JP7163375B2 - 化合物、試薬、およびそれらの使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１７年９月２８日出願の米国仮出願第６２／５６４，５５８号の出願日の利益を主張し、すべての図面、式、仕様、および特許請求の範囲を含むその全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景
本発明の背景を説明する次の情報は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の先行技術を構成または説明することを認めるものではない。

腎臓機能は、従来、糸球体濾過量（ＧＦＲ）を使用して評価されている。黄金律の方法論であり、測定ＧＦＲ（ｍＧＦＲ）は正確かつ精密であるが、試験の複雑で時間のかかる侵襲的な性質に起因して、その有用性は限定される。また、実施に費用のかかる試験である。その結果、ＧＦＲは、血清中で測定された内因性濾過マーカ、クレアチニン、およびシスタチンＣの濃度に基づく等式を使用して臨床的に推定される。ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）を推定するために現在使用されている等式（ＭＤＲＤ、ＣＫＤ－ＥＰＩ）には、クレアチニンおよびシスタチンＣの血清レベルに影響を与える腎臓機能／ＧＦＲとは無関係の因子の代用物として、人口統計学的変数（年齢、性別、人種）が含まれている。しかしながら、これらのｅＧＦＲ等式は、ｍＧＦＲに対して限定的な精密性および正確性を示す。

人口統計学的変数は、非ＧＦＲ決定因子の代用物（例えば、クレアチニンでは筋肉量、シスタチンＣでは脂肪症）として優良ではなく、ある特定の患者は、不適切に分類され（例えは混血、トランスジェンダー、間性）、報告するには地域的に（例えば人種的に）デリケートであるので、現在のマーカは限定的な有用性を有し得る。現在のｅＧＦＲマーカの制限に起因して、糸球体によって自由に濾過され、非ＧＦＲ決定因子によって影響を受けない（または最小限に抑える）低分子量を有する代替内因性濾過マーカが同定されている。これらの代替マーカは、人口統計学的変数からも独立することができ、それによりこれらの変数の使用に関連する制限を克服することができる。

本明細書に記載されているのは、生体試料中の内因性小分子濾過マーカ（（２Ｒ，３Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－５－メチルチオ－トランス－４－ペンテン酸、ＤＭＴＰＡ）の合成、単離、検出、および定量の方法である。以前、ＧＦＲおよび腎臓機能に関連するマーカとしての分析物／マーカＸ－１１５６４が発見されたが、構造が不明であり、その有用性は限定的であった。本明細書では、この分子の構造を報告し、化合物を合成する方法、測定する方法（個々に、またはマーカのパネルの一部としての測定を含む）、測定用試薬（例えば内部標準、抗体）、およびそれらを使用するキットを提供する。

本発明は、腎臓機能の評価およびモニタリング、ならびに腎臓疾患の診断方法において有用であり得る、新規の化合物および組成物、生体試料中の化合物の合成方法および量を検出するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）：

によって表される化合物またはその塩であって、化合物が、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または９９．９％純粋である、化合物またはその塩を提供する。

別の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）：

によって表される化合物またはその塩であって、化合物が、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または９９．９％純粋である、化合物またはその塩を提供する。

別の実施形態では、本発明は、アッセイを使用して、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩のレベルを決定するための方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、対象における式Ｉもしくは式ＩＩの化合物、またはそれらの塩のレベルを決定するための方法であって、（１）対象から得られた生体試料から分析用試料を調製することと、（２）クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して、化合物のレベルを決定することと、を含む方法を提供する。

本発明の一態様では、方法は、試料中の式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩の量を質量分析法によって検出および決定することを含む。別の態様では、方法は、試料中の式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩と、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）、クレアチニン、メソ－エリトリトール、アラビトール、ｍｙｏ－イノシトール、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、３－メチルヒスチジン、トランス－４－ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、３－インドキシル硫酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された１つ以上の分析物で構成される分析物のパネルのうちの１つ以上との量を、質量分析法によって検出および決定することを含む。生体試料から分析物を抽出する方法、および質量分析法による検出の前に分析物をクロマトグラフィーで分離する方法も提供される。

方法が試料中の化合物Ａの量を質量分析法によって検出および決定することを含む本発明の一態様では、化合物Ａの質量スペクトルは、約１７７、１５９、１３３、１３１、１２９、１１５、１１３、１１１、１０１、１００、９９、８９、８５、８３、７５、７３、５７．０３、５７．００、９７、８７、７４、８４、および６７からなる群から選択される１つ以上のピーク（すなわち、質量対電荷比（ｍ／ｚ））を含み得る。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、値±０．５を意味する。

別の実施形態では、本発明は、対象における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を計算するための方法であって、
１）クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して、対象から得られた生体試料中の式Ｉもしくは式ＩＩによって表される化合物またはそれらの塩のレベルを決定するステップと、
２）化合物の決定されたレベルを利用するアルゴリズムを使用して、ｅＧＦＲを計算するステップと
を含む方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、対象から得られた生体試料中で検出された式Ｉまたは式ＩＩによって表される化合物のレベルに基づいて、対象の腎臓機能低下を発症する素因を決定するための、腎臓機能のレベル（またはステージ）に従って対象を分類（またはステージ分類）するための、対象における腎臓機能をモニタリングするための、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を診断するための、対象におけるＣＫＤの進行または後退をモニタリングするための、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）を診断するための、ＡＫＩの進行または後退をモニタリングするための、組成物への応答で対象の腎臓機能を評価するための、ＣＫＤを有する対象を治療するための、およびＡＫＩを有する対象を治療するための、方法を提供する。

本発明はまた、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩を含むキットを提供する。

別の実施形態では、本発明のキットは、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩と、生体試料中の式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩のレベルを測定するための指示書とを含む。

別の実施形態では、キットは、式Ｉもしくは式ＩＩの標識化合物またはそれらの塩を含む内部標準と、生体試料中の式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩のレベルを測定するための指示書とを含む。

さらに別の実施形態では、キットは、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩と、式Ｉもしくは式ＩＩの標識化合物またはそれらの塩と、生体試料中の式Ｉまたは式ＩＩの化合物のレベルを測定するための指示書とを含む。

一実施形態では、本発明のキットは、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物またはそれらの塩と、対象から得られた生体試料中で検出された化合物のレベルに基づいて、対象におけるＧＦＲを推定するための、対象の腎臓機能低下を発症する素因を決定するための、腎臓機能のレベル（またはステージ）に従って対象を分類（またはステージ分類）するための、対象における腎臓機能をモニタリングするための、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を診断するための、対象におけるＣＫＤの進行または後退をモニタリングするための、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）を診断するための、ＡＫＩの進行または後退をモニタリングするための、組成物への応答で対象の腎臓機能を評価するための、ＣＫＤを有する対象を治療するための、およびＡＫＩを有する対象を治療するための指示書とを含む。
[本発明1001]
次式：

によって表される化合物またはその塩であって、前記化合物が、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、99．5％、または99．9％純粋である、前記化合物またはその塩。
[本発明1002]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、99．5％、または99．9％光学的に純粋である、本発明1001～1003のいずれかの化合物。
[本発明1005]
同位体標識されている、本発明1001～1004のいずれかの化合物。
[本発明1006]
重水素化され、炭素13（ ¹³ Ｃ）、酸素17（ ¹⁷ Ｏ）、酸素18（ ¹⁸ Ｏ）、硫黄33（ ³³ Ｓ）、硫黄34（ ³⁴ Ｓ）、もしくは任意の他の既知の硫黄同位体、またはそれらの組み合わせで標識されている、本発明1001～1005のいずれかの化合物。
[本発明1007]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1008]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1009]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1010]
次式：

（式中、＊は、 ¹³ Ｃを示す）によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1011]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1012]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1013]
次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1014]
次式：

（式中、＊は、 ¹³ Ｃを示す）によって表されるか、またはその塩である、本発明1006の化合物。
[本発明1015]
対象における、次式：

によって表される化合物またはその塩のレベルを決定する方法であって、
（1）前記対象から得られた生体試料から分析用試料を調製することと、
（2）クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して、前記化合物のレベルを決定することと
を含む、前記方法。
[本発明1016]
対象における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を計算するための方法であって、
1）前記対象から得られた生体試料中の、次式：

によって表される化合物またはその塩のレベルを、クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して決定するステップと、
2）前記化合物の前記決定されたレベルを利用するアルゴリズムを使用して、前記ｅＧＦＲを計算するステップと
を含む、前記方法。
[本発明1017]
前記計算されたｅＧＦＲが、前記対象における腎臓機能を評価するために使用される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記計算されたｅＧＦＲが、前記対象における腎臓機能低下を発症する素因を決定するために使用される、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記計算されたｅＧＦＲが、腎臓機能のレベルに従って前記対象を分類するために使用される、本発明1016の方法。
[本発明1020]
前記計算されたｅＧＦＲが、前記対象における腎臓機能をモニタリングするために使用される、本発明1016の方法。
[本発明1021]
前記計算されたｅＧＦＲが、前記対象における慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、または急性腎臓傷害（ＡＫＩ）を診断するために使用される、本発明1016の方法。
[本発明1022]
前記計算されたｅＧＦＲが、ＣＫＤまたはＡＫＩの進行または後退をモニタリングするために使用される、本発明1016の方法。
[本発明1023]
前記ｅＧＦＲが、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、2－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、Ｎ6－カルバモイルトレオニルアデノシン、4－アセトアミドブタノアート、エリトリトール、ｍｙｏ－イノシトール、エリトロナート、尿素、アラビトール、Ｎ2，Ｎ2－ジメチルグアノシン、Ｎ1－メチルアデノシン、3－メチルグルタリルカルニチン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、Ｎ－アセチルメチオニン、Ｎ6－アセチルリシン、キヌレニン、アラボナート、スクシニルカルニチン、リボース、キシロナート、Ｎ－ホルミルメチオニン、Ｏ－メチルカテコールスルフェート、2－メチルブチリルカルニチン、フェニルアセチルグルタミン、Ｎ2，Ｎ5－ジアセチルオルニチン、トリプトファン、クレアチニン、ウラート、3－インドキシルスルフェート、ｐ－クレゾールスルフェート、およびＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）から選択される1つ以上の追加の化合物を利用して計算される、本発明1016～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記ｅＧＦＲアルゴリズムが、血清シスタチンＣレベルをさらに利用する、本発明1016～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記ｅＧＦＲアルゴリズムが、年齢、性別、および人種からなる群から選択される1つ以上の人口統計学的パラメータをさらに利用する、本発明1016～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1015～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1015～1025のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記化合物のレベルが、タンデム液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定される、本発明1015～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記生体試料が、血液、血漿、血清、唾液、または尿である、本発明1015～1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記生体試料が、血清または血漿である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記対象が、ヒトである、本発明1015～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記対象が、腎臓機能障害の症状を有さない、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記対象が、慢性腎臓疾患を発症するリスク因子を呈する、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記対象が、高血圧と以前に診断されている、本発明1031の方法。
[本発明1035]
前記対象が、糖尿病と以前に診断されている、本発明1031の方法。
[本発明1036]
前記対象が、慢性腎臓疾患の家族歴を有する、本発明1031の方法。
[本発明1037]
前記対象が、腎臓機能障害の症状を有する、本発明1031の方法。
[本発明1038]
前記対象が、従来の方法を使用した腎臓機能評価が困難である対象である、本発明1031の方法。
[本発明1039]
前記対象が、肥満、痩せすぎ、菜食主義者、慢性の病気、および高齢者からなる群から選択される、本発明1031の方法。
[本発明1040]
前記対象が、腎臓ドナーになる候補者である、本発明1031の方法。
[本発明1041]
前記対象が、腎臓に毒性作用を有し得る薬剤を用いて治療されたか、または該薬剤を用いる治療が検討されている、本発明1031の方法。
[本発明1042]
前記薬剤が、造影剤である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記薬剤が、治療剤である、本発明1041の方法。
[本発明1044]
前記薬剤が、化学療法剤である、本発明1041の方法。
[本発明1045]
前記薬剤が、抗生物質である、本発明1041の方法。
[本発明1046]
前記対象が、腎臓機能障害の既知のリスク因子を有さない、本発明1031の方法。
[本発明1047]
前記試料が、糸球体濾過量の直接測定を可能にする薬剤を用いる治療の前に、前記対象から得られる、本発明1015～1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
次式：

によって表される化合物またはその塩と、対象から得られた生体試料中の前記化合物のレベルを測定するための指示書とを含む、キット。
[本発明1049]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1048のキット。
[本発明1050]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1048のキット。
[本発明1051]
前記生体試料中で測定された前記化合物のレベルに基づいて、前記生体試料中の推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を計算するための指示書をさらに含む、本発明1048～1050のいずれかのキット。
[本発明1052]
前記化合物が、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、99．5％、または99．9％純粋である、本発明1048～1051のいずれかのキット。
[本発明1053]
前記化合物が、同位体標識されている、本発明1048～1052のいずれかのキット。
[本発明1054]
前記化合物が、重水素化され、炭素13（ ¹³ Ｃ）、酸素17（ ¹⁷ Ｏ）、酸素18（ ¹⁸ Ｏ）、硫黄33（ ³³ Ｓ）、硫黄34（ ³⁴ Ｓ）、もしくは任意の他の既知の硫黄同位体、またはそれらの組み合わせで標識されている、本発明1048～1053のいずれかのキット。
[本発明1055]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1056]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1057]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1058]
前記化合物が、次式：

