JP2022548109A - マルチプレックスターゲット評価における質量分析の使用方法 - Google Patents
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Abstract
質量分析技術を使用して、種々の受容体標的分子への試験化合物の結合を特徴付けるためのマルチプレックス法が提供される。大脳皮質、小脳、脳室および肝膜調製物など、種々の機能を持つ、あるいは種々の組織に存在する受容体分子を用いる方法である。本方法により、試験化合物の望ましくない標的外結合を決定することができる。この方法は、種々の受容体標的分子の異種混合物をリガンド（既知の結合剤）、および試験化合物とインキュベートすることを含む。様々なウェルに種々の量の分子を入れ、濃度曲線の作成に使用する。次に、非結合リガンドをウェルの内容物から分離する。次に、受容体に結合したリガンドを分離する。LC/ESI-MS/MS法を使用して、無関係な質量スペクトルのピークを減らすことができる。所望の受容体標的分子への試験化合物の結合を、他の受容体標的分子への試験化合物の結合、すなわち標的外結合と比較する。
Description
（関連出願の引用）
本出願は、2019年9月13日に出願された仮出願シリアル番号EP19306104、および2019年9月16日に出願された仮出願シリアル番号EP19306110の優先権を主張し、これらは参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
本出願は、2019年9月13日に出願された仮出願シリアル番号EP19306104、および2019年9月16日に出願された仮出願シリアル番号EP19306110の優先権を主張し、これらは参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
（発明の属する技術分野）
本方法は、質量分析（MS）のようなラベルフリー技術を用いた、様々な化合物の標的分子への結合の特性評価に関する。さらに、特異的受容体標的分子に対するリガンドの親和性を評価することに関する。
本方法は、質量分析（MS）のようなラベルフリー技術を用いた、様々な化合物の標的分子への結合の特性評価に関する。さらに、特異的受容体標的分子に対するリガンドの親和性を評価することに関する。
以下に提示されるのは、詳細な説明で言及される技術的特徴に関連し得るが、必ずしも詳細に説明されない、本発明の特定の態様に関する背景情報である。すなわち、本発明で使用される個々の部品または方法は、後述する資料においてより詳細に説明される場合があり、その資料は、請求された本発明の特定の態様を製造または使用するために当業者にさらなる指針を提供し得る。このような文書は、参照により本出願に組み込まれる。以下の議論は、本明細書の請求項に対する情報の関連性、または記載された材料の先行技術効果、に関する容認として解釈するべきではない。
（特定の特許および刊行物）
Wannerら、WO 2002095403（US 7,074,334）、「Method for determining binding behavior of ligands which specifically bind to target molecules」は、以下の発明を開示する。少なくとも1つの結合部位で標的分子に特異的に結合するリガンドの結合挙動を決定する方法に関する発明で、それによってマーカーが固有の形態で存在し、濃度K4およびK5または量M2およびM1が、質量分析によって決定されるものである。
Wannerら、WO 2002095403（US 7,074,334）、「Method for determining binding behavior of ligands which specifically bind to target molecules」は、以下の発明を開示する。少なくとも1つの結合部位で標的分子に特異的に結合するリガンドの結合挙動を決定する方法に関する発明で、それによってマーカーが固有の形態で存在し、濃度K4およびK5または量M2およびM1が、質量分析によって決定されるものである。
Wannerら、米国公報2006/0201886、「Method for determining binding behavior of ligands which specifically bind to target molecules」は、少なくとも1つの結合部位で標的分子に特異的に結合するリガンドの結合挙動を決定する方法を開示している。マーカーは固有の形態で存在し、その濃度の決定は、質量分析によって行われる。標的分子としてμ-オピオイド受容体、マーカーとしてモルヒネ、およびリガンドとしてナロキソンを種々の濃度で使用することが開示されている。
Dollingerら、US 5,891,742、「Affinity selection of ligands by mass spectroscopy」は、ライブラリとターゲット（ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子）とを接触させ、化合物-ターゲット複合体から非結合化合物を分離し、質量分析により複合体または溶出化合物を分析することにより、コンビナトリアルライブラリから化合物を選択する方法を開示している。
Neiensら、「Simultaneous Multiple MS Binding Assays for the Dopamine, Norepinephrine, and Serotonin Transporters,」 ChemMedChem 13（5） 453-463（2018）、は、モナミン輸送体を標的とした、ラベルフリー、質量分析ベースの結合アッセイ（MS Binding Assays）を開示している。ヒトドーパミン、ノルエピネフリン、およびセロトニン輸送体（hDAT、hNET、およびhSERT）は、同時結合実験に使用されている。
Grimmら、「Development and validation of an LC-ESI-MS/MS method for the triple reuptake inhibitor indatraline enabling its quantification in MS Binding Assays」、Anal Bioanal Chem. 2015 Jan; 407（2）:471-85、は、3つのモノアミン輸送体（ドーパミン用、DAT；ノルエピネフリン用、NET；セロトニン用、SERT）の高活性非選択的阻害剤インダトラリンのLC-MS/MS定量法と、そのMS Binding Assaysへの応用とを開示している。
de Jongら、「Development of a multiplex non-radioactive receptor assay: the benzodiazepine receptor, the serotonin transporter and the β-adrenergic receptor」、Rapid Comm. Mass Spectrom. 21:567-572（2007）、は、ラット皮質組織からの受容体プール、すなわちホモジナイズした皮質を、フルニトラゼパム（ベンゾジアゼピン結合部位［受容体］に結合）と、MADAM（2-［2-［（ジメチルアミノ）メチル］フェニル］スルファニル-5-メチルアニリン；二塩酸塩、セロトニン輸送体に結合）と、ピンドロール（βブロッカー［アドレナリンのβ拮抗剤］）と、混合した方法を開示している。各リガンドは、既知の置換剤とインキュベートされた。
Bowesら、「Reducing safety-related drug attrition: the uses of in vitro pharmacological profiling」、Nat. Rev. Drug Discov. 2012 Dec;11（12）:909-22、は、大手製薬会社4社で使用されているin vitro薬理学的プロファイリングの理論的根拠を開示している。提案された標的は、GPCRと、イオンチャネルと、酵素と、神経伝達物質輸送体と、核内受容体とを含む。
以下の簡単な要約は、本発明のすべての特徴および態様を含むことを意図したものではなく、また、本発明がこの要約で議論されたすべての特徴および態様を含む必要があることを意味するものでもない。
本発明は、様々な実施形態において、試験化合物の標的分子への結合および標的外標的分子への結合を定量化するためのマルチプレックス法であって、以下のステップを含む、マルチプレックス法である。（a）（i）健康なヒトまたは非健康なヒトの組織、および（ii）合成タンパク質調製物の少なくとも1つから標的分子を含む混合物を得るステップ；（b）リガンドおよび試験化合物を含む複数の混合物中で前記標的分子をインキュベートするステップであり、ここで前記標的分子が、種々のリガンドとインキュベートされるステップ；（c）インキュベートした後、前記複数の混合物から非結合リガンドを除去するステップ；次に（d）標的分子、リガンド、および試験化合物の前記混合物中の標的分子に結合していたリガンドを分離するステップ；（e）ステップ（d）で得られたリガンドを質量分析および検量線を用いて測定することで、標的分子に結合していたリガンドの量を決定するステップ；および（f）ステップ（e）で得られたデータを用いて、標的分子の前記混合物中の標的分子に対する試験化合物の親和性を決定するステップ；および（g）前記試験化合物の所定の標的分子への結合を測定し、該結合と標的外分子への前記試験化合物の結合とを比較するステップ。
様々な実施形態において、本発明は、試験化合物の所定の標的分子への結合、および標的外標的分子への結合をも定量化するためのマルチプレックス法を開示し、以下のステップを含む。（a）（i）健康なヒトまたは非健康なヒトの組織、および（ii）合成タンパク質調製物の少なくとも1つから標的分子を含む混合物を得るステップ；（b）リガンドおよび試験化合物を含む複数の混合物中で前記標的分子をインキュベートするステップであり、ここで前記標的分子が、種々のリガンドとインキュベートされるステップ；（c）前記複数の混合物から非結合リガンドを除去するステップ；次に（d）標的分子の前記混合物中の標的分子に結合していたリガンドを分離するステップ；（e）ステップ（d）で得られたリガンドを質量分析および検量線を用いて測定することで、標的分子に結合していたリガンドの量を決定するステップ；および（f）ステップ（e）で得られたデータを用いて、標的分子の前記混合物中の標的分子に対する試験化合物の親和性を決定するステップ；および（g）前記試験化合物の所定の標的分子への結合を測定し、該結合と標的外分子への前記試験化合物の結合とを比較するステップ。
本方法におけるマルチプレキシングは、同一混合物中に複数の標的分子を含むことができ、当該標的分子は、自然界では単一の調製物では存在しないものである。様々な実施形態において、本発明は、標的分子の異種混合物を含む。特定の他の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのヒト標的分子または2つ以上のヒト標的分子を含む標的分子の混合物を含む。
本発明は、特定の態様において、ステップ（a）が、粗抽出物から標的分子（単数）または標的分子（複数）を得ることを含む、上記のような方法を含む。本発明は、特定の態様において、標的分子を得る前記ステップが、ヒト標的分子を得ることを含んでなる、上記のような方法を含む。抽出物は、大脳皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の生体外膜に存在し得る。
様々な実施形態において、試験化合物の所定の標的分子への結合は、大脳皮質、小脳、脳室および肝膜調製物のいずれか1つであってもよい。例えば、試験化合物がA1受容体に結合することが注目される。A1受容体への刺激には、電気インパルスの伝導を減少させることによる心筋抑制作用がある。このため、アデノシンは、心拍数が過度に速い場合の治療および診断に有用な薬剤となる。
様々な実施形態において、試験化合物の他の標的分子への結合は、標的外結合と見なすことができる。
本発明は、特定の実施形態において、上記に記載の方法を含み、当該方法において、ステップ（c）が、ガラスフィルターを用いて混合物または複数の混合物から非結合リガンドを除去することを含む。本発明は、特定の実施形態において、上記に記載の方法を含み、当該方法において、ステップ（d）が、溶媒を用いてガラスフィルターから結合したリガンドを溶出し、次いでフィルタからのサンプルを濃縮することを含む。
本発明は、特定の態様において、上記に記載の方法を含み、当該方法において、前記質量分析が、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析を用いることを含む。本発明は、特定の態様において、上記に記載の方法を含み、当該方法は、標的分子に対する試験化合物のKonおよびKoffを決定するステップをさらに含む。
本発明は、特定の態様において、上記に記載の方法を含み、当該方法において、前記標的分子は、自然界には存在しない受容体標的分子の混合物中に存在する。本発明は、特定の態様において、上記に記載の方法を含み、当該方法において、前記標的分子が、Na+チャネル、α1β-アデノレセプター、α2β-アドレノセプター A1（アデノシン受容体）、M1（ムスカリン受容体）、5-HT2A（セロトニン受容体）、α1ns（アドレナリン受容体）、α2ns（アドレナリン作動性 D1（ドーパミン受容体）、および5HTtrans（セロトニン受容体）からなる群から選択される。
特定の実施形態において、本発明は、Koffが置換法または希釈法によって決定される、標的分子に対する試験化合物のKonおよびKoffを決定するステップを含む、上記のような方法を開示する。
本発明は、特定の実施形態において、上記のような方法であって、標的分子を研究するために使用されるリガンドが、CPX、ピレンゼピン、プラゾシン、RX821002、SCH233900、8-OH-DPAT、EMD281014、パロキセチン、D600、MK801、およびナロキソンからなる群から選択されてもよい。
本発明は、様々な実施形態において、少なくとも２つの異なる試験化合物（試験化合物C1、C2等）の少なくとも２つの異なる受容体標的分子（C1については受容体標的RT1、C2についてはRT2等）への結合を、試験化合物とRT1およびRT2についての既知の結合剤（既知の結合剤B1、B2等）との間の競合結合に基づいて定量するマルチプレックス法であって、以下のステップを含む、マルチプレックス法を提供する。（a）（i）試験化合物C1およびC2；（ii）既知の結合剤B1、B2、および（iii）受容体標的分子RT1、RT2を含む混合物を準備するステップ；（b）前記混合物中で試験化合物C1、C2等、RT1およびRT2、ならびにB1およびB2との間に複合体を形成することを可能にするステップ；（c）RT1、RT2等と複合体を形成しない化合物を前記複合体から分離するステップ；（d）ステップ（c）で得られた複合体から結合剤B1、B2等を分離し、分離した結合剤を質量分析計に通過させて質量分析を用いて試験化合物C1およびC2の結合を測定するステップ；および（e）C1およびC2のRT1およびRT2それぞれに対する相対親和性を決定するステップ。
