JP7084045B2 - Cd47抗体およびサイトカインを含む融合タンパク質 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年11月10日に提出された国際出願番号PCT/CN2017/110517の優先権を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
CD47(Cluster of Differentiation 47)は、1980年代にヒト卵巣癌で腫瘍抗原として最初に同定された。それから、CD47は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫(MM)、膀胱癌、や他の固形腫瘍などの複数のヒト腫瘍タイプで発現することが見出された。高レベルのCD47により、癌細胞はより高レベルのカルレティキュリン-優勢の前-食作用シグナル(dominant pro-phagocytic signal)を有するにもかかわらず食作用がなくなる。
一態様では、本発明は、ヒトCD47に結合する単離モノクローナル抗体およびその免疫学的に活性のある断片を提供する。簡略して表現するために、上記CD47に結合する単離モノクローナル抗体およびその免疫学的に活性のある断片を、以降では「CD抗体」と称する。本発明のCD47抗体は、CD47の発現、活性および/またはシグナル伝達、またはCD47とSIRPαとの相互作用を、調節する、例えば、遮断する、阻害する、抑制する、拮抗する、中和する、または干渉することが可能である。非常に驚くべきことに、本発明のCD47抗体は、通常、有意なレベルのヒト赤血球の枯渇または赤血球凝集を引き起こさず、驚くべきことに、多くの場合において、ヒト赤血球の枯渇または赤血球凝集を全く引き起こさない。さらに、本発明のCD47抗体は、強力な抗腫瘍活性を示した。
血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさず、多くの場合、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない。
いくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、および配列番号:77からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一の可変重(VH)鎖配列;ならびに
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、および配列番号:78からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一の可変軽(VL)鎖配列
を含む。
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配列番号:1および配列番号:2(すなわち、1A1)、配列番号:3および配列番号:4(すなわち、1F8)、配列番号:5および配列番号:6(すなわち、2A11)、配列番号:7および配列番号:8(すなわち、2C2)、配列番号:9および配列番号:10(すなわち、2D7)、配列番号:11および配列番号:12(すなわち、2G4)、配列番号:13および配列番号:14(すなわち、2G11)、配列番号:15および配列番号:16(すなわち、6F4)、配列番号:17および配列番号:18(すなわち、5H1)、配列番号:19および配列番号:20(すなわち、5F6)、配列番号:21および配列番号:22(すなわち、1F3)、配列番号:23および配列番号:24(すなわち、2A4)、配列番号:25および配列番号:26(すなわち、2B12)、配列番号:27および配列番号:28(すなわち、13A11)、配列番号:29および配列番号:30(すなわち、15E1)、配列番号:31および配列番号:32(すなわち、13H3)、配列番号:33および配列番号:34(すなわち、14A8)、配列番号:35および配列番号:36(すなわち、16H3)、配列番号:37および配列番号:38(すなわち、1A1)、配列番号:39および配列番号:40(すなわち、1A1-A)、配列番号:41および配列番号:42(すなわち、1A1-Q)、配列番号:43および配列番号:44(すなわち、1A2)、配列番号:45および配列番号:46(すなわち、1A8)、配列番号:47および配列番号:48(すなわち、1B1)、配列番号:49および配列番号:50(すなわち、1B2)、配列番号:51および配列番号:52(すなわち、1H3)、配列番号:53および配列番号:54(すなわち、1H3-Q)、配列番号:55および配列番号:56(すなわち、1H3-A)、配列番号:57および配列番号:58(すなわち、2A2)、配列番号:59および配列番号:60(すなわち、2A3)、配列番号:61および配列番号:62(すなわち、2A6)、配列番号:63および配列番号:64(すなわち、2A10)、配列番号:65および配列番号:66(すなわち、2B1)、配列番号:67および配列番号:68(すなわち、2C6)、配列番号:69および配列番号:70(すなわち、2E7)、配列番号:71および配列番号:72(すなわち、2E9)、配列番号:73および配列番号:74(すなわち、2F1)、配列番号:75および配列番号:76(すなわち、2F3)、ならびに配列番号:77および配列番号:78(すなわち、34C5)またはそれらと少なくとも95%(例えば少なくとも95%)同一である組み合わせからなる群より選択されるVHおよびVL鎖配列を含む。
