することができ、前記例に限定されない。

化粧料組成物に製剤化される場合、前記神経幹細胞培養液の含量は、化粧料組成物の総重量に対して、０．０００１～５０重量％であり、好ましくは０．０１～１０重量％である。最小限の紫外線による皮膚損傷の改善効果を達成することができるように、神経幹細胞培養液の含量は前記最小値以上であることが好ましく、過量添加による使用感低下及び各種の剤形への適用可能性を考慮して、神経細胞培養液の含量は前記最大値以下であることが好ましい。ここで、神経細胞培養液の含量は剤形又は化粧料組成物に含有される成分の含量によって前記範囲内で適宜調節することが好ましい。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分以外に、化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤、そして担体を含む。

本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などを用いることができる。

本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム又はポリアミドパウダーを用いることができ、特にスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。

本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解剤又は乳濁剤を用いる。担体成分は、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガカントなどを用いることができる。

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。

本発明は、さらに他の観点で、ＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液を用いた皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進方法に関するものである。

本発明は、さらに他の観点で、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進に使うためのＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液の用途に関するものである。

本発明は、さらに他の観点で、皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物の製造に使うためのＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を含む神経幹細胞の培養液の用途に関するものである。

実施例
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないというのは当該分野で通常の知識を有する者に明らかであろう。

実施例１：神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物生産

胎児脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させて細胞を得た。

具体的には、１４週になった胎児神経細胞組職を０．１％コラゲナーゼと０．１％ヒアルロニダーゼ溶液で３７℃で１時間処理し、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡで２～３分処理して単一細胞に分離した後、ＣＤ４５－／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４－マーカーを用いてＦＡＣＳによって分離した。これをＮ－２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、０．２ｍｇ／ｍｌヘパリン、２０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ）、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）及び１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦが添加されたヒトニューロスフェア（ｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養培地で培養した。１０～１４日経過の後、形成されたニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）をコラゲナーゼで処理して単一細胞に分離し、レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ）を用いてｖ－ｍｙｃ遺伝子を形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）し、選別（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）して得た細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地で培養した（Flax JD et al., Nature Biotechnology, 16, 1998; Lim H-C et al., Neuroscience Letters 435:175-180, 2008）。１５０ｍｍの培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈｓ）に前記細胞５×１０^５個を分株し、培養培地１５ｍｌを添加した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養し、８０％の細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達したとき、培養液を収得した。ここで、培養培地はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地であり、培養の後、非接着性細胞は除去した。このような過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を継代培養する過程で培養液を収得し、これを遠心分離し、上澄み液を濾過した。

実施例２：神経幹細胞培養液のヒト体細胞に対する細胞毒性確認

ヒト体細胞５×１０^３個を９６－ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、神経幹細胞培養液を２４時間処理した。ＷＳＴ－１を入れ、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定して神経幹細胞培養液の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認した。

その結果、神経幹細胞培養液はヒト体細胞増殖に影響がないことを確認した（図１）。

実施例３：神経幹細胞培養液によるＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種抑制確認

ヒト体細胞５×１０^３個を黒い９６－ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液で２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ^２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）を神経幹細胞培養液が抑制するかを確認するために、１０μＭジヒドロエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ、ＤＨＥ）溶液を入れ、３７℃で３０分間処理し、蛍光マイクロプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。

その結果、神経幹細胞培養液はヒト体細胞でＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種の減少に効果があることを確認した（図２）。

また、２４－ウェルプレート（２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）にカバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）を用いてヒト体細胞を接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液を２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ^２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭで２４時間培養した。ＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）に神経幹細胞培養液が及ぶ影響を確認するために、１０μＭジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）溶液を入れ、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて分析した。

その結果、神経幹細胞培養液はヒト体細胞でＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種の減少に効果があることを確認した（図３）。

実施例４：神経幹細胞培養液によるヒト体細胞でマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性抑制確認

ヒト体細胞がＵＶＢに露出されればコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解が促進される。したがって、本実施例では、このようなコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を確認した。

ヒト体細胞を１００ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液を２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ^２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢに露出されるとき、コラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性に対する神経幹細胞培養液の効果をｑＰＣＲ（図４）、ウェスタンブロット法（図５）及びザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）（図６）を用いて測定した。

その結果、神経幹細胞培養液はＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させる役割をするマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制することを確認した（図４～６）。