さらに明確にするために、「等」という記述は、Cn、Bn、およびRTn、として表すことができる一連の材料のメンバーを指し、ここでnは2から40または1から40または2から50の数である。これは、例えば、n＝10の場合、Cが10個、Bが10個、RTが10個であることを示す。
明確化のために、受容体標的分子（RT） 試験化合物（C）、および既知の結合剤（B）のセットは、単一の多重反応において2から約20のメンバー（またはそれよりも多く）を含むことが考えられる。
本発明は、様々な実施形態において、受容体標的分子RT1からRTnが、自然界では単一の混合物または同じ組織には見られない混合物中に存在する、上記のような方法を含むものである。
多くの実施形態において、本発明は、試験化合物と、RT1およびRT2に対する既知の結合剤（既知の結合剤B1からBn）との間の競合結合に基づき、少なくとも２つの異なる受容体標的分子（C1については受容体RT1、CnについてはRTn）に対する少なくとも２つの異なる試験化合物（試験化合物C1からCn）の結合親和性を定量化するマルチプレックス法を開示し、この方法は、以下のステップを含む。（a）（i）試験化合物C1からCn；（ii）既知の結合剤B1からBnおよび（iii）受容体標的分子RT1からRTnを含む混合物を準備するステップ；（b）試験化合物C1からCn、RT1からRTnおよびB1からBn間の前記混合物中で複合体を形成することを可能にするステップ；（c）その標的分子との複合体を形成しない化合物を前記複合体から分離するステップ；（d）ステップ（c）で得られた複合体から既知の結合剤を分離し、分離した結合剤を質量分析計に通し、質量分析を用いて試験化合物の結合を測定するステップ；および（e）RT1からRTnに対する化合物C1からCnの相対親和性をそれぞれ決定するステップ。ここで、Cn、BnおよびRTnは、nが2から40の一連のメンバーを表す。
本発明は、様々な実施形態において、ステップ（a）が、粗抽出物から受容体標的分子を得ることを含む、上記のような方法を含む。本発明は、特定の態様において、上記のような方法を含み、当該方法において、受容体標的分子RT1からRTnを準備する前記ステップが、ヒト受容体標的分子を準備することを含む。本発明は、特定の態様において、上記のような方法を含み、当該方法において、ステップ（c）が、ガラスフィルターを用いて分離すること、および洗浄することを含む。本発明は、特定の態様において、上記のような方法を含み、当該方法において、ステップ（d）が、溶媒を用いてフィルタから結合リガンドを溶出し、次いでフィルタからのサンプルを濃縮することを含む。
本発明は、様々な実施形態において、上記のような方法を含み、当該方法において、前記質量分析が、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析を用いることを含む。本発明は、様々な他の実施形態において、上記のような方法を含み、当該方法において、標的分子に対する試験化合物のKonおよびKoffを決定するステップをさらに含む。
さらに、本発明は、標的分子に対する試験化合物の結合親和性を定量化するためのマルチプレックス法を開示し、当該方法は、以下のステップを含む。（a）以下の表（表1）に示されるように少なくとも3つの標的分子を得るステップ；（b）リガンドと試験分子とを含む複数の混合物中で前記標的分子をインキュベートするステップ；（c）混合物から非結合リガンドを取り除くステップ；（d）標的分子に結合したリガンドを分離するステップ；（e）ステップ（d）で得られたリガンドを、既知濃度のリガンドで作成した検量線を用いて質量分析により測定することで、標的分子上に存在した各リガンドの量を求めるステップ；および（f）ステップ（e）で得られたデータから、標的分子に対する試験化合物の親和性を計算するステップ。各標的分子で同じ試験化合物を使用する、開示された方法である。本方法は、表2に示すようなリガンドを有する標的分子を使用することを、さらに含む。
本発明は、ある特定の態様において、上記のような方法を含み、当該方法では、受容体標的分子とリガンドとの以下の組み合わせ（表3）を用いる。
上記受容体標的分子は、上記表3に記載されていない他のリガンドを用いて分析してもよいし、上記表3に記載されていない他の受容体標的分子は、上記に示したリガンドを用いて分析してもよい。
様々な実施形態において、本方法は、標的分子に対する試験化合物のKon値およびKoff値を決定するためのマルチプレックス法を含み、当該方法は、以下のステップを含む。（a）（i）健康なヒトまたは非健康なヒトの組織、あるいは非ヒト組織、および（ii）合成タンパク質調製物の少なくとも1つから標的分子の混合物を得るステップ；（b）リガンドおよび試験化合物を含む複数の混合物中で前記標的分子をインキュベートし、ここで前記標的分子が、種々のリガンドに結合し、種々の標的分子とインキュベートされるステップ；（c）インキュベーション後、混合物から非結合リガンドを除去するステップ；（d）標的分子に結合した結合リガンドを分離するステップ；（e）反応の定義された時点においてステップ（d）で得られたリガンドを、質量分析および検量線を用いて測定することで、標的分子に結合したリガンドの量を決定するステップ；および、（f）ステップ（e）で得られたデータを用いて標的分子に対する試験化合物のKonまたはKoffを計算するステップ。
様々な実施形態において、本方法は、ラット皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の少なくとも2つからなる種々の生体外膜の混合物において、KonおよびKoffを決定する方法を含む。特定の態様において、本方法は、膜混合物が、受容体A1、A2A（h）、A3（h）、M1、M2（h）、α1ns、α2ns、D1、D2S（h）、5HT1a、5HT2a、5HTtrans、Cave、PCP、オピオイドns、AT2（h）、B2（h）、CB1（h）、CCK1（CCKA）、H4（h）、およびCysLT1（LTD4）（h）のうち少なくとも２つを含む。特定の態様では、本方法は、列挙された受容体の全てを含む膜混合物を含むような方法を含む。特定の態様において、本方法は、列挙された受容体の全てを含む膜混合物を含む。特定の他の実施形態において、本方法は、Koffを置換法によって決定する方法を含む。特定の態様において、本方法は、Koffを希釈法によって決定する方法を含む。様々な実施形態において、（h）は、ヒトを表す。
様々な実施形態において、標的分子は受容体である。
後述するように、同一の試験化合物を上記種々の標的受容体分子および種々のリガンドと併用することにより、試験化合物による標的および標的外結合に関する情報を生成することができる。
他の特徴は、添付の図および以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
例示的な実施形態は、表および添付の図において、例示的かつ無制限に示されており、同様のリファレンスは、同様の要素を示し、図は以下のようなものである。
（概要）
生体関連標的分子の混合物を用いて、試験化合物の受容体標的分子への結合活性を測定する方法について説明する。ここでは、生体関連標的分子の異種混合物を用いて、様々な受容体（標的）分子への試験化合物の結合活性を測定する方法について、さらに説明する。このアッセイにおける標的分子は、標的外結合を評価するために使用してもよい。1つの態様において、本方法は、リガンドに結合することが知られている標的分子または組織を用いた競合結合アッセイを用いる。ラジオイムノアッセイ（RIA）の原理から知られているように、希釈曲線は、既知のリガンド（または「マーカー」）を様々な濃度で用いて、および、そのリガンドの、標的分子との結合を用いて、構築される。RIAとは異なり、本方法におけるマーカーは、標識またはその他の化学的修飾を施す必要はない。次に、リガンドを有する試験化合物と組織（標的分子）との結合を既知の濃度で測定し、そして、MSシグナルを希釈曲線で得られたMSシグナルと比較する。これにより、試験化合物が標的分子に結合する際の有効性がわかり、IC50またはEC50を決定することができる。
生体関連標的分子の混合物を用いて、試験化合物の受容体標的分子への結合活性を測定する方法について説明する。ここでは、生体関連標的分子の異種混合物を用いて、様々な受容体（標的）分子への試験化合物の結合活性を測定する方法について、さらに説明する。このアッセイにおける標的分子は、標的外結合を評価するために使用してもよい。1つの態様において、本方法は、リガンドに結合することが知られている標的分子または組織を用いた競合結合アッセイを用いる。ラジオイムノアッセイ（RIA）の原理から知られているように、希釈曲線は、既知のリガンド（または「マーカー」）を様々な濃度で用いて、および、そのリガンドの、標的分子との結合を用いて、構築される。RIAとは異なり、本方法におけるマーカーは、標識またはその他の化学的修飾を施す必要はない。次に、リガンドを有する試験化合物と組織（標的分子）との結合を既知の濃度で測定し、そして、MSシグナルを希釈曲線で得られたMSシグナルと比較する。これにより、試験化合物が標的分子に結合する際の有効性がわかり、IC50またはEC50を決定することができる。
本方法では、種々の標的分子に対する試験化合物の結合特性をマルチプレックス手順で決定することができる。また、本方法は、薬剤候補を研究するためのin vitro法に関するものである。
本方法は、市販の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびMS装置を使用することができる。MS形式は、ウェルからのエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（MALDI）形式でのマトリックスの使用、または他のイオン化技術を使用することができる。
本方法は、実験用ロボットを用いた自動化が可能である。回収した分子をHPLCに投入するまでの間、本方法における全ての分離および反応は、同じサンプルウェル内に収められる。任意の数の所望のウェルを持つサンプルプレートを使用することができる。
本方法で使用するために、様々な標的分子を調製することができる。粗抽出物または精製抽出物を使用してもよく、例えば、US 4,446,122「Purified human prostate antigen」、US 6,548,019 「Device and methods for single step collection and assaying of biological fluids」、Magomedova ら、 「Quantification of Oxysterol Nuclear Receptor Ligands by LC/MS/MS,」 Methods Mol. Biol. 2019;1951:1-14；およびWang、 「Purification and autophosphorylation of insulin receptors from rat skeletal muscle」、 Biochim Biophys Acta. 1986 Aug 29;888（1）:107-15、で開示された方法は、すべて参照により本明細書に組み込まれる。
MS分析用の試料を調製するためのガラスフィルターの使用は、例えば、以下の方法で行うことができる。Merck Millipore、 「Perfection in preparation for better mass spectra」、Millipore product sheet、2012 retrieved at http （colon slash slash www. <http://www/> merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-JP-Site/ja_JP/-/JPY/ShowDocument-Pronet id=201306.10657。
（定義）
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料について説明する。一般に、細胞および分子生物学および化学に関連して利用される命名法、および技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されているものである。特定の実験技術は、特に定義されないが、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って行われ、本明細書を通じて引用され議論される様々な一般的およびより具体的な文献に記載されている。明確化のために、以下の用語を、以下に定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料について説明する。一般に、細胞および分子生物学および化学に関連して利用される命名法、および技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されているものである。特定の実験技術は、特に定義されないが、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って行われ、本明細書を通じて引用され議論される様々な一般的およびより具体的な文献に記載されている。明確化のために、以下の用語を、以下に定義する。
値の範囲が提供される場合、文脈から明らかに他に指示がない限り、その範囲の上限と下限の間に、下限の単位の10分の1までの各介在する値、およびその述べられた範囲内の他の述べられたまたは介在する値は、方法、細胞、組成物およびキットの中に包含されると理解する。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれることができ、記載された範囲内の特に除外された限界値に従って、方法、細胞、組成物およびキットの中に包含されることもできる。記載された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除く範囲もまた、方法、細胞、組成物、およびキットに含まれる。
本明細書では、特定の範囲を、数値の前に「約」を付けて提示している。「約」という用語は、本明細書において、それが先行する正確な数値、ならびにその用語が先行する数値に近い数値または近似する数値の文字通りの裏付けを提供するために使用される。ある数字が具体的に言及された数字に近いか、または近似であるかを判断する際に、近いまたは近似する言及されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に言及された数と実質的に同等のものを提供する数であってよい。
本明細書で引用されるすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する材料および／または方法を開示および記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであり、提供された刊行物の日付が、独立して確認する必要があり得る実際の刊行物の日付と異なる場合があるので、本発明の方法、細胞、組成物およびキットがかかる刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈するべきではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、複数の参照語を含むことに注意されたい。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成され得ることに、さらに注意されたい。そのため、本明細書は、請求項要素の記載に関連して「単独で」、「のみ」などの排他的用語を使用すること、または「否定的」限定を使用することの先行根拠となるよう意図されている。
「親和性」という用語は、結合親和性を意味する慣用的な意味で用いられている。結合親和性は、単一の生体分子（例えば、タンパク質）とそのリガンド／結合パートナー（例えば、薬剤または阻害剤）との間の結合相互作用の強さである。結合親和性は通常、平衡解離定数（Kd）により測定および報告され、二分子間相互作用の強さを評価し、順位をつけるために用いられる。したがって、結合速度論は、化合物がその標的に結合する速度と標的から解離する速度とを記述するものである。つまり、オンレートとオフレートとの2つを測定するわけである。参照、US 5,324,633A、「Method and apparatus for measuring binding affinity」。
本明細書では、「リガンド」または「結合剤」という用語は、所定の受容体または他の標的分子に結合することが知られている物質を意味するために使用される。この用語については、競合結合の概念を提供するものとして参照により本明細書に組み込まれるSiimansら、US5，814，498、「Methods of enumerating receptor molecules for specific binding partners on formed bodies and in solution」を参照することでさらに理解しうる。
「標的の混合物」または標的分子とは、構造的に異なる標的または他の受容体標的分子の混合物を意味する。非限定的な例として、この混合物は、グルタミン酸受容体、D1ドーパミン受容体、およびニコチン性アセチルコリン受容体を含み得る。これらの受容体は、動物の脳の大脳皮質などの単一の組織型に存在してもよいし、単一の組織型に存在しなくてもよい。また、標的の混合物は、例えば、グルタミン酸受容体（大脳皮質由来）、VEGF受容体（内皮細胞由来）などを含むことができる。下記、「受容体標的分子の異種混合物」を参照。
「標的分子の異種混合物」とは、自然界では単一の組織には存在しないか、または同じ組織に存在するとしても異なる生物学的機能を有する異なる標的分子の混合物を意味する。非限定的な例として、この混合物は、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）を発現する人工細胞、動物由来の大脳皮質（例えば、Zillesら、「Multiple Transmitter Receptors in Regions and Layers of the Human Cerebral Cortex」、Front Neuroanat、11:78（2017）、に記載のように15の種々の標的分子を有するもの）、小脳、心臓、筋肉（心臓イオンチャネルを含む）、生体酵素（例えば、COX2、COX1、MAO、PDE4、Ache、LCK）、核受容体（例えば、ARおよびNR3C1）および核酸分子からなる群より選ばれた複数の組織から構成されてもよい。
標的分子は、望ましい結合と、標的外結合として知られる、望ましくない結合とを含む。上述したように、標的外結合は、安全上の理由から一般に回避される。以下を参照、Bowesら、およびEurofins Safety Panels、h-t-t-ps-:slash-slash www（dot）.eurofinsdiscoveryservices.com/cms/cms-content/services/safety-and-efficacy/safety- pharmacology/safety-panels/。本参照は、in vitro Safety Panelの選択を開示するものである。
「MS」という用語は、質量分析計を意味する。本方法においては、種々の質量分析法を用いることができ、例えば、AMS（加速器質量分析）、ガスクロマトグラフィー-MS、液体クロマトグラフィー-MS、ICP-MS（誘導結合プラズマ-質量分析）、IRMS（同位体比質量分析）、イオンモビリティ分光分析-MS、MALDI-TOF、SELDI-TOF、タンデムMS、TIMS（熱イオン化-質量分析）、およびSSMS（スパークソース質量分析）などが挙げられる。
「マルチプレックス」という用語は、種々のリガンドを有する種々の標的分子を用いて、1つの手順で複数の種々の分析を行うアッセイを意味する。また、このプロセスは、種々の試験化合物を有することを含んでいてもよい。マルチプレックスアッセイでは、自然界に一緒に存在しない種々の標的分子への試験化合物の結合を同時に実施することができる。さらに、マルチプレックスアッセイは、標的受容体の単一の混合物から複数の結果をもたらし、標的外結合、ひいては安全性を明らかにする、種々の標的分子への結合プロファイルを得ることができる。
「液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析」という用語については、例えば、Banduら、「Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric（LC/ESI-MS/MS） Study for the Identification and Characterization of Cisplatin in Vivo Metabolites in Rat Kidney Cancer Tissues: Online Hydrogen/Deuterium（H/D） Exchange Study,」PLosOne 2015 Aug 5:10（8）、を参照することで、さらに理解し得る。
「受容体標的分子」または「標的分子」または「受容体分子」という用語は、試験化合物の結合が測定されるべき生体化合物を意味する。所定の受容体標的分子は、細胞、動物（ヒトまたは非ヒト）から得られた標的組織中に存在し得る。受容体標的分子は、組換えDNAによって産生されるか、あるいは、そうでなければ、1つ以上の目的の標的分子を含むように合成され得る。受容体標的分子は、膜結合していてもよいし、酵素のような液体混合物の中に存在していてもよい。本明細書で使用される潜在的な受容体標的組織は、大脳皮質、脳アストロサイト、神経細胞組織（神経細胞幹細胞を含む）、心臓組織、肝臓組織、血液組織、腎臓組織、眼組織、腸組織などであってもよい。標的組織は、正常組織であってもよいし、疾患組織であってもよい。標的組織は、動物由来であっても、ヒト由来であってもよい。「標的分子の異種混合物」という用語は、上記に例示したように、種々の起源に由来する組織または細胞株を意味する。組織は、同じ組織からであれば異なる組織であっても、病気、発育の状態などにより、組織の構造が異なる場合がある。
「合成タンパク質調製物」という用語は、固有の細胞または組織から得られたというよりも寧ろ、合成されたタンパク質の調製物を意味する。合成タンパク質調製物は、組換えDNA法、ペプチド合成法等によって合成されたものであってよい。
「試験化合物」とは、標的分子に対する結合親和性を検討中の物質を意味する。試験化合物が、マーカーとも結合している標的分子に結合すれば、既知のリガンド（マーカー）と相互作用し、競合することになる。試験化合物は、薬剤ならびに、そのような薬剤の代謝物の可能性がある。低分子、またはタンパク質、またはポリヌクレオチドであってもよい。また、in vivo診断への応用が期待されることから試験される分子であってもよい。
（一般化した方法および装置）
本方法は、多種多様な試験化合物、および試験化合物の結合特性を解明したい多種多様な標的に適応することができる。特に興味深いのは、in vivoでヒトに使用するための薬剤候補である試験化合物の研究である。本方法では、様々な組織に代表される様々な標的分子に対する試験化合物の結合が検討される。結合は、治療効果のために望まれる場合、または、医薬品の安全性の問題として、標的外作用を避けるために望まれない場合がある。このように、本方法は、例えば、潜在的なヒト治療薬および、試験化合物結合の潜在的標的を発現する様々なヒト組織への潜在的な望ましくない結合の同定において、使用することを見出す。
本方法は、多種多様な試験化合物、および試験化合物の結合特性を解明したい多種多様な標的に適応することができる。特に興味深いのは、in vivoでヒトに使用するための薬剤候補である試験化合物の研究である。本方法では、様々な組織に代表される様々な標的分子に対する試験化合物の結合が検討される。結合は、治療効果のために望まれる場合、または、医薬品の安全性の問題として、標的外作用を避けるために望まれない場合がある。このように、本方法は、例えば、潜在的なヒト治療薬および、試験化合物結合の潜在的標的を発現する様々なヒト組織への潜在的な望ましくない結合の同定において、使用することを見出す。
（実施例1：ワークフロー）
図1Aおよび図1Bを参照すると、本発明の方法は、既知の結合剤リガンドによって標的分子から競合された試験化合物の直接または間接定量につながる一連のインキュベーション、分離および洗浄ステップからなることが示されている。１つの試験ウェル107を例示する図1Aの挿入を参照されたい。リガンドは、1つのウェルで異なる受容体標的分子104に結合する異なるリガンド105を指定するために、1、2、および3と指定されている。
図1Aおよび図1Bを参照すると、本発明の方法は、既知の結合剤リガンドによって標的分子から競合された試験化合物の直接または間接定量につながる一連のインキュベーション、分離および洗浄ステップからなることが示されている。１つの試験ウェル107を例示する図1Aの挿入を参照されたい。リガンドは、1つのウェルで異なる受容体標的分子104に結合する異なるリガンド105を指定するために、1、2、および3と指定されている。
図1Aから1Bは、受容体標的分子の異種混合物とリガンド（既知の結合剤）、および種々の試験化合物とのインキュベーションを示す。ウェル、バイアル、または他の容器には標的分子が入っている。101のステップ（a）に示すように、マルチウェルプレート中の所定のウェルは、標的分子104、リガンド（既知の結合剤）105、および種々の試験化合物106の混合物を含むことができる。挿入図107に示すように、標的分子104は、1、2、および3としてラベル付けされた種々のリガンド105に結合し得る。リガンドの区別と同定は、MSによって行われる。様々なウェルは、種々の量の分子を含み、それによって図1Aおよび1Bのウェルの分析結果は、図2から6に示すように、濃度曲線の描画に使用することができる。次に、図1Aのステップ（b）で示すように、非結合リガンドをウェル内の複合体から分離する。次に、（c）に示すように、標的分子と結合したリガンドを混合物から分離し、図1Bのステップ（d）で使用するためにウェルから除去する。ステップ（c）における結合したリガンドの除去は、アセトニトリル103と、非結合リガンドのみを通過させるガラスフィルターとを使用することにより容易に行うことができる。このステップでは、ステップ（d）で使用するためのリガンドの調製のための他の回収ステップと同様に、様々な有機溶媒を使用することができる。
先に結合したリガンド分子の回収後、各ウェルから得られたリガンド量を液体クロマトグラフィーとエレクトロスプレーMS（質量分析計）とで定量する（図1Bのステップ（d））。LC/ESI-MS/MS法を用いることで、質量分析計を用いて種々のリガンドを同定・定量する際に、液体クロマトグラフィーによって無関係な質量分析計のピークの量を低減させることができる。
図1Bは、HPLC装置108、移動相109を生成する溶媒、成分混合物調製装置110、イオン源112と質量分析計113とに出力するHPLCカラム111を示すものである。例示的なクロマトグラムおよび質量分析により、溶出された標的分子114の絶対定量が明らかになる。
本方法の別の実施形態では、一定量の試験化合物を、種々の濃度のリガンド（既知の結合剤）の下で測定することができる。すなわち、過剰の試験化合物のようなものが利用可能であり、種々の量のリガンドを使用する場合、過剰の試験化合物を使用する。リガンドを試験化合物-標的分子複合体から競合させ、試験化合物の標的分子への結合挙動を決定する。
さらに、図1Aおよび図1Bは、受容体標的分子の調製物を試験用ウェル、バイアル、または他の容器に入れた状態を示す。受容体標的分子の調製物は、受容体標的分子を含む粗組織抽出物であってもよい。組織は、血液、血清、脳脊髄液、脳区分（大脳皮質、小脳、脳幹など）、腺（副腎、下垂体、胸腺、膵臓、卵巣、甲状腺、精巣、視床下部など）のエキス、または心臓、骨格筋、腎臓、肺などの器官組織であってもよい。組織は、ヒト由来の組織または非ヒト由来組織、または動物由来組織であってもよい。組織は、正常な組織であっても疾患のある組織であってもよい。受容体標的分子は、精製されている必要はなく、試験化合物の予想される用途、既知のリガンドの利用可能性、およびアッセイの目的に基づいて選択される。アッセイの目的は、安全性プロファイルを得ることであってよく、多種多様な潜在的標的分子を試験化合物と共に試験し、望ましくない結合を評価する。
さらに、受容体標的分子は、内因性組織を使用せずに、むしろ、rDNAまたはタンパク質合成によって調製することができる。本方法に有用な既知のクローン化受容体としては、H3ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、Gタンパク質共役型受容体、バニロイド受容体、グルタミン酸受容体等がある。
本明細書でのマルチプレックス法は、8列96ウェルプレート（101に示す）の場合、F、G、およびHで示す複数の反応領域（ウェル）で実施される。384ウェルプレートまたはその他のマルチウェルフォーマットを使用することが出来る。この例では、リガンドと試験化合物とで受容体標的分子を調製し、96ウェルプレートで2時間、37℃でマルチプレックスをインキュベートしている。107パネル（a）の下の挿入図に示すように、ウェルは、リガンド105に結合した多数の受容体と、リガンド105の代わりに試験化合物106に結合した多数の受容体104とから構成される。
ステップ（a）のインキュベーション後、標的分子に結合した標的分子受容体の複合体を、非結合リガンドおよび遊離標的分子からろ過により分離する。真空ろ過は、同時にプレート上に施される（図1A、ステップ（b））。あるいは、ステップ（b）は、結合した複合体を非結合分子から分離するために、ピストンまたはシリンジからなるウェルを使用してもよい。あるいは、ウェルから分離するために、受容体標的分子にタグを付けてもよい。この実施形態では、非結合分子を容易に除去することができる。
結合したリガンドが遊離リガンドから分離されると、複合体を低イオン強度緩衝液で洗浄し、最後に有機緩衝液または高イオン強度緩衝液を用いて溶出し、ステップ（c）の処理のためにリガンド-結合受容体を効果的に分離することができる。受容体はまた、磁気ビーズでタグ付けされ、上記のように処理されてもよい。したがって、図1Aステップ（b）102に示すように、分離されたリガンド-受容体複合体は、例えばアセトニトリルによる溶出によって、リガンドを結合標的受容体分子から分離するようにさらに処理される（図1A、ステップ（c）、103）。ステップ（d）、（図1B）において、ステップ（c）からの分離されたリガンド分子は、LCエレクトロスプレーMS-MS（液体クロマトグラフィー陽イオンエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析）を用いて直接分析される。
ここで図1Bのステップ（d）を参照すると、リガンド混合物は、液体クロマトグラフィーによってクリーンアップされ、質量分析によって分析される。使用した画像は、Wikipedia 「Liquid chromatography-mass spectrometry」、https（colon slash slash en.wikipedia（dot）org/wiki/Liquid_chromatography-mass_spectrometry、 retrieved 6-28-2019.から取得したものである。そこに書かれているように、質量分析（MS）とは、荷電粒子（イオン）の質量電荷比（m/z）を測定する分析技術である。質量分析計にはさまざまな種類があるが、いずれも電場または磁場を利用して、分析対象物から生成されるイオンの動きを操作し、そのm/z比を決定するものである。質量分析計の基本構成は、イオン源、質量分析計、検出器、データシステムおよび真空システムである。イオン源は、電子ビーム、光子ビーム（紫外線）、レーザービームまたはコロナ放電などにより、MSシステムに導入された試料の成分をイオン化させるところである。エレクトロスプレーイオン化の場合、イオン源は、液体中に存在するイオンを気相に移動させる。イオン源は、中性試料分子を気相のイオンに変換およびフラグメント化し、質量分析計に送る。質量分析計が電場と磁場とを印加してイオンを質量で選別している間、検出器がイオン電流を測定・増幅して質量分解された各イオンの存在量を計算する。人の目で見て認識しやすい質量スペクトルを生成するために、データシステムは、コンピュータにデータを記録し、処理し、保存し、表示する。この例では、エレクトロスプレーイオン化MSを使用する。
濃度既知の検量線を用いて、リガンドと競合して受容体試験分子に結合した試験化合物の量を定量する。上記で詳述したような他の種々の質量分析法も、過剰な余分なデータを発生させない限り、使用可能である。
既知の結合剤、すなわちマーカーは（試験化合物と同様に）標識が付けられていないことに注意すべきである。これは、RIA（ラジオイムノアッセイ）法に対する本MS法の重要な利点である。RIAもまた、既知の結合剤と試験化合物との間の競合に基づくが、所望の感度を達成するためには、マーカーを放射性標識することが必要である。別の実施形態では、重水素のようなラベルを追加して感度を高めることができる。
液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Becker、 US 6,835,927、「Mass spectrometric quantification of chemical mixture components」、に記載されている場合がある。
したがって、図1Aおよび1Bは、試験化合物の直接または間接的な定量のための開示されたアッセイの一連のインキュベーションおよび洗浄ステップを示し、ステップ（a）において、マルチウェルプレート中の所定のウェル101は、混合受容体標的分子104、リガンド（既知の結合剤）105、および試験化合物106から構成される。さらに、挿入図107に示すように、標的分子は、1、2、3として標識された種々のリガンドに結合することができる。この混合物をマルチウェルプレート内で37℃、2時間インキュベートする。ステップ（a）のインキュベーションの後、ステップ（b）に示すように、結合した受容体標的分子を非結合リガンドおよび遊離標的分子から分離するために、マルチウェルプレート内で真空ろ過102を適用する。ステップ（c）は、開示された結合アッセイのステップ（d）に移る前に、結合した標的受容体分子からリガンドを分離するように、分離したリガンド受容体複合体をアセトニトリルによる溶出のような低イオン強度緩衝液でさらに洗浄すること103を示す。ステップ（d）において、（図1B）、ステップ（c）からの分離されたリガンド分子は、LCエレクトロスプレーMS-MS（液体クロマトグラフィー正イオンエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析）を用いて直接分析される。
（実施例2：本MS法とRIA法との比較可能性）
ここで、図2Aを参照して、ナトリウム（Na）チャネルの放射性リガンド結合アッセイと、図2Bおよび図2Cに示す本MS法との比較について説明する。図2Bは、50nMのバトラコトキシンの存在下でのベラトリジンの特異的結合を示す。この実験は、受容体標的分子としてナトリウムチャネルを用いたものである。リガンド（既知の結合剤）は、神経細胞のナトリウムチャネルに結合して不可逆的に開き、閉じるのを防ぐバトラコトキシンと考えてよい。試験化合物は、神経毒のベラトリジンで、心臓、神経、骨格筋の細胞膜にある電位依存性ナトリウムイオンチャネルに結合し、不活性化を防ぐことで作用する。
ここで、図2Aを参照して、ナトリウム（Na）チャネルの放射性リガンド結合アッセイと、図2Bおよび図2Cに示す本MS法との比較について説明する。図2Bは、50nMのバトラコトキシンの存在下でのベラトリジンの特異的結合を示す。この実験は、受容体標的分子としてナトリウムチャネルを用いたものである。リガンド（既知の結合剤）は、神経細胞のナトリウムチャネルに結合して不可逆的に開き、閉じるのを防ぐバトラコトキシンと考えてよい。試験化合物は、神経毒のベラトリジンで、心臓、神経、骨格筋の細胞膜にある電位依存性ナトリウムイオンチャネルに結合し、不活性化を防ぐことで作用する。
SNR（シグナル対雑音）は以下のように求めた（表4）。
図2Cは、結合の特異性を示すものである。図2Cの線201は全シグナルを示し、線202は、ベラトリジンの存在下での非特異的結合に関連するシグナルを示し、線203は、特異的シグナルを示す。この場合、バトラコトキシンの結合は、同じ部位に結合することが知られている競合物質（ベラトリジン）とプレインキュベーションした膜で決定した。このようにして、特異的リガンドがフィルタ、プラスチックまたは他の部位に非特異的に結合しないかどうかを判断することができる。
（材料および方法）
（ラット皮質膜の調製）
Wistar系雄ラットのラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移した後、ポリトンでホモジナイズした。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、15分間、4°Cで遠心分離をした。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って、最終的なタンパク質濃度を決定した。
（ラット皮質膜の調製）
Wistar系雄ラットのラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移した後、ポリトンでホモジナイズした。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、15分間、4°Cで遠心分離をした。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って、最終的なタンパク質濃度を決定した。
（試料のろ過および溶出）
インキュベーションは、結合混合物/反応物（ウェルあたり200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris-HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間、前処理した。
インキュベーションは、結合混合物/反応物（ウェルあたり200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris-HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間、前処理した。
フィルタを50℃で1時間乾燥させ、室温まで冷却した後、アセトニトリル（内部標準として100pMのアンチピリン含有）を用いてバトラコトキシンを真空マニホールドで溶出させた。各サンプル中のリガンドの相対定量は、UHPLC-MS-MSで行い、リガンドと内部標準との比率面積を使用した。
（UHPLC-MS/MS法の開発）
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LC システム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo V イオン源を有するQ-TRAP 5500 質量分析計（SCIEX, Foster City, CA, USA）とを組み合わせて実行した。
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LC システム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo V イオン源を有するQ-TRAP 5500 質量分析計（SCIEX, Foster City, CA, USA）とを組み合わせて実行した。
C18カラム（Poroshell 120 EC-C18, Agilent）を用いてクロマトグラフィー分離を行った。注入量は20μl（フルループ注入）であった。移動相は、溶媒A（0.1%ギ酸および6mM酢酸アンモニウム水溶液）および溶媒B（0.1%ギ酸および6mM酢酸アンモニウムアセトニトリル溶液）を含む2溶液からなり、カラムは、35℃のオーブンで加熱し、流量は650μl/分であった。
C18カラムでクロマトグラフィーのグラジエントを使用し、Bの初期組成は、0.3分で0%、0.3分から0.9分で80%まで増加させ、1分から1.3分で100%に到達し、0.3分で初期組成に再平衡化された。
MS分析は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）ポジティブモードでデータを取得し、イオンスプレー電圧は、5500Vに設定した。ソースでの脱溶媒は、以下の設定パラメータで行った：温度（TEM）は、600℃、イオン源ガス1（GS1）は、40PSI、イオン源ガス2（GS2）は、50PSI、カーテンガス（CUR）は、50PSIであった。リガンド（バトラコトキシン）の定量およびモニタリングを可能にするMRM法の具体的なパラメータを表5に示す。生データはSciex Analystで処理され、各サンプル中の各分析物の個別のAUC（曲線下面積）は、MultiQuantソフトウェアを使用して決定した。
（MS実験による結合）
（最適なリガンド濃度の決定）
ナトリウムチャネル（Na+）サイト2受容体とバトラコトキシンとを含む皮質膜調製物は、アッセイバッファー（50mMのHepes/Tris-HCl、0.8mMのMgSO4、5mMのKCl、7.5mg/lのサソリ毒、2mMのMgCl2、10μg/mlのトリプシン、1g/lのグルコース、130mMの塩素、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのペプスタチン、および0,1%のBSA）で、ポリプロピレンの96ディープウェルプレートで37℃にて3連でインキュベートした。最初に、１２個の濃度（10pMから300nMの範囲）のバトラコトキシンを、1濃度（200μg/ウェル）のラット皮質膜調製物と37℃で60分間共インキュベートした。
（最適なリガンド濃度の決定）
ナトリウムチャネル（Na+）サイト2受容体とバトラコトキシンとを含む皮質膜調製物は、アッセイバッファー（50mMのHepes/Tris-HCl、0.8mMのMgSO4、5mMのKCl、7.5mg/lのサソリ毒、2mMのMgCl2、10μg/mlのトリプシン、1g/lのグルコース、130mMの塩素、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのペプスタチン、および0,1%のBSA）で、ポリプロピレンの96ディープウェルプレートで37℃にて3連でインキュベートした。最初に、１２個の濃度（10pMから300nMの範囲）のバトラコトキシンを、1濃度（200μg/ウェル）のラット皮質膜調製物と37℃で60分間共インキュベートした。
非特異的結合は、10μMのベラパミルとの共インキュベーションにより決定した。
インキュベーションは、結合反応の全量をフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了させた。バトラコトキシンの残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
（飽和アッセイ用）
200μgのラット皮質膜調製物を含む膜アリコートを、50nMのバトラコトキシンの存在下、総容量200μlのアッセイバッファーの中、3連でインキュベートした。インキュベーションは、37℃で60分間インキュベートした後、ろ過によって終了させた。
200μgのラット皮質膜調製物を含む膜アリコートを、50nMのバトラコトキシンの存在下、総容量200μlのアッセイバッファーの中、3連でインキュベートした。インキュベーションは、37℃で60分間インキュベートした後、ろ過によって終了させた。
非特異的結合は、10μMのベラパミルとの共インキュベーションにより決定した。
インキュベーションは、結合反応の全量をフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了させた。バトラコトキシンの残量をUHPLC-MS/MSで決定した。
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、８つの濃度の競合リガンド、ベラトリジン（0.1nMから100μMの範囲）を用いて、3連で行った。37℃で60分間インキュベートした後、ろ過によりインキュベーションを終了させた。バトラコトキシンの残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
