JP7089484B2 - ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞および心筋細胞サブポピュレーションの生成、同定ならびに単離のための方法 - Google Patents

Description

心血管疾患は、世界中の主要な死因である。心筋梗塞後、多数の心筋細胞（ＣＭ）が、失われ、線維芽細胞に置き換わり、瘢痕組織が形成される。これにより、不整脈が引き起こされ、心臓機能が低下する。したがって、有効な細胞置換戦略に対する必要性が高い。それが理由で、純粋であり、十分に特徴付けられた、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来の心筋細胞の生成が必須条件である。さらに、細胞置換療法には莫大な量の心筋細胞（細胞１０^９個超／用量）が必要とされ、今日まで、スケーラブルで、完全に自動化された心臓分化および精製プロセスとして利用可能なものはない。

例えば、使用される分化プロトコールまたは幹細胞株によって、異なる程度で標的細胞（心筋細胞）および非標的細胞（非心筋細胞）の混合物を生成する、ＰＳＣ由来心筋細胞のインビトロ生成方法がいくつか報告されている。これまで報告されたプロトコールは、様々な基本培地およびサイトカイン／小分子組成物を使用する、人手による細胞プロセシング手順に主に基づいている。大部分のプロトコールにはＷｎｔシグナル伝達の活性化および阻害が含まれ、プロトコールによっては追加の制御因子としてアクチビンＡおよびＢＭＰ４を使用する。例えば、米国特許出願公開第２０１４０１３４７３３Ａ１号および欧州特許第１４１６７２０１．４号は、例えば、Ｂ２７サプリメントを含む（ゼノフリーではない）ため、再生医学アプローチへの適用可能性が低い、Ｗｎｔアゴニストおよびアンタゴニストの使用に基づく汎用のプロトコールを記載している。種々のサイトカインおよび小分子を使用する高度に複雑なプロトコールが、米国特許出願公開第２０１４０１９３９０９Ａ１号に開示されている。高い分化効率が記載されているが、培地調合が複雑であり、様々な幹細胞クローンの間で分化効率が変動すると予測されるため、そのプロトコールを標準化することは困難である。国際公開第２０１３０６３３０５Ａ２号は、規定条件下で心筋細胞の生成を可能にする分化プロトコールを開示している。そのプロトコールには、ブレビスタチン（ｂｌｅｂｉｓｔａｔｉｎ）、アクチビンＡ、ＢＭＰ－４およびＩＷＲ－１と基本培地ＳｔｅｍＰｒｏ ３４（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との組合せが含まれる。培養の２１日後に９０％を超える分化効率が得られると主張している。しかし、分化誘導前に、ディスパーゼを使用して細胞塊を形成させてから幹細胞を採取することを記載している。細胞数を決定することができないことにより、初期の細胞播種が複雑となり、制御できにくく、標準化しにくい。こうした理由と、分化時間が比較的長いことから、このプロトコールは、再生医学アプローチへの適用可能性が低いと考えられる。２０１５年に、前述の小分子に追加して、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤）および基本培地としてＫＯ ＤＭＥＭを含む類似のプロトコールが公開された（Ｚｈａｎｇ等、２０１５）。高い分化効率が、分化の８日以内に達成された。

ヒトＰＳＣ培養物の心血管分化は、均質な細胞集団を含有せず、どちらかといえば種々の心筋細胞および非心筋細胞、ならびに心筋細胞サブタイプまたはサブポピュレーションで構成される。重要なことに、ｈＰＳＣ由来心筋細胞集団の不純度または不均質性は、細胞療法などの、下流にあるいかなる種類の適用にも影響する。心筋細胞サブポピュレーションの標的および非標的細胞または混合物が移植される場合、心不整脈が誘発される可能性がある。代謝性選択、遺伝子工学、または表面マーカーに基づく分離を含む、ＰＳＣ由来心筋細胞の単離方法が、以下の通りいくつか報告されている。

Ｔｏｈｙａｍａ等（２０１３）および米国特許出願公開第２００９０２７５１３２Ａ１号は、培地への乳酸補充に基づく心筋細胞の代謝性選択を記載している。その方法は、非筋細胞を選択的に死滅させることを意図しているにもかかわらず、増殖している心筋細胞も影響を受け、それによって、心筋細胞の回収率が低くなる。さらに、代謝性選択は、長期プロセスであり、数日にわたって実施される必要がある。

ＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮は、遺伝子操作および抗生物質選択によって達成することもできる（Ｘｕ等、２００８）。抗生物質選択によってほとんど純粋な心筋細胞培養物を得ることができるけれども、遺伝子改変を伴わないことが細胞療法アプローチには有利である。

表面マーカーに基づくＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮も報告されており、例えば、ＳｉｒｐａまたはＶＣＡＭ－１に基づく細胞分離プロトコールを使用する（Ｄｕｂｏｉｓ等、２０１１、Ｕｏｓａｋｉ等、２０１１）。しかし、これらのマーカーは、ＣＭ、さらには非心筋細胞を部分的にしか標識しないことが示されたため、細胞療法の開発に必要とされる標準化された心筋細胞精製プロセスの確立には適していない。加えて、ＶＣＡＭ－１またはＳｉｒｐａに対する抗体を使用する磁気による濃縮の間に心筋細胞の損失が大きいことが報告された（例えば、Ｆｕｅｒｓｔｅｎａｕ－Ｓｈａｒｐ等、２０１５）。

米国特許出願公開第２０１５／０１８４１２９Ａ１号は、心筋細胞特異的なマーカーとしてＣＤ３４０、ＣＤ５６、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４を開示している。これらの抗原に対する抗体により、非心筋細胞を事前に除去することなく、心筋細胞および非心筋細胞の混合細胞集団から心筋細胞を濃縮することが可能となることが記載されている。しかし、全てのマーカーが、神経細胞もしくはＮＫ細胞（ＣＤ５６）または上皮性および多能性幹細胞（ＣＤ３４０、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４）などの、非心筋細胞においても発現することは周知である。したがって、多能性幹細胞の心血管分化によって生成される心筋細胞の選択的な精製は、関連する非心筋細胞集団の除去を可能にする事前の精製ステップなしには、見込みがほとんどない。

さらに、心臓系列に向かって分化したＰＳＣ培養物が、ＣＤ９０、ＣＤ３１、ＣＤ１４０ｂおよびＣＤ４９ａに関して陽性の非心筋細胞をも含むことが報告された（例えば、Ｄｕｂｏｉｓ等、２０１１）。Ｄｕｂｏｉｓ等（２０１１）によって示唆されたように、これらのマーカーを発現する細胞を除去するアプローチは、心筋細胞の濃縮に使用することができる。国際公開第２０１２／１３５２５３Ａ１号および国際公開第２０１２／０２４７８２Ａ１号は、以下のマーカーＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、Ｓｔｒｏ－１；ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１のうちの１つまたは複数に関して陽性の細胞の枯渇化によるＣＭ濃縮方法を記載した。請求項は、非心筋細胞の最も重要なマーカーとしてＣＤ９０に焦点を当てている。

さらに、ＰＳＣ由来心筋細胞集団が、心筋細胞サブポピュレーション、例えば、心房性、心室性、およびペースメーカー様細胞ならびにそれぞれの細胞培養物の電気生理学的な特徴付けなどによって以前に示された異なる成熟度段階の混合物を含有することが公知である（例えば、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ等、２０１４）。現在まで、心臓前駆細胞の同定または選択的な単離を可能にし得るマーカーがほんのわずかであるが報告されており、例えば、ＣＤ１３およびＲＯＲ２である（Ｓｋｅｌｔｏｎ等、２０１６）。ＰＳＣ由来心筋細胞の発現プロファイリングからのデータを、心筋細胞サブポピュレーションの濃縮を目的とする細胞同定または細胞分離手順へと移行させることはまだできていない（Ｐｉｃｃｉｎｉ等、２０１５；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等、２０１５）。

より詳細には、心筋細胞精製プロトコールの現在の制限事項は以下の通りである。
ａ． 例えば、心筋細胞および非筋細胞を標識する表面抗体の使用（ＳｉｒｐａおよびＶＣＡＭ－１に基づくＣＭ精製戦略）により、心筋細胞マーカーの特異性が欠如していること
ｂ． 例えば、磁気細胞分離（Ｄｕｂｏｉｓ等、２０１１；Ｆｕｅｒｓｔｅｎａｕ－Ｓｈａｒｐ等、２０１５）または乳酸ベースの分化／選択培地による、単離手順の間に心筋細胞の損失が大きいこと
ｃ． 手順が長期にわたること（例えば、乳酸ベースの分化培地）（Ｔｏｈｙａｍａ等、２０１３）
ｄ． 例えば、心筋細胞における表面マーカーの発現が分化プロセスの間に変動しやすく、心筋細胞における表面マーカーの発現が分化プロトコールによっても異なるので、標準化の可能性が失われていること
ｅ． 心筋細胞機能または生存度に対して影響があること
ｆ． 心筋細胞産生の手順を標準化し、細胞置換療法に必要とされる多数の細胞数を得るための、心筋細胞分化および精製の自動化プロセスが確立されていないこと
ｇ． 現在、心筋細胞サブポピュレーションの混合物は、例えば、前臨床細胞療法への適用のために使用され、ＰＳＣから心筋細胞への分化によって生成されるＣＭサブポピュレーションに関する詳細な報告がないこと。

したがって、ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞および心筋細胞サブポピュレーション（それにより、例えば、その後、研究、診断学、薬理学的および／または臨床的適用、例えば、細胞療法における前記心筋細胞および／または心筋細胞サブポピュレーションの使用が可能になる）を生成、同定および／または単離するための改善または代替方法に対する必要性が高い。

予想外なことに、１または２ステップの細胞分離手順により、９８％までの純度での、多能性幹細胞由来心筋細胞のロバストで標準化された精製（濃縮または単離）が可能となることが見出された。開発された細胞分離手順は、マーカー遺伝子発現および分化効力、ならびに使用される分化プロトコールおよび多能性幹細胞クローン、または多能性幹細胞由来心筋細胞の濃縮のために選択される分化の時点の変動に関わらず、心筋細胞が同様の純度になることを保証する。細胞分離手順には、１ステップ分離の場合、非心筋細胞の枯渇化のための非心筋細胞マーカーに対する少なくとも２つの抗体またはその抗原結合断片の組合せが含まれ、非心筋細胞マーカーは抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１４１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される。驚くべきことに、これら非心筋細胞マーカーのうちの２つの組合せを使用して、インビトロで分化した多能性および／または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞に由来する心筋細胞を含むサンプルから非心筋細胞を枯渇化させることにより、当技術分野において公知の方法によっては達成されない心筋細胞精製プロセスの標準化が可能となり、その理由は、開発された細胞分離手順が、マーカー遺伝子発現および分化効力、ならびに使用される分化プロトコールおよび多能性幹細胞クローン、または多能性幹細胞由来心筋細胞の濃縮のために選択される分化の時点の変動に関わらず、心筋細胞が同様の純度になることを保証するからである。この細胞分離手順のロバスト性により、このプロセスが自動化された細胞プロセシングシステムに移行させることが可能であり、それによって、例えば、再生療法アプローチに必要とされる多数の細胞数の心筋細胞の制御および標準化された濃縮も実現される。

さらに、心筋細胞の濃縮した細胞組成物を、当技術分野において公知の方法によっては達成されない優れた純度および回収率で得ることができる。前記２つのマーカーの組合せに、非心筋細胞マーカーの前記群から選択される１つまたは複数の非心筋細胞マーカーを加えることにより、生成された心筋細胞の細胞組成物における心筋細胞の純度および／または回収率がさらに向上した（ｓ．図７～１１）。重要なことに、前記非心筋細胞マーカーのうちの少なくとも２つの組合せは十分であり、２つは、心筋細胞ではなく、非心筋細胞の枯渇化後の心筋細胞濃縮ステップのため選択された、すなわち、サンプルから望まれない（非標的）細胞を枯渇化させる抗体によって標識されるであろう全ての細胞型が枯渇化させる。当業者に公知の方法によって細胞集団を心筋細胞に分化させる場合に多能性および／または複能性幹細胞を含む出発細胞組成物からの細胞の混入が起こり得るとしても、それに関わらず、前記非心筋細胞マーカーのうちの２つ以上を使用して非心筋細胞が枯渇化される。

好ましい細胞分離手順には、１ステップ分離の場合、非心筋細胞の枯渇化のための、非心筋細胞マーカー、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０に対する抗体の組合せが含まれる。２ステップ分離手順には、本明細書で開示されている非心筋細胞マーカー、および本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合断片の組合せを使用することによって非心筋細胞を枯渇化させ、続いてまたは同時に、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ９９、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｆ、抗ＣＤ２６２、抗ＣＤ８１、抗Ｔｒａ－１－８５、抗ＣＤ４９ｅ、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４６、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ９８、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ１４６ｃ、および抗ＣＤ１５１からなる群から選択される少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片を用いて心筋細胞を濃縮するステップが含まれる。優先的には、心筋細胞マーカーは、ＣＤ５６である。

好ましい２ステップ分離手順には、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１およびＣＤ１０に対する抗体の組合せによって非心筋細胞を枯渇化させ、続いてまたは同時に、ＣＤ５６に対する抗体を用いて心筋細胞を濃縮するステップが含まれる。

さらに、磁気または蛍光活性化セルソーティングによって、事前に濃縮した多能性幹細胞由来心筋細胞からの心筋細胞サブポピュレーションを同定し、続いて精製することを可能にする新規細胞表面マーカーを同定した。同定された各サブポピュレーションの機能性は、例えば、細胞療法への適用の開発に現在使用されている心筋細胞サブポピュレーションの混合物をしのぐ可能性がある。

Ｚｈａｎｇ等（２０１５）または任意の他のロバストなＰＳＣ心筋細胞分化プロトコールなどの当業者に公知の方法によって多能性または複能性幹細胞を心筋細胞に分化させることによって生成される心筋細胞は、心筋細胞および心筋細胞サブポピュレーションの濃縮のための新しく開発されたプロトコールによってさらに精製することができる。

重要なことに、心筋細胞および心筋細胞サブタイプの濃縮のための新しく開発された手順は、高度に精製された多能性幹細胞由来心筋細胞を提供する、人手によるまたは自動化された磁気ならびに蛍光活性化セルソーティング手順に適用可能である。それによって、多能性幹細胞由来心筋細胞の生成、ならびにそれに続く心筋細胞および心筋細胞サブポピュレーションの精製は、驚くべきことに、閉鎖された細胞サンプルプロセシングシステム中で実施して、心筋細胞をＧＭＰまたはＧＭＰ様条件下で生成することができる。さらに予想外なことに、本発明のプロセスは、前記閉鎖された細胞サンプルプロセシングシステムを使用する自動化された手順において利用しやすいことが見出された。本発明の方法によって得られる組成の細胞は、例えば、冠状動脈性心疾患などの、心筋細胞の損失と関連する心血管疾患に罹患している患者における心筋細胞の損失によって引き起こされる症状を軽快または好転させる治療処置として、患者に対する細胞置換療法に使用してもよい。

多能性幹細胞由来心筋細胞の生成に使用されるプロトコールは、Ｚｈａｎｇ等（２０１５）による以前に公開された方法に基づき、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤および阻害剤、ならびにＦＧＦ－２、アクチビンＡ、ＢＭＰ－４およびＲｈｏ－キナーゼ阻害剤を組み合わせた（Ａ）。心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）発現のフローサイトメトリー分析（Ｂ）、およびＰＳＣ由来心筋細胞培養物の典型的な形態（Ｃ）によって示されるように、心筋細胞が高い効力で生成された。 フローサイトメトリーに基づく抗体スクリーニングにより、ＣＭマーカーアルファアクチニンまたはトロポニンＴとの発現の重複がほとんどないことによって示されるように、非心筋細胞のいくつかの表面マーカーを同定した。さらに、これらのマーカーは、ＣＤ５６との共発現を示す。それぞれのマーカーのドットプロットが、この図中に示される（図２Ａ、図２Ｂ）。 フローサイトメトリーに基づく抗体スクリーニングにより、それぞれの表面マーカーとＣＭマーカーアルファアクチニンまたはトロポニンＴの発現が重複することによって示されるように、心筋細胞のいくつかの表面マーカーを同定した。それぞれのマーカーのドットプロットが、この図中に示される（図３Ａ、図３Ｂ）。 抗体に基づく表面マーカー分析により、いくつかの以前に報告された非心筋細胞表面マーカーと、アルファアクチニンまたはトロポニンＴのような心筋細胞マーカーとの共発現を同定した。したがって、これらの表面マーカーは非心筋細胞の除去に適していない。 ＣＤ１４０ｂに対する抗体を使用して非心筋細胞を磁気で枯渇化させることによってＰＳＣ由来心筋細胞を濃縮することは、心筋細胞含量を、オリジナル画分中のおよそ３７％から心筋細胞濃縮画分中のおよそ４８％にしか濃縮することができないことから、不十分である。心筋細胞は、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する抗体によって標識される。 細胞表面マーカー（ａ）Ｓｉｒｐａ（ＣＤ１７２ａ）または（ｂ）ＶＣＡＭ－１（ＣＤ１０６）に対する抗体を使用する磁気分離によるＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮。抗Ｓｉｒｐａに基づく分離により、ＣＭがおよそ１７％からおよそ３１％に濃縮され、抗ＶＣＡＭ－１に基づく分離により、ＣＭがおよそ１２％からおよそ３４％に濃縮される。心筋細胞は、トロポニンＴに対する抗体によって標識される。 非心筋細胞の除去のための、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１およびＣＤ１０に対する抗体を使用する磁気細胞分離による心筋細胞の精製、すなわち、心筋細胞精製のための１ステップ手順についての２つの例。ドットプロットは、心筋細胞、すなわち、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性細胞が、オリジナル画分中のおよそ６６％またはおよそ２２％から、それぞれおよそ９６％およびおよそ９２％の純度に濃縮されることを示す。 引き続く非心筋細胞の枯渇化、および磁気細胞分離による心筋細胞の濃縮、すなわち、心筋細胞精製のための２ステップ手順による心筋細胞精製についての２つの例。ドットプロットは、心筋細胞（すなわち、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性細胞）が、それぞれ、オリジナル画分中のおよそ５９％、またはおよそ２７％から、およそ９５％、およびおよそ９２％の純度に濃縮されることを示す。 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する、フローサイトメトリーに基づくセルソーティングによる心筋細胞精製についての１つの例。そのために、非筋細胞マーカーとしてＣＤ１０／ＣＤ１４１／ＣＤ１４０ｂおよび心筋細胞マーカーとしてＣＤ５６の組合せを使用した。ＣＤ５６単陽性細胞集団を選択してソーティングした。ドットプロットは、心筋細胞、すなわち、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性細胞が、オリジナル画分中のおよそ２９％からおよそ９６％に、またはおよそ３０％の心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）陽性細胞から出発しておよそ９８％の純度に濃縮されることを示す。 心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）発現を、オリジナル画分（Ａ）、非心筋細胞の除去後の心筋細胞濃縮画分（Ｂ）、ならびに非心筋細胞の除去および心筋細胞の濃縮後の心筋細胞濃縮画分（Ｃ）において分析した。細胞の核は、Ｄａｐｉで標識されている。 Ａ）精製およびリプレーティングした後の、心筋細胞によるカルシウム感受性色素Ｆｌｕｏ８の取り込みにより、心筋細胞機能が証明される。Ｂ）精製およびリプレーティングした心筋細胞は、典型的な形態を示す。 精製された心筋細胞のフローサイトメトリー分析により、アルファアクチニン、ミオシン重鎖、およびトロポニンＴのような、心筋細胞特異的マーカーの発現が明らかにされ、真の心筋細胞の濃縮が示される。トロポニンＴ陽性集団内のＭＬＣ２ａおよびＭＬＣ２ｖの発現は、異なる心筋細胞サブポピュレーションの存在を示す。 ＰＳＣ由来心筋細胞のフローサイトメトリー分析により、アルファアクチニンまたはトロポニンＴ発現心筋細胞の集団内のいくつかの表面マーカーの発現が明らかにされた。それぞれの細胞内心筋細胞マーカー（アルファアクチニンおよびトロポニンＴ）との共発現の比に基づいて、表面マーカーは、Ａ：群１：８０～９５％ＣＭ標識；Ｂ：群２：６０～８０％ＣＭ標識；Ｃ：群３：４０～６０％ＣＭ標識；Ｄ：群４：２５～４０％ＣＭ標識；ＥおよびＦ：群５：１０～２５％ＣＭ標識の５群に細分される。 図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅおよび図１４Ｆは、ＰＳＣ由来心筋細胞の精製に使用することができる潜在的なマーカー組合せを示す。全てのマーカー組合せは、特異的な心臓マーカーｃＴＮＴとの共発現をほんのわずかでも示さないが、ｃＴＮＴ陰性集団とは強い共発現を示す。これによって、それらは非心筋細胞の効率の高い枯渇化に適したマーカーとして認定される。さらに、マーカー組合せはＣＤ５６と共発現され、ＣＤ５６に対する抗体を使用する心筋細胞の濃縮前にそれらの細胞を除去する必要性を示している。全てのドットプロットにおいて、単陽性ＣＤ５６心筋細胞集団は、二重陽性ＣＤ５６／非心筋細胞マーカー陽性集団から明らかに区別可能である。それが理由で、単陽性心筋細胞集団は、高度に純粋な心筋細胞集団を取得するために容易にソーティングすることができる。