さらにいくつかの実施形態において、サイトカインは、免疫グロブリン(Ig)、造血成長因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン-17受容体、または単量体糖たんぱく質を含む。
本発明は、ヒトCD47がSIRPαと相互作用することを防止できる、またはCD47発現細胞のマクロファージが介する食作用を促進できる新規な単離されたモノクローナルCD47抗体を提供する。これらのCD47抗体は、有意な(significant)または顕著な(noticeable)レベルの赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさず、多くの場合、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない。
CD47は、細胞外N末端IgVドメイン、5つの膜貫通ドメイン(transmembrane domain)、および短いC末端細胞内テールを有する50kDaの膜レセプターである。ヒトFcまたはビオチン化ヒトCD47-IgVドメインタンパク質(ACROBiosystems)と結合した(conjugated with)ヒトCD47-IgVドメインタンパク質を、ファージライブラリーパンニング(phage library panning)用の抗原として使用した。
ヒトCD47-IgVドメインに特異的に結合するファージクローンを得るために、2つのファージパンニング方法を使用した。
本方法において、上記したのと同様にして開発したファージライブラリーを、まず、カゼイン被覆イムノチューブ中で2時間インキュベートした。ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を第1のパンニングラウンドで使用した。PBSTで5~20回洗浄することによって、非結合ファージを除去した。結合ファージを新たに調製した100mMトリエチルアミン溶液で溶出させ、Tris-HClバッファーを添加することによって中和して、第1のアウトプットファージプールとした。この第1のアウトプットファージプールを、増幅を目的として大腸菌TG-1(E. Coli TG-1)細胞に感染させることにより回収した(rescue)後、抗原としてビオチン化ヒトCD47-IgVを用いた第2のパンニングラウンドを行った。結合ファージを同様の方法で溶出させ、第2のアウトプットファージプールとし、さらにこれを回収した後、抗原としてヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を用いた第3のパンニングラウンドを行った。さらに、結合ファージを第3のアウトプットファージプールとし、ビオチン化ヒトCD47-IgVを用いた第4のパンニングラウンドを行った。
本第2の方法において、ファージライブラリーを、まず、カゼインブロック(casein-blocked)100μL ストレプトアビジン-磁気ビーズ(streptavdin-magnetic bead)中でインキュベートして、ストレプトアビジンビーズバインダーを消耗させた。ストレプトアビジン-磁気ビーズ及びAG0084-huIgG1/kをネガティブ消耗(negative depletion)に使用した。消耗したライブラリーを回収した後、抗原としてビオチン化ヒトCD47-IgVを用いた第2のパンニングラウンドを行い、さらに、カゼインブロックストレプトアビジン-磁気ビーズを用いてネガティブ消耗を行った。PBSTで5~20回洗浄することによって、非結合ファージを除去した。結合ファージを新たに調製した100mMトリエチルアミン溶液で溶出させ、Tris-HClバッファーを添加することによって中和した後、回収し、さらにヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を用いた第3のパンニングラウンドを行い、AG0084-huIgG1/kを用いて消耗させた。さらに、結合ファージを第3のアウトプットファージプールとし、ビオチン化ヒトCD47-IgVを用いた第4のパンニングラウンドおよびカゼインブロックストレプトアビジン-磁気ビーズを用いたネガティブ消耗を行った。
本発明のCD47抗体の結合親和性は、インビトロアフィニティ成熟によって、例えば、部位特異的ランダム突然変異(site-specific randomized mutation)によって、向上でき、これにより、本発明の範囲に含まれる変異配列が得られる。
組換ヒトCD47-Fc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、室温(RT)で2時間、マイクロタイタープレートにリン酸緩衝食塩水(PBS)における2μg/mLで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、室温(RT)で1時間、1% BSAを含むPBS/0.05% Tween(PBST)でブロックした。ウェルをPBSTで洗浄した後、単一のクローンから精製したