JP7152050B2 - 幹細胞からドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法 - Google Patents
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Description
本発明は幹細胞由来中脳特異的ドーパミン神経前駆細胞の分化誘導及び大量生産方法に関する。
幹細胞(stem cell)とは、組織を構成する各細胞に分化(differentiation)される前段階の未分化細胞を総称し、特定分化刺激(環境)により特定細胞に分化が進行される。幹細胞はこれ以上分裂しない完全に分化された細胞とは異なり、細胞分裂により自身と同一な細胞が生産(self-renewal)できるので増殖(proliferation;expansion)する特性があり、また分化刺激が加えられれば特定細胞に分化されるが、他の環境または他の分化刺激により他の細胞にも分化できるので、分化に柔軟性(plasticity)を有していることが特徴である。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは脳神経系疾患のための細胞治療剤を開発するために幹細胞を中脳-特異的ドーパミン神経前駆細胞に分化誘導させることができる製造方法を開発するために努力した。その結果、中脳特異的ドーパミン神経前駆細胞を臨床に適用できる程度の高収率で大量生産できる方法を考案することによって、本発明を完成するようになった。
本発明者らは脳神経系疾患のための細胞治療剤を開発するために幹細胞を中脳-特異的ドーパミン神経前駆細胞に分化誘導させることができる製造方法を開発するために努力した。その結果、中脳-特異的ドーパミン神経前駆細胞を臨床に適用できる程度の高収率で大量生産できる方法を考案した。
本発明の一様態は次の段階を含む幹細胞からドーパミン神経前駆細胞(dopaminergic neural precursor cells)への分化誘導方法に関するものである。
a)幹細胞(stem cells)を単一細胞層の形態に培養するステップ;
b)胚芽体(embryoid body)を形成させて維持培養するステップ;
c)神経ロゼット(neural rosette)を形成させるステップ;及び
d)神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ。
a)ステップ
前記SAGは次のような化学式3で表示することができる:
a)幹細胞(stem cells)を培養するステップ;
b)胚芽体(embryoid body)を形成させて維持培養するステップ;
c)神経ロゼット(neural rosette)を形成させるステップ;
d)神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ;及び
e)ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。
本発明は幹細胞からドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法及びドーパミン神経前駆細胞の大量生産方法に関するものである。本発明の方法を用いる場合、幹細胞を効率よく神経前駆細胞に分化させることができるところ、これを関連の研究開発及び製品化に有用に使用することができる。
〔図1〕本発明の一実施例に従うドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法を模式化した図である。
〔図2a及び図2b〕本発明の一実施例に従って最適の幹細胞培養期間を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図3〕本発明の一実施例に従って最適の胚芽体培養期間を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図4a乃至図4c〕本発明の一実施例に従って胚芽体培養時、SAG及びCHIR99021の最適処理時期を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図5a及び図5b〕本発明の一実施例に従って胚芽体形成ステップの必要か否かを確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図6〕神経ロゼット形成時、最適の培養期間を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図7a及び図7b〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、最適の培養期間を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図8a乃至図8d〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、SAG及びCHIR99021の最適の処理期間を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図9a乃至図9c〕本発明の一実施例に従ってSAG及びCHIR99021の最適の処理濃度を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図10a及び図10b〕本発明の一実施例に従ってECMの最適の処理濃度を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図11a及び図11b〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の最終分化率を確認した図である。(11a:胚芽幹細胞由来、11b:誘導多能性幹細胞由来)
〔図12〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の大量生産を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
〔図13a及び図13b〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の生体内(in vivo)効能を確認した図である。(胚芽幹細胞由来)
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
1-1.DM及びSB431542処理時期の最適化
2-1.培養期間の最適化
3-1.分化期間の最適化
4-1.分化期間の最適化
実験例8.本発明のプロトコルを使用して製造された細胞の生体内(in vivo)移植効果確認
本発明は幹細胞由来中脳特異的ドーパミン神経前駆細胞の分化誘導及び大量生産方法に関する。
Claims (15)
- 次のステップを含む幹細胞からドーパミン神経前駆細胞(dopaminergic neural precursor cells)への分化誘導方法:
a)BMP信号経路抑制剤及びアクチビン/ノーダル信号経路抑制剤を添加することにより、幹細胞(stem cells)を単一細胞層の形態に培養するステップ;
b)BMP信号経路抑制剤、アクチビン/ノーダル信号経路抑制剤、SHH(sonic hedgehog)信号経路活性剤及びGSK-3抑制剤を添加することにより、胚芽体(Embryoid Body)を形成させて維持培養するステップ;
c)神経ロゼット(neural rosette)を形成させるステップ;及び
d)神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ。 - 前記方法は次のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
e)ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。 - 前記幹細胞は、胚芽幹細胞(Embryonicstem cells)、誘導多能性幹細胞(Induced pluripotent stem cells、iPSCs)、成体幹細胞(Adult stem cells)、核置換胚芽幹細胞(Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell)、または直接分化法(direct reprogramming)により生成される幹細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は細胞外基質(extracellular matrix;ECM)で培養することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記a)ステップはステップの終了日から1-3日前から1日毎にBMP信号経路抑制剤及びアクチビン/ノーダル信号経路抑制剤を添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記b)ステップはステップの開始日から1日毎にBMP信号経路抑制剤及びアクチビン/ノーダル信号経路抑制剤を添加し、ステップの開始日から2-6日目に1日毎にSHH(sonic hedgehog)信号経路活性剤及びGSK-3抑制剤を添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記c)ステップはステップの開始日から1日毎にSHH信号経路活性剤及びGSK-3抑制剤を添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記d)ステップはステップの開始日から1日毎にSHH信号経路活性剤及びGSK-3抑制剤を添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記d)ステップはステップの開始日から1日毎に培地を交替し、3日毎に継代培養して遂行されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記BMP信号経路抑制剤はドルソモルヒネ(dorsomorphin)であり、前記アクチビン/ノーダル信号経路抑制剤は4-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2イル)-ベンズアミド(SB431542)であることを特徴とする、請求項5または6に記載の方法。
- 前記SHH信号経路活性剤はSAG(Smoothened Agonist)であり、前記GSK-3抑制剤はCHIR99021であることを特徴とする、請求項6から8のうち、いずれか一項に記載の方法。
- 前記方法はドーパミン神経前駆細胞への分化率が80%以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ドーパミン神経前駆細胞はFOXA2及び/又はLMX1A発現が増加したことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ドーパミン神経前駆細胞はパーキンソン病の症状を緩和させるものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 次のステップを含むドーパミン神経前駆細胞(dopaminergic neural precursor cells)の大量生産方法:
a)BMP信号経路抑制剤及びアクチビン/ノーダル信号経路抑制剤を添加することにより、幹細胞(stem cells)を単一細胞層の形態に培養するステップ;
b)BMP信号経路抑制剤、アクチビン/ノーダル信号経路抑制剤、SHH(sonic hedgehog)信号経路活性剤及びGSK-3抑制剤を添加することにより、胚芽体(Embryoid Body)を形成させて維持培養するステップ;
c)神経ロゼット(neural rosette)を形成させるステップ;
d)神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ;及び
e)ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。
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