実施例５：神経幹細胞培養液のＵＶＢによるコラーゲン分解抑制確認

ヒト体細胞がＵＶＢに露出されればコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解が促進され、このようなコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解促進にはマトリクスメタロプロテイナーゼが関与することを実施例４で確認した。したがって、本実施例では、神経幹細胞培養液によってマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制して、コラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の合成が促進されることを確認した。

実施例４と同様な方法で細胞を準備し、神経幹細胞培養液で２４時間処理して、ＵＶＢによってコラーゲン分解を促進させるのに関与するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制した。その後、神経幹細胞培養液によってマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性が抑制されるコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）をウェスタンブロット法で測定した。

その結果、神経幹細胞培養液がＵＶＢによって促進されるコラーゲン分解に関与するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制すれば、コラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の合成が促進されることを確認した（図７）。

実施例６：マトリクスメタロプロテイナーゼの活性抑制に関与する神経幹細胞培養液内の有効成分（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）ＴＩＭＰ－１／２確認

ヒト体細胞を１５０ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで培養した。４８時間培養して培養液を収得し、タンパク質量が２００μｇになるように試料を準備した後、神経幹細胞培養液内の成分をサイトカインアレイ、特にＲａｙＢｉｏ社のＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙによって分析した。

その結果、神経幹細胞培養液内にＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２が存在することをＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙによって確認し、もう一度ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）で確認した（図８）。

その後、ヒト体細胞を１００ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液及び組み換えタンパク質ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２をそれぞれ又は一緒に２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ^２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢによって促進されるマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を神経幹細胞培養液が抑制するかを分析した。

その結果、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２が含有された神経幹細胞培養液はＵＶＢによって増加するマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制することを確認した（図９）。

実施例７：ＳＫＨ－１マウスにおいて神経幹細胞培養液によるしわ生成抑制確認

７－１：しわ生成抑制効果

雌性ＳＫＨ－１マウスを１２週間ＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２／１回）に露出させ、神経幹細胞培養液で処理した後、１２週にマウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させた。神経幹細胞培養液で処理した群（ｇｒｏｕｐ）でのしわ生成抑制及びしわ改善効果をシリコンレプリカ（ｓｉｌｉｃｏｎｅｒｅｐｌｉｃａ）で分析した。

その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスでしわ生成の抑制及び防止及びしわ改善の効果を現すことを確認した（図１０及び図１１）。

７－２：ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）減少効果

実施例７－１のように組職を準備し、ＵＶＢによって生成されるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）に神経幹細胞培養液が及ぶ影響をＤＨＥ染色で分析した。

その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスで、ＵＶＢによって促進されるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）が減少する効果を現すことを確認した（図１２）。

７－３：コラーゲン及びエラスチン回復効果

実施例７－１のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンに埋め込んで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付けた。その後、ＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンをＭａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及びＶｅｒｈｏｅｆｆ’ｓｅｌａｓｔｉｎ染色でそれぞれ分析した。

その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスでＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンが回復することを確認した（図１３）。

実施例８：ＳＫＨ－１マウスにおいて神経幹細胞培養液によるＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９減少確認

８－１：ＵＶＢによって増加するＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の減少

実施例７－１のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付け、パラフィン除去及び再水和過程（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅａｎｄｒｅｈｙｄｒａｔｅ）を実施した。その後、抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ｃｉｔｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）及び０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００処理を実施し、正常ロバ血清（ｎｏｒｍａｌｄｏｎｋｅｙｓｅｒｕｍ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体を１：１００で２４時間処理した。その後、２次抗体を用いて１時間処理し、ＤＡＰＩ染色を５分間実施した。ベクタシールド封入剤（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｍｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）を用いてスライドに固定させた後、共焦点顕微鏡（ＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で確認した。

その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって増加するＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９が減少することを確認した（図１４）。

８－２：ＵＶＢによって増加するマトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子ＮＦｋＢ

実施例７－１のように組職を準備し、マウス皮膚組職においてＵＶＢによって促進される真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解に関与するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性、そして前記マトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ）の発現をウェスタンブロット法で確認した（図１５～図１７）。また、神経幹細胞培養液がマトリクスメタロプロテイナーゼ及びマトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子によってコラーゲン生成に及ぶ影響を調査した（図１８）。