（式中、＊は、 ¹³ Ｃを示す）によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1059]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1060]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1061]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1062]
前記化合物が、次式：

（式中、＊は、 ¹³ Ｃを示す）によって表されるか、またはその塩である、本発明1054のキット。
[本発明1063]
腎臓機能の評価に関連する1つ以上の追加の化合物をさらに含む、本発明1048～1062のいずれかのキット。
[本発明1064]
前記追加の化合物が、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、2－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、Ｎ6－カルバモイルトレオニルアデノシン、4－アセトアミドブタノアート、エリトリトール、ｍｙｏ－イノシトール、エリトロナート、尿素、アラビトール、Ｎ2，Ｎ2－ジメチルグアノシン、Ｎ1－メチルアデノシン、3－メチルグルタリルカルニチン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、Ｎ－アセチルメチオニン、Ｎ6－アセチルリシン、キヌレニン、アラボナート、スクシニルカルニチン、リボース、キシロナート、Ｎ－ホルミルメチオニン、Ｏ－メチルカテコールスルフェート、2－メチルブチリルカルニチン、フェニルアセチルグルタミン、Ｎ2，Ｎ5－ジアセチルオルニチン、トリプトファン、クレアチニン、ウラート、3－インドキシルスルフェート、ｐ－クレゾールスルフェート、およびＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）からなる群から選択される、本発明1063のキット。
[本発明1065]
前記追加の化合物が、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、2－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、キヌレニン、ｍｙｏ－イノシトール、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）、およびクレアチニンからなる群から選択される、本発明1064のキット。
[本発明1066]
前記追加の化合物が、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、およびクレアチニンからなる群から選択される、本発明1064のキット。
[本発明1067]
シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、およびフェニルアセチルグルタミンをさらに含む、本発明1064のキット。
[本発明1068]
シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、およびクレアチニンをさらに含む、本発明1064のキット。
[本発明1069]
次式：

によって表される化合物またはその塩を調製するための方法であって、
ａ）次式：

によって表される化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’ ₃ Ｐ＝ＣＨ ₂ ＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（Ｖａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）（Ｖａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（Ｉ）の化合物またはその塩を形成するステップと
を含む、前記方法。
[本発明1070]
式（Ｉ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩ）：

の化合物またはその塩を得ることをさらに含む、本発明1069の方法。
[本発明1071]
式（Ｉ）の前記化合物またはその塩が、次式：

によって表されるか、またはその塩であり、前記方法が、
ａ）次式：

によって表される化合物またはその塩を、前記ウィッティヒ試薬と反応させて、式（Ｖａ）：

の化合物またはその塩を形成することと、
ｂ）式（Ｖａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（Ｖｂ）：

の化合物またはその塩を得ることと、
ｃ）式（Ｖｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成することと
を含む、本発明1069の方法。
[本発明1072]
式（ＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を調製する方法であって、
ａ）式（ＶＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’ ₃ Ｐ＝ＣＨ ₂ ＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（ＶＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩｂ）：

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成するステップと
を含む、前記方法。
[本発明1073]
式（ＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を調製する方法であって、
ａ）式（ＶＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’ ₃ Ｐ＝ＣＨ ₂ ＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（ＶＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩｃ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩｃ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を得るステップと
を含む、前記方法。
[本発明1074]
前記脱保護ステップが、酸の存在下で行われる、本発明1069～1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
式（ＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を調製する方法であって、
ａ）式（ＶＩＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’ ₃ Ｐ＝ＣＨ ₂ ＳＭｅと反応させて、式（ＶＩＩａ）：

（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子吸引基であり、Ｒ ₁ およびＲ ₂ は、各々独立してシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩｂ）：

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩＩｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成するステップと
を含む、前記方法。
[本発明1076]
式（ＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を調製する方法であって、
ａ）式（ＶＩＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’ ₃ Ｐ＝ＣＨ ₂ ＳＭｅと反応させて、式（ＶＩＩａ）

（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子吸引基であり、Ｒ ₁ およびＲ ₂ は、各々独立してシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩｃ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩＩｃ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を得るステップと
を含む、前記方法。
[本発明1077]
前記脱保護ステップが、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム、トリス（ジメチルアミノ）スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート、フッ化水素もしくはその溶媒和物、フッ化水素ピリジン、四フッ化ケイ素、ヘキサフルオロケイ酸、フッ化セシウム、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム、ｐ－トルエンスルホン酸（ｐ－ＴｓＯＨ）、ギ酸、および過ヨウ素酸から選択される脱保護試薬の存在下で行われる、本発明1075または1076の方法。
[本発明1078]
前記ウィッティヒ試薬が、メチルチオメチルトリフェニルホスホニウムイリド（Ｐｈ ₃ Ｐ＝ＣＨ ₂ ＳＭｅ）である、本発明1069～1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
前記ウィッティヒ反応が、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドの存在下で行われる、本発明1069～1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記ウィッティヒ反応が、テトラヒドロフランの溶媒中で行われる、本発明1069～1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
式（ＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を調製する方法であって、
ａ）式（ＩＸ）：

の化合物をメタンチオールと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩＩｂ）：

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成するステップと
を含み、式中、Ｒ ₁ およびＲ ₂ が、各々独立してシリル基であり、Ｒ ₃ がｔ－ブチル基またはシリル基である、前記方法。
[本発明1082]
式（ＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を調製する方法であって、
ａ）式（ＩＸ）：

の化合物をメタンチオールと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩＩｂ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を得るステップと
を含み、式中、Ｒ ₁ およびＲ ₂ が、各々独立してシリル基であり、Ｒ ₃ がｔ－ブチル基またはシリル基である、前記方法。
[本発明1083]
前記シリル基が、トリメチルシリルまたはトリス（トリメチルシリル）シリルである、本発明1081または1082の方法。
[本発明1084]
前記脱保護反応が、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム、トリス（ジメチルアミノ）スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート、フッ化水素もしくはその溶媒和物、フッ化水素ピリジン、四フッ化ケイ素、ヘキサフルオロケイ酸、フッ化セシウム、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム、ｐ－トルエンスルホン酸（ｐ－ＴｓＯＨ）、ギ酸、および過ヨウ素酸から選択される脱保護試薬の存在下で行われる、本発明1081～1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
次式：

によって表される化合物またはその塩に結合する、抗体または抗体断片。
[本発明1086]
前記化合物が、次式：

によって表されるか、またはその塩である、本発明1085の抗体または抗体断片。
[本発明1087]
本発明1069または1070の抗体のＶ _Ｈ およびＶ _Ｌ 配列を含む、ポリペプチド。
[本発明1088]
融合タンパク質である、本発明1087のポリペプチド。
[本発明1089]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくは抗体断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドを生産する、細胞。
[本発明1090]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドを生成する方法であって、
（1）本発明1089の細胞を培養することと、
（2）前記培養細胞から前記抗体もしくはその抗原結合断片、またはポリペプチドを単離することと
を含む、前記方法。
[本発明1091]
前記細胞が、真核細胞である、本発明1090の方法。
[本発明1092]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドと、前記対象から得られた生体試料中で検出された前記化合物のレベルを決定するための指示書とを含む、キット。
[本発明1093]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドと、前記対象から得られた生体試料中で検出された前記化合物のレベルに基づいて対象における腎臓機能を評価またはモニタリングするための指示書とを含む、キット。
[本発明1094]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドと、前記対象から得られた生体試料中で検出された前記化合物のレベルに基づいて対象における腎臓機能低下を発症する素因を決定するための指示書とを含む、キット。
[本発明1095]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドと、前記対象から得られた生体試料中で検出された前記化合物のレベルに基づいて腎臓機能のレベルに従って対象を分類するための指示書とを含む、キット。
[本発明1096]
本発明1085もしくは1086の抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明1087もしくは1088のポリペプチドと、前記対象から得られた生体試料中で検出された前記化合物のレベルに基づいて対象における慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を診断またはモニタリングするための指示書とを含む、キット。

塩基性クロマトグラフ条件下でのヒトの血漿試料中の化合物ＡのＬＣ／ＭＳクロマトグラムおよびスペクトルを示す。 血漿試料中の化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 酸性クロマトグラフ条件下でのヒト血漿試料（Ａ）、ヒト尿試料（Ｂ）中、およびヒト血漿と尿との混合物（Ｃ）中の化合物ＡのＬＣ／ＭＳクロマトグラムを示す。 衝突誘起解離（ＣＩＤ）を使用して生成された、尿試料中の化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 衝突誘起解離（ＣＩＤ）を使用して生成された、尿試料中の化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）を使用して生成された、尿試料中の化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）を使用して生成された、尿試料中の化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｅ、図６Ｄ、および図６Ｆは、尿試料中の、ＣＩＤを使用したｍ／ｚ８５（Ａ）、１１５（Ｂ）、１２９（Ｃ）、１５９（Ｄ）、およびＨＣＤを使用したｍ／ｚ８５（Ｅ）、１５９（Ｆ）の化合物ＡのＭＳ^３スペクトルを示す。 早期の溶出ピークの収集画分の濃縮残留物の^１Ｈ ＮＭＲ（７００ＭＨｚ）を示し、スルホキシドを示している。 回収画分の濃縮残留物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳクロマトグラムおよびスペクトルを示し、２．４２および２．５３分でスルホキシド、ならびにそれらに対応するＭＳ^２スペクトルを示している。 ウィッティヒ生成物の混合物のＬＣ／ＭＳクロマトグラムを示し、２．１４、２．３２、２．４２、および２．５３分で微量成分としてのスルホキシドの存在、ならびにそれぞれ４．４５および４．４９分で保護トランスおよびシスチオエノールエーテルを示している。 収集画分の濃縮残留物のＬＣ／ＭＳクロマトグラムおよびスペクトルを示し、それぞれ２．４２および２．５３分でｍ／ｚ２７３．０８０４９および２７３．０８０４６を有するスルホキシド、ならびに微量成分として４．４５分でｍ／ｚ２５７．０８５４５を有する保護トランスチオエノールエーテルを示している。 トランスＤＭＴＰＡ（２．５４分、上）、シスおよびトランスＤＭＴＰＡの混合物（それぞれ２．２１分および２．５３分、中央）、ならびにそれらの同時注入（下）のＬＣ／ＭＳクロマトグラムを示す。 尿試料中の重水素交換化合物ＡのフルスキャンＬＣ／ＭＳクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の重水素交換化合物ＡのＭＳ^２スペクトルを、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の重水素交換化合物ＡのＭＳ^２スペクトルを、拡大図とともに示す。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＣＩＤを使用した、尿試料中の重水素交換化合物Ａのｍ／ｚ１６０のＭＳ^３スペクトル（Ａ）を、拡大図（Ｂ）とともに示す。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＣＩＤを使用した、尿試料中の重水素交換化合物Ａのｍ／ｚ１６１のＭＳ^３スペクトル（Ａ）を、拡大図（Ｂ）とともに示す。 図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、および図１６Ｅは、ＣＩＤを使用した、尿試料中の重水素交換化合物Ａのｍ／ｚ１３０（Ａ）、１３１（Ｂ）、８６（Ｃ）、８７（Ｄ）、および１１６（Ｅ）のＭＳ^３スペクトルを示す。 図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、および図１７Ｄは、尿試料中の水素化化合物ＡのＬＣ／ＭＳ質量スペクトル（Ａ～Ｂ）およびクロマトグラム（Ｄ）を示す。パネルＣは、水素化後に存在しない元の化合物Ａ（約２．５分）の抽出イオンクロマトグラムを示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の水素化化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の水素化化合物Ａのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＣＩＤ（Ａ）、またはＨＣＤ（Ｂ）を使用した、尿試料中の水素化化合物Ａのｍ／ｚ１３１のＭＳ^３スペクトルを示す。 尿試料中の水素化化合物Ａの重水素化種のＬＣ／ＭＳクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の水素化化合物Ａの重水素化種のプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の水素化化合物Ａの重水素化種のプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の水素化化合物Ａの重水素化種のｍ／ｚ１３２のＭＳ^３スペクトルを示す。 ＣＩＤを使用した、尿試料中の水素化化合物Ａの重水素化種のｍ／ｚ１３３のＭＳ^３スペクトルを示す。 合成シスおよびトランスＤＭＴＰＡのＬＣ／ＭＳクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。 図２５Ａ、図２５Ｂ、および図２５Ｃは、尿試料中の化合物Ａ（２．５３分）（Ａ）、合成シスおよびトランスＤＭＴＰＡ、それぞれ２．２０および２．５３分（Ｂ）、ならびにそれらの同時注入（Ｃ）のＬＣ－ＭＳクロマトグラム）を示す。 ＣＩＤを使用した、合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＨＣＤを使用した、合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＨＣＤを使用した、合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 図２８Ａ、図２８Ｂ、図２８Ｃ、および図２８Ｄは、ＣＩＤを使用した、合成トランスＤＭＴＰＡのｍ／ｚ１１５（Ａ）、１２９（Ｂ）、１５９（Ｃ）、および８５（Ｄ）のＭＳ^３スペクトルを示す。 図２９Ａおよび図２９Ｂは、ＨＣＤを使用した、合成トランスＤＭＴＰＡのｍ／ｚ１５９（Ａ）および８５（Ｂ）のＭＳ^３スペクトルを示す。 図３０Ａおよび図３０Ｂは、合成トランスＤＭＴＰＡの重水素種（Ａ）および尿試料中の重水素種化合物Ａ（Ｂ）のフルスキャン質量スペクトルを示す。 ＣＩＤを使用した、重水素化合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、重水素化合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、重水素化合成トランスＤＭＴＰＡのｍ／ｚ１６０のＭＳ^３スペクトルを、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、重水素化合成トランスＤＭＴＰＡのｍ／ｚ１６１のＭＳ^３スペクトルを、拡大図とともに示す。 精製したウィッティヒ反応生成物（保護シスおよびトランスチオエノールエーテルの混合物）の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。 精製したウィッティヒ反応生成物（保護シスおよびトランスチオエノールエーテルの混合物）のＬＣ／ＭＳクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。 ＣＩＤを使用した、精製したウィッティヒ反応生成物のプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）（室温、２．８１分）を、拡大図とともに示す。 ＣＩＤを使用した、精製したウィッティヒ反応生成物のプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）（室温、２．９８分）を、拡大図とともに示す。

発明の詳細な説明
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語は、次のように定義される。

本発明の化合物は、塩の形態で存在し得る。本発明には、任意の好適な有機または無機塩が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物の塩は、非毒性の「薬学的に許容可能な塩」を指す。「薬学的に許容可能な」という語句は、本明細書では、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当な利益／リスク比に見合う、人間および動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または剤型を指すために用いられる。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」とは、親化合物がその酸性塩または塩基塩を作製することによって修飾されている、開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の形態としては、薬学的に許容可能な酸性／アニオン性または塩基性／カチオン性の塩が挙げられる。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定されないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。

例えば、かかる塩としては、酢酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ベンジル酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エタンジスルホン酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グリセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキシルレゾルシン酸塩（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸、ナプシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、フェニル酢酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、亜酢酸塩、コハク酸塩、スルファミド、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、アンモニウム、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、およびプロカイン塩が挙げられる。さらなる薬学的に許容可能な塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などのような金属からのカチオンで形成することができる。（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓａｌｔｓ，Ｂｉｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，（１９７７），６６，１－１９も参照されたい）。

本発明の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基の形態を、水中、またはエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、もしくはアセトニトリル、もしくはそれらの混合物のような有機希釈剤中で十分な量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。

例えば、本発明の化合物を精製または単離するために有用である、上記のもの以外の酸の塩（例えば、トリフルオロ酢酸塩）もまた、本発明の一部を構成する。

本発明の化合物は、異性体の特異的合成または異性体混合物からの分解のいずれかによって、個々の異性体として調製してもよい。従来の分解技法としては、光学活性酸を使用して異性体対の各異性体の遊離塩基の塩の形成（続いて分別結晶化および遊離塩基の再生成）、光学活性アミンを使用して異性体対の酸の形態の各異性体の塩の形成（続いて分別結晶化および遊離酸の再生成）、光学的に純粋な酸、アミン、もしくはアルコールを使用して異性体対の各異性体のエステルもしくはアミドの形成（続いてキラル補助剤のクロマトグラフィー分離および除去）、または様々な周知のクロマトグラフィー方法を使用して、出発物質または最終生成物のいずれかの異性体混合物を分解することが挙げられる。

開示の化合物の立体化学が構造によって命名または描写されるとき、その命名または描写された立体異性体は、他の立体異性体と比較して、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％純粋である。単一のエナンチオマーが構造によって命名または描写されるとき、その描写または命名されたエナンチオマーは、重量で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％光学的に純粋である。重量での光学純度パーセントは、エナンチオマーの重量とその光学異性体の重量との合計に対するエナンチオマーの重量の比である。

開示の化合物が立体化学を示さずに構造によって命名または描写され、化合物が少なくとも１つのキラル中心を有するとき、その名称または構造は、対応する光学異性体を含まない化合物のうちの１つのエナンチオマー、化合物のラセミ体混合物、およびその対応する光学異性体と比較して１つのエナンチオマーが豊富な混合物を包含すると理解されるべきである。

開示の化合物が立体化学を示さずに構造によって命名または描写され、少なくとも２つのキラル中心を有するとき、その名称または構造は、他のジアステレオマーを含まないジアステレオマー、他のジアステレオマー対を含まないジアステレオマー対、ジアステレオマーの混合物、ジアステレオマー対の混合物、１つのジアステレオマーが他のジアステレオマー（複数可）と比較して豊富であるジアステレオマーの混合物、および１つのジアステレオマー対が他のジアステレオマー対（複数可）と比較して豊富であるジアステレオマー対の混合物、を包含すると理解されるべきである。

１つ以上の立体中心を有する化合物が、少なくとも１つの立体中心に対して特定の立体化学を用いて描写されるとき、本発明はまた、対応する立体中心（複数可）で反対の立体化学を有する化合物、および対応する立体中心（複数可）で特定の立体化学を有さない化合物も含む。

状態または疾患を「治療すること」とは、状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒、ならびに寛解することを指す。

本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、任意の動物を意味するが、好ましくは、例えば、ヒト、サル、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、またはウサギなどの哺乳動物である。さらにより好ましくは、対象はヒトである。

本明細書で使用される場合、「有効量」とは、対象に所望の生体応答を誘発する活性化合物薬剤の量を意味する。かかる応答は、治療されている疾患または障害の症状の緩和を含む。かかる療法的方法における本発明の化合物の有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日である。

本発明の化合物または１つ以上の追加の化合物の「レベル」とは、試料中で測定された化合物の絶対もしくは相対量、または濃度を意味する。

「試料」または「生体試料」とは、対象から単離された生体物質を意味する。生体試料は、所望の化合物を検出するのに好適な任意の生体物質を含有し得、対象からの細胞性および／または非細胞性物質を含み得る。試料は、例えば、腎臓組織、血液、血漿（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）（血漿（ｐｌａｓｍａ））、血清（ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ）（血清（ｓｅｒｕｍ））、尿、唾液、または脳脊髄液（ＣＳＦ）などの任意の好適な生体組織または体液から単離してもよい。好ましくは、生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、または尿である。別の好ましい実施形態では、生体試料は、血清または血漿である。

「参照レベル」とは、特定の病状、表現型、またはそれらの欠如、ならびに病状、表現型、またはそれらの欠如の組み合わせを示す、本発明の化合物または追加の化合物（複数可）のレベルを意味する。「参照レベル」は、本発明の化合物もしくは追加の化合物（複数可）の絶対もしくは相対量もしくは濃度、本発明の化合物もしくは追加の化合物（複数可）の存在もしくは不在、本発明の化合物もしくは追加の化合物（複数可）の量もしくは濃度の範囲、本発明の化合物もしくは追加の化合物（複数可）の最小および／もしくは最大の量もしくは濃度、本発明の化合物もしくは追加の化合物（複数可）の平均量もしくは濃度、ならびに／または本発明の化合物もしくは追加の化合物（複数可）の中央量もしくは濃度であってもよく、加えて、本発明の化合物と追加の化合物（複数可）との組み合わせの「参照レベル」はまた、２つ以上の化合物の互いに対する絶対もしくは相対量または濃度の比であってもよい。特定の病状、表現型、またはその欠如に対する本発明の化合物または追加の化合物（複数可）の適切な参照レベルは、１人以上の適切な対象における本発明の化合物または所望の化合物のレベルを測定することによって決定することができる。「正の」参照レベルとは、特定の病状または表現型を示すレベルを意味する。「負の」参照レベルとは、特定の病状または表現型の欠如を示すレベルを意味する。

本明細書で使用される場合、「参照試料」とは、参照レベルの化合物を含有する試料を指す。例えば、参照試料は、ＣＫＤまたは急性腎臓傷害などの特定の疾患、病状、または表現型を有さない対象から得ることができる。

「糸球体濾過量」または「ＧＦＲ」は、単位時間あたりに腎糸球体毛細血管からボーマン嚢に濾過される体液の体積である。ＧＦＲは、ある特定の閾値以上のＧＦＲが正常な腎臓機能を示し、閾値未満のＧＦＲが腎臓機能の弱まりまたは障害を示す、腎臓機能の測定基準である。一般に、高いＧＦＲ値は良好な腎臓機能を示し、低いＧＦＲは腎臓機能障害（例えば、慢性腎臓疾患、急性腎臓傷害）を示す。

「測定糸球体濾過量」または「ｍＧＦＲ」とは、イヌリン、イオタラミック酸塩またはイオヘキソールなどの濾過マーカを使用して決定される実際の糸球体濾過量を意味し、ｍＧＦＲは、臨床環境で実施され、腎機能の最も正確な測定値である。

「推定糸球体濾過量」または「ｅＧＦＲ」とは、実際の糸球体濾過量の計算された推定値を意味する。計算値は、１つ以上の化合物またはバイオマーカのレベルに基づく場合があり、人口統計学的情報（例えば、年齢または性別）などの他の変数を含み得る。ｅＧＦＲを計算するための現在の１つの方法は、血清クレアチニン濃度に基づく。ｅＧＦＲを計算するための他の現在の方法は、シスタチンＣの量を単独で、または血清クレアチニンの量と組み合わせて使用する。ＧＦＲを推定するための現在使用されている等式としては、「慢性腎臓病疫学共同研究」（ＣＫＤ－ＥＰＩ）および「腎疾患ｅＧＦＲの食事療法の変更（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ ｅＧＦＲ）」（ＭＤＲＤ）が挙げられる。一般に、低いｅＧＦＲ値は、腎臓機能の低下と関連している。

「尿アルブミン」は、尿中のアルブミン量を測定する試験であり、腎臓疾患の検出にも使用される。

「血清クレアチニン」または「ＳＣｒ」とは、血清中のクレアチニンの測定値を指し、ＧＦＲの推定に通常使用される。

「血中尿素窒素」または「ＢＵＮ」とは、血液中の尿素の形態の窒素量の測定値を指す。ＢＵＮは、腎臓機能を測定するために使用される試験である。

「慢性腎臓疾患」または「ＣＫＤ」は、腎臓に損傷を与え、腎臓が身体から老廃物を除去する能力の低下を生じ、身体内に高レベルの老廃物を生じ、病気のリスクの増加、ならびに高血圧、貧血、栄養健康不良、および神経損傷などの合併症の発症に至る、状態を含む。少なくとも３か月間腎臓機能に異常がある患者は、ＣＫＤと診断することができる。ＣＫＤに起因する腎臓損傷は永続的である。

「急性腎臓傷害」または「ＡＫＩ」とは、腎臓機能の急速な喪失がある状態を指す。ＡＫＩに起因する腎臓損傷は可逆的な場合がある。

「慢性腎臓疾患ステージ」または「ＣＫＤステージ」とは、測定または推定糸球体濾過量（ｍＧＦＲ、ｅＧＦＲ）を使用して現在評価されている腎臓損傷の程度を意味する。臨床的には、ステージ１（ＧＦＲ＞９０）で正常、ステージ２（ＧＦＲ６０～８９）で最小限の低下、ステージ３Ａおよび３Ｂ（ＧＦＲ３０～５９）で中程度の低下、ステージ４（ＧＦＲ１５～２９）で重度の低下、ステージ５（ＧＦＲ＜１５、または透析中）で確立された腎不全とも称される非常に重度または末期の腎臓不全とみなされる腎臓機能を用いる、５つのステージのＣＫＤが一般に認識されている。腎臓機能ステージは、任意の時間量の間存在する腎臓損傷（すなわち、ＡＫＩまたはＣＫＤに起因する腎臓損傷）を指すために使用することができる。

本発明は、本発明の非限定的な実施形態を例示することを目的とする次の詳細な説明および実施例を参照することにより、より完全に理解することができる。

化合物および組成物
本発明は、新規化合物、組成物、合成する方法、検出方法、ならびに診断方法および治療方法におけるそれらの使用を提供する。

第１の実施形態では、本発明は、次式：

によって表される化合物またはその塩を提供する。

ある特定の実施形態では、第１の実施形態における式（Ｉ）の化合物は、次式：

によって表されるか、またはその塩である。

ある特定の実施形態では、第１の実施形態における式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、次式：

によって表されるか、またはそれらの塩である。

ある特定の実施形態では、第１の実施形態における式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、次式：

によって表されるか、またはそれらの塩である。

一実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩は、少なくとも６０％光学的に純粋、少なくとも７０％光学的に純粋、少なくとも８０％光学的に純粋、少なくとも９０％光学的に純粋、少なくとも９５％光学的に純粋、または少なくとも９９％光学的に純粋である。

様々な実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）によって表される化合物またはそれらの塩）は、実質的に不純物を含まない。

様々な実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）によって表される化合物またはそれらの塩）は、少なくとも６０％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９９％純粋である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）によって表される化合物またはそれらの塩）は、同位体標識されている。一実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩は、トリチウム（^３Ｈ）、または炭素１４（^１４Ｃ）などで放射性標識されている。別の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩は、重水素、炭素１３（^１３Ｃ）、酸素１７（^１７Ｏ）、酸素１８（^１８Ｏ）、硫黄３３（^３３Ｓ）、硫黄３４（^３４Ｓ）、または他の既知の硫黄同位体、またはそれらの組み合わせで標識されている。本発明の化合物の同位体標識のための任意の好適な方法を使用することができる。

ある特定の実施形態では、本発明の同位体標識化合物は、次式：

（式中、＊は、^１３Ｃを示す）によって表されるか、または薬学的に許容可能なその塩である。

式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）、（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）、もしくは（Ｌ８）の化合物またはそれらの塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）などの上記の化合物は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかで使用することができる。例えば、本発明の化合物を使用して、対象における腎臓機能を評価し、対象における糸球体濾過量の推定値を計算し、対象をモニタリングして腎臓機能の変化（例えば、急性腎臓傷害または初期のＣＫＤを示し得る機能低下）を検出し、腎臓機能の程度（例えば、正常、軽度の低下、中程度の低下、重度の低下、末期腎臓不全）に従って対象を分類し、ＣＫＤと診断されていない対照対象に対してＣＫＤを有する対象を区別することができる。さらに、化合物を使用して、経時的な腎臓機能の変化、または薬物治療への応答、疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病）、または生活習慣介入（例えば、食事、運動）をモニタリングし、薬物療法および／または腎臓移植に好適な候補者として対象を特定または除外することができる。

また本発明には、本明細書に記載の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩（例えば、薬学的に許容可能な塩））に特異的に結合する抗体または抗体断片も含まれる。小分子に特異的に結合する抗体を生成するための方法は、当技術分野で既知である。上記の抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含むポリペプチドなどの抗体誘導体も含まれる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質である。本発明はまた、本明細書に記載の抗体または抗体断片、および抗体誘導体を生成するための細胞を含む。一実施形態では、細胞は、真核細胞である。

方法
第２の実施形態では、本発明は、対象における本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩）のレベルを決定するための方法であって、（１）対象から得られた生体試料から分析用試料を調製することと、（２）化合物のレベルを決定することと、を含む、方法を提供する。

生体試料は、試料中の本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩）のレベルを決定するために分析される。試料を分析する方法としては、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）、質量分析法（例えば、ＭＳ、ＭＳ－ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的手法、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

例示的な方法では、対象から得られた生体試料中の式（Ｉ）：

の化合物またはその塩のレベルを決定することは、質量分析法を使用して、式（Ｉ）の化合物のレベルを決定することを含む。

一実施例では、生体試料は、質量分析法の前に液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を施してもよい。ＬＣ方法としては、例えば、高速ＬＣ（ＨＰＬＣ）、または超高速ＬＣ（ＵＨＰＬＣまたはＵＰＬＣ）を挙げることができる。いくつかの実施例では、ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフィーシステム、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、または混合相カラムクロマトグラフィーシステムを使用して行うことができる。

質量分析法は、断片化された試料をイオン化し、さらに分析するために荷電分子を作り出すためのイオン源を含む質量分析器を使用して実施される。試料のイオン化は、例えば、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）によって実施することができる。試料は、ポジティブモードまたはネガティブモードでイオン化してもよい。

試料がイオン化された後、正または負に帯電したイオンを分析して、質量電荷比を決定することができる。質量電荷比を決定するための例示的な好適な分析器としては、四重極分析器、イオントラップ分析器、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）分析器、および飛行時間分析器が挙げられる。

いくつかの実施形態では、質量分析法によって試料中の化合物Ａのレベルを決定するための方法は、約１７７、１５９、１３３、１３１、１２９、１１５、１１３、１１１、１０１、１００、９９、８９、８５、８３、７５、７３、５７．０３、５７．００、５６、９７、８７、７４、８４、および６７の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンからなる群から選択される、１つ以上のイオンを検出することを含む。

分析結果は、タンデムＭＳによって生成されたデータを含み得る。いくつかの実施例では、タンデムＭＳは、精密質量タンデムＭＳであってもよい。例えば、精密質量タンデム質量分析法は、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）分析器を使用してもよい。他の実施例では、タンデムＭＳは、ＦＴＭＳであってもよい。タンデムＭＳは、複雑な混合物中の化学成分の親娘の関係性を表すデータ構造を作成することを可能にする。この関係は、娘イオンが親イオンのサブコンポーネントを表す、親イオンと娘イオンとの互いに対する関係性を示すツリー様の構造によって表すことができる。

いくつかの実施形態では、本発明の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）のレベルを使用して、例えば、対象における腎臓機能を評価し、対象における糸球体濾過量の推定値を計算し、対象をモニタリングして腎臓機能の変化（例えば、急性腎臓傷害または初期のＣＫＤを示し得る機能低下）を検出し、腎臓機能の程度（例えば、正常、軽度の低下、中程度の低下、重度の低下、末期腎臓不全）に従って対象を分類し、ＣＫＤと診断されていない対照対象に対してＣＫＤを有する対象を区別することができる。さらに、化合物を使用して、経時的な腎臓機能の変化、または薬物治療への応答、疾患（例えば、ＩＩ型糖尿病）、または生活習慣介入（例えば、食事、運動）をモニタリングし、薬物療法および／または腎臓移植に好適な候補者として対象を特定または除外することができる。

例示的な方法では、対象における腎臓機能を評価することは、対象から得られた生体試料中の式（Ｉ）：

の化合物またはその塩のレベルを決定することを含み、基準レベルと比較して生体試料中の化合物の上昇したレベルが、対象における腎臓機能の低下を示す。

第３の実施形態では、本発明は、患者における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を計算するための方法であって、（１）対象から得られた生体試料中の式（Ｉ）の化合物またはその塩のレベルを決定するステップと、（２）化合物の測定されたレベルを利用するアルゴリズムを使用してｅＧＦＲを計算するステップであって、アルゴリズムが外因性濾過マーカを使用して測定されたＧＦＲを使用して展開される、ステップと、を含む方法を提供する。化合物のレベルを決定するために、任意の好適な方法を使用することができる。一実施形態では、化合物のレベルは、クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して決定される。

ある特定の実施形態では、ｅＧＦＲは、腎臓機能の評価に関連する１つ以上の追加の化合物を使用して計算される。一実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、Ｎ６－カルバモイルトレオニルアデノシン、４－アセトアミドブタノアート、エリトリトール、ｍｙｏ－イノシトール、エリトロナート、尿素、アラビトール、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、３－メチルグルタリルカルニチン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、Ｎ－アセチルメチオニン、Ｎ６－アセチルリシン、キヌレニン、アラボナート、スクシニルカルニチン、リボース、キシロナート、Ｎ－ホルミルメチオニン、Ｏ－メチルカテコールスルフェート、２－メチルブチリルカルニチン、フェニルアセチルグルタミン、Ｎ２，Ｎ５－ジアセチルオルニチン、トリプトファン、クレアチニン、ウラート、３－インドキシルスルフェート、ｐ－クレゾールスルフェート、およびＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）から選択される。別の実施形態では、ｅＧＦＲアルゴリズムは、血清シスタチンＣレベルをさらに利用する。さらに別の実施形態では、ｅＧＦＲアルゴリズムは、年齢、性別、および人種からなる群から選択される１つ以上の人口統計学的パラメータをさらに利用する。

第４の実施形態では、第２および第３の実施形態に記載の方法のための式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：

によって表されるか、またはその塩である。

第５の実施形態では、第２および第３の実施形態に記載の方法のための式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：

によって表されるか、またはそれらの塩である。

第６の実施形態では、第２および第３の実施形態に記載の方法のための式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＶ）：

によって表されるか、あるいはそれらの塩である。

第７の実施形態では、第２～第６の実施形態に記載の方法の化合物のレベルが、タンデム液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定される。

第８の実施形態では、第２～第７の実施形態に記載の方法が、化合物の決定されたレベルを数学的モデルに使用して腎臓機能を評価することをさらに含む。

第９の実施形態では、第２～第８の実施形態に記載の方法が、生体試料を分析して腎臓機能の評価に関連する１つ以上の追加の化合物のレベルを決定することをさらに含む。１つ以上の化合物は、次の化合物：シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、Ｎ６－カルバモイルトレオニルアデノシン、４－アセトアミドブタノアート、エリトリトール、ｍｙｏ－イノシトール、エリトロナート、尿素、アラビトール、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、３－メチルグルタリルカミチン（ｃａｍｉｔｉｎｅ）、Ｓ－アデノシルホモシステイン、Ｎ－アセチルメチオニン、Ｎ６－アセチルリシン、キヌレニン、アラボナート、スクシニルカルニチン、リボース、キシロナート、Ｎ－ホルミルメチオニン、Ｏ－メチルカテコールスルフェート、２－メチルブチリルカルニチン、フェニルアセチルグルタミン、Ｎ２，Ｎ５－ジアセチルオルニチン、トリプトファン、クレアチニン、ウラート、３－インドキシルスルフェート、およびｐ－クレゾールスルフェート、およびＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）、およびそれらの組み合わせからからなる群から選択され得る。一実施形態では、追加の化合物は、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、キヌレニン、ｍｙｏ－イノシトール、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）、およびクレアチニンからなる群から選択される。別の実施形態では、追加の化合物は、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、およびクレアチニンからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の追加の化合物のレベルは、第９の実施形態に記載の方法で決定される。

ある特定の実施形態では、第９の実施形態に記載の方法は、生体試料を分析してシュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、およびフェニルアセチルグルタミンのレベルを決定することをさらに含む。

ある特定の実施形態では、第９の実施形態に記載の方法は、生体試料を分析してシュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、およびクレアチニンのレベルを決定することをさらに含む。

本発明の化合物および１つ以上の追加の化合物のレベルを決定することは、記載の方法でより高い感度および特異性を可能にすることができる。例えば、生体試料中の、２つの化合物またはある特定の化合物のレベルの比率を対で分析することによって、腎臓機能の評価におけるより高い感度および特異性、ならびに腎臓機能の評価の支援を可能にすることができる。

式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、および／または１つ以上の追加の化合物のレベル（複数可）は、単純な比較（例えば、手作業での比較）を含む、様々な技法を使用して腎臓機能の参照レベルと比較してもよい。生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物、および／または１つ以上の追加の化合物のレベル（複数可）はまた、１つ以上の統計的分析（例えば、ｔ検定、ウェルチのＴ検定、ウィルコクソンの順位和検定、相関分析、ランダムフォレスト、Ｔスコア、Ｚスコア）を使用するか、あるいは数学的モデル（例えば、アルゴリズム、統計モデル）を使用して、参照レベルと比較してもよい。例えば、単一のアルゴリズムまたは多数のアルゴリズムを含む数学的モデルを使用して、対象における腎臓機能を評価してもよい。

方法の結果は、対象における腎臓機能の評価に有用な他の方法および測定（またはそれらの結果）とともに使用することができる。例えば、ＢＵＮ、ＳＣｒ、および／または尿アルブミン測定値などの臨床パラメータ、β－２ミクログロブリン、β－ＴＲＡＣＥ、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファンなどの腎臓機能のマーカ、ならびに例えばＣＫＤの家族歴または他のリスク因子などの患者情報を化合物とともに使用することができる。

ある特定の実施形態では、本発明の化合物および／または１つ以上の追加の化合物のレベルを、数学的または統計的モデルまたは式に使用して、腎臓機能のレベルおよび／または対象がＡＫＩもしくはＣＫＤを示し得る腎臓機能の弱まりを有する可能性を示す数値スコア（「腎臓機能スコア」）を医師に提供することができる。スコアは、化合物および／または化合物の組み合わせの、臨床的に有意に変化した参照レベル（複数可）に基づく。参照レベルは、アルゴリズムから導出するか、あるいは障害のあるＧＦＲのインデックスから算出することができる。対象の腎臓機能スコアを決定するための方法は、対象の腎臓機能スコアを決定するために、試料中の１つ以上の腎臓機能化合物のレベル（複数可）を１つ以上の化合物の腎臓機能参照レベルと比較することを含み得る。方法は、次のリスト：シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、Ｎ６－カルバモイルトレオニルアデノシン、４－アセトアミドブタノアート、エリトリトール、ｍｙｏ－イノシトール、エリトロナート、尿素、アラビトール、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、３－メチルグルタリルカルニチン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、Ｎ－アセチルメチオニン、Ｎ６－アセチルリシン、キヌレニン、アラボナート、スクシニルカミチン（ｃａｍｉｔｉｎｅ）、リボース、キシロナート、Ｎ－ホルミルメチオニン、Ｏ－メチルカテコールスルフェート、２－メチルブチリルカルニチン、フェニルアセチルグルタミン、Ｎ２，Ｎ５－ジアセチルオルニチン、トリプトファン、クレアチニン、ウラート、３－インドキシルスルフェート、ｐ－クレゾールスルフェート、およびＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）から選択される任意の数の化合物を用いてもよい。複数の化合物は、回帰分析などの統計的方法を含む任意の方法によって、腎臓機能と相関させることができる。

腎臓機能スコアを使用して、正常（すなわち腎臓機能障害がない）から軽度の低下、中程度の低下、重度の低下、または末期腎臓不全までの腎臓機能の範囲に対象を定めることができる。腎臓機能スコアの非限定的な使用例としては、腎臓機能の評価、ＧＦＲの推定、腎臓機能の分類、ＣＫＤの発症に対する感受性、ＡＫＩ発症に対する感受性、ＣＫＤの診断およびステージ、定期的な決定および腎臓機能スコアのモニタリングによるＣＫＤ進行のモニタリング、腎臓移植レシピエントの腎臓機能状態のモニタリング、療法的介入に対する応答の決定、薬効の評価、ならびに治療剤および／または造影剤の耐性の決定が挙げられる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法のための生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、または尿である。一実施形態では、生体試料は、血漿である。別の実施形態では、生体試料は、血清である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法のための生体試料は、糸球体濾過量の直接測定を可能にする薬剤を用いる治療の前に、対象から得られる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法のための対象は、ヒトである。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法のための対象は、腎臓機能障害の症状を有さないか、あるいは腎臓機能障害の既知のリスク因子を有さない。他の実施形態では、対象は、慢性腎臓疾患を発症するリスク因子（例えば、６０歳以上、高血圧、糖尿病、心血管疾患、ＣＫＤの家族歴）を呈する。ある特定の実施形態では、対象は、高血圧または糖尿病と以前に診断されている。ある特定の実施形態では、対象の慢性腎臓疾患の家族歴。ある特定の実施形態では、対象は、腎臓機能障害の症状を有する。ある特定の実施形態では、対象は、従来の方法を使用した腎臓機能評価が困難である対象である。

ある特定の実施形態では、対象は、肥満、痩せすぎ、菜食主義者、慢性の病気、および高齢者からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、対象は、腎臓ドナーになる候補者である。

ある特定の実施形態では、対象は、腎臓に毒性作用を有し得る薬剤を用いて治療されたか、あるいは該薬剤を用いる治療が検討されている。一実施形態では、薬剤は、造影剤である。別の実施形態では、薬剤は、化学療法剤などの、疾患または状態を治療するための治療剤である。さらに別の実施形態では、薬剤は、抗生物質である。

ある特定の実施形態では、方法を使用して、ＣＫＤを有する対象またはＣＫＤを発症する素因があると疑われる対象（例えば、ＣＫＤの家族歴、薬物療法、慢性の病気などに起因するリスクのある対象）における腎臓機能をモニタリングすることができる。一実施例では、本発明の化合物を使用して、ＣＫＤを有さない対象における腎臓機能をモニタリングしてもよい。例えば、ＣＫＤを発症する素因があると疑われる対象において、本明細書に記載の化合物を使用して、ＣＫＤの発症をモニタリングすることができる。

キット
本発明は、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩のレベルを測定するためのキットを含む。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩を含む。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩と、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の化合物のレベルを測定するための指示書とを含む。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、標識化合物（例えば、内部標準）、または生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩を検出することが可能な薬剤を含むことができる。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、標識化合物（例えば、内部標準）、または生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物もしくはそれらの塩を検出することが可能な薬剤と、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩のレベルを測定するための指示書とを含むことができる。

一実施形態では、上記のキットの内部標準は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の標識化合物またはそれらの塩（例えば、式（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）、（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）、もしくは（Ｌ８）の化合物またはそれらの塩）である。

一実施形態では、本発明のキットは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の非標識化合物またはそれらの塩と、内部標準として式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の標識化合物またはその塩（例えば、式（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）、（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）、もしくは（Ｌ８）の化合物、またはそれらの塩）と、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩のレベルを測定するための指示書とを含む。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、標識化合物（例えば、式（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）、（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）、もしくは（Ｌ８）の化合物またはそれらの塩などの内部標準）を含むことができる。他の実施形態では、キットは、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩を検出することが可能な薬剤と、試料中の化合物（例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩に対する抗体）の量を決定するための手段と、を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩の量は、本明細書に記載の本発明のキットを使用して、クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせによって決定することができる。ある特定の実施形態では、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩の量は、クロマトグラフィー、質量分析法、またはそれらの組み合わせによって決定することができる。ある特定の実施形態では、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩の量は、本発明のキットを使用して、ＬＣ－ＭＳによって決定することができる。

キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、または安定剤を含んでもよい。キットはまた、アッセイされ試験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含んでもよい。キットの各構成要素は通常、個々の容器内に封入され、すべての様々な容器は、試験対象が関連化合物に関連する障害を患っているか、あるいは発症するリスクがあるかどうかを決定するための指示書とともに単一のパッケージ内にある。

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、対象から得られた生体試料中で検出された化合物のレベルに基づいて、対象における腎臓機能を評価もしくはモニタリングするための、腎臓機能低下を発症する素因を決定するための、腎臓機能のレベルに従って対象を分類するための、ＣＫＤを診断もしくはモニタリングするための、ＡＫＩを診断もしくはモニタリングするための、または対象におけるＧＦＲを推定するための指示書を含み得る。

本発明のキットのある特定の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の化合物は、同位体標識されている。一実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の化合物は、例えば、トリチウム（^３Ｈ）または炭素１４（^１４Ｃ）で放射性標識されている。別の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の化合物は、重水素化され、炭素１３^（１３Ｃ）、酸素１７^（１７Ｏ）、酸素１８^（１８Ｏ）、硫黄３３（^３３Ｓ）、硫黄３４（^３４Ｓ）、もしくは任意の他の既知の硫黄同位体、またはそれらの組み合わせで標識されている。別の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の標識化合物は、上記の式（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）、（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）、または（Ｌ８）によって表される。一実施例では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の標識化合物（例えば、式（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）、（Ｌ５）、（Ｌ６）、（Ｌ７）、もしくは（Ｌ８）の化合物またはそれらの塩）を、内部標準として使用することができる。

本発明はまた、上記の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）に特異的に結合する抗体または抗体断片を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、本発明のキットは、上記の抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含むポリペプチドなどの抗体誘導体を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）に特異的に結合する抗体または抗体断片と、生体試料中の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩のレベルを測定するための指示書とを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、上記の抗体、抗体断片、または抗体誘導体と、対象から得られた生体試料中で検出された化合物のレベルに基づいて、腎臓機能を評価もしくはモニタリングするための、ＧＦＲを推定するための、腎臓機能低下を発症する素因を決定するための、腎臓機能のレベルに従って対象を分類するための、対象における慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を診断もしくはモニタリングするための、または急性腎臓傷害（ＡＫＩ）を診断もしくはモニタリングするための指示書とを含む。

ある特定の実施形態では、上記のキットは、１つ以上の追加のバイオマーカを含み、１つ以上の追加のバイオマーカが、腎臓機能の評価に関連している。本明細書に記載のいずれかの化合物は、本発明のキットで使用することができる。

様々な実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－アセチルアラニン、Ｎ６－カルバモイルトレオニルアデノシン、４－アセトアミドブタノアート、エリトリトール、ｍｙｏ－イノシトール、エリトロナート、尿素、アラビトール、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、３－メチルグルタリルカルニチン、Ｓ－アデノシルホモシステイン、Ｎ－アセチルメチオニン、Ｎ６－アセチルリシン、キヌレニン、アラボナート、スクシニルカルニチン、リボース、キシロナート、Ｎ－ホルミルメチオニン、Ｏ－メチルカテコールスルフェート、２－メチルブチリルカルニチン、フェニルアセチルグルタミン、Ｎ２，Ｎ５－ジアセチルオルニチン、トリプトファン、クレアチニン、ウラート、３－インドキシルスルフェート、ｐ－クレゾールスルフェート、およびＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、追加の化合物は、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、２－Ｃ－マンノピラノシルトリプトファン、キヌレニン、ｍｙｏ－イノシトール、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリンベタイン（ＴＭＡＰ）、およびクレアチニンからなる群から選択される。別の実施形態では、追加の化合物は、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、およびクレアチニンからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、上記の本発明の化合物（式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩）、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、およびフェニルアセチルグルタミンを含む。

ある特定の実施形態では、本発明のキットは、上記の本発明の化合物（式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）の化合物またはそれらの塩）、シュードウリジン、Ｎ－アセチルトレオニン、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、およびクレアチニンを含む。

調製する方法
好適な合成する方法については、次のＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８５、またはＷｕｔｓ Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５^ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ ２０１４、およびＲｉｃｈａｒｄ Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，４^ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＶＣＨ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ，１９８９に記載の参照文献を参照してもよい。

第１の実施形態では、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、
ａ）式（Ｖ）：

の化合物またはそれらの塩を、Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）（その共鳴構造Ｒ’_３Ｐ^＋Ｃ^-ＨＳＭｅによって表すこともできる）などのウィッティヒ試薬と反応させて、式（Ｖａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（Ｖａ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（Ｉ）の化合物またはその塩を形成するステップと
を含む方法によって調製することができる。

ある特定の実施形態では、第１の実施形態の方法は、式（Ｖａ）の化合物を精製して、式（Ｖｂ）：

の化合物を得、続いて式（Ｖｂ）の化合物を脱保護して式（ＩＩ）の化合物またはその塩を形成することをさらに含む。

ある特定の実施形態では、第１の実施形態の方法は、式（Ｉ）の化合物またはその塩を精製して、トランス異性体とシス異性体とを分離して、式（ＩＩ）の化合物またはその塩を得ることをさらに含む。

第２の実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を調製する方法であって、
ａ）式（ＶＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（ＶＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）（ＶＩａ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩｂ）：

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩｂ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を形成するステップと
を含む方法を提供する。

あるいは、第３の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩は、
ａ）式（ＶＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（ＶＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩａ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩｃ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩｃ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を得るステップと
を含む方法によって調製することができる。

ある特定の実施形態では、第１、第２、または第３の実施形態の方法における脱保護反応は、酸の存在下で行うことができる。任意の好適な酸を使用することができる。例示的な酸としては、限定されないが、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム、ｐ－トルエンスルホン酸（ｐ－ＴｓＯＨ）、ギ酸、または水素の形態の強もしくは弱カチオン交換樹脂が挙げられる。ある特定の実施形態では、酸は、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ８樹脂である。

ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物またはその塩は、式（ＶＩ）の化合物を式（ＶＩ’）の化合物で置き換えた第２または第３の実施形態に記載の方法に従って調製することができる：

。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の同位体標識化合物は、同位体標識出発物質および／または試薬を使用して調製することができる。一実施形態では、同位体標識ウィッティヒ試薬を、第１、第２、または第３の実施形態に記載の方法で使用して、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の同位体標識化合物を調製することができる。一実施形態では、同位体標識ウィッティヒ試薬は、Ｐｈ_３Ｐ＝ＣＨ_２ＳＣＤ_３である（その共鳴構造Ｐｈ_３Ｐ^＋Ｃ^-ＨＳＣＤ_３によって表すこともできる）。別の実施形態では、同位体標識ウィッティヒ試薬は、Ｐｈ_３Ｐ＝ＣＨ_２Ｓ^１３ＣＤ_３である（その共鳴構造Ｐｈ_３Ｐ^＋Ｃ^-ＨＳ^１３ＣＤ_３によって表すこともできる）。

さらに別の実施形態では、同位体標識２，３－シクロヘキシリデン－エリトルロン酸を使用して、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の同位体標識化合物を調製することができる。一実施形態では、同位体標識２，３－シクロヘキシリデン－エリトルロン酸は、次式：

によって表され、式中、＊は、^１３Ｃを示す。

第４の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、
ａ）式（ＶＩＩ）：

の化合物またはその塩を、Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅなどのウィッティヒ試薬と反応させて、式（ＶＩＩａ）

（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子吸引基であり、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩａ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩｂ）

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩＩｂ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の化合物を形成するステップと
を含む方法によって調製することができる。

あるいは、第５の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、
ａ）式（ＶＩＩ）：

の化合物またはその塩を、Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅなどのウィッティヒ試薬と反応させて、式（ＶＩＩａ）

（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子吸引基であり、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩａ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩｃ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩＩｃ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を得るステップと
を含む方法によって調製することができる。

ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物またはその塩は、式（ＶＩＩ）の化合物を式（ＶＩＩ’）の化合物で置き換えた第４または第５の実施形態に記載の方法に従って調製することができる：

。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）、または（ＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の化合物を化合物式（ＶＩＩ”）で置き換えた第４または第５の実施形態に記載の方法によって調製することができる：

。

第６の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩は、
ａ）式（ＶＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３ＰＣＨ_２ＳＭｅと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）

（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引性基であり、Ｒ_１およびＲ_２は、シリル基であり、Ｒ_３はｔ－ブチル基であるか、あるいはＲ_３はシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩｂ）：

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を形成するステップと
を含む方法によって調製することができる。

あるいは、第７の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩は、
ａ）式（ＶＩＩＩ）：

の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）

（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引性基であり、Ｒ_１およびＲ_２は、シリル基であり、Ｒ_３はｔ－ブチル基であるか、あるいはＲ_３はシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩＩｃ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩＩＩｃ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を得るステップと
を含む方法によって調製することができる。

ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物またはその塩は、式（ＶＩＩＩ）の化合物を式（ＶＩＩＩ’）の化合物で置き換えた第６または第７の実施形態に記載の方法に従って調製することができる：

。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）、または（ＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）の化合物を化合物式（ＶＩＩＩ”）で置き換えた第４または第５の実施形態に記載の方法によって調製することができる：

。

ある特定の実施形態では、上記の方法（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、または第７の実施形態）におけるウィッティヒ試薬は、メチルチオメチルトリフェニルホスホニウムイリド（Ｐｈ_３Ｐ＝ＣＨＳＭｅ（その共鳴構造Ｐｈ_３Ｐ^＋Ｃ^-ＨＳＭｅによって表すこともできる））である。

ある特定の実施形態では、上記の方法（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、または第７の実施形態）におけるウィッティヒ反応は、塩基の存在下で行われる。任意の適切な塩基を使用することができる。例示的な塩基としては、限定されないが、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド、カリウムビス（トリメチルシリル）アミド、およびｎ－ブチルリチウムが挙げられる。

一実施形態では、上記の方法（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、または第７の実施形態）におけるウィッティヒ反応は、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドの存在下で行われる。