本発明者らは、Ｚｈａｎｇ等（２０１５）などの当業者に公知の方法によって多能性および／または複能性幹細胞を心筋細胞に分化させることに由来する心筋細胞の精製のための、人手によるならびに自動化および標準化された新規のプロセスを開発した。詳細について図１を参照されたい。精製プロセスは、表面マーカースクリーニングにおいて同定された、非心筋細胞マーカー（方法のステップ１）に対する抗体（複数の抗体）の組合せ、および心筋細胞マーカー（方法の任意選択のステップ２）に対する単一の抗体または抗体の組合せに基づいており（図２および図３）、１または２ステップの細胞分離手順のいずれかとなる。非心筋細胞または心筋細胞に対して特異的な以下の抗原を同定した：

（ｉ）非心筋細胞マーカー（図２）：
・ＣＤ１０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ６１、ＣＤ１４１、ＣＤ５１／６１
（ｉｉ）心筋細胞マーカー（図３）：
・ＰＴＫ７、ＣＤ９９、ＣＤ２７６、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ１４７、ＣＤ２３９、ＣＤ２９８、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２６２、ＣＤ８１、Ｔｒａ－１－８５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５１、ＣＤ２９、ＣＤ９８、ＣＤ６３、ＣＤ１４６ｃ、ＣＤ１５１

驚くべきことに、本発明者らのデータは、ＣＤ９０、ＣＤ３１およびＣＤ４９ａのような、非心筋細胞に関する以前に報告されたマーカー（Ｄｕｂｏｉｓ等、２０１１）が、アルファアクチニンまたは心臓トロポニンＴのような、心筋細胞マーカーと共発現されることを示す。この観察は分化時点、使用される幹細胞クローンおよび分化効率に依存し、このため、これらのマーカーは非心筋細胞の選択的な除去による効率的な標準化されたＣＭ精製に適していない（図４）。さらに、本発明者らは、非心筋細胞の以前に報告されたマーカー（すなわち、ＣＤ１４０ｂ（Ｄｕｂｏｉｓ等、２０１１））に対する抗体が、非心筋細胞の除去による心筋細胞の精製に十分であるかどうかを試験した。本発明者らのデータは、約３７％の初期ＣＭ含量が、ＣＤ１４０ｂ陽性非心筋細胞の磁気による枯渇化後におよそ４８％の純度にしか増加させることができないこと（図５）から、ＣＤ１４０ｂに対する抗体を使用するだけでは心筋細胞を十分に濃縮することができないことを示している。さらに、ＣＤ１４０ｂに基づく非心筋細胞枯渇化ステップの後にＰＳＣ由来心筋細胞の排他的な精製を可能にし得る、心筋細胞表面マーカーに対する抗体は見出されなかった。さらに、ＣＤ１４０ｂを発現する細胞の量は、変動し、分化効率、プロトコールおよび幹細胞クローンに依存し、それによって、ＣＤ１４０ｂ単独は、ＰＳＣ由来非心筋細胞の除去に適したマーカーではないことが示される。

予想外なことに、ＶＣＡＭ－１のような、心筋細胞に関する以前に報告された表面マーカーは、心筋細胞のサブポピュレーションまたは心筋細胞および非心筋細胞のサブポピュレーションだけを標識し（Ｓｉｒｐａ）、したがって、多能性幹細胞の心血管分化からの心筋細胞の精製に適していないことを本発明者らは見出した（図６）。

以前に報告されたマーカーは心筋細胞の精製に適しておらず、本発明者らのスクリーニングではＰＳＣ由来心筋細胞だけに発現される表面マーカーの同定につながらなかったので、本発明者らは、１または２ステップ手順に基づく心筋細胞の精製のための新しい方法を開発した。驚くべきことに、新しい方法は、出発ヒトＰＳＣクローン、使用される分化プロトコール、または分離の時点（図７～図１１）に関わらず、機能する。プロセスには、第１のステップにおける非心筋細胞の除去、および任意選択で心筋細胞濃縮ステップが含まれ、９８％までの純度、および非常に良好な回収率（８０％まで）で心筋細胞が供給される。

本発明者らのフローサイトメトリーに基づくスクリーニングは、本明細書で開示されている方法において使用することができる、非心筋細胞の７つの抗原に対する抗体を同定し、これら抗体またはその抗原結合断片のうちの２つは、非心筋細胞を枯渇化させ、それによって、心筋細胞を濃縮するのに十分であり得る。本明細書で開示されている非心筋細胞の枯渇化のための２つの抗体またはその断片のそのような組合せは：
抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ６１および抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６１および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ６１および抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ４４および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ４４および抗ＣＤ５１／６１、または抗ＣＤ１４１および抗ＣＤ５１／６１であってもよい。これらの２つの抗体またはその抗原結合断片の組合せの各々は、前記７つのマーカーの１つまたは複数の追加のマーカーによって補充されてもよい（図１４）。３つの抗体またはその抗原結合断片の好ましい組合せは、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０およびＣＤ１４１であってもよい。しかし、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１４１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される３つの抗体またはその抗原結合断片のあらゆる他の組合せも、本明細書で開示されている枯渇化に好適である（図１４）。非心筋細胞の１ステップの枯渇化か、または第２のステップ、例えば、ＣＤ５６に対する抗体での心筋細胞の濃縮との組合せのいずれかにより、９８％までのＰＳＣ由来心筋細胞の精製が可能である。２ステップ手順には、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１４１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される複数の抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０に対する抗体）での事前の枯渇化ステップ、次いで、心筋細胞の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその断片を使用して心筋細胞を濃縮することが含まれ、前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ９９、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｆ、抗ＣＤ２６２、抗ＣＤ８１、抗Ｔｒａ－１－８５、抗ＣＤ４９ｅ、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４６、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ９８、抗ＣＤ６３、および抗ＣＤ１４６ｃ、抗ＣＤ１５１からなる群から選択される。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ５６抗体またはその抗原結合断片であってもよい（図８）。

抗ＣＤ５６抗体またはその抗原結合断片は、本明細書で開示されている方法のステップ２において心筋細胞の濃縮を陽性とするために好ましい抗体またはその抗原結合断片であってもよい。表面マーカースクリーニングによって同定され、心筋細胞濃縮ステップに使用された、候補から選択されたマーカーＣＤ５６は、心筋細胞に排他的に発現されないので、ＣＤ５６に対する抗体による高い純度への心筋細胞の濃縮は、全てのＣＤ５６陽性非心筋細胞の効率的な除去後にのみ可能である。抗体の抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１４１の組合せは、ＣＤ５６陽性非心筋細胞の必要とされる除去を達成した。精製プロトコールの標準化には、分化効率および表面マーカー発現の効率的な適用範囲での変動が必要とされる。ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０およびＣＤ１０に対する抗体を含めることは、非心筋細胞を標識するための抗体組合せの１つの選択であり、心筋細胞精製プロトコールの標準化を可能にし、すなわち、マーカー発現または分化効力の変動に関わらず、同様の純度が得られる。したがって、予想外なことに、抗体の組合せが、分化効率、幹細胞クローンおよび分化プロトコールに関わらず、ＰＳＣ由来心筋細胞の標準化された精製を可能にすることにより、この精製戦略が、性能のロバスト性により再生医学への適用に適したものになる。非心筋細胞を除去するための、同様に有効な戦略は、いまだどこにも報告されていない。

重要なことに、前述の手順は、例えば、ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）ＰｒｏまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用する、人手による磁気細胞分離手順にも、自動化された細胞分離手順にも適用可能であり、それによって、細胞分離手順のスケールアップを可能にし、心筋細胞の自動化された生成を閉鎖系における心筋細胞の自動化された精製に直接的に連結する。さらに、この組合せに限定されないがＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１およびＣＤ１０であることが好ましい、非心筋細胞の枯渇化のための表面マーカー、ならびにこれに限定されないがＣＤ５６であることが好ましい心筋細胞濃縮のための表面マーカーに対する抗体の同じ組合せを使用して、例えば、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用する蛍光活性化セルソーティングによって心筋細胞を濃縮することができることを本発明者らは見出した（図９）。これらのデータにより、抗体の同様のセットを使用する、磁気およびフローサイトメトリーに基づくセルソーティング手順の両方が、再現性をもって心筋細胞を精製するために適用することができることが証明される。

重要なことに、選択される戦略に関わりなく、本明細書で記載された全ての分離手順により、高度に純粋で機能的な心筋細胞が得られ、すなわち、濃縮された心筋細胞を良好にプレーティングし、プレーティング後２４時間以内に収縮を開始し、培養において安定に維持することができた。心筋細胞の濃縮ならびに濃縮後のプレーティングの成功およびサルコメア構造は、オリジナル画分、枯渇化後の心筋細胞濃縮画分、ならびに非心筋細胞の枯渇化、および心筋細胞に関する濃縮後の純粋な心筋細胞集団におけるトロポニンＴ発現の免疫蛍光分析によって追加的に示すことができた（図１０）。濃縮された心筋細胞は典型的な形態を示し、カルシウム感受性色素での標識は、典型的なＣａ^２＋流が観察されたことから精製された心筋細胞の機能性を示した（図１１）。さらに、単離手順は、細胞療法の必須の前提条件である、残留する多能性幹細胞の完全な除去を可能にする。そのような精製された心筋細胞をサブポピュレーションへとさらに分離することは、本明細書で記載された同様の細胞分離技術、および以下に記載される心筋細胞サブポピュレーションマーカーに対する新規抗体を使用することで可能である。

濃縮された心筋細胞のフローサイトメトリー分析により、ミオシン重鎖、アルファアクチニンおよびトロポニンＴのような、心筋細胞特異的マーカーの発現が示され、真の心筋細胞の濃縮が示される。トロポニンＴ陽性集団内のＭＬＣ２ａ（「心房性／未成熟心筋細胞」）およびＭＬＣ２ｖ（「心室性／成熟心筋細胞」）の発現は、異なる心筋細胞サブポピュレーションの存在を示す（図１２）。また、前述の表面マーカーのスクリーニングにより、ＰＳＣ由来心筋細胞サブポピュレーションの標識に適したいくつかの表面マーカーが明らかにされ（図１３）、それによって、ＣＭサブポピュレーションの定量、さらにはＣＭサブポピュレーションの単離が可能となった。

心筋細胞を、心筋細胞特異的筋肉タンパク質（心臓アルファアクチニンまたはトロポニンＴ）に対するモノクローナル抗体で検出した。濃縮された心筋細胞、または心筋細胞および非心筋細胞の混合物を、ヒト表面エピトープに対する抗体で同時に染色した。驚くべきことに、フローサイトメトリー分析は、いくつかの抗体が心筋細胞サブポピュレーションを検出することを明らかにしたが、それぞれの抗原が、ｈＰＳＣ由来ＣＭサブポピュレーションに発現されていることについては以前には報告されていなかった。したがって、本発明のさらなる態様は、心筋細胞サブタイプの分析および単離のための方法を提供する。

本明細書で開示されている方法の多能性および／または複能性幹細胞（ステップａ）を含む出発細胞組成物から由来する心筋細胞は、心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片で標識されてもよく、前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＣＤ３２４、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＣＤ１８４、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７４、および抗ＣＤ８０からなる群から選択される。

心筋細胞のサブポピュレーションの前記標識は、本明細書で開示されている方法のステップｃ）またはｅ）後に引き続いて実施されてもよい。または、非心筋細胞の枯渇化（ステップｃ）および心筋細胞のサブポピュレーションの濃縮は、同時に実施されてもよい。

本発明の好ましい実施形態において、心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片は、厳密に抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＣＤ３２４、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＣＤ１８４、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７４、および抗ＣＤ８０からなる群から選択される１つの抗体またはその断片である。

前記群から選択される心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な１つの抗体またはその抗原結合断片の使用は、心筋細胞サブポピュレーションを同定し単離するのに十分である。

それぞれの表面マーカーと細胞内心筋細胞マーカー（アルファアクチニンまたはトロポニンＴ）の共発現に応じて、表面マーカーは、様々な群に細分される（図１３）：

それぞれの表面マーカーと心筋細胞マーカーの共発現（％）：
群１、８０～９５％：ＰＴＫ７、ＣＤ８１、ＣＤ２７６、ＣＤ２３９、ＣＤ２９８、ＣＤ４９ｃ（図１３Ａ）
群２、６０～８０％：ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ３２４、ＲＯＲ１、ＣＤ１４６、ＣＤ３１７、ＣＤ４９ａ（図１３Ｂ）
群３、４０～６０％：ＣＤ４３、ＣＤ１１１、ＣＤ２０１、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ２２２、ＣＤ８２（図１３Ｃ）
群４、２５～４０％：ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１４２、Ｎｏｔｃｈ－２（図１３Ｄ）
群５、１０～２５％：ＫＩＲ－２Ｄ、ＣＤ１９７、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ１８４、ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、ＣＣＲ１０、ＣＤＩＲ、ＣＤ１８３、ＣＤ９７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３、ｆＭＬＰ、ＣＤ８３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５、ＣＤ７４、ＣＤ８０（図１３Ｅおよび１３Ｆ）

したがって、本明細書で列挙された全ての表面マーカーは、心筋細胞サブポピュレーションを同定、定量および精製するために使用することができる。各サブポピュレーションの機能性は、下流の実験、特に細胞置換療法のために現在使用される心筋細胞の混合物をしのぐ可能性がある。これらのマーカーは、様々な発生段階の細胞、または様々なタイプの心筋細胞を標識することもでき、したがって、様々なサブポピュレーションが、他のものよりも良好に心臓に一体化し得ることから、これらのマーカーの発現は移植において重要な役割を果たし得る。それが理由で、これらのマーカーは、細胞療法などのための心筋細胞サブポピュレーションの精製のための類似の技術（磁気またはフローサイトメトリーに基づく細胞分離）を使用した、当業者に公知の心筋細胞分化プロトコールによって生成されたＰＳＣ由来心筋細胞およびサブポピュレーションの品質管理および選択の両方に適している。

一態様において、本発明は、多能性および／または複能性幹細胞を含む出発細胞組成物に由来する心筋細胞の生成、単離、検出および／または分析のための方法であって、
ａ） 前記多能性および／または複能性幹細胞を心血管細胞に分化させ、それによって、心筋細胞および非心筋細胞を含むサンプルを生成するステップ；
ｂ） 前記サンプルの非心筋細胞を、非心筋細胞の抗原に特異的な複数の抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記複数の抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択されるステップ；
ｃ） 標識された前記非心筋細胞を前記サンプルから枯渇化させるステップ
を含む方法を提供する。

前記方法において、前記サンプルの前記非心筋細胞は、非心筋細胞の抗原に特異的な２、３、４、５、６または７つの抗体またはその抗原結合断片で標識され、前記２、３、４、５、６または７つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される；

前記方法において、前記非心筋細胞は、２つの抗体またはその抗原結合断片で標識され、前記２つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１４０ｂおよび抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ６１および抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６１および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ６１および抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ４４および抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ４４および抗ＣＤ５１／６１、または抗ＣＤ１４１および抗ＣＤ５１／６１である。

前記方法において、前記非心筋細胞は、３つの抗体またはその抗原結合断片で標識され、前記抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１４１および抗ＣＤ１０である。

前記方法において、非心筋細胞の抗原に特異的な前記複数の抗体またはその抗原結合断片は、タグにカップリングされている。

前記枯渇化は、磁気細胞分離によってまたは蛍光活性化セルソーティングによって実施されてもよい。

前記方法において、枯渇化ステップｃ）は、磁気細胞分離によって実施されてもよく、前記タグは磁気粒子であってもよい、または蛍光活性化セルソーティングによって実施されてもよく、前記タグはフルオロフォアであってもよい。

前記方法は、追加のステップ：
ｄ） 前記サンプルの心筋細胞を、心筋細胞の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ９９、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｆ、抗ＣＤ２６２、抗ＣＤ８１、抗Ｔｒａ－１－８５、抗ＣＤ４９ｅ、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４６、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ９８、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ１４６ｃおよび抗ＣＤ１５１からなる群から選択される、ステップ；
ｅ） 標識された前記心筋細胞を濃縮するステップ
を含み得る。

心筋細胞に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ５６であってもよい。

前記方法において、心筋細胞の抗原に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、タグにカップリングされてもよい。

標識された心筋細胞の前記濃縮は、磁気細胞分離によってまたは蛍光活性化セルソーティングによって実施されてもよい。

前記方法において、濃縮ステップｅ）は、磁気細胞分離によって実施されてもよく、前記タグは磁気粒子であってもよい、または蛍光活性化セルソーティングによって実施されてもよく、前記タグはフルオロフォアであってもよい。

前記枯渇化および前記濃縮の両方は、磁気細胞分離によって実施されてもよい、あるいは前記枯渇化および前記濃縮の両方は、蛍光活性化セルソーティングによって実施されてもよい、またはさらに代替的に前記枯渇化は磁気細胞分離によって実施されてもよく、前記濃縮は蛍光活性化セルソーティングによって実施されてもよく、またはその逆でもよい。

前記方法において、ステップは、ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｄ）およびステップｅ）の順番で実施されてもよい。

ステップａ）からｅ）を含む前記方法において、ステップａ）からｅ）は、前記心筋細胞の単離または濃縮の成功を可能にする、任意の順番で実施されてもよい。

前記方法において、前記枯渇化（ステップｃ）および前記濃縮（ステップｅ）が同時に実施される場合、前記サンプルの心筋細胞の、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片での前記標識（ステップｄ）は、ステップａ）の後（かつステップｃ）の前）に実施されてもよい。前記枯渇化（ステップｃ）および前記濃縮（ステップｅ）が同時に実施される場合、非心筋細胞の抗原に特異的な前記複数の抗体またはその抗原結合断片にカップリングされている前記タグと、心筋細胞の抗原に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片にカップリングされている前記タグとは、区別可能な（または別個の）タグであってもよい。タグがフルオロフォアである場合、区別可能なタグは、例えば、ＦＩＴＣおよびＡＰＣであってもよい、またはタグが磁気粒子である場合、区別可能なタグは、例えば、ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）およびマイクロビーズ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）であってもよい。

前記方法において、非心筋細胞の標識（ステップｂ）および心筋細胞の標識（ステップｄ）が同時に実施される場合、非心筋細胞の抗原に特異的な前記複数の抗体またはその抗原結合断片にカップリングされている磁気粒子と、心筋細胞の抗原に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその断片にカップリングされている磁気粒子とは、区別可能な磁気粒子である、あるいは非心筋細胞の標識（ステップｂ）および心筋細胞の標識（ステップｄ）が同時に実施される場合、非心筋細胞の抗原に特異的な前記複数の抗体またはその抗原結合断片にカップリングされているフルオロフォアと、心筋細胞の抗原に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその断片にカップリングされているフルオロフォアとは、区別可能なフルオロフォアである。

あるいは、前記タグ（ｔａｇ）またはタグ（ｔａｇｓ）は、本明細書で開示される方法において使用される抗体の間接的な固定化が可能とする、ビオチンのようなハプテンなどの、磁気粒子またはフルオロフォア以外の他の分子であってもよい。
前記タグが、区別可能なフルオロフォアである場合、少なくともステップｃ）およびｅ）は、蛍光活性化セルソーティングによって同時に実施されてもよい。あるいは、全てのステップは、引き続いて実施されてもよい。

ステップａ）からｃ）を含む前記方法において、方法は、ステップｃ）の後に、追加のステップ：
Ｉ） ステップｃ）の心筋細胞を、心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＣＤ３２４、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＣＤ１８４、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７４、および抗ＣＤ８０からなる群から選択される、ステップ；
ＩＩ） ステップＩ）の標識された前記心筋細胞を濃縮し、それによって、心筋細胞のサブポピュレーションを濃縮するステップ
を含む。

ステップａ）からｅ）を含む前記方法において、方法はステップｅ）の後に、追加のステップ：
Ｉ） ステップｅ）の心筋細胞を、心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＣＤ３２４、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＣＤ１８４、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７４、および抗ＣＤ８０からなる群から選択される、ステップ；
ＩＩ） ステップＩ）の標識された前記心筋細胞を濃縮し、それによって、心筋細胞のサブポピュレーションを濃縮するステップ
を含む。

一般に、前記方法の分化ステップは、前記多能性および／または複能性幹細胞を心筋細胞に分化させることに適した任意の培地で実施されてもよい（本明細書で開示されている方法のステップａ））。多能性／複能性幹細胞の心筋細胞への分化、ならびに心筋細胞および心筋細胞サブタイプの精製は、閉鎖系において自動化された形で実施されてもよい。多能性／複能性幹細胞の心筋細胞への分化に使用される好ましい閉鎖系は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ｐｒｏｄｉｇｙであってもよい。