その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって増加するＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の発現（図１５）と活性（図１６）が減少することを確認した。また、このようなマトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子であるＮＦｋＢも減少することを確認し（図１７）、これによって真皮内のコラーゲンが再び回復することを確認した（図１８）。

実施例９：神経幹細胞培養液によるＤＮＡ損傷抑制及び回復確認

実施例７－１のように組職を準備し、実施例８－１と同様な方法で組職を染色し、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで確認した。また、神経幹細胞培養液がＤＮＡ損傷に及ぶ影響を確認するために、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０をウェスタンブロット法で確認した。

その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）が復旧された。このとき、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって損傷されたＤＮＡが復旧されることを確認した（図１９及び図２０）。

実施例１０：神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液生産

神経幹細胞培養液（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ；ＮＳＣ－ＣＭ）と脂肪幹細胞培養液（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ；ＡＳＣ－ＣＭ）の製造のために、１５０ｍｍ培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈｓ）に前記それぞれの細胞５×１０^５個を分株し、培養培地１５ｍｌを添加した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養し、８０％細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達するとき、培養液を収得した。このとき、神経幹細胞培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンストレプトマイシンを使い、脂肪幹細胞培養培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地を使った。培養の後、非接着性細胞は除去した。このような過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）及び脂肪幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＡＳＣ）を継代培養する過程で培養液を収得し、これを遠心分離し、上澄み液を濾過した。また、それぞれの培養液が細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）がないことをＷＳＴ－１で確認した（図２１ａ）。

実施例１１：ｉｎｖｉｔｒｏで神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現抑制比較

１１－１：マトリクスメタロプロテイナーゼの発現確認

ヒト体細胞がＵＶＢに露出されればコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解が促進される。したがって、本実施例では、このようなコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現を確認し、それぞれの幹細胞培養液内に存在するＭＭＰ－１を確認した。

ヒト体細胞を１００ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液を２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ^２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢに露出されるとき、コラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現に対する神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液の効果をｑＰＣＲ（図２１ｂ）及びウェスタンブロット法（図２２ｂ）で測定した。

その結果、神経幹細胞培養液内でＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させる役割をするマトリクスメタロプロテイナーゼの発現をもっと大きく抑制することを確認した。

１１－２：しわ生成抑制関連因子比較

本実施例では、コラーゲン（ｐｒｏ－ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させる役割をするマトリクスメタロプロテイナーゼ及びこれらの活性を阻害する因子（ＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２）が神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液内に存在するかを確認した。それぞれの培養液内のタンパク質総量をＢｒａｄ－ｆｏｒｄ（図２３ａ）によって確認し、その後、ＲａｙＢｉｏ(R) ＨｕｍａｎｃｙｔｏｋｉｎｅａｎｔｉｂｏｄｙａｒｒａｙでＭＭＰ－１、－２、－３、－７、－９、－１０及び－１３の濃度を分析した（図２２ａ）。また、それぞれの培養液で処理し、ついでマトリクスメタロプロテイナーゼの発現をウェスタンブロット法（図２３ｂ）で分析した。

その結果、神経幹細胞培養液内にはコラーゲンの分解を促進させるＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９の含量がずっと少なく、さらにマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制させるＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２の含量が脂肪幹細胞培養液より高かった。そして、他のＭＭＰ－７、ＭＭＰ－１０及びＭＭＰ－１３の含量はそれぞれの培養液内にほぼ同一に存在することを確認した。したがって、神経幹細胞培養液内の主要マトリクスメタロプロテイナーゼの含量が低いので、コラーゲン保護能力がより良いと予測することができる。

実施例１２：ｉｎｖｉｖｏで神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液の効果比較
１２－１：ＳＫＨ－１マウスにおいて神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるしわ生成抑制確認

雌性ＳＫＨ－１マウスを１２週間ＵＶＢに（１週～４週は３０ｍＪ／ｃｍ^２／３回、５週～１２週は３０ｍＪ／ｃｍ^２／１回）露出させ、神経幹細胞培養液で処理した後、１２週にマウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させた。神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液で処理した群（ｇｒｏｕｐ）でしわ生成抑制及びしわ改善効果をｓｉｌｉｃｏｎｅｒｅｐｌｉｃａで分析した。