ある特定の実施形態では、上記の方法（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、または第７の実施形態）でのウィッティヒ反応は、有機溶媒中で行われる。限定されないが、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ－ブチルエーテル、ジクロロメタンなどを含み得る、任意の好適な有機溶媒または有機溶媒の混合物を使用することができる。例えば、ウィッティヒ反応は、テトラヒドロフラン中で行われる。

さらに別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩は、式（ＩＸ）：

の化合物またはその塩を、メタンチオールまたはその塩と反応させることによって調製することができる（式中、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してシリル基であり、Ｒ_３はｔ－ブチル基であるか、あるいはＲ_３はシリル基である）。

第８の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、
ａ）式（ＩＸ）の化合物をメタンチオールと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩＩｂ）：

の化合物またはその塩を得るステップと、
ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を形成するステップと
を含む方法によって調製することができる。

第９の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、
ａ）式（ＩＸ）の化合物をメタンチオールと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩＩｂ）：

の化合物またはその塩を形成するステップと、
ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を得るステップと
を含む方法によって調製することができる。

ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物またはその塩は、式（ＩＸ）の化合物を式（ＩＸ’）の化合物によって置き換えた第７または第８の実施形態に記載の方法によって調製することができる：

。

ある特定の実施形態では、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはそれらの塩は、式（ＩＸ）の化合物を式（ＩＸ”）の化合物によって置き換えた第７または第８の実施形態に記載の方法によって調製することができる：

。

ある特定の実施形態では、アルキンのヒドロチオール化反応（すなわち、第８または第９の実施形態におけるメタンチオールとの反応）は、合成アプローチに使用され得る。アルキンのヒドロチオール化は、例えば、ＵＶ照射、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、カチオン性ロジウムとイリジウムとの錯体、トリウムとウランとの錯体、ロジウム錯体などのラジカル開始剤、炭酸セシウム、および／または金によって触媒され得る。

ある特定の実施形態では（例えば、第４、第５、第６、第７、第８、または第９の実施形態では）、上記のシリル基としては、限定されないが、トリアキルシリル（例えば、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルヘキシルシリル、トリメチルシリル、またはトリイソプロピルシリル）、トリベンジルシリル、トリフェニルシリル、２－ノルボルニルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル、２－トリメチルエチルシリル（ＴＥＯＣ）、または［２－（トリメチルシリル）エトキシ］メチル）が挙げられる。ある特定の実施形態では、シリル基は、トリアキルシリル基である。ある特定の実施形態では、シリル基は、トリメチルシリルまたはトリス（トリメチルシリル）シリルである。

保護基、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３の除去は、保護基の性質に依存する。一実施形態では、保護基は、フッ化物および／または酸である脱保護試薬での処理によって除去することができる。ある特定の実施形態では、脱保護試薬としては、限定されないが、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム、トリス（ジメチルアミノ）スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート、フッ化水素もしくはその溶媒和物、フッ化水素ピリジン、四フッ化ケイ素、ヘキサフルオロケイ酸、フッ化セシウム、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム、ｐ－トルエンスルホン酸（ｐ－ＴｓＯＨ）、ギ酸、または過ヨウ素酸が挙げられる。ある特定の実施形態では、脱保護試薬は、塩酸またはフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）である。ある特定の実施形態では、脱保護試薬は、フッ化水素－ピリジン（ＨＦ－ピリジン）である。

ある特定の実施形態では（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、または第９の実施形態では）、上記の方法に記載の精製ステップは、任意の好適な精製方法によって行うことができる。ある特定の実施形態では、精製ステップは、シス異性体から対応するトランス異性体（二重結合のトランス配置）の分離を生じる。ある特定の実施形態では、トランス異性体とシス異性体との分離は、クロマトグラフィーまたは結晶化によって達成することができる。ある特定の実施形態では、トランス異性体とシス異性体との分離は、ＨＰＬＣによって達成することができる。

材料および方法
試薬および機器
質量分析法グレードのギ酸（約９８％）、ＨＰＬＣグレードのトリフルオロ酢酸（≧９９．０％）、活性炭担持パラジウム（１０％）、（メチルチオメチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、無水テトラヒドロフラン、ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（テトラヒドロフラン中１．０Ｍ）、２，３－シクロヘキリデン－Ｌ－エリトルロン酸、Ｄｏｗｅｘ^{（登録商標）}５０ＷＸ８（水素形態、１００～２００メッシュ）、および一塩基性リン酸ナトリウムをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから、ＨＰＬＣグレードのメタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、濃水酸化アンモニウム、および水をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、酸化重水素（９９．８％）をＡｃｒｏｓから入手した。混合にはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのボルテックスミキサを使用した。５０ｍＬチューブの遠心分離にはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｏｒｖａｌｌ ＳＴ４０Ｒ遠心分離機を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブの遠心分離にはＳｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ２１Ｒ微量遠心分離機を使用した。化学反応の混合には、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの磁気スターラを使用した。ヒト血漿（Ｋ_２－ＥＤＴＡ）は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから入手し、－８０°Ｃで保存した。ヒトの尿は家庭で収集された。Ａｒｇｏｎａｕｔ ＳＰＥ ＤＲＹ^（商標）９６ ＤＵＡＬ蒸発器を溶媒の蒸発に使用した。すべてのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ５００または７００ＭＨｚ機器で行った。

クロマトグラフィー
特に明記されない限り、バイナリソルベントマネージャー、冷蔵試料マネージャー（１２°Ｃに設定）、およびカラムマネージャー（４０°Ｃに設定）を装備したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを、逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ^{（登録商標）}ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を備えた液体クロマトグラフィーに使用した。最終試料溶液の５．０μＬのループ固定アリコートを各試料に注入した。溶出液は、質量分析器のエレクトロスプレー源に直接導入した。流量は３５０μＬ／分であり、溶出液は、質量分析器のエレクトロスプレー源に直接導入した。強ニードル洗浄液（２００μＬ）は未希釈のメタノールであり、弱ニードル洗浄液（６００μＬ）は、メタノールと水との混合物（０．５：９９．５）であった。シール洗浄液は、メタノールと水との混合物（１０：９０）であった。

クロマトグラフィー：塩基性条件
移動相Ａは、水中６．５ｍＭの重炭酸アンモニウムであり、移動相Ｂは、メタノール／水（９５：５）中６．５ｍＭの重炭酸アンモニウムであった。線形勾配溶出は、０％の移動相Ｂの初期条件で行い、これを１．５０分間保持した。次いで、移動相Ｂを０．５０分で９８％に増加させ、０．９０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために、０．１０分で０％に戻した。合計実行時間は、４．００分であった。

クロマトグラフィー：水素化生成物の条件、酸性条件
移動相Ａは水中０．１％のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。線形勾配溶出は、２％の移動相Ｂの初期条件で行い、これを３．００分間保持した。次いで、移動相Ｂを０．４０分で９８％に増加させ、０．５０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために、０．１０分で２％に戻した。合計実行時間は、５．００分であった。

クロマトグラフィー：水素化生成物の条件、重水素化酸性条件
移動相Ａは重水素化水中０．１％のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。線形勾配溶出は、２％の移動相Ｂの初期条件で行い、これを３．００分間で７％に増加させた。次いで、移動相Ｂを０．４０分で９８％に増加させ、０．５０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために、０．１０分で２％に戻した。合計実行時間は、５．００分であった。

クロマトグラフィー：ウィッティヒ反応生成物の条件
移動相Ａは水中０．１％のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。線形勾配溶出は、３８％の移動相Ｂの初期条件で行い、これを３．００分間で４５％に増加させた。次いで、移動相Ｂを０．４０分で９８％に増加させ、０．５０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために、０．１０分で３８％に戻した。合計実行時間は、５．００分であった。

クロマトグラフィー：二重結合決定の条件（スルホキシド）
移動相Ａは水中０．１％のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。線形勾配溶出は、２０％の移動相Ｂの初期条件で行い、これを３．００分間で３０％に増加させた。次いで、移動相Ｂを１．４０分で９８％に増加させ、０．５０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために、０．１０分で２０％に戻した。合計実行時間は、６．００分であった。

質量分析法
加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）プローブを装備したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析器を、ネガティブモードで使用した。機器は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ^（商標）２．７、およびＸＣａｌｉｂｕｒ^（商標）２．２ソフトウェア（後で３．０にアップグレード）によって制御した。加熱エレクトロスプレー源は、ヒーター温度４３０°Ｃ、シースガス６５、補助ガス流量１５、掃引ガス０、イオンスプレー電圧３．２５ｋＶ、キャピラリー温度３５０°Ｃ、およびＳレンズＲＦレベル６０％に設定した。３０，０００の分解能を使用して、質量範囲ｍ／ｚ１００～６００のフルスキャンＦＴＭＳスペクトルを収集した。すべての断片化実験は、スキャン範囲ｍ／ｚ５０～２００、分解能１５，０００、単離幅１．０、活性化Ｑ０．２５０、および活性化時間１０．０ｍｓに設定した。すべての質量分析データは、ロックマスなしで取得および処理し、外部質量較正を使用した。

ＭＳ^２実験の正規化衝突エネルギーは、ｍ／ｚ１７７．０２（または重水素交換では１７９．０３）のＣＩＤ ＭＳ^２実験では２８．０ｅＶで、対応するＨＣＤ ＭＳ^２実験では１００ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１５９．０１（または重水素交換では１７９．０３／１６０．０２および１７９．０３／１６１．０２）のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２６．０および２５．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１５９．０１のＨＣＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１（ＣＩＤ）および第２（ＨＣＤ）ステージの断片化でそれぞれ２６．０および１００ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１２９．０２（または重水素交換では１７９．０３／１３０．０３および１７９．０３／１３１．０３）のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２５．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１１５．０２（または重水素交換では１７９．０３／１１６．０３）のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１ステージおよび第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および３０．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／８５．０３（または重水素交換では１７９．０３／８６．０４および１７９．０３／８７．０４）のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２１．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／８５．０３のＨＣＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１（ＣＩＤ）および第２（ＨＣＤ）ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２００ｅＶであった。

水素化生成物の場合、ｍ／ｚ１７９．０４（または重水素交換では１８１．０５）のＣＩＤ ＭＳ^２実験では、正規化衝突エネルギーは、２８．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７９．０４／１３１．０３（または重水素交換では１８１．０５／１３２．０４および１８１．０５／１３３．０５）のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２５．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７９．０４／１３１．０３のＨＣＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１（ＣＩＤ）および第２（ＨＣＤ）ステージの断片化でそれぞれ２８．０および１２０ｅＶであった。

ウィッティヒ反応生成物（シスおよびトランス保護チオエノールエーテルの混合物）の場合、正規化衝突エネルギーは、ｍ／ｚ７０～２８０のスキャン範囲のｍ／ｚ２５７．０９のＣＩＤ ＭＳ^２実験では、２６．０ｅＶであった。

スルホキシドの場合、シスおよびトランス保護チオエノールエーテルの二重結合配置の決定では、ｍ／ｚ７５～２８０のスキャン範囲のｍ／ｚ２７３．０８のＣＩＤ ＭＳ^２実験では、正規化衝突エネルギーは２６．０ｅＶであった。

実施例１．血漿および尿代謝物化合物Ａの構造解明
試料前処理
５０ｍＬのプラスチック製遠沈管に、プールした６ｍＬのヒト血漿および３０ｍＬのメタノールを添加した。混合物を約１分間ボルテックスし、４０００ｒｐｍで１５分間、４°Ｃで遠心分離した。上清を各ウェルに５００μＬ入る９６ウェルプレートに移し、穏やかな４０°Ｃの窒素流下で乾燥させた。５つのウェルの残留物を、ボルテックス（各１分）しながら水（２００ｍＬ）に順次再溶解した。次いで、混合物を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、室温で１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで上清をＬＣ／ＭＳ分析用の試料バイアルに移した。尿試料を、室温で１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清（必要に応じて水で希釈）をＬＣ／ＭＳ分析用の試料バイアルに移した。血漿および尿試料中の化合物Ａの保持時間を比較するために、注入溶液を１．０Ｎの塩酸でｐＨ約３．０に調節した。

化合物Ａの水素化
２０ｍＬの反応バイアルに、４ｍＬの尿、３０ｍｇの活性炭担持パラジウム（１０％）、および磁気攪拌棒を添加した。バイアルを水素でフラッシュし、次いで水素で満たしたバルーンを装備した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いでゆっくりとシリンジフィルタ（０．４５μＭ）に通した。透明な濾液をＬＣ／ＭＳ分析のために試料バイアルに移した。

構造解明
Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析器を使用して、高分解能質量スペクトルを取得した。プロトン化疑似分子イオンの式は、計算した１７７．０２２７０のモノアイソトピック質量を用いる精密質量測定によって、Ｃ_６Ｈ_９Ｏ_４Ｓ^－であると事前に決定した。現在の研究は、血漿抽出物を使用してクロマトグラフィー条件を最適化することによって開始した。１００％重炭酸アンモニウム水溶液を使用する塩基性移動相条件下の逆相カラム（１．１９分、図１）で、化合物Ａをわずかのみ保持した。図２に示されるように、疑似分子イオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって、質量範囲全体にわたり多くの娘イオンが生成された。酸性移動相条件を使用すると、０．１％のギ酸を含む９８％水および０．１％のギ酸を含む２％アセトニトリルの同じ逆相カラムで、化合物Ａをより良好に保持した（２．５３分、図３Ａ）。さらなる調査のために、この方法を選択した。