別の態様において、本発明は、上記および本明細書で開示されている方法によって得られる心筋細胞の実質的に純粋な組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、上記および本明細書で開示されている方法によって得られる心筋細胞の組成物を含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、心筋細胞のサブポピュレーションを含む実質的に純粋な組成物であって、前記サブポピュレーションが、ＰＴＫ７、ＣＤ８１、ＣＤ２７６、ＣＤ２３９、ＣＤ２９８、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ３２４、ＲＯＲ１、ＣＤ１４６、ＣＤ３１７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４３、ＣＤ１１１、ＣＤ２０１、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ２２２、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１４２、Ｎｏｔｃｈ－２、ＫＩＲ－２Ｄ、ＣＤ１９７、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ１８４、ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、ＣＣＲ１０、ＣＤＩＲ、ＣＤ１８３、ＣＤ９７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３、ｆＭＬＰ、ＣＤ８３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５、ＣＤ７４、およびＣＤ８０からなる表面マーカーの群から選択される少なくとも１つの表面マーカー（抗原）の発現を含み、前記組成物が、多能性および／または複能性幹細胞を含む出発細胞組成物に由来する心筋細胞の濃縮のための方法によって得られ、前記方法が、
ａ） 前記ヒト多能性および／または複能性幹細胞を心血管細胞に分化させ、それによって、心筋細胞および非心筋細胞を含むサンプルを生成するステップ；
ｂ） 前記ンプルの非心筋細胞を、非心筋細胞の抗原に特異的な複数の抗体またはその断片で標識するステップであって、前記複数の抗体またはその断片は、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１７１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される、ステップ；
ｃ） 標識された前記非心筋細胞を前記サンプルから枯渇化させるステップ；
ｄ） ステップｃ）の心筋細胞を、心筋細胞の前記サブポピュレーションの抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＣＤ３２４、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＣＤ１８４、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７４、および抗ＣＤ８０からなる群から選択される、ステップ；
ｅ） ステップｄ）の標識された前記心筋細胞を濃縮し、それによって、心筋細胞のサブポピュレーションの組成物を生成するステップ
を含む、実質的に純粋な組成物を提供する。

心筋細胞の前記サブポピュレーションは、薬学的な使用のためであってもよい。

別の態様において、本発明は、心筋細胞のサブポピュレーションの実質的に純粋な組成物であって、前記サブポピュレーションが、ＰＴＫ７、ＣＤ８１、ＣＤ２７６、ＣＤ２３９、ＣＤ２９８、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ３２４、ＲＯＲ１、ＣＤ１４６、ＣＤ３１７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４３、ＣＤ１１１、ＣＤ２０１、ＣＤ１３８、ＣＤ２７１、ＣＤ２２２、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１４２、Ｎｏｔｃｈ－２、ＫＩＲ－２Ｄ、ＣＤ１９７、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ１８４、ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、ＣＣＲ１０、ＣＤＩＲ、ＣＤ１８３、ＣＤ９７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３、ｆＭＬＰ、ＣＤ８３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５、ＣＤ７４、およびＣＤ８０からなる群から選択される少なくとも１つの表面マーカー（抗原）の発現を含み、前記組成物が、多能性および／または複能性幹細胞を含む出発細胞組成物に由来する心筋細胞の生成および単離のための方法によって得られ、前記方法が、
ａ） 前記多能性および／または複能性幹細胞を心血管細胞に分化させ、それによって、心筋細胞および非心筋細胞を含むサンプルを生成するステップ；
ｂ） 前記サンプルの非心筋細胞を、非心筋細胞の抗原に特異的な複数の抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ１７１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される、ステップ；
ｃ） 標識された前記非心筋細胞を前記サンプルから枯渇化させるステップ；
ｄ） 前記サンプルの心筋細胞を、心筋細胞の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ９９、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ４９ｆ、抗ＣＤ２６２、抗ＣＤ８１、抗Ｔｒａ－１－８５、抗ＣＤ４９ｅ、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４６、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ９８、抗ＣＤ６３、抗ＣＤ１４６ｃおよび抗ＣＤ１５１からなる群から選択される、ステップ；
ｅ） 標識された前記心筋細胞を濃縮するステップ；
ｆ） ステップｅ）の心筋細胞を、心筋細胞の前記サブポピュレーションの抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＣＤ３２４、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＣＤ１８４、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７４、および抗ＣＤ８０からなる群から選択される、ステップ；
ｇ） ステップｆ）の標識された前記心筋細胞を濃縮し、それによって、心筋細胞のサブポピュレーションの組成物を生成するステップ
を含む、実質的に純粋な組成物を提供する。

実施形態
ＰＳＣ由来心筋細胞の精製のための方法は、ＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用する磁気細胞分離によって例示された：

ＰＳＣ由来心筋細胞の単離の出発点は、ヒトＰＳＣの心血管分化から典型的に得られる、ＰＳＣ由来心筋細胞および非心筋細胞の混合細胞集団である。分化プロセスは、図１に示されるように実施されてもよい。

ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来心筋細胞の磁気単離は、１または２ステップ手順において実施される。第１に、非心筋細胞を、非心筋細胞マーカー（例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０）に対する抗体の組合せ（複数の抗体）で磁気的に標識し、引き続いて、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）の磁場に置いたＭＡＣＳ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）による分離によって枯渇化させる。

第２ステップにおいて、ＰＳＣ由来心筋細胞を、心筋細胞マーカー（例えば、ＣＤ５６）に対する少なくとも１つの抗体で磁気的に標識し、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に置いたＭＡＣＳ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による分離によって、事前に濃縮されたＰＳＣ由来心筋細胞画分からの陽性選択によって単離する。

磁場からカラムを取り除いた後、磁気的に保持しているＰＳＣ由来心筋細胞を、陽性選択された細胞画分として溶出することができる。磁気によるＣＭ（心筋細胞）濃縮は、例えば、ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）、ならびに閉鎖系、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用して自動化された形で実施することもできる。

ＭＡＣＳ（登録商標）技術以外の他の磁気細胞分離システムを使用してもよい。本明細書でほんの一例として使用されるＭＡＣＳ（登録商標）技術に磁気細胞分離プロセスを制限することは意図していない。

ＰＳＣ由来心筋細胞の精製のための方法は、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｑｕａｎｔ Ｔｙｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用する蛍光活性化セルソーティング技術によって例証された：
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）では、１または２ステップソーティング手順が、可能である。ＰＳＣ由来心筋細胞および非心筋細胞は、異なるフルオロフォアを使用して、非心筋細胞マーカー（例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０）に対する抗体および心筋細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ５６）に対する抗体の組合せで標識される。心筋細胞表面マーカーについて陽性であり、非心筋細胞マーカーについて陰性である心筋細胞は、次いで、閉鎖型の無菌システムにおけるセルソーティングも可能にする、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｑｕａｎｔ Ｔｙｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）などのフローサイトメーターを使用してソーティングすることができる。

精製された心筋細胞は、選択した分離戦略に関わらず、効率的にプレーティングされ、培養においてリプレーティング後に接触を開始する。ＭＡＣＳ（登録商標）Ｑｕａｎｔ Ｔｙｔｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）以外の他の蛍光活性化セルソーティングシステムも、使用してもよい。本明細書でほんの一例として使用されるＭＡＣＳ（登録商標）Ｑｕａｎｔ Ｔｙｔｏに、磁気細胞分離プロセスを制限することは意図していない。

閉鎖系におけるＰＳＣ由来心筋細胞の精製のための方法：
本明細書中、本発明の方法を、閉鎖され、優先的には自動化されたシステムにおいて実施して、濃縮された心筋細胞をＧＭＰまたはＧＭＰ様条件下で生成することができることも開示される。予想外なことに、本発明の方法は、前記閉鎖系を使用する自動化されたプロセスにおいて利用しやすいことが見出された。

本発明の方法によって得られる組成の細胞は、例えば、冠状動脈性心疾患のような、心筋細胞の損失と関連する心臓疾患に罹患している患者における、心筋細胞の損失によって引き起こされる症状を軽快または好転させる治療処置として、患者に対する細胞置換療法に使用してもよい。

本発明の一実施形態において、前記方法は、自動化された方法（プロセス）である。方法は、（１）ＰＳＣ由来心筋細胞の生成、ならびに（２）閉鎖系における心筋細胞および心筋細胞サブポピュレーションの精製を含む。

心血管分化プロトコールを閉鎖系に移行させるには、それぞれの分化の安定的な性能およびスケーラビリティが必要とされる。心筋細胞精製プロトコールの標準化には、分化効率および表面マーカー発現の有効な適用範囲での変動が必要とされる。したがって、使用される分化プロトコールもしくは幹細胞株または分化の時点に関わらず、例えば、非心筋細胞の除去のための抗体カクテル抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１４１および抗ＣＤ１０、ならびに、例えば、心筋細胞のさらなる濃縮のための抗ＣＤ５６抗体のロバスト性能は、閉鎖系における標準化されたプロセスを保証する。抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ９０および抗ＣＤ３１のような、非心筋細胞マーカーに対する他の以前に報告された抗体組合せ（図４）は、非心筋細胞に制限されず、または単独で使用される場合（抗ＣＤ１４０ｂ、図５）も、非心筋細胞のサブポピュレーションだけを標識し、したがって、心筋細胞の高い精製を保証する、閉鎖され、自動化されたシステムにおける使用に適していない。さらに、ＣＤ５６に対する抗体だけによる心筋細胞の濃縮は、ＣＤ５６が非心筋細胞にも発現されることが公知であることから、不十分であり、したがって、第１のステップにおいてＣＤ５６陽性非心筋細胞の除去が必要とされる。したがって、本明細書で開示される抗体組合せは、閉鎖され自動化された心筋細胞生成および精製手順に適している。さらに、本明細書で開示される方法によって供給される心筋細胞からの心筋細胞サブポピュレーションの選択的な濃縮により、閉鎖系における心筋細胞集団のさらなる純化が可能となる。

したがって、多能性細胞または非心筋細胞が混入していない、より良く規定された細胞組成をもたらす全てのステップは、心血管疾患の処置のための潜在的な細胞産物などの細胞組成物の臨床への適用の安全性および有効性を高めるのに寄与する。

そのような閉鎖系は、ほとんどの、優先的には全てのステップを自動化された形で実施することが可能となり得る。例として、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が、自動化されたプロセスを実装された、閉鎖細胞サンプルプロセシングシステムとして本明細書で使用されている。このシステムは、ＷＯ２００９／０７２００３に詳細に開示されている。しかし、本発明の方法の使用を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に制限することは意図していない。

定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味と同一である。

本明細書で使用される用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、自己複製し、胚性胚葉の内胚葉、中胚葉および外胚葉、ならびにそれに由来する細胞のいずれかに分化する潜在能力を有することが可能な細胞を指す。これらの特徴は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にも当てはまる。優先的には、これらの細胞は、ヒトである。ヒト胚性幹細胞を、例えば、ＷＯ０３／０４６１４１に開示されているように、破壊することなく胚から単離することができる。多能性の程度が異なることは、当技術分野において公知であり、「プライム型」の多能性幹細胞、「ナイーブ型」の多能性幹細胞、または「リセット段階」の多能性幹細胞と呼ばれる。

本明細書で使用される用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、分化能が低くなった細胞、すなわち、より分化した細胞、典型的には体細胞から多能性の状態に変換することによって生成された多能性細胞を指し、生じた細胞は、自己複製し、胚性胚葉の内胚葉、中胚葉および外胚葉、ならびにそれに由来する細胞のいずれかに分化する潜在能力を有することが可能である。

本明細書で使用される用語「複能性幹細胞」は、限定されるが複数の細胞型に分化する能力を有する前駆細胞を指す。

本明細書で使用される用語「分化」は、発生生物学において使用される用語である細胞分化を指し、特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスを表す。インビトロでは、幹細胞の分化は、自発的に起こり得るか、または特殊な培養培地、サイトカイン、受容体アンタゴニストまたは小分子などの分化誘導因子を培養培地に添加することによって意図的に誘導される。「０日」は、分化の開始日を示す。分化プロセスは、操作者が望む限り持続してもよく、細胞培養培地が細胞を生存および／または成長および／または増殖させる条件を有する限り実施することができる。

本明細書で使用される用語「出発細胞組成物」は、多能性および／または複能性幹細胞ならびに他の細胞を任意の比で含むサンプル、またはサンプル中の前記多能性または複能性幹細胞と他の細胞との混合物を指す。優先的には、前記出発細胞組成物は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％までの多能性または複能性幹細胞である細胞を含む。優先的には、出発細胞組成物は、多能性および／または複能性幹細胞からなる。前記他の細胞は、前記多能性または複能性幹細胞を起源とする、自発的に分化した細胞であってもよい。前記自発的に分化した細胞は、幹細胞関連マーカーの発現の損失および分化関連マーカーの発現の開始によって特徴付けられる。優先的には、細胞は、生存可能である。細胞は、ヒトを起源とする。

本明細書で使用される用語「ロバスト性能」または「ロバスト性」は、心筋細胞濃縮について選択される、抗原発現における変動性、分化効率、使用される幹細胞クローン、および分化の時点に関わらず、９８％までの純度の心筋細胞の精製を指す。精製方法は、本明細書で開示されている非心筋細胞または心筋細胞を標識するための抗体の組合せによる、本明細書で開示されている１または２ステップの細胞分離手順のいずれかに基づいており、これによって、前記抗原を発現する細胞の生成および分離のための自動化されたプロセスの実装が可能となる。

抗原結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片に関する用語「に特異的に結合する」または「に特異的な」は、サンプル中の特異的抗原、例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０、ＣＤ５６を認識して、それに結合するが、前記サンプル中の他の抗原は実質的に認識せず、結合もしない抗原結合分子（抗体またはその抗原結合断片の場合、抗原結合ドメイン）を指す。ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗体またはその断片の抗原結合ドメインは、別の種に由来するその抗原にも結合し得る。この異種間反応性は、本明細書で使用される「に特異的な」の定義に反しない。抗原、例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０、ＣＤ５６抗原に特異的に結合する抗体またはその断片の抗原結合ドメインは、前記抗原の異なるバリアント（対立形質バリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど）にも実質的に結合し得る。この交差反応性は、抗原、例えば、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０、ＣＤ５６に特異的であるという抗原結合ドメインの定義に反しない。

本明細書で使用される用語「閉鎖系」は、新たな材料の導入、ならびに細胞の増殖、分化、活性化および／または分離などの細胞培養ステップの実施などの培養プロセスの実施の間の細胞培養汚染の危険性を低下させるいかなる閉鎖系も意味する。このような系は、ＧＭＰまたはＧＭＰ様条件（「無菌」）下での操作を可能にし、臨床的に適用可能な細胞組成物を生じる。本明細書では、例としてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を閉鎖系として使用する。このシステムは、ＷＯ２００９／０７２００３に開示されている。しかし、本発明の方法の使用をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙに制限することは意図していない。

本明細書で使用される用語「自動化された方法」、または「自動化されたプロセス」は、そうでなければ操作者によって手動で実施されるであろう、装置および／またはコンピュータおよびコンピュータソフトウェアの使用により自動化されている任意のプロセスを指す。自動化された方法（プロセス）は、実現するためヒトの介入を減らし、ヒトの時間を短縮することを必要とする。場合によっては、本発明の方法の少なくとも１ステップが、ヒトの支援も介入もなく実施される場合、本発明の方法は自動化されている。優先的には、本明細書で開示されている本発明の全てのステップがヒトの支援も介入もなく実施される場合、本発明の方法は自動化されている。優先的には、自動化されたプロセスは、本明細書で開示されている閉鎖系、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙに実装される。

用語「治療上有効な量」は、患者における治療上の利益をもたらす量を意味する。

本明細書で使用される用語「マーカー」は、ある特定の細胞型によって特異的に発現される、細胞抗原を指す。優先的には、マーカーは、細胞表面マーカーであるため、生細胞の濃縮、単離および／または検出を実施することができる。マーカーは、本明細書で使用されるＣＤ５６などの陽性選択マーカーであってもよい、または本明細書で使用されるＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０などの陰性選択マーカーであってもよい。細胞内に発現される細胞抗原、例えば、構造または筋肉タンパク質または転写因子は、心筋細胞および／またはそのサブポピュレーションを同定するため使用される分析用マーカーであるが、生細胞の濃縮のためには使用できない。

本明細書で使用される用語「発現」は、コードされるタンパク質を含む、遺伝子または遺伝子産物の発現を互換的に指す。遺伝子産物の発現は、例えば、タンパク質に結合する抗体を使用するイムノアッセイによって決定されてよい。例えば、タンパク質、例えば、細胞表面タンパク質ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１０、ＣＤ５６のレベルを決定するため好適な技術は、フローサイトメトリー技術である。
代替的に、遺伝子の発現は、例えば、ｍＲＮＡレベルの測定によって決定されてよい。

本明細書で使用される用語「ＰＳＣ由来心筋細胞（ＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」または「ＰＳＣ由来心筋細胞（ＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）」は、特殊な培地、小分子、成長因子、サイトカイン、選択される遺伝子またはＲＮＡの過剰発現などの誘導の合図によって、多能性幹細胞からインビトロで生成されるサルコメア含有横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、特殊な分子、例えば、ミオシン重鎖、トロポニンＴ、ミオシン軽鎖、心臓アルファアクチニンのようなタンパク質の発現によって特徴付けられる。心筋細胞は、同様に、他の細胞型から生成されてもよい。本明細書で使用される用語「心筋細胞」は、任意の心筋細胞サブポピュレーションまたは心筋細胞サブタイプ、例えば、心房性、心室性およびペースメーカー心筋細胞を含むアンブレラタームである。

本明細書で使用される用語「非心筋細胞（ｎｏｎ－ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」または「非心筋細胞（ｎｏｎ－ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）」は、本明細書で規定される、および使用される「心筋細胞」の判定基準を満たさない細胞調製物における任意の細胞、または細胞の集団を指す。

用語「心筋細胞サブポピュレーション」または「心筋細胞サブタイプ」は、互換的に使用され、上で規定される心筋細胞の集団内の任意のサブポピュレーションを指す。それぞれの心筋細胞サブポピュレーションまたはサブタイプは、選択される細胞表面マーカーと、ミオシン重鎖、トロポニンＴ、心臓アルファアクチニン、ミオシン軽鎖のような細胞内心筋細胞特異的なタンパク質との共発現によって同定される。本明細書で開示されている方法によって得られる心筋細胞および／または心筋細胞サブポピュレーションは、当業者に公知の研究、診断学、薬理学的、または臨床適用などの引き続くステップに使用されてもよい。

本明細書で使用される用語「心血管細胞」は、多能性幹細胞の分化によってインビトロで生成された心血管系統の細胞を指す。これには、単または複能性の前駆細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心筋細胞、および各細胞型のそれぞれのサブタイプが含まれるが、制限されない。

本明細書で使用される用語「除去／枯渇化」は、例えば、本明細書で規定される、および使用される非心筋細胞に特異的な抗原結合分子との標識による、またはパーコール勾配遠心分離などの物理的な枯渇化法の使用による、または特殊な培地（例えば、グルコース枯渇化乳酸豊富化培地）の使用による、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子もしくは分子ビーコンを使用し、それによって、非心筋細胞を特異的に標識し、細胞分離手順、例えば、磁気セルソーティングまたは蛍光活性化セルソーティング（例えば、ＦＡＣＳ（登録商標））による、それらの枯渇化を可能にすることによる、望まれない非心筋細胞から所望の心筋細胞を分離する陰性選択のプロセスを指す。

本明細書で使用される用語「タグ」は、抗原結合分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片が、他の分子、例えば、粒子、フルオロフォア、ビオチンのようなハプテン、または培養皿およびマイクロタイタープレートなどの大きな表面にカップリングまたはコンジュゲーションすることを指す。場合によっては、例えば、抗原結合分子を培養皿の大きな表面にカップリングする場合、カップリングは、抗原結合分子の直接的な固定化となる。他の場合は、このカップリングは間接的な固定化となり、例えば、磁気ビーズに直接的または間接的に（例えば、ビオチンを介して）カップリングされている抗原結合分子は、前記ビーズが磁場に保持されると固定化される。さらに他の場合は、抗原結合分子の、他の分子へのカップリングは、直接的にも間接的にも固定化せず、本発明による細胞の濃縮、分離、単離および検出を可能にする。例えば、抗原結合分子がフルオロフォアにカップリングされ、これにより、例えば、ＦＡＣソーティング（ＦＡＣＳｏｒｔｉｎｇ）のようなフローサイトメトリー法または蛍光顕微鏡によって、強く標識された細胞、弱く標識された細胞、および標識されていない細胞を区別することが可能になる場合などである。

本明細書で使用される用語「粒子」は、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子またはビーズなどの固相を指す。このような粒子を生成する方法は、当技術分野において周知である。粒子は、磁気粒子であってもよい。粒子は、溶液もしくは懸濁液中にあってもよく、または本発明で使用する前に、ある状態にあってもよい。次いで、凍結乾燥された粒子は、本発明に関して処理されるサンプルと接触させる前に好都合な緩衝液で復元される。