リガンド置換アッセイは、８つの濃度の競合リガンド、ベラトリジン（0.1nMから100μMの範囲）を用いて、3連で行った。37℃で60分間インキュベートした後、ろ過によりインキュベーションを終了させた。バトラコトキシンの残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
（実施例3：2つの同時ターゲットを使用したマルチプレキシング）
図3Aは、α1およびα2βアドレナリン受容体との同時結合実験を示すグラフである。標的分子は、α1およびα2βアドレナリン受容体の両方を含むラット皮質で構成されている。試験化合物は、WB4101で、リガンドは、プラゾシンおよびRX821002である。図3Bは、試験化合物としてヨヒンビンを用い、図3Aと同じ標的分子とリガンドとを用いて、α1およびα2βアドレナリン受容体との同時結合決定を行ったものである。
図3Aは、α1およびα2βアドレナリン受容体との同時結合実験を示すグラフである。標的分子は、α1およびα2βアドレナリン受容体の両方を含むラット皮質で構成されている。試験化合物は、WB4101で、リガンドは、プラゾシンおよびRX821002である。図3Bは、試験化合物としてヨヒンビンを用い、図3Aと同じ標的分子とリガンドとを用いて、α1およびα2βアドレナリン受容体との同時結合決定を行ったものである。
ここで、図3Aを詳しく見てみる。ラット皮質調製物を用いて、2つの異なる標的分子、この場合は、α1B-アドレナリン受容体とα2B-アドレナリン受容体とに対する化合物の効果を測定した。この2つの受容体は、構造的および機能的に異なっている。ヒトα-1Aアドレナリン受容体（ADRA1A）は、466アミノ酸の正規の長さと51,487daの質量とを持つ。ヒトα-2Aアドレナリン受容体（ADRA2A）は、450アミノ酸の正規の長さと、48,957daの質量とを持つ。
WB4101は、α1B-アドレナリン受容体のアンタゴニストとして知られている。プラゾシンは、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）であるα-1（α1）アドレナリン受容体の結合剤として知られている薬剤である。これらの受容体は、血管平滑筋に存在する。RX821002は、強力で選択的なα2-アドレナリン受容体アンタゴニストである。
この実施例では、図3Aに示すように、プラゾシン（リガンド、またはα1に対する「マーカー」）およびRX821002（リガンド、またはα2に対する「マーカー」）の存在下でWB4101（試験化合物）とインキュベートしたα1およびα2βアデノ受容体の両方からなる標的分子を使用した。図3Bにおいて、ヨヒンビン（試験化合物）を、プラゾシン（α1に対するマーカー）およびRX821002（α2に対するマーカー）の存在下で試験した。シグナルは、ns（非特異的）であることを示す。
図3Aに示すように、プラゾシンおよびRX821002の両方は、α1およびα1アドレナリン受容体に特異的に結合することが示された（それぞれ）。図3Bは、ヨヒンビンを試験化合物とし、図3Aと同じ標的およびリガンドを用いて、α1およびα1との同時結合決定を行ったものである。
（ラット皮質膜の調製）
Wistar系雄ラットのラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移した後、ポリトンでホモジナイズした。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、15分間、4°Cで遠心分離をした。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終タンパク質濃度を決定した。
Wistar系雄ラットのラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移した後、ポリトンでホモジナイズした。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、15分間、4°Cで遠心分離をした。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終タンパク質濃度を決定した。
（試料のろ過および溶出）
インキュベーションは、結合混合物/反応物（ウェルあたり200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理した。
インキュベーションは、結合混合物/反応物（ウェルあたり200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理した。
フィルタを50℃で1時間乾燥させ、室温まで冷却した後、真空マニホールドを介してアセトニトリル（内部標準として100pMのアンチピリンを含む）を用いてリガンドを溶出させた。各サンプル中のリガンドの相対定量は、UHPLC-MS-MSにより行い、リガンドと内部標準との比の面積を用いた。
（UHPLC-MS/MS法の開発）
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施した。
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施した。
C18カラム（Poroshell 120 EC-C18, Agilent）を用いてクロマトグラフィー分離を行った。注入量は、20μl（フルループ注入）であった。移動相は、溶媒A（0.1%のギ酸および6mMの酢酸アンモニウム水溶液）および溶媒B（0.1%のギ酸および6mMの酢酸アンモニウムアセトニトリル溶液）を含む２溶液で、カラムは、35℃のオーブンで加熱し、流量は、650μl/minであった。
C18カラムでクロマトグラフィーのグラジエントを使用し、Bの初期組成は、0.3分で0%、0.3分から0.9分で80%まで増加させ、1分から1.3分で100%に到達し、0.3分で初期組成に再平衡化された。
MS分析では、ポジティブモードでエレクトロスプレーイオン化（ESI）を使用してデータを取得し、イオンスプレー電圧は5500Vに設定した。ソースでの脱溶媒は、以下の設定パラメータで行った：温度（TEM）は、600℃、イオン源ガス1（GS1）は、40PSI、イオン源ガス2（GS2）は、50PSI、カーテンガス（CUR）は、50PSIであった。プラゾシン（リガンド、またはα1の「マーカー」）およびRX821002（リガンド、またはα1の「マーカー」）の定量およびモニタリングを可能にするMRM法の特異的パラメータは、表6に記載されている。生データは、Sciex Analystで処理し、各サンプルにおける各分析物の個別のAUC（曲線下面積）はMultiQuantソフトウェアを用いて決定した。
（MS実験による結合）
（最適なリガンド濃度の決定）
α1非選択性（α1NS）受容体とα2非選択性（α2NS）受容体との両方を含むラット皮質膜調製物に、プラゾシン（α1NSの特異的リガンド）とRX821002（α2NSの特異的リガンド）を同時に共インキュベートした。アッセイバッファー（50mMのTris-HCl、5mMのEDTA/Tris、150mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl2および0,1%のBSA）中、ポリプロピレンの96ディープウェルプレートで22℃、3連で実施した。最初に、１２個の濃度（0.1nMから300nMの範囲）のプラゾシンおよびRX821002を、3つの濃度（200μg/ウェル）のラット皮質膜調製物を用いて22℃で60分間共インキュベートした。
（最適なリガンド濃度の決定）
α1非選択性（α1NS）受容体とα2非選択性（α2NS）受容体との両方を含むラット皮質膜調製物に、プラゾシン（α1NSの特異的リガンド）とRX821002（α2NSの特異的リガンド）を同時に共インキュベートした。アッセイバッファー（50mMのTris-HCl、5mMのEDTA/Tris、150mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl2および0,1%のBSA）中、ポリプロピレンの96ディープウェルプレートで22℃、3連で実施した。最初に、１２個の濃度（0.1nMから300nMの範囲）のプラゾシンおよびRX821002を、3つの濃度（200μg/ウェル）のラット皮質膜調製物を用いて22℃で60分間共インキュベートした。
非特異的結合は、10μMのWB4101とヨヒンビンとの共インキュベーションにより決定した。
インキュベーションは、結合反応の全量をフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了させた。プラゾシンおよびRX821002の両方の残存量をUHPLC-MS/MSで決定した。
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、１２個の濃度の競合リガンド、WB4101（α1NSの阻害剤）およびヨヒンビン（α2NSの阻害剤）（0.1nMから100μMの範囲）、および0，3nMのプラゾシン、および1nMのRX821002を用いて実施した。これらをアッセイバッファー中でラット膜皮質200μg/ウェルと3連で共インキュベートした。22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によりインキュベーションを終了させた。プラゾシンおよびRX821002の両方とも残量は、UHPLC-MS/MSにより、α2アドレナリンアンタゴニストであることを確認した。
リガンド置換アッセイは、１２個の濃度の競合リガンド、WB4101（α1NSの阻害剤）およびヨヒンビン（α2NSの阻害剤）（0.1nMから100μMの範囲）、および0，3nMのプラゾシン、および1nMのRX821002を用いて実施した。これらをアッセイバッファー中でラット膜皮質200μg/ウェルと3連で共インキュベートした。22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によりインキュベーションを終了させた。プラゾシンおよびRX821002の両方とも残量は、UHPLC-MS/MSにより、α2アドレナリンアンタゴニストであることを確認した。
（実施例4．種々の標的分子のマルチプレキシング）
図4AからKは、ラット皮質の標的分子を用いた同時結合アッセイの結果を示す一連のグラフである。リガンドおよび試験化合物は、各図に示されている。標的分子は、以下の受容体分子である：A1（アデノシン受容体）（図4A）; M1（ムスカリン受容体）（図4B）; 5-HT 2A（セロトニン受容体）（図4C）; α1ns（アドレナリン受容体）（図4D）; α2ns（アドレナリン受容体）（図4E）; D1（ドーパミン受容体）（図4F）; 5HTtrans（セロトニン受容体）（図4G）; 5-HT2A 受容体（図4H）；Ca++チャネル（図4I）；μオピオイド受容体（図4J）；PCP（シグマオピオイド受容体）（図4K）。
図4AからKは、ラット皮質の標的分子を用いた同時結合アッセイの結果を示す一連のグラフである。リガンドおよび試験化合物は、各図に示されている。標的分子は、以下の受容体分子である：A1（アデノシン受容体）（図4A）; M1（ムスカリン受容体）（図4B）; 5-HT 2A（セロトニン受容体）（図4C）; α1ns（アドレナリン受容体）（図4D）; α2ns（アドレナリン受容体）（図4E）; D1（ドーパミン受容体）（図4F）; 5HTtrans（セロトニン受容体）（図4G）; 5-HT2A 受容体（図4H）；Ca++チャネル（図4I）；μオピオイド受容体（図4J）；PCP（シグマオピオイド受容体）（図4K）。
図4AからKに示すように、11種類の標的分子を同時に試験した。種々の組織を用いてもよい。例えば、最初の標的受容体分子であるアデノシン受容体A1は、血管系全体の平滑筋にも見出される。
図4AからKの実験をまとめると、以下のようになる（表7）。
（材料および方法）
（ラット皮質膜の調製）
Wister系雄ラットのラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移し、ポリトンでホモジナイズした。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、15分間、4°Cで遠心分離をした。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終タンパク質濃度を決定した。
（ラット皮質膜の調製）
Wister系雄ラットのラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移し、ポリトンでホモジナイズした。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、15分間、4°Cで遠心分離をした。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終タンパク質濃度を決定した。
（試料のろ過および溶出）
インキュベーションは、結合サンプル（各ウェル200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理した。
インキュベーションは、結合サンプル（各ウェル200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理した。
フィルタを50℃で1時間乾燥させ、室温まで冷却した後、真空マニホールドを介してアセトニトリル（内部標準としてアンチピリン100pMを含む）を用いて特異的リガンドを溶出させた。各サンプル中のリガンドの相対定量は、UHPLC-MS-MSで行い、リガンドと内部標準との比率面積を使用した。
（UHPLC-MS/MS法の開発）
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施した。
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施した。
C18カラム（Poroshell 120 EC-C18, Agilent）を用いてクロマトグラフィー分離を行った。注入量は、20μl（フルループ注入）であった。移動相は、溶媒A（0.1%のギ酸および6mMの酢酸アンモニウム水溶液）および溶媒B（0.1%のギ酸および6mMの酢酸アンモニウムアセトニトリル溶液）を含む２溶液で、カラムは、35℃のオーブンで加熱し、流量は、650μl/minであった。
C18カラムでクロマトグラフィーのグラジエントを使用し、Bの初期組成は、0.3分で0%、0.3分から0.9分で80%まで増加させ、1分から1.3分で100%に到達し、0.3分で初期組成に再平衡化された。
MS分析は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）ポジティブモードでデータを取得し、イオンスプレー電圧は、5500Vに設定した。ソースでの脱溶媒は、以下の設定パラメータで行った：温度（TEM）は、600℃、イオン源ガス1（GS1）は、40PSI、イオン源ガス2（GS2）は、50PSI、カーテンガス（CUR）は、50PSIであった。リガンドの定量およびモニタリングを可能にするMRM法の具体的なパラメータを表8に示す。生データはSciex Analystで処理し、各サンプル中の各分析物の個別のAUC（曲線下面積）は、MultiQuantソフトウェアを使用して決定した。