化合物Ａは血漿中に低レベルで存在することが判明した。尿試料を試験したところ、血漿抽出物中の化合物Ａの保持時間と一致するピークは、尿でより強かった（図３Ｂ）。尿と血漿抽出物との混合物を注入すると、血漿中の化合物Ａとともに尿中の化合物が共溶出した（図３Ｃ）。尿中の化合物のプロダクトイオンスペクトル（図４）はまた、血漿抽出物中の化合物Ａのスペクトル（図２）とも非常によく一致した。これらの結果は、化合物Ａが血漿中よりも高濃度で尿中に存在することを確立した。尿試料を使用して、さらなる分析を行った。

疑似分子イオンのＣＩＤプロダクトイオンスペクトルによって、図４に示されるように、ｍ／ｚ１５９、１３３、１３１、１２９、１１５、１１３、１１１、１０１、１００、９９、８９、８５、８３、７５、７３、５７．０３、および５７．００である、異なる強度を有する１７の娘イオンが生成された。高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）による別のプロダクトイオンスペクトル（図５）によって、３つの追加の娘イオン（ｍ／ｚ９７、８７、および７４）が生成された。ｍ／ｚ８５、１１５、１２９、および１５９イオン（ＣＩＤ ＭＳ^３、図６Ａ～Ｄ）、ならびにｍ／ｚ８５および１５９イオン（ＨＣＤ ＭＳ^３、図６Ｅ～Ｆ）のさらなる断片化スペクトルによって、さらに２つのイオン（ｍ／ｚ８４および６７）が検出され、ある特定のイオンの関係性が確立された。

これらの断片とそれらの形成経路との理論的説明に基づいて、化合物Ａの化学構造が提案された。提案された構造は、以下に示されるように、未決定の二重結合配置および未決定の立体化学を有する。

。

化合物Ａは、５’－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）から生合成される５－メチルチオリボース（ＭＴＲ）に近い構造的類似性を有する。

化合物Ａの立体化学を、ＭＴＲおよびＭＴＡとのその構造的類似性に基づいて割り当て、式は次の構造によって表されると決定した：

。

二重結合配置の決定
実施例２、方法１で合成された保護トランスおよびシスチオエノールエーテルの混合物の一部分を、中性移動相条件下で半分取してクロマトグラフィーにかけ、早期に溶出する異性体の溶出液を収集し、蒸発乾固させた（ＨＰＬＣ精製試料と称される）。得られた残留物を^１Ｈ ＮＭＲ（図７）によって分析すると、スペクトルは、予想外にも、保護チオエノールエーテルの異性体（シスまたはトランス）のいずれのスペクトルとも一致しなかった。ＣＯＳＹ、ＬＣ／ＭＳ、およびＬＣ／ＭＳ^２スペクトルを使用したさらなる分析によって、早期に溶出する異性体の精製プロセス中に、一対のジアステレオマー型のスルホキシド（２．４２および２．５３分）が形成されたことが示された（ＬＣ／ＭＳ^２、図８）。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、オレフィンのプロトン間に１５Ｈｚのカップリング定数を示し、一対のジアステレオマー型のスルホキシドの二重結合配置がトランスであったことを示している。スルホキシドは、精製プロセス中に早期に溶出した保護チオエノールエーテルから形成されたので、保護チオエノールエーテルの早期に溶出する異性体の二重結合配置はトランスであると決定した。

実施例２、方法１で合成された保護トランスおよびシスチオエノールエーテルの混合物を、ＬＣ／ＭＳによって分析した。図９に示されるように、ＬＣ／ＭＳによって、保護トランスおよびシスチオエノールエーテルがそれぞれ４．４５および４．４９分で検出された。保護トランスチオエノールエーテルは、^１Ｈ ＮＭＲによるＨＰＬＣ精製試料では観察されなかったが、ＬＣ／ＭＳ分析（図１０）によって明らかに４．４５分で検出され、保護トランスチオエノールエーテルのスルホキシドへの酸化が不完全であることを示している。保護トランスチオエノールエーテルは、ＨＰＬＣ精製試料中に依然として存在していたが、スルホキシドと比較してはるかに低いレベルであった。ＨＰＬＣ精製試料をわずかに酸性の条件下で処理すると、保護トランスチオエノールエーテルからの保護基の除去が達成されて、２．５４分でＬＣ／ＭＳで検出されたようにトランスＤＭＴＰＡを形成した。トランスＤＭＴＰＡは、シスおよびトランスＤＭＴＰＡの混合物の後期に溶出する異性体と共溶出した（図１１）。したがって、後期に溶出するＤＭＴＰＡ異性体は、トランス二重結合配置を有すると決定した。したがって、化合物Ａも後期に溶出する異性体と共溶出するため、トランス二重結合配置を有すると決定した。立体化学が割り当てられた化合物Ａの構造を、式（ＩＩＩ）として以下に示す。

。

スキーム１および２に示されるように、化合物Ａの脱プロトン化された疑似分子イオンからの可能な断片化経路を提案する。

スキーム１．可能な断片化経路

スキーム２．可能な断片化経路

重水素交換による構造検証
提案された化合物Ａの構造は、重水素交換実験によって検証した。簡単に言えば、クロマトグラフィーの移動相を重水素化溶媒に変更し、尿抽出物を再度分析した。フルスキャン質量スペクトルを取得し、ｍ／ｚ１７９．０３５１８イオン（Ｃ_６Ｈ_７Ｄ_２Ｏ_４Ｓ^－Ｓの計算値から－０．４ＰＰＭ減算）を有する新しいイオンを、提案された構造と一致する、重水素化化合物Ａ（図１２）の主要な種として検出した。ｍ／ｚ１７９イオンのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）（図１３）および対応するｍ／ｚ１６０（図１４）、１６１（図１５）、１３０、１３１、８６、８７、および１１６（図１６Ａ～Ｅ）イオンのＭＳ^３スペクトルを示す。二重に重水素化された断片を、ｍ／ｚ１６１、１３５、１３１、１１７、１０３、１０２、８７、７７、および５９で検出したが、ｍ／ｚ１６０、１３２、１３０、１１６、１１４、１１２、１０２、１０１、１００、９０、８６、８４、７６、および５８には単一の重水素が組み込まれていた。重水素が組み込まれていない断片を、ｍ／ｚ１１３、１１１、８９、８３、７５、７２、および５７で観察した。ｍ／ｚ１６０および１６１イオンの検出は、二重に重水素化された親イオンからのＨＯＤおよびＨ_２Ｏの損失をそれぞれ示している。Ｈ_２Ｏの損失前に、酸素上の重陽子の、炭素上のプロトンとの交換に起因して、ｍ／ｚ１６１イオンの形成が生じ得る。これらのすべてのイオンは、本来提案された断片化経路（スキーム３～５を参照）を十分に理論的に説明することができ、化合物Ａの提案された構造の有効性について説得力のある証拠を提供している。

スキーム３．重水素化類似体の可能な断片化経路

スキーム４．重水素化類似体の可能な断片化経路

スキーム５．重水素化類似体の可能な断片化経路

水素化による構造検証
提案された構造は、炭素－炭素二重結合を含有し、飽和実験によってさらに確認した。尿試料に接触水素化を施し、反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析によって、化合物Ａに対応するピークの消失（約２．５分）、およびＣ_６Ｈ_１１Ｏ_４Ｓ^－（１７９．０３８３５の計算値から０．２ｐｐｍ減算）の式に対応するｍ／ｚ１７９．０３８３９を有するピークの出現が３．１７分で示されている（図１７）。ｍ／ｚ１３１イオンのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）（図１８）およびＭＳ^３スペクトル（ＣＩＤおよびＨＣＤ）（図１９）は、断片の理論的説明としてスキーム６に示されるように、化合物Ａの飽和構造の同一性を裏付けている。

スキーム６．水素化類似体の可能な断片化経路

重水素化移動相を使用したＬＣ／ＭＳ分析によって、Ｃ_６Ｈ_９Ｄ_２Ｏ_４Ｓ^－（１８１．０５１９１の計算値から－１．７７ｐｐｍ減算）の式に対応するｍ／ｚ１８１．０５０５９を有する疑似分子イオンに２つの重陽子が組み込まれていることが明らかになった（図２０）。重水素化種のプロダクトイオンスペクトル（図２１）、ならびにｍ／ｚ１３２イオン（図２２）およびｍ／ｚ１３３イオン（図２３）のＭＳ^３スペクトルは、予想される飽和生成物と一致している。重水素化種の可能な断片化経路を、スキーム７に概説する。

スキーム７．水素化類似体の二重重水素化種の可能な断片化経路

提案された構造は、合成標準との直接比較によってさらに確認した（実施例１を参照）。実施例２、方法１によって調製した合成シスおよびトランスＤＭＴＰＡ混合物は、ＬＣ／ＭＳによって、２．１９および２．５３分でｍ／ｚ１７７．０２２６２の分子イオン（計算値から－０．５ｐｐｍ減算）（図２４）を含む生成物を生じた。化合物Ａとさらに比較するために、方法１によって調製した２．５３分で溶出する生成物（後にトランスＤＭＴＰＡであると決定された）を選択した。

合成トランスＤＭＴＰＡの保持時間（図２５Ｂ）は、クロマトグラフィー条件下で共溶出（図２５Ｃ）したため、尿中の化合物Ａの保持時間（図２５Ａ）と一致した。ＣＩＤ（図２６）およびＨＣＤ（図２７）による合成トランスＤＭＴＰＡのプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）は、断片化パターンおよび強度分布によってこれらの化合物Ａ（図４および５）のものと一致した。合成トランスＤＭＴＰＡの１１５、１２９、１５９、および８５娘イオンのＣＩＤによるさらなる断片化によって、ＭＳ^３スペクトルが生成された（図２８Ａ～Ｄ）。１５９および８５の娘イオンのＭＳ^３スペクトルもまた、ＨＣＤによって生成された（図２９Ａ～Ｂ）。得られた合成トランスＤＭＴＰＡのＭＳ^３スペクトルは、化合物Ａのスペクトルと本質的に同一であった（図６）。さらに、重水素交換後に合成トランスＤＭＴＰＡを分析したところ、図１３～１５と比較して、図３０～３３に示されるように、得られたＭＳ、ＭＳ^２、およびＭＳ^３スペクトルはまた、化合物Ａのスペクトルと非常によく一致した。これらのすべてのクロマトグラフィーおよびＭＳスペクトルデータは、化合物ＡがトランスＤＭＴＰＡであることを強く裏付けている。

実施例２．（２Ｒ，３Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－５－メチルチオ－トランス－４－ペンテン酸（トランスＤＭＴＰＡ）の合成
方法１．
ウィッティヒ反応
（メチルチオメチル）トリフェニルホスホニウムクロリド（５００ｍｇ、１．３９ミリモル、２．２当量）を、２５ｍＬの丸底フラスコ内のアルゴン雰囲気下でテトラヒドロフランに懸濁した。混合物を０℃に冷却し、混合物を攪拌しながらナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（テトラヒドロフラン中１．０Ｍ、１．３９ｍＬ、１．３９ミリモル、２．２当量）をゆっくりと添加した。得られた混合物を０℃でさらに３０分間撹拌し、２，３－シクロヘキシリデン－Ｌ－エリトルロン酸（１．０ｍＬのテトラヒドロフラン中１３６ｍｇ、０．６３３ミリモル、１．０当量）をゆっくりと添加した。５分後、反応混合物を室温に温め、一晩攪拌した。反応混合物をＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液（１．０Ｍ、２５ｍＬ）に移し、得られた混合物（ｐＨ約６．０）を酢酸エチル（２ｘ４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発乾固させて、濃厚な油（４０２ｍｇ）を得た。この粗抽出物を、シリカゲルカラム（２．５×１８ｃｍ）でのクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチル／メタノール（９：１）で溶出した。対応する画分をプールし、濃縮乾固して、褐色がかったワックス様物質（７５ｍｇ、４６％）として、保護チオエノールエーテルのＥ／Ｚ異性体の混合物（約５：４）を得た。

構造は、^１Ｈ、^１３Ｃ、および^１Ｈ－^１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ分光分析および質量分析法によって特徴付けた。精製したウィッティヒ反応生成物（保護シスおよびトランスチオエノールエーテルの混合物）の^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図３４に示す。精製したウィッティヒ反応生成物のＬＣ／ＭＳクロマトラムおよび質量スペクトルを図３５に示す。精製したウィッティヒ反応生成物の室温での２．８１分または２．９８分のプロダクトイオンスペクトル（ＭＳ^２）を、それぞれ図３６および３７に示す。

脱保護
２０ｍＬシンチレーションバイアルに、保護シスおよびトランスチオエノールエーテルの混合物（０．５０ｍＬのアセトニトリル中２．０ｍｇ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ８（０．７５ｇ、水（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄）、水（４．５ｍＬ）、および撹拌バーを添加した。室温で２０分間攪拌した後、混合物を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。合わせた上清を、希釈した水酸化アンモニウム（水中４％の濃水酸化アンモニウム）でｐＨ約７に調節した。アリコートを水で希釈し、ＬＣ／ＭＳによって分析した。

脱保護のための第２の方法は、０．１％のギ酸水溶液に出発物質を溶解することによって行った。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、溶液を室温で１時間保持した。