本明細書で使用される用語「磁性粒子」における「磁性」は、当業者に周知の方法で調製できる磁性粒子の全てのサブタイプ、特に強磁性粒子、超常磁性粒子および常磁性粒子を指す。「強磁性」材料は磁場に強く影響を受け、磁場が除去されたとき、磁気特性を保持することが可能である。「常磁性」材料は、弱い磁化率のみを有し、磁場を取り除くと迅速にその弱い磁気を失う。「超常磁性」材料は、高い磁化率を有し、すなわち、磁場に置くと強く磁気を帯びるが、常磁性材料のように迅速に磁気を失う。

本明細書で使用される用語「抗体」は、当業者に周知の方法で生成することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を指す。抗体は、マウス、ラット、ヒツジ、ヒトなどの任意の種のものであってもよい。治療目的では、非ヒト抗原結合断片が使用される場合は当技術分野で公知の任意の方法によってこれらをヒト化することができる。抗体は、修飾抗体（例えばオリゴマー、還元、酸化および標識抗体）であってもよい。

用語「抗体」は、インタクトな分子とＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体などの抗体断片（抗原結合断片）の両方を含む。

抗体と、タグまたは粒子との間の連結（カップリングまたはコンジュゲーション）は、共有結合または非共有結合であり得る。共有結合は、例えばポリスチレンビーズ上のカルボキシル基に対する、または修飾ビーズ上のＮＨ２もしくはＳＨ２基に対する連結であり得る。非共有結合連結は、例えば、ビオチン－アビジン、または抗フルオロフォア抗体に連結されているフルオロフォアカップリング粒子を介する。粒子、フルオロフォア、ビオチンのようなハプテン、または大きな表面、例えば、培養皿に対して抗体をカップリングするための方法は、当業者に周知である。

原理的には、除去、濃縮、単離または選択のために、任意のソーティング技術を使用することができる。この技術には、例えばアフィニティークロマトグラフィー、または当技術分野において公知の任意の他の抗体依存性の分離技術が含まれる。当技術分野において公知のあらゆるリガンド依存性の分離技術を、細胞の物理的特性を利用する陽性および陰性の両方の分離技術と併用することもできる。

特に強力なソーティング技術は、磁気セルソーティングである。細胞を磁気的に分離する方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｉｎ Ｃｅｌｌｐｒｏ、Ｓｅａｔｔｌｅ、またはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎから市販されている。例えば、モノクローナル抗体は、Ｄｙｎａｌ Ｍ４５０のような磁気ポリスチレン粒子または類似の磁気粒子に直接的にカップリングし、例えば細胞分離のため使用することができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ技術はカラムベースではなく、代わりに、細胞が付着したこれらの磁気ビーズはサンプルチューブ中で液相キネティクスを受け、チューブを磁気ラック上に置くことによって細胞が単離される。しかし、本発明による心筋細胞を含有するサンプルから心筋細胞サブポピュレーションを濃縮、ソーティングおよび／または検出するための好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、例えば、多糖による有機物コーティングを有するコロイド性超常磁性マイクロ粒子（磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ（登録商標））技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ））と併用される。これらの粒子（ナノビーズまたはマイクロビーズ）は、モノクローナル抗体に直接的にコンジュゲートするか、または抗免疫グロブリン、アビジンもしくは抗ハプテン特異的マイクロビーズと併用するかのいずれかであってもよい。ＭＡＣＳ技術により、細胞を、特定の表面抗原に対する抗体でコーティングした磁気ナノ粒子と共にインキュベートすることによって分離することが可能となる。これにより、この抗原を発現する細胞を磁気ナノ粒子に付着させる。その後、細胞溶液は、強磁場に置かれたカラムに移される。このステップにおいて、細胞（抗原を発現している）はナノ粒子に付着し、カラムに滞留するが、他の細胞（抗原を発現していない）は流される。この方法により、細胞を、特定の抗原に関して陽性または陰性に分離することができる。陽性選択の場合、磁気カラムに付着している、対象の抗原を発現している細胞は、磁場からカラムを取り除いた後に、分離容器に洗い出される。陰性選択の場合、使用される抗体は、対象ではない細胞に存在することが公知である表面抗原に対する抗体である。

カラムに細胞／磁気ナノ粒子溶液をアプライした後、これらの抗原を発現している細胞はカラムに結合し、流出する画分は、対象の細胞を含有するため採取される。これらの細胞は、ナノ粒子にカップリングされている抗体によって標識されていないので、「自然のまま（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ）」である。手順は、直接的な磁気標識または間接的な磁気標識を使用して実施することができる。直接的な標識の場合、特異的な抗体は、磁気粒子に直接的にカップリングされている。直接的な磁気標識が可能ではない、または望まれない場合、間接的な標識が好都合な代替となる。任意の細胞表面マーカーに対する、一次抗体、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体、一次抗体の組合せを、この標識戦略に使用することができる。一次抗体は、コンジュゲートされていないもの、ビオチン化されたもの、またはフルオロフォアがコンジュゲートされたもののいずれであってもよい。次いで、磁気標識は、抗免疫グロブリンマイクロビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、または抗フルオロフォアマイクロビーズで達成される。本発明の方法は、ａ）混合細胞集団からの非心筋細胞の除去、またはｂ）混合細胞集団からの心筋細胞および心筋細胞サブタイプの濃縮を目的とする、直接的な磁気標識および間接的な磁気標識の両方を可能にする。前述のプロセスはまた、閉鎖型細胞サンプルプロセシングシステム、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施することができる。

本明細書で使用される用語「剤」は、優先的には多能性幹細胞から心血管細胞、好ましくは心筋細胞への分化を誘導するように細胞培地に添加するための、物質、例えば、小分子、成長因子、サイトカイン、選択された遺伝子またはＲＮＡの過剰発現を指す。

本明細書で使用される用語「心筋細胞の実質的に純粋な組成物」または「心筋細胞のサブポピュレーションの実質的に純粋な組成物」は、標的細胞画分中に、少なくとも７０％、より優先的には少なくとも９０％、最も優先的には少なくとも９５％のアルファアクチニンもしくはトロポニンＴまたはミオシン重鎖もしくはミオシン軽鎖陽性細胞を含有する細胞組成物を指す。

用語「多能性および／または複能性幹細胞から心筋細胞への分化」には、少なくとも２０％、より優先的には少なくとも５０％、最も優先的には少なくとも７０％の効力で心筋細胞が分化するのに適した任意の培地または方法が含まれる。そのような方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｚｈａｎｇ等（２０１５）に開示されている。

濃縮された心筋細胞集団および／またはサブポピュレーションはまた、細胞培養の前および／または後に、療法、例えば、細胞療法、または疾患の予防における医薬組成物として使用することもできる。医薬組成物は、動物またはヒト、優先的にはヒト患者に移植されてもよい。医薬組成物は、薬学的に有効な量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを場合によって含む、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の処置および／または予防のために使用することができる。疾患は、心筋細胞の存在によって、および／または関連性のある場所、すなわち心臓における関連性のある細胞の濃度を増加させることによって処置および／または予防することができる、任意の疾患であってもよい。治療的および／または予防的に処置される疾患は、任意の心臓障害、例えば、虚血または急性／慢性炎症の結果としての心筋細胞の損失により特徴付けられる障害であってもよい。処置は、心臓の関連性のある場所への濃縮された心筋細胞集団および／またはサブポピュレーションの移植であってもよい。本開示の医薬組成物は、処置（または予防）対象の疾患に適した形で投与してもよい。適切な用量は臨床試験によって決定できるが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの因子によって決定されることになる。

多能性および／または複能性幹細胞の心筋細胞への分化
多能性幹細胞由来心筋細胞の効率の高い生成に使用されたプロトコールは、Ｚｈａｎｇ等（２０１５）による以前に公開された方法に基づき、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤および阻害剤、ならびにＦＧＦ－２、アクチビンＡ、ＢＭＰ－４およびＲｈｏ－キナーゼ阻害剤を組み合わせた（図１ａ）。心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）発現のフローサイトメトリー分析（図１ｂを参照されたい）、およびＰＳＣ由来心筋細胞培養物の典型的な形態（図１ｃを参照されたい）によって示されるように、心筋細胞は７日以内で高い効力で生成された。

ＰＳＣ由来心筋細胞の精製に適した心筋細胞および非心筋細胞マーカーの同定
実施例１に記載されたプロトコールに従ってｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを分化させた。心筋細胞および非心筋細胞マーカーの同定のために、４００を超える抗体でのフローサイトメトリーに基づく表面マーカースクリーニングを、９６ウェルフォーマットで実施した。心筋細胞と非心筋細胞とを区別するために、細胞内心筋細胞マーカー、例えば、アルファアクチニンまたはトロポニンＴ（ｃＴＮＴ）に対する抗体で細胞をカウンター染色した。Ｉｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して細胞内染色（ｉｎｓｉｄｅ ｓｔａｉｎ）を実施した。表面マーカースクリーニングの結果を、フローサイトメーター、例えば、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分析した。この手順を使用して、細胞内心臓マーカーとの共発現がほとんどない（図２Ａ、２Ｂを参照されたい）、細胞内心筋細胞マーカーの発現と完全に重複する（図３Ａ、３Ｂを参照されたい）、または心臓マーカーの発現と部分的に重複する（図１３Ａ～Ｆを参照されたい）のいずれかを示す、いくつかのマーカーを同定した。後者のマーカーは、心筋細胞サブポピュレーションを標識する。さらに、非心筋細胞に関して以前に報告された、いくつかの表面マーカーを、このスクリーニングアプローチによって分析した（図４を参照されたい）。全ての３つのマーカーが細胞内心臓マーカー、トロポニンＴまたはアルファアクチニンとの部分的な共発現を示すので、３つのマーカーのうちのどれもが非心筋細胞だけを標識するわけではないことを、データは示す。

非心筋細胞の磁気枯渇化によるＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１を参照されたい）を、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）に使用した。細胞を、引き続いて、抗ＣＤ１４０ｂビオチン抗体、および磁気ビーズにコンジュゲートした抗ビオチン抗体で標識し、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に置かれたＭＡＣＳ細胞分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してさらに分離した。陰性画分を、抗ＣＤ１４０ｂおよび細胞内心筋細胞特異的マーカー心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）でカウンター染色した。出発心筋細胞集団の純度を３７．１％から４８．１８％に増加できることが示された（図５）。