（MS実験による結合）
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、以下の受容体を自然に含むラット皮質膜調製物を用いて実施した。A1（アデノシン）、M1（ムスカリン性）、α1ns（アドレナリン作動性）α2ns（アドレナリン作動性）、D1（ドーパミン）、5HT1a（セロトニン）、5HT2a（セロトニン）、5HTtrans（セロトニン）、Ca2+チャネル（ベラパミルサイト）、グルタミン酸（非選択性）ラットイオンチャネル、およびオピオイド非選択性受容体。
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、以下の受容体を自然に含むラット皮質膜調製物を用いて実施した。A1（アデノシン）、M1（ムスカリン性）、α1ns（アドレナリン作動性）α2ns（アドレナリン作動性）、D1（ドーパミン）、5HT1a（セロトニン）、5HT2a（セロトニン）、5HTtrans（セロトニン）、Ca2+チャネル（ベラパミルサイト）、グルタミン酸（非選択性）ラットイオンチャネル、およびオピオイド非選択性受容体。
リガンド置換アッセイは、８つの濃度の阻害剤（表9参照）（0.1nMから100μMの範囲）と、各特異的リガンドの単濃度の混合物（表9参照）とを用いて実施した。これらは、アッセイバッファー（50mMのTris-HCl、5mMのEDTA/Tris、150mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl2および0,1%のBSA）中のラット膜皮質200μg/ウェルと3連で共インキュベートされた。インキュベーションは、22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によって終了させた。各特異的リガンド（表9参照）の残存量は、UHPLC-MS/MSにより決定した。
（実施例5：種々の異種組織のマルチプレックス-生体外膜：ラット皮質、ラット小脳、ラット脳室組織）
この実施例では、記載されているように、MS競合結合アッセイのマルチプレックスを示すが、同じ実験内で種々の組織を使用している。
この実施例では、記載されているように、MS競合結合アッセイのマルチプレックスを示すが、同じ実験内で種々の組織を使用している。
結果を以下の表10に示す。この実施例では、種々の組織が使用されている。標的分子受容体の例示的な組織源は、大脳皮質、小脳、および脳室膜（ラットまたはヒト）である。列１に示された結合アッセイは、A1、M1などである。それぞれの場合に、既知のリガンド（列2に[リガンド]として示す）を添加し、調査した組織への結合の程度を測定した。既知の（マーカー）リガンドは、実施例4で使用したものと同じである。検量線を作成した。以下に示すように、SNRは、シグナル対雑音、%CVは変動係数を示す。
（実施例6：単一ウェルでのマルチプレキシング-ラット生体外膜の混合物または組み換え膜の混合物における20のリガンドの質量結合）
この実施例では、種々の組織および/または受容体分子を同一ウェル内で組み合わせて、1回の反応を行う。ラット皮質、小脳、脳室膜を1つのウェルに加え、実施例5で示したようなリガンドを用いて一連の反応を行う。
この実施例では、種々の組織および/または受容体分子を同一ウェル内で組み合わせて、1回の反応を行う。ラット皮質、小脳、脳室膜を1つのウェルに加え、実施例5で示したようなリガンドを用いて一連の反応を行う。
（材料および方法）
（生体外膜の調製）
Wister系雄ラットからラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移し、ポリトンでホモジナイズする。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、4℃で15分間遠心分離した。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終的なタンパク質濃度を決定した。
（生体外膜の調製）
Wister系雄ラットからラット皮質を採取し、50mMのTris-HCl（pH 7.4）に移し、ポリトンでホモジナイズする。このホモジネートを50000G、4℃で15分間遠心分離した。得られたペレットを1μg/mlのロイペプチンと1μMのペプスタチンとを含む50mMのTris-HCl（pH 7.4）を含む溶解バッファで洗浄し、50000G、4℃で15分間遠心分離した。最後に、ペレットをより少量の溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終的なタンパク質濃度を決定した。
ラット小脳、肝および心室膜の調製は、上記と同様に行う。
（組み換え膜の調製）
（細胞培養および発現）
目的の受容体のコーディング配列を含む適切な発現ベクターを用いて、ヒト細胞株の安定的なトランスフェクションを行う。安定にトランスフェクションされた細胞の単一コロニーを、特異的な抗生物質を用いた選択培地でさらに培養する。最終的なクローンの選択は、特異的リガンドに対するクローンの結合親和性に基づいて行われる。
（細胞培養および発現）
目的の受容体のコーディング配列を含む適切な発現ベクターを用いて、ヒト細胞株の安定的なトランスフェクションを行う。安定にトランスフェクションされた細胞の単一コロニーを、特異的な抗生物質を用いた選択培地でさらに培養する。最終的なクローンの選択は、特異的リガンドに対するクローンの結合親和性に基づいて行われる。
（膜抽出）
目的の受容体を安定的に発現しているヒト細胞のクローンの乾燥細胞ペレットを溶解バッファ（50mMのTris-HCl、5mMのTris-EDTA、20mMのNaCl、1.5mMのCaCl2、5mMのMgCl2、10μg/mlのトリプシン阻害剤、1μg/mlのロイペプチン、75μg/mlのPMSF）に再懸濁させた。超音波プローブ（Sonifier 250, Branson）を用いて、細胞を溶解する。細胞溶解液を50000xgで4℃、15分間遠心分離する。膜ペレットを10%（v/v）グリセロールを含む溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終タンパク質濃度を決定する。
目的の受容体を安定的に発現しているヒト細胞のクローンの乾燥細胞ペレットを溶解バッファ（50mMのTris-HCl、5mMのTris-EDTA、20mMのNaCl、1.5mMのCaCl2、5mMのMgCl2、10μg/mlのトリプシン阻害剤、1μg/mlのロイペプチン、75μg/mlのPMSF）に再懸濁させた。超音波プローブ（Sonifier 250, Branson）を用いて、細胞を溶解する。細胞溶解液を50000xgで4℃、15分間遠心分離する。膜ペレットを10%（v/v）グリセロールを含む溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って最終タンパク質濃度を決定する。
（サンプルのろ過および溶出）
インキュベーションは、結合サンプル（各ウェル200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理する。
インキュベーションは、結合サンプル（各ウェル200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理する。
フィルタを50℃で1時間乾燥させ、室温まで冷却した後、真空マニホールドを介してアセトニトリル（内部標準としてアンチピリン100pMを含む）を用いて特異的リガンドを溶出させる。各サンプル中のリガンドの相対定量は、UHPLC-MS-MSで行い、リガンドと内部標準との比率面積を使用する。
（UHPLC-MS/MS法の開発）
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施する。
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施する。
C18カラム（Poroshell 120 EC-C18, Agilent）を用いてクロマトグラフィー分離を行う。注入量は、20μl（フルループ注入）である。移動相は、溶媒A（0.1%のギ酸および6mMの酢酸アンモニウム水溶液）および溶媒B（0.1%のギ酸および6mMの酢酸アンモニウムアセトニトリル溶液）を含む２溶液で、カラムは、35℃のオーブンで加熱し、流量は、650μl/minである。
C18カラムでクロマトグラフィーのグラジエントを使用し、Bの初期組成は、0.3分で0%、0.3分から0.9分で80%まで増加させ、1分から1.3分で100%に到達し、0.3分で初期組成に再平衡化される。
MS分析は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）ポジティブモードでデータを取得し、イオンスプレー電圧は、5500Vに設定する。ソースでの脱溶媒は、以下の設定パラメータで行う：温度（TEM）は、600℃、イオン源ガス1（GS1）は、40PSI、イオン源ガス2（GS2）は、50PSI、カーテンガス（CUR）は、50PSIであった。リガンドの定量およびモニタリングを可能にするMRM法の具体的なパラメータを表11に示す。生データは、Sciex Analystで処理し、各サンプル中の各分析物の個別のAUC（曲線下面積）は、MultiQuantソフトウェアを使用して決定する。
（MS実験による結合）
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、ラット皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の4種類の生体外膜の混合物を用いて実施する。各組織膜調製物を等量（50μg）混合する。
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、ラット皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の4種類の生体外膜の混合物を用いて実施する。各組織膜調製物を等量（50μg）混合する。
さらに、20種類の組み換え膜（表12参照）の混合物を用いてリガンド置換アッセイも行い、各膜調製物を等量（10μg）混合する。
質量結合競合アッセイは、８つの濃度の阻害剤（表12参照）（0.1nMから100μMの範囲）と、各リガンドが最終濃度5nMである単一濃度の各特異的リガンド（表12参照）の混合物を用いて実施する。これらは、アッセイバッファー（50mMのTris-HCl、5mMのEDTA/Tris、150mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのMgCl2および0,1%のBSA）中の生体外膜混合物または組み換え膜混合物のいずれか200μg/ウェルで、3連で共インキュベートされる。インキュベーションは、22℃で60分間インキュベートした後、ろ過により終了させる。各特異的リガンド（表参照）の残存量は、UHPLC-MS/MSで決定する。
（実施例7：安全性試験のための単一ウェルでのマルチプレキシング）
この実施例では、以下の表13に示すように、種々の組織タイプの組み合わせを個々のウェルで組み合わせる。
この実施例では、以下の表13に示すように、種々の組織タイプの組み合わせを個々のウェルで組み合わせる。
上記標的受容体分子は、記載の組織から入手することも、クローン細胞で生成することも可能である。
材料および方法は、上記のように実施される。
（実施例8A、8B：薬理KonおよびKoffの決定）
図5は、MSを用いて試験化合物とその同族受容体分子との結合動態を決定するための概略的なワークフローである。図示のように、標的分子を含む材料（例えば、ラット皮質）をリガンドおよび試験化合物（この図ではイミプラミンおよびセロトニン）と共にインキュベートする。結合したリガンドは、上記の方法で回収され、各リガンドの量が決定される。図5に示すように、まず、少なくとも1つの標的受容体分子からなるサンプル（例えばラット皮質）を、Tris/HCl、NaCl、KCl、およびBSAからなるバッファ中で、リガンドおよび試験化合物、例えばイミプラミン（5nM）およびセロトニン（10μM）それぞれとともにインキュベートする（501）。インキュベーション後、結合した受容体-リガンド複合体は、本発明に記載の方法により分離される（502）。分離されたリガンド-受容体複合体は、例えばアセトニトリルと、非結合リガンドのみを通過させるガラスフィルターとを使用することにより、結合した標的受容体分子からリガンドを分離するように、さらに処理される（503）。結合したリガンド分子の回収後、マルチプレートリーダー（504）の各ウェルから、液体クロマトグラフィー／ESI-MS／MSにより定量を行い（505）、検量線を使用してKonおよびKoffを決定する。
図5は、MSを用いて試験化合物とその同族受容体分子との結合動態を決定するための概略的なワークフローである。図示のように、標的分子を含む材料（例えば、ラット皮質）をリガンドおよび試験化合物（この図ではイミプラミンおよびセロトニン）と共にインキュベートする。結合したリガンドは、上記の方法で回収され、各リガンドの量が決定される。図5に示すように、まず、少なくとも1つの標的受容体分子からなるサンプル（例えばラット皮質）を、Tris/HCl、NaCl、KCl、およびBSAからなるバッファ中で、リガンドおよび試験化合物、例えばイミプラミン（5nM）およびセロトニン（10μM）それぞれとともにインキュベートする（501）。インキュベーション後、結合した受容体-リガンド複合体は、本発明に記載の方法により分離される（502）。分離されたリガンド-受容体複合体は、例えばアセトニトリルと、非結合リガンドのみを通過させるガラスフィルターとを使用することにより、結合した標的受容体分子からリガンドを分離するように、さらに処理される（503）。結合したリガンド分子の回収後、マルチプレートリーダー（504）の各ウェルから、液体クロマトグラフィー／ESI-MS／MSにより定量を行い（505）、検量線を使用してKonおよびKoffを決定する。
図5に示すように、バッファ、リガンド（イミプラミン）、非特異的結合剤セロトニンを様々なウェルでインキュベートする。ラット皮質における複合化した標的分子、セロトニントランスポーター（5-HT）の分離は、従来通り実施する。複合体は、アクリロニトリルを用いて分離し、分離したセロトニンをMSで測定し、KonおよびKoffを決定する。
図6A、図6B、および図6Cは、MS法で会合速度Kon（図6A）および解離速度Koff（図6Bおよび図6C）を求めた結果を示す一連のグラフである。図6Bにおいて、10μMのCPG52432の添加を介した置換アプローチによる、濃度1nMのCGP54626からのGABAB1b／2の解離速度である。データポイントは、特異的結合を表す（平均＋／-SD、n＝2）。図6Cにおいて、希釈アプローチによる5nMの濃度でのCGP54626からのGABAB1b／2の解離速度を示す。データポイントは、特異的結合を表す（平均＋／-SD、n＝2）。