ウィッティヒ反応生成物のＨＰＬＣ精製（保護シスおよびトランスチオエノールエーテルの混合物）
バイナリソルベントポンプユニット、冷蔵オートサンプラ（４°Ｃに設定）、およびカラムヒーター（５０°Ｃに設定）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＨＰＬＣシステムを、逆相カラム（ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅ^{（登録商標）}Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を備えた半分取液体クロマトグラフィーに使用した。移動相Ａは、水／アセトニトリル（９２：８）であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。線形勾配溶出は、１００％の移動相Ａの初期条件で行い、これを１０分間維持した。移動相Ｂを１．０分で９０％に増加させ、２．０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために０．５分で０％に戻し、２．５分間維持した。１６分の合計実行時間の間の流量は、９００μＬ／分であった。溶出液は、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ５５００質量分析器のエレクトロスプレー源に直接導入した。ニードル洗浄液には、イソプロパノールを使用した。質量分析器は、ネガティブ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。イオンスプレー電圧は－４．３ｋＶ、源温度は５５０°Ｃ、カーテンガスは３０、ならびにネブライザおよび脱溶媒ガスの流量は７０、ＣＡＤガスは中程度に設定した。２つの遷移（２５７．１／１１５．０および２５７．１／１００．０）は、－６０Ｖのデクラスタリングポテンシャル、－１０Ｖのエントランスポテンシャル、－１０ｅＶ（離調）の衝突エネルギー、および－１２Ｖの衝突セルイグジットポテンシャルでモニタリングした。質量分析器の切り替えバルブを使用して、約４００回の実験から（早期の溶出ピークでは）７．０～９．８分の間の溶出液を、自動的に収集フラスコに転用した。収集した画分を、穏やかな窒素流下の室温で２週間乾燥させた。残留物をメタノールに溶解し、溶液を小さなバイアルに移した。溶媒を除去した後、残留物をＮＭＲおよびＭＳによって分析した。スルホキシドの結果は、

である。２．４２分で溶出する異性体では、ＨＲＥＳＩＭＳ ｍ／ｚ２７３．０８０４９［Ｍ－Ｈ］^－（Ｃ_１２Ｈ_１７Ｏ_５Ｓ^－で計算、２７３．０８０２２）。ＭＳ^２ ｍ／ｚ２５８．０５７００、１５６．９９６６６、１３１．０１７３７、１２３．００８９５、１１５．９９３８８、１１３．００６８１、１１１．００８９２、９８．９９１１６、９７．９８３３４。２．５３分で溶出する異性体では、ＨＲＥＳＩＭＳ ｍ／ｚ２７３．０８０４６ ［Ｍ－Ｈ］^－（Ｃ_１２Ｈ_１７Ｏ_５Ｓ^－で計算、２７３．０８０２２）．ＭＳ^２ ｍ／ｚ２５８．０５７０２、１５６．９９６７０、１３１．０１７３８、１２３．００８８８、１１５．９９３８９、１１３．００６８３、１１１．００８９４、９８．９９１１４、９７．９８３３５。

方法２．
第２の合成アプローチの一般的な戦略を以下に表す。保護Ｌ－エリトルロン酸を出発分子として使用することができる。任意の好適なヒドロキシル保護基を使用することができる（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４）。一実施形態では、保護基Ｒ_１およびＲ_２は、トリアルキルシリル基（例えば、トリメチルシリル）などのシリル基であってもよい。ウィッティヒ試薬は、Ｘ^-が、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-などであり得る任意の塩のものであってもよい。保護基Ｒ_１およびＲ_２の除去は、保護基の性質に依存する。一実施形態では、保護基は、フッ化物を用いる処理によって除去することができる。

この一般的な戦略の別の実施例では、出発物質は、保護Ｌ－エリトルロン酸であってもよい。カルボキシル保護基、Ｒ_３は、ｔ－ブチル基またはシリル基（例えば、トリス（トリメチルシリル）シリル）であってもよい。保護基、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３の除去は、保護基の性質に依存する。一実施形態では、保護基は、フッ化物および／または酸を用いる処理によって除去することができる。

方法３．
第３の合成アプローチの一般的な戦略を以下に表す。（２Ｒ，３Ｒ）－２，３－ジヒドロキシ－４－ペンチン酸またはその保護形態を、出発分子として使用することができる。任意の好適なヒドロキシルおよびカルボキシル保護基を使用することができる（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４）。一実施形態では、保護基Ｒ_１およびＲ_２，は、トリアルキルシリル基（例えば、トリメチルシリル）などのシリル基であってもよく、カルボキシル保護基Ｒ_３は、ｔ－ブチル基またはシリル基（例えば、トリス（トリメチルシリル）シリル）であってもよい。一実施形態では、アルキンのヒドロチオール化反応を合成アプローチで使用することができる。アルキンのヒドロチオール化は、例えば、ＵＶ照射、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、カチオン性ロジウムとイリジウムとの錯体、トリウムとウランとの錯体、ロジウム錯体などのラジカル開始剤、炭酸セシウム、および／または金によって触媒され得る。保護基、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３の除去は、保護基の性質に依存する。一実施形態では、保護基は、フッ化物および／または酸を用いる処理によって除去することができる。

実施例３．化合物ＡのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定
バイナリソルベントマネージャー、冷蔵試料マネージャー（１２°Ｃに設定）、およびカラムマネージャー（４０°Ｃに設定）を装備したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを、逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ^{（登録商標）}ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を備えた液体クロマトグラフィーに使用した。移動相Ａは水中０．１％のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。線形勾配溶出は、２％の移動相Ｂの初期条件で行い、これを３．００分間保持した。次いで、移動相Ｂを０．４０分で９８％に増加させ、０．５０分間維持した。移動相Ｂは、次の注入のための平衡化のために、０．１０分で２％に戻した。合計実行時間は５．００分であった。最終試料溶液の５．０μＬのループ固定アリコートを各試料に注入した。流量は３５０μＬ／分であり、溶出液は、質量分析器のエレクトロスプレー源に直接導入した。強ニードル洗浄液（２００μＬ）は未希釈のメタノールであり、弱ニードル洗浄液（６００μＬ）は、メタノールと水との混合物（０．５：９９．５）であった。シール洗浄液は、メタノールと水との混合物（１０：９０）であった。

加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）プローブを装備したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析器を使用して、ネガティブモードで操作して、質量分析法を実施した。すべての質量は高分解能で測定したが、明確にするために簡略化して報告されている。機器は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ^（商標）２．７、およびＸＣａｌｉｂｕｒ^（商標）２．２ソフトウェア（後で３．０にアップグレード）によって制御した。加熱エレクトロスプレー源は、ヒーター温度４３０°Ｃ、シースガス６５、補助ガス流量１５、掃引ガス０、イオンスプレー電圧３．２５ｋＶ、キャピラリー温度３５０°Ｃ、およびＳレンズＲＦレベル６０％に設定した。３０，０００の分解能を使用して、質量範囲ｍ／ｚ１００～６００のフルスキャンＦＴＭＳスペクトルを収集した。すべての断片化実験は、スキャン範囲ｍ／ｚ５０～２００、分解能１５，０００、単離幅１．０、活性化Ｑ０．２５０、および活性化時間１０．０ｍｓに設定した。すべての質量分析データは、ロックマスなしで取得および処理し、外部質量較正を使用した。

ＭＳ^２実験の正規化衝突エネルギーは、ｍ／ｚ１７７．０２のＣＩＤ ＭＳ^２実験では２８．０ｅＶで、対応するＨＣＤ ＭＳ^２実験では１００ｅＶであった。約１７７．０２のｍ／ｚを有する親イオンの断片化によって、約１５９、１３３、１３１、１２９、１１５、１１３、１１１、１０１、１００、９９、８９、８５、８３、７５、７３、５７．０３、５７．００、および５６のｍ／ｚを有する娘イオンを生じた。ＨＣＤによって、約９７、８７、および７４のｍ／ｚを有する３つの追加の娘イオンを生じた。ｍ／ｚ１７７．０２／１５９．０１のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２６．０および２５．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１５９．０１のＨＣＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１（ＣＩＤ）および第２（ＨＣＤ）ステージの断片化でそれぞれ２６．０および１００ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１２９．０２のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２５．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／１１５．０２のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および３０．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／８５．０３のＣＩＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１および第２ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２１．０ｅＶであった。ｍ／ｚ１７７．０２／８５．０３のＨＣＤ ＭＳ^３実験では、正規化衝突エネルギーは、第１（ＣＩＤ）および第２（ＨＣＤ）ステージの断片化でそれぞれ２８．０および２００ｅＶであった。約１７７．０２／１５９．０１、１７７．０２／１２９．０２、１７７．０２／１１５．０２、および１７７．０２／８５．０３のｍ／ｚのＭＳ^３断片化によって、約８４および６７のｍ／ｚを有する２つの追加のイオンが生じた。

Claims (18)

1. 次式：
   

   

   によって表される化合物またはその塩であって、前記化合物が、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または９９．９％純粋である、前記化合物またはその塩。
2. 次式：
   

   

   によって表されるか、またはその塩である、請求項１に記載の化合物。
3. 次式：
   

   

   によって表されるか、またはその塩である、請求項１に記載の化合物。
4. 同位体標識されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
5. 以下の式：
   

   

   および
   

   

   （式中、＊は、 ^１３ Ｃを示す）からなる群より選択される式によって表されるか、またはその塩である、請求項４に記載の化合物。
6. 対象における、以下の式：
   

   

   、
   

   

   、および
   

   

   からなる群より選択される式によって表される化合物またはその塩のレベルを決定する方法であって、
   （１）前記対象から得られた生体試料から分析用試料を調製することと、
   （２）クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して、前記化合物のレベルを決定することと
   を含む、前記方法。
7. 対象における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を計算するための方法であって、
   １）前記対象から得られた生体試料中の、次式：
   

   

   によって表される化合物またはその塩のレベルを、クロマトグラフィー、質量分析法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、イムノブロッティング、免疫組織化学（ＩＨＣ）、他の免疫化学的方法、またはそれらの組み合わせを使用して決定するステップと、
   ２）前記化合物の前記決定されたレベルを利用するアルゴリズムを使用して、前記ｅＧＦＲを計算するステップと
   を含む、前記方法。
8. 以下の式：
   

   

   、
   

   

   、および
   

   

   からなる群より選択される式によって表される化合物またはその塩と、対象から得られた生体試料中の前記化合物のレベルを測定するための指示書とを含む、キット。
9. 前記化合物が、同位体標識されている、請求項８に記載のキット。
10. 前記化合物が、以下の式：
    

    

    および
    

    

    （式中、＊は、 ^１３ Ｃを示す）からなる群より選択される式によって表されるか、またはその塩である、請求項９に記載のキット。
11. 次式：
    

    

    によって表される化合物またはその塩を調製するための方法であって、
    ａ）次式：
    

    

    によって表される化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨ_２ＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（Ｖａ）：
    

    

    の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｂ）（Ｖａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（Ｉ）の化合物またはその塩を形成するステップと
    を含む、前記方法。
12. 式（Ｉ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を得ることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
    

    
13. 式（ＩＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を調製する方法であって、
    ａ）式（ＶＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨ_２ＳＭｅ（式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子求引基である）と反応させて、式（ＶＩａ）：
    

    

    の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｂ）式（ＶＩａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩｂ）：
    

    

    の化合物またはその塩を得るステップと、
    ｃ）式（ＶＩｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成するステップと
    を含む、前記方法。
14. 式（ＩＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を調製する方法であって、
    ａ）式（ＶＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨ_２ＳＭｅと反応させて、式（ＶＩＩａ）：
    

    

    （式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子吸引基であり、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｂ）式（ＶＩＩａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩｂ）：
    

    

    の化合物またはその塩を得るステップと、
    ｃ）式（ＶＩＩｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成するステップと
    を含む、前記方法。
15. 式（ＩＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を調製する方法であって、
    ａ）式（ＶＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を、ウィッティヒ試薬Ｒ’_３Ｐ＝ＣＨ_２ＳＭｅと反応させて、式（ＶＩＩａ）
    

    

    （式中、Ｒ’は、Ｐｈまたは電子吸引基であり、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立してシリル基である）の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｂ）式（ＶＩＩａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩｃ）：
    

    

    の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｃ）式（ＶＩＩｃ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を得るステップと
    を含む、前記方法。
16. 式（ＩＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を調製する方法であって、
    ａ）式（ＩＸ）：
    

    

    の化合物をメタンチオールと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）：
    

    

    の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＶＩＩＩｂ）：
    

    

    の化合物またはその塩を得るステップと、
    ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を形成するステップと
    を含み、式中、Ｒ_１およびＲ_２が、各々独立してシリル基であり、Ｒ_３がｔ－ブチル基またはシリル基である、前記方法。
17. 式（ＩＩＩ）：
    

    

    の化合物またはその塩を調製する方法であって、
    ａ）式（ＩＸ）：
    

    

    の化合物をメタンチオールと反応させて、式（ＶＩＩＩａ）：
    

    

    の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｂ）式（ＶＩＩＩａ）の前記化合物またはその塩を脱保護して、式（ＶＩＩＩｂ）：
    

    

    の化合物またはその塩を形成するステップと、
    ｃ）式（ＶＩＩＩｂ）の前記化合物またはその塩を精製して、式（ＩＩＩ）の前記化合物またはその塩を得るステップと
    を含み、式中、Ｒ_１およびＲ_２が、各々独立してシリル基であり、Ｒ_３がｔ－ブチル基またはシリル基である、前記方法。
18. 次式：
    

    

    によって表される化合物またはその塩に結合する、抗体または抗体断片。

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