その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてしわ生成の抑制及び防止及びしわ改善効果がもっと大きく高いことを確認した（図２５ａ及び図２５ｂ）。

１２－２：ＳＫＨ－１マウスにおいて神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるコラーゲン及びエラスチン回復効果

実施例７のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンに埋め込んで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付けた。その後、ＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンをＭａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及びＶｅｒｈｏｅｆｆ’ｓｅｌａｓｔｉｎ染色によってそれぞれ分析した。

その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンがより大きく回復することを確認した（図２６）。

実施例１３：ｉｎｖｉｖｏで神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現抑制比較

実施例７－１のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンに埋め込んで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付け、パラフィン除去及び再水和過程（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅａｎｄｒｅｈｙｄｒａｔｅ）を実施した。その後、抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ｃｉｔｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）及び０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００処理を実施し、正常ロバ血清（ｎｏｒｍａｌｄｏｎｋｅｙｓｅｒｕｍ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体を１：１００で２４時間処理した。その後、２次抗体を用いて１時間処理し、ＤＡＰＩ染色を５分間実施した。ベクタシールド封入剤（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｍｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）を用いてスライドに固定させた後、共焦点顕微鏡（ＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で確認した。

その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって増加するＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９がより大きく減少することを確認した（図２７）。

実施例１４：神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるＤＮＡ損傷抑制及び回復確認

実施例７－１のように組職を準備し、実施例８－１と同様な方法で組職を染色し、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで確認した。また、神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液がＤＮＡ損傷に及ぶ影響を確認するために、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０をウェスタンブロット法で確認した。

その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）が復旧された。このとき、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって、損傷されたＤＮＡがより大きく復旧されることを確認した（図２８）。

本発明による低濃度の多様なマトリクスメタロプロテイナーゼ及び高濃度のＴＩＭＰ－１及びＴＩＭＰ－２を有効成分として含む神経幹細胞培養液はコラーゲンの生成を抑制するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制してコラーゲンとエラスチンの合成を回復させるので、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進用組成物として有用である。

以上で本発明の内容のうち特定の部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術は単に好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求範囲及びその等価物によって定義されると言える。

Claims

次の段階を含む、ＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）及びＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）を有効成分として含む紫外線による皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）生成抑制用又はＤＮＡ損傷の復旧用組成物の製造方法：
（ａ）脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させる段階と、
（ｂ）前記不死化神経幹細胞を非誘導性培地で培養して神経幹細胞培養液を収得する段階。
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、及びＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造方法。
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造方法。
前記紫外線はＵＶＢ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－Ｂ）であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造方法。
前記ＤＮＡ損傷の復旧は、Ｒａｄ５０の発現増加によってなされることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造方法。
前記非誘導性培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物の製造方法。
ＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）及びＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）を含む脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）由来の神経幹細胞培養液を有効成分として含む、紫外線による皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）生成抑制用化粧料組成物。
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、ＭＭＰ－３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３）、ＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）、ＭＭＰ－７（Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、ＭＭＰ－１０（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）及びＭＭＰ－１３（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を低濃度で含むことを特徴とする、請求項７に記載の化粧料組成物。
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、及びＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）の発現を抑制することを特徴とする、請求項７に記載の化粧料組成物。
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とする、請求項７に記載の化粧料組成物。
前記紫外線はＵＶＢ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－Ｂ）であることを特徴とする、請求項７に記載の化粧料組成物。
前記化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ及び噴霧剤からなる群から選択されるいずれか１種の剤形であることを特徴とする、請求項７に記載の化粧料組成物。
ＴＩＭＰ－１（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１）及びＴＩＭＰ－２（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２）を含む、脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ）由来の神経幹細胞培養液を有効成分として含む、紫外線によるＤＮＡ損傷の復旧用化粧料組成物。
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、ＭＭＰ－３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３）、ＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）、ＭＭＰ－７（Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、ＭＭＰ－１０（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）及びＭＭＰ－１３（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を低濃度で含むことを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ－１（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）、及びＭＭＰ－９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９）の発現を抑制することを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
前記紫外線はＵＶＢ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－Ｂ）であることを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
前記ＤＮＡ損傷の復旧は、Ｒａｄ５０の発現増加によってなされることを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
前記化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ及び噴霧剤からなる群から選択されるいずれか１種の剤形であることを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。