図6Aは、異なる時間間隔での特異的結合を測定することにより、会合速度曲線とKonとの決定を示したものである。図6Bは、リガンドと標的受容体分子との特異的結合の時間的減少を測定することによって得られた解離速度曲線とKoffとを示すものである。図6Cは、希釈によって測定された解離速度である。
（実施例8A：GABA 1b Kon／Koff）
（GABAB1b/2の細胞培養および発現）
2単位からなるヒトGABA B受容体1b（NM_021903）およびGABA 2（NM_005458）のコード配列を含むpCi/neoベクター（Promega）を用いて、CHO-S細胞株の安定的トランスフェクションを実施した。安定的にトランスフェクトされた細胞のシングルコロニーを、ジェネティシンを用いた選択培地でさらに培養した。最終的なクローンの選択は、3H[CGP54626]に対するクローンの結合親和性に基づいて行った。
（GABAB1b/2の細胞培養および発現）
2単位からなるヒトGABA B受容体1b（NM_021903）およびGABA 2（NM_005458）のコード配列を含むpCi/neoベクター（Promega）を用いて、CHO-S細胞株の安定的トランスフェクションを実施した。安定的にトランスフェクトされた細胞のシングルコロニーを、ジェネティシンを用いた選択培地でさらに培養した。最終的なクローンの選択は、3H[CGP54626]に対するクローンの結合親和性に基づいて行った。
（膜抽出）
GABAB1b/2を安定発現しているCHO-S細胞のクローンの乾燥細胞ペレットを溶解バッファ（50mMのTris-HCl、5mMのTris-EDTA、20mMのNaCl、1.5mMのCaCl2、5mMのMgCl2、10μg/mlのトリプシン阻害剤、1μg/mlのロイペプチン、75μg/mlのPMSF）中に再懸濁させた。超音波プローブ（Sonifier 250, Branson）を用いて細胞を溶解させた。細胞溶解液を50000xgで4℃、15分間遠心分離した。膜ペレットを10％（v／v）グリセロールを含む溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って、最終タンパク質濃度を決定した。
GABAB1b/2を安定発現しているCHO-S細胞のクローンの乾燥細胞ペレットを溶解バッファ（50mMのTris-HCl、5mMのTris-EDTA、20mMのNaCl、1.5mMのCaCl2、5mMのMgCl2、10μg/mlのトリプシン阻害剤、1μg/mlのロイペプチン、75μg/mlのPMSF）中に再懸濁させた。超音波プローブ（Sonifier 250, Branson）を用いて細胞を溶解させた。細胞溶解液を50000xgで4℃、15分間遠心分離した。膜ペレットを10％（v／v）グリセロールを含む溶解バッファに再懸濁し、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるブラッドフォード法に従って、最終タンパク質濃度を決定した。
（試料のろ過および溶出）
インキュベーションは、結合サンプル（各ウェル200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理した。
インキュベーションは、結合サンプル（各ウェル200μlのアリコート）を96ウェルガラスフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了し、その後真空下で急速にろ過し、フィルタに結合した膜画分を真空マニホールド上で洗浄バッファ（50mMのTris-HClおよび150mMのNaCl）で数回リンスした。膜フィルタは、50mMのTris/HClと0.3%のポリエチレンイミン溶液（PEI）とで1時間前処理した。
フィルタを50℃で1時間乾燥させ、室温まで冷却後、真空マニホールドを介してアセトニトリル（内部標準として100pMのアンチピリン含有）を用いてCGP54626を溶出する。各サンプル中のリガンドの相対定量は、UHPLC-MS-MSで行い、リガンドと内部標準との比の面積を使用した。
（UHPLC-MS/MS法の開発）
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施した。
UHPLC-QQQ分析は、1290 Infinity Binary LCシステム（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）と、ESI Turbo Vイオン源（SCIEX, Foster City, CA, USA）付きQ-TRAP 5500質量分析計とにより実施した。
C18カラム（Poroshell 120 EC-C18, Agilent）を用いてクロマトグラフィー分離を行った。注入量は、20μl（フルループ注入）であった。移動相は、溶媒A（0.1%ギ酸および6mM酢酸アンモニウム水溶液）および溶媒B（0.1%ギ酸および6mM酢酸アンモニウムアセトニトリル溶液）を含む2溶液からなり、カラムは、35℃のオーブンで加熱し、流量は、650μl/分であった。
C18カラムでクロマトグラフィーのグラジエントを使用し、Bの初期組成は、0.3分で0%、0.3分から0.9分で80%まで増加させ、1分から1.3分で100%に到達し、0.3分で初期組成に再平衡化される。
MS分析は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）ポジティブモードでデータを取得し、イオンスプレー電圧は、5500Vに設定した。ソースでの脱溶媒は、以下の設定パラメータで行った：温度（TEM）は、600℃、イオン源ガス1（GS1）は、40PSI、イオン源ガス2（GS2）は、50PSI、カーテンガス（CUR）は、50PSIであった。リガンド（CGP54626）の定量およびモニタリングを可能にするMRM法の具体的なパラメータを表14に示す。生データはSciex Analystで処理し、各サンプル中の各分析物の個別のAUC（曲線下面積）は、MultiQuantソフトウェアを使用して決定した。
（MS実験による結合）
（受容体およびリガンドの最適濃度の決定）
GABAB1b/2とCGP54626とを含む膜調製物は、アッセイバッファー（50mMのTris-HCl、2.5mMのCaCl2、10μg/mlのトリプシン、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのペプスタチン）中、ポリプロピレンの96ディープウェルプレートで22℃、3連でインキュベートした。最初に、6つの濃度（0.1、0.5、1、3、5、10、25、および50nM）のCGP54626（Tocris、ref：1088）を、3つの濃度（45、100、および180μg/ウェル）の組み換え受容体GABAB1b/2と22℃で60分間共インキュベートした。
（受容体およびリガンドの最適濃度の決定）
GABAB1b/2とCGP54626とを含む膜調製物は、アッセイバッファー（50mMのTris-HCl、2.5mMのCaCl2、10μg/mlのトリプシン、1μg/mlのロイペプチン、1μg/mlのペプスタチン）中、ポリプロピレンの96ディープウェルプレートで22℃、3連でインキュベートした。最初に、6つの濃度（0.1、0.5、1、3、5、10、25、および50nM）のCGP54626（Tocris、ref：1088）を、3つの濃度（45、100、および180μg/ウェル）の組み換え受容体GABAB1b/2と22℃で60分間共インキュベートした。
非特異的結合は、10μMのCGP52432との共インキュベーションにより決定した。
インキュベーションは、結合反応の全量をフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了させた。CGP54626の残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
（飽和アッセイ用）
10から180μgのGABAB1b/2タンパク質を含む膜アリコートを、総容量200μlのアッセイバッファー中、1nMのCGP54626の存在下、3連でインキュベートした。インキュベーションは、22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によって終了させた。
10から180μgのGABAB1b/2タンパク質を含む膜アリコートを、総容量200μlのアッセイバッファー中、1nMのCGP54626の存在下、3連でインキュベートした。インキュベーションは、22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によって終了させた。
非特異的結合は、10μMのCGP52432との共インキュベーションにより決定した。
インキュベーションは、結合反応の全量をフィルタープレートに移した後、ろ過によって終了させた。CGP54626の残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
（質量結合会合アッセイ（Kon））
22.5μg/100μlのGABAB1b/2膜タンパク質を含む膜アリコートを、1nMのCGP54626とともに、総容量2000μlのアッセイバッファーの中で22℃にてインキュベートした。各時点で200μlの反応混合物を除去し、インキュベーションは、ろ過によって終了させた。CGP54626の残存量は、UHPLC-MS/MSにより決定した（図6Aを参照）。
22.5μg/100μlのGABAB1b/2膜タンパク質を含む膜アリコートを、1nMのCGP54626とともに、総容量2000μlのアッセイバッファーの中で22℃にてインキュベートした。各時点で200μlの反応混合物を除去し、インキュベーションは、ろ過によって終了させた。CGP54626の残存量は、UHPLC-MS/MSにより決定した（図6Aを参照）。
非特異的結合は、10μMのCGP52432との共インキュベーションにより決定した。
（質量結合競合アッセイ）
リガンド置換アッセイは、８つの濃度の競合リガンド、CGP52432（1nMから30μMの範囲）、GABA（10nMから1mMの範囲）およびバクロフェン（10nMから1mMの範囲）を用いて実施した。GABAB1b/2膜タンパク質45μg/ウェルと1nMのCGP54626とをアッセイバッファー中、3連で共インキュベートした。22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によりインキュベーションを終了させた。CGP54626の残量はUHPLC-MS/MSで決定した。
リガンド置換アッセイは、８つの濃度の競合リガンド、CGP52432（1nMから30μMの範囲）、GABA（10nMから1mMの範囲）およびバクロフェン（10nMから1mMの範囲）を用いて実施した。GABAB1b/2膜タンパク質45μg/ウェルと1nMのCGP54626とをアッセイバッファー中、3連で共インキュベートした。22℃で60分間インキュベートした後、ろ過によりインキュベーションを終了させた。CGP54626の残量はUHPLC-MS/MSで決定した。
（質量結合解離アッセイ-置換）
22.5μg/100μlのGABAB1b/2膜タンパク質を含む膜アリコートを、1nMのCGP54626とともに、総容量2000μlのアッセイバッファー中、22℃にてインキュベートした。この反応を60分間平衡状態にした後、10μMのCPG52432を添加して解離を開始した。解離は、200μlの反応混合物をろ過することで、決められた時間間隔（1から80分）で停止させた。各時点のサンプルは、二重に調製した。CGP54626の残量は、UHPLC-MS/MSにより決定した（図6Bを参照）。
22.5μg/100μlのGABAB1b/2膜タンパク質を含む膜アリコートを、1nMのCGP54626とともに、総容量2000μlのアッセイバッファー中、22℃にてインキュベートした。この反応を60分間平衡状態にした後、10μMのCPG52432を添加して解離を開始した。解離は、200μlの反応混合物をろ過することで、決められた時間間隔（1から80分）で停止させた。各時点のサンプルは、二重に調製した。CGP54626の残量は、UHPLC-MS/MSにより決定した（図6Bを参照）。
（質量結合解離アッセイ-希釈法）
希釈によるKoff定数の決定のために、112.5μg/100μlのGABAB1b/2膜タンパク質を5nMのCGP54626と22℃で60分間インキュベートした。22μlのアリコートを取り出し、2178μlのアッセイバッファーに加え、1:100希釈とした。解離は、定められた時間間隔（1から80分）の後、ろ過によって停止された。各時点のサンプルは、二重に準備された。CGP54626の残量は、UHPLC-MSにより決定した（図6Cを参照）。
希釈によるKoff定数の決定のために、112.5μg/100μlのGABAB1b/2膜タンパク質を5nMのCGP54626と22℃で60分間インキュベートした。22μlのアリコートを取り出し、2178μlのアッセイバッファーに加え、1:100希釈とした。解離は、定められた時間間隔（1から80分）の後、ろ過によって停止された。各時点のサンプルは、二重に準備された。CGP54626の残量は、UHPLC-MSにより決定した（図6Cを参照）。
（実施例8B：単一生体外膜または生体外膜の混合物、あるいは組み換え膜の混合物におけるkon/koff決定の質量分析実験マルチプレキシングによる結合）
（膜混合物の調製）
KonおよびKoffの決定は、ラット皮質膜で、あるいは、ラット皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の4種類の生体外膜の混合物を用いて行う。各組織膜調製物を等量（50μg）混合する。さらに、20種類の組み換え膜の混合物（表15参照）を用いる、KonおよびKoffの決定も行い、各膜調製物を等量（10μg）混合する。
（膜混合物の調製）
KonおよびKoffの決定は、ラット皮質膜で、あるいは、ラット皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の4種類の生体外膜の混合物を用いて行う。各組織膜調製物を等量（50μg）混合する。さらに、20種類の組み換え膜の混合物（表15参照）を用いる、KonおよびKoffの決定も行い、各膜調製物を等量（10μg）混合する。
（質量結合会合アッセイ（Kon））
22.5μg/100μlの各膜タンパク質混合物を含む膜アリコートを、総容量2000μlのアッセイバッファー中、22℃で、それぞれ最終濃度1nMの特異的リガンド（表15参照）の混合物とともにインキュベートする。各時点で200μlの反応混合物を除去し、インキュベーションは、ろ過で終了させる。各特異的リガンド（表参照）の残量は、UHPLC-MS/MSで決定する。