心筋細胞の磁気濃縮化によるＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１を参照されたい）を磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）に使用した。細胞を、抗Ｓｉｒｐａビオチンまたは抗ＶＣＡＭ－１ビオチン抗体のいずれか、および磁気ビーズにコンジュゲートした抗ビオチン抗体で標識した。ＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮のための両マーカーは以前に報告されたものである。ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に置かれたＭＡＣＳ細胞分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、細胞をさらに分離した。陽性画分（濃縮された心筋細胞）を、抗Ｓｉｒｐａまたは抗ＶＣＡＭ－１抗体のいずれか、および細胞内心筋細胞特異的マーカー心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）に対する抗体でカウンター染色した。細胞分離抗体として、抗Ｓｉｒｐａを使用して１７％から３２％に、抗ＶＣＡＭ－１を使用して１２％から３４％にＰＳＣ由来心筋細胞を濃縮できることが示された（それぞれ図６ａおよび６ｂを参照されたい）。

１または２ステップ細胞分離戦略を使用するＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１を参照されたい）をＭＡＣＳに使用した。分化効率および幹細胞クローンに応じて、１または２ステップの細胞分離戦略を使用した。第１のステップには、抗ＣＤ１４０ｂビオチン、抗ＣＤ１０ビオチンおよび抗ＣＤ１４１ビオチン、非心筋細胞集団に特異的な抗体の組合せ、および磁気ビーズにコンジュゲートした抗ビオチン抗体の抗体での、非心筋細胞集団の磁気標識が含まれる。次いで、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に置かれたＭＡＣＳ細胞分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、細胞を分離した。非心筋細胞の枯渇化のみの後に得られた心筋細胞濃縮画分は、図７に示される高度に精製された心筋細胞集団、または図８に示される部分的に精製された心筋細胞集団のいずれかを含有した。後者の結果では、引き続いて、磁気ビーズに直接的にコンジュゲートされた抗ＣＤ５６抗体を使用して、心筋細胞を直接的に磁気的に標識した（ステップ２）。ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場に置かれたＭＡＣＳ細胞分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、細胞をさらに分離した。陽性心筋細胞含有画分は、心筋細胞マーカー心臓トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）に対する抗体でカウンター染色したところ、高い純度を示した。

蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用するＰＳＣ由来心筋細胞の濃縮
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１を参照されたい）をＦＡＣＳに使用した。抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１０および抗ＣＤ１４１ ＰＥ－Ｖｉｏ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ならびに抗ＣＤ５６ ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ（商標）ＦＩＴＣ抗体を使用して細胞を染色した。次いで、細胞をソーティングカートリッジに移し、マイクロチップに基づくフローサイトメーターＭＡＣＳ ＱｕａｎｔＴｙｔｏ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してソーティングした。ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１０およびＣＤ１４１陰性かつＣＤ５６陽性細胞を規定し、陽性画分としてソーティングした。陽性画分の細胞を、心臓マーカー心臓トロポニンＴを使用してカウンター染色したところ、高い純度の陽性画分を示した（図９を参照されたい）。

精製されていないおよび精製されたＰＳＣ由来心筋細胞の免疫蛍光分析
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１）を、実施例５に記載されたＭＡＣＳを使用して精製した。オリジナル画分、非心筋細胞枯渇化画分（ステップ１）および心筋細胞濃縮画分（ステップ２）の細胞を、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティング９６ウェルプレートのＳｔｅｍＭＡＣＳ（登録商標）Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した標準培養培地にプレーティングした。細胞密度は、細胞３００，０００個／ｃｍ^２であった。細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養した。その後、細胞を、４％ＰＦＡを使用して固定した。ＭＡＣＳ（登録商標）ＢＳＡストック溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）リンス緩衝液を使用して、ブロッキングを実施した。次いで、細胞を、心臓トロポニンＴ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＩｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の成分を使用するＨｏｅｃｈｓｔで染色した。図１０に示されるように、ＰＳＣ由来心筋細胞の段階的な精製プロセスは、蛍光顕微鏡を使用して可視化することができた。

精製された心筋細胞の機能性および形態
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１）を、実施例５に記載されたＭＡＣＳを使用して精製した。陽性画分の細胞を、マトリゲル（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティング９６ウェルプレートのＳｔｅｍＭＡＣＳ（登録商標）Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した標準培養培地にプレーティングした。細胞密度は、細胞３００，０００個／ｃｍ^２であった。細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養した。次いで、細胞形態をモニターした（図１１ｂを参照されたい）。次いで、心筋細胞のカルシウム流を可視化するために、細胞を、カルシウム感受性色素Ｆｌｏｕ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生染色した。心筋細胞に典型的なカルシウム流を、蛍光顕微鏡を使用して観察した（図１１ａを参照されたい）。

精製された心筋細胞の心筋細胞特異的なマーカーの分析
ＰＳＣ由来心筋細胞培養物（実施例１）を、実施例５に記載されたＭＡＣＳを使用して精製した。精製された心筋細胞画分を、Ｉｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、心筋細胞特異的細胞内マーカーに対する抗体の異なる組合せで染色し、フローサイトメーター、例えば、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分析した。マーカー組合せは、心筋細胞特異的な発現プロファイルを示した（図１２を参照されたい）。

心筋細胞精製に適したマーカー組合せの同定
ソーティング戦略に使用することができる特異的な組合せを見出すために、８つの非心臓マーカーからのマーカー組合せをＣＤ５６および心臓トロポニンＴ（細胞内心臓マーカー）と共染色した。そのために、凍結したｉＰＳ由来心筋細胞（８日）を、標準培養培地において解凍した。次いで、１ウェル当たり２×１０^５個の細胞を、ＡＰＣ中にマーカー組合せの特異的な抗体を含有し、ＦＩＴＣ中にＣＤ５６を含有する９６ウェルプレートに添加した。表面マーカーを、フローサイトメトリーに関する標準プロトコールを使用して染色した。次いで、心筋構造（心臓トロポニンＴ）を、ｉｎｓｉｄｅ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して染色した。細胞染色を、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して分析した。全ての単一マーカー染色は、非筋細胞集団との部分的な重複を示した（図２Ａ、２Ｂ）。非心筋細胞および心筋細胞を、明らかに区別できなかった。それが理由で、これらの単一マーカーは、ＰＳＣ由来心筋細胞の効率的な精製に適していなかった。セルソーティング後、残りの非心筋細胞は、心筋細胞集団に混入するであろう。それと対照的に、非心筋細胞マーカーのうちの少なくとも２つを組み合わせることによって標識された非筋細胞の数を増加させることができた（図１４Ａ～Ｆ）。心筋細胞および非心筋細胞集団を、明らかに区別できた。したがって、これらのマーカーは、図７～９に示されるように心筋細胞集団の効率の高い精製を可能にする。

［文献］
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Claims (11)

1. 多能性および／または複能性幹細胞を含む出発細胞組成物に由来する心筋細胞の生成、単離、検出および／または分析のための方法であって、
   ａ） 前記多能性および／または複能性幹細胞を心血管細胞に分化させ、それによって、心筋細胞および非心筋細胞を含むサンプルを生成するステップ；
   ｂ） 前記サンプルの非心筋細胞を、非心筋細胞の抗原に特異的な複数の抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記複数の抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１４１、および抗ＣＤ５１／６１からなる群から選択される、ステップ；
   ｃ） 標識された前記非心筋細胞を前記サンプルから枯渇化させるステップ
   を含み、
   前記非心筋細胞は、少なくとも３つの抗体またはその抗原結合断片で標識され、前記抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＤ１４０ｂ、抗ＣＤ１４１および抗ＣＤ１０を含む、方法。
2. 非心筋細胞の抗原に特異的な前記複数の抗体またはその抗原結合断片は、タグにカップリングされている、請求項１に記載の方法。
3. 枯渇化ステップｃ）は、磁気細胞分離によって実施され、前記タグは磁気粒子である、または蛍光活性化セルソーティングによって実施され、前記タグはフルオロフォアである、請求項２に記載の方法。
4. ｄ） ステップｃ）の後、前記サンプルの心筋細胞を、心筋細胞の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ９９、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｆ、抗ＣＤ２６２、抗ＣＤ８１、抗Ｔｒａ－１－８５、抗ＣＤ４９ｅ、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４６、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ５１、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ９８、抗ＣＤ６３、および抗ＣＤ１４６ｃ、抗ＣＤ１５１からなる群から選択される、ステップ；
   ｅ） 標識された前記心筋細胞を濃縮するステップ
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 心筋細胞に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、抗ＣＤ５６である、請求項４に記載の方法。
6. 心筋細胞の抗原に特異的な前記少なくとも１つの抗体またはその断片は、タグにカップリングされている、請求項４または５に記載の方法。
7. 濃縮ステップｅ）は、磁気細胞分離によって実施され、前記タグは磁気粒子である、または蛍光活性化セルソーティングによって実施され、前記タグはフルオロフォアである、請求項６に記載の方法。
8. ステップｃ）の後に、追加のステップ：
   Ｉ） ステップｃ）の心筋細胞を、心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な１つの抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、および抗ＣＤ７４からなる群から選択される、ステップ；
   ＩＩ） ステップＩ）の標識された前記心筋細胞を濃縮し、それによって、心筋細胞のサブポピュレーションを濃縮するステップ
   を含む、請求項１に記載の方法。
9. ステップｅ）の後に、追加のステップ：
   Ｉ） ステップｅ）の心筋細胞を、心筋細胞のサブポピュレーションの抗原に特異的な１つの抗体またはその抗原結合断片で標識するステップであって、前記１つの抗体またはその抗原結合断片は、抗ＰＴＫ７、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ２７６、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２９８、抗ＣＤ４９ｃ、抗ＣＤ２００、抗ＣＤ２３０、抗ＲＯＲ１、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ３１７、抗ＣＤ４９ａ、抗ＣＤ４３、抗ＣＤ１１１、抗ＣＤ２０１、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ２２２、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ９５、抗ＣＤ１４２、抗Ｎｏｔｃｈ－２、抗ＫＩＲ－２Ｄ、抗ＣＤ１９７、抗ＣＤ２４０ＤＣＥ、抗ＡＳＣＡ－１（ＧＬＡＳＴ）、抗ＣＣＲ１０、抗ＣＤＩＲ、抗ＣＤ１８３、抗ＣＤ９７、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＣＤ１３４、抗ＣＤ１３、抗ｆＭＬＰ、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ７９ｂ、抗ＣＤ５、および抗ＣＤ７４からなる群から選択される、ステップ；
   ＩＩ） ステップＩ）の標識された前記心筋細胞を濃縮し、それによって、心筋細胞のサブポピュレーションを濃縮するステップ
   を含む、請求項４に記載の方法。
10. 閉鎖系において実施される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 心筋細胞を含む医薬組成物の製造方法であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によって心筋細胞を生成し、前記心筋細胞を用いて医薬組成物を製造することを含む、方法。

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