22.5μg/100μlの各膜タンパク質混合物を含む膜アリコートを、総容量2000μlのアッセイバッファー中、22℃で、それぞれ最終濃度1nMの特異的リガンド（表15参照）の混合物とともにインキュベートする。各時点で200μlの反応混合物を除去し、インキュベーションは、ろ過で終了させる。各特異的リガンド（表参照）の残量は、UHPLC-MS/MSで決定する。
非特異的結合は、最終濃度10μMの特異的阻害剤（表参照）をそれぞれ混合してインキュベートすることにより決定する。
（質量結合解離アッセイ-置換法）
22.5μg/100μlの各膜タンパク質混合物を含む膜アリコートを、総容量2000μlのアッセイバッファー中、22℃で、それぞれ最終濃度1nMの特異的リガンド（表15参照）の混合物とともにインキュベートする。この反応を60分間平衡状態にした後、それぞれ最終濃度10μMの特異的阻害剤（表参照）の混合物を加えて解離を開始させる。解離は、決められた時間間隔（1から80分）で、200μlの反応混合物をろ過して停止させる。各時点のサンプルは、二重に調製する。各リガンドの残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
22.5μg/100μlの各膜タンパク質混合物を含む膜アリコートを、総容量2000μlのアッセイバッファー中、22℃で、それぞれ最終濃度1nMの特異的リガンド（表15参照）の混合物とともにインキュベートする。この反応を60分間平衡状態にした後、それぞれ最終濃度10μMの特異的阻害剤（表参照）の混合物を加えて解離を開始させる。解離は、決められた時間間隔（1から80分）で、200μlの反応混合物をろ過して停止させる。各時点のサンプルは、二重に調製する。各リガンドの残量は、UHPLC-MS/MSで決定した。
（質量結合解離アッセイ-希釈法）
希釈によるKoff定数の決定のために、各膜タンパク質混合物112.5μg/100μlを、それぞれ最終濃度1nMの特異的リガンド（表参照）の混合物とインキュベートし、22℃で60分間インキュベートする。22μlのアリコートを取り出し、2178μlのアッセイバッファーに加え、1:100の希釈とした。解離は、決められた時間間隔（1から80分）後にろ過によって停止する。各時点のサンプルは、二重に調製する。各リガンドの残量は、UHPLC-MS/MSで決定する。
希釈によるKoff定数の決定のために、各膜タンパク質混合物112.5μg/100μlを、それぞれ最終濃度1nMの特異的リガンド（表参照）の混合物とインキュベートし、22℃で60分間インキュベートする。22μlのアリコートを取り出し、2178μlのアッセイバッファーに加え、1:100の希釈とした。解離は、決められた時間間隔（1から80分）後にろ過によって停止する。各時点のサンプルは、二重に調製する。各リガンドの残量は、UHPLC-MS/MSで決定する。
（結論）
上記の具体的な説明は、本発明を例示し説明するためのものであり、添付の請求項の文字通りの範囲および添付の請求項と同等の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。本明細書で言及された特許または刊行物は、明示的に規定されていないかもしれないが、当業者に理解されるであろう、本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法および材料の詳細を伝えることを意図している。そのような特許または刊行物は、参照された方法または材料を説明し可能にする目的のために必要な場合、それぞれが参照によって具体的および個別に本明細書に組み込まれ、本明細書に含まれるのと同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
上記の具体的な説明は、本発明を例示し説明するためのものであり、添付の請求項の文字通りの範囲および添付の請求項と同等の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。本明細書で言及された特許または刊行物は、明示的に規定されていないかもしれないが、当業者に理解されるであろう、本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法および材料の詳細を伝えることを意図している。そのような特許または刊行物は、参照された方法または材料を説明し可能にする目的のために必要な場合、それぞれが参照によって具体的および個別に本明細書に組み込まれ、本明細書に含まれるのと同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
前述は、単に本開示の原理を説明したに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲の中に含まれる様々なアレンジメントを考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に記載されたすべての実施例および条件文は、主として、本発明の原理と技術を促進するために本発明者らが貢献した概念とを理解するにあたって読者を助けることを意図しており、かかる具体的に記載された実施例および条件に制限されないものと解釈される。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な実施例を説明する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。さらに、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく同じ機能を果たす任意の要素が開発されることを意図している。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、説明される例示的な実施形態に限定されることは意図しない。
Claims (30)
- 試験化合物の所定の標的分子への結合、および試験化合物の標的外標的分子への結合を定量化するためのマルチプレックス法であって、以下のステップ、
（a）（i）健康なヒトまたは非健康なヒトの組織、あるいは非ヒト組織、および（ii）合成タンパク質調製物の少なくとも1つから標的分子の混合物を得るステップ；
（b）前記標的分子を、リガンドおよび試験化合物の複数の混合物中でインキュベートするステップであって、前記標的分子と種々のリガンドとがインキュベートされる、ステップ；
（c）前記複数の混合物から非結合のリガンドを除去するステップ；
（d）標的分子の前記混合物中の標的分子に結合していたリガンドを分離するステップ；
（e）ステップ（d）で得られたリガンドを、質量分析および検量線を用いて測定することにより、標的分子に結合していたリガンドの量を決定するステップ；
（f）ステップ（e）で得られたデータを用いて、標的分子の前記混合物中の標的分子に対する試験化合物の親和性を決定するステップ；および、
（g）前記試験化合物の所定の標的分子への結合を測定し、該結合を前記試験化合物の標的外分子への結合と比較するステップ
を含む、方法。 - 標的分子の前記混合物が、標的分子の異種混合物をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 標的分子の前記混合物が、ヒト標的分子である標的を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- ステップ（c）が、ガラスフィルターを用いて前記複数の混合物から非結合リガンドを除去することを含む、請求項1から3のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（a）が、粗抽出物から標的分子を得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ（d）が、結合したリガンドを、溶媒を用いてフィルタから溶出させ、次にフィルタからのサンプルを濃縮することを含む、請求項1から5のいずれか１項に記載の方法。
- 質量分析を用いるステップ（e）が、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析を用いることを含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 標的分子に対する試験化合物のKonおよびKoffを決定するステップをさらに含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- Koffを置換法によって決定する、請求項8に記載の方法。
- Koffを希釈法によって決定する、請求項8に記載の方法。
- 前記標的分子が、自然界には単一の混合物では存在しない受容体標的分子の混合物で形成されている、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分子が、Na+チャネル、α1β-アドレナリン受容体、α2β-アドレナリン受容体、A1（アデノシン受容体）、M1（ムスカリン受容体）、5-HT2A（セロトニン受容体）、α1ns（アドレナリン受容体）、α2ns（アドレナリン受容体）、D1（ドーパミン受容体）および5HTtrans（セロトニン受容体）からなる群から少なくとも1つ選択される、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- リガンドが、CPX、ピレンゼピン、プラゾシン、RX821002、SCH233900、8-OH-DPAT、EMD281014、パロキセチン、D600、MK801、およびナロキソンからなる群から選択される少なくとも1つのリガンドである、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つの異なる試験化合物（試験化合物C1からCn）の少なくとも2つの異なる受容体標的分子（C1については受容体RT1、CnについてはRTn）への結合親和性を、試験化合物とRT1およびRT2に対する既知の結合剤（既知の結合剤B1からBn）との間の競合結合に基づいて定量するマルチプレックス法であって、以下のステップ、
（a）（i）試験化合物C1からCn；（ii）既知の結合剤B1からBnおよび（iii）受容体標的分子RT1からRTnを含む混合物を準備するステップ；
（b）試験化合物C1からCn、RT1からRTnおよびB1からBn間の前記混合物中で複合体を形成することを可能にするステップ；
（c）それらの標的分子と複合体を形成しない化合物を前記複合体から分離するステップ；
（d）ステップ（c）で得られた複合体から既知の結合剤を分離し、分離した結合剤を質量分析計に通し、質量分析を用いて試験化合物の結合を測定するステップ；および、
（e）RT1からRTnに対する化合物C1からCnの相対親和性をそれぞれ決定するステップ
を含み、
Cn、BnおよびRTnは、nが2から40の一連のメンバーを表す、方法。 - 受容体標的分子RT1からRTnが、自然界では同じ組織に見出されない混合物である、請求項14に記載の方法。
- ステップ（a）が粗抽出物から受容体標的分子を得ることを含み、前記受容体標的分子が皮質、小脳、脳室および肝膜調製物の少なくとも2つの生体外膜から得られる、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 受容体標的分子RT1からRTnを準備する前記ステップが、ヒト受容体標的分子を準備することを含む、請求項14から16のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（c）が、ガラスフィルターを用いた分離および洗浄を含む、請求項14から17のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（d）が、溶媒を用いてフィルタから結合リガンドを溶出し、次いでフィルタからのサンプルを濃縮することを含む、請求項14から18のいずれか１項に記載の方法。
- 前記質量分析が、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法を用いることを含む、請求項14から19のいずれか１項に記載の方法。
- 標的分子に対する試験化合物のKonおよびKoffを決定するステップをさらに含む、請求項14から20のいずれか１項に記載の方法。
- 標的分子に対する試験化合物の結合親和性を定量化するためのマルチプレックス法であって、以下のステップ、
（a）以下の表に示される少なくとも3つの標的分子を得るステップ、
（c）混合物から非結合リガンドを除去するステップ；
（d）インキュベート後に標的分子に結合していたリガンドを分離するステップ；
（e）ステップ（d）で得られたリガンドを、既知濃度のリガンドで作成した検量線を用いて質量分析により測定することで、標的分子上に存在した各リガンドの量を決定するステップ；および、
（f）ステップ（e）で得られたデータから、標的分子に対する試験化合物の親和性を算出するステップ、
を含む方法。 - 各標的分子に対して同一の試験化合物を使用する、請求項22に記載の方法。
- 以下の表に記載の標的分子およびリガンドを使用することを含む、請求項22に記載の方法。
- 標的分子に対する試験化合物のKon値および/またはKoff値を決定するためのマルチプレックス法であって、以下のステップ、
（a）（i）健康なヒトまたは非健康なヒトの組織、あるいは非ヒト組織、および（ii）合成タンパク質調製物の少なくとも1つから標的分子の混合物を得るステップ；
（b）リガンドと試験化合物との複数の混合物中で前記標的分子をインキュベートするステップであって、前記標的分子が、種々のリガンドに結合し、種々の標的分子とインキュベートされる、ステップ；
（c）混合物から非結合リガンドを除去するステップ；
（d）標的分子に結合した結合リガンドを分離するステップ；
（e）反応混合物中の定義された時点においてステップ（d）で得られたリガンドを、質量分析および検量線を用いて測定することで、標的分子に結合したリガンドの量を決定するステップ；および、
（f）ステップ（e）で得られたデータを用いて標的分子に対する試験化合物のKonまたはKoffを計算するステップ、
を含む方法。 - 皮質、小脳、脳室および肝膜調製物のうち少なくとも2つを含む種々の生体外膜の混合物において、KonおよびKoffを決定する、請求項25に記載の方法。
- 膜混合物が、受容体A1、A2A（h）、A3（h）、M1、M2（h）、α1ns、α2ns、D1、D2S（h）、5HT1a、5HT2a、5HTtrans、Cave、PCP、オピオイドns、AT2（h）、B2（h）、CB1（h）、CCK1（CCKA）、H4（h）およびCysLT1（LTD4）（h）のうち少なくとも2つを含む、請求項25または請求項26に記載の方法。
- 膜混合物が、列挙された受容体の全てを含む、請求項27に記載の方法。
- Koffを置換法によって決定する、請求項25から28のいずれか1項に記載の方法。
- Koffを希釈法によって決定する、請求項25から29のいずれか1項に記載の方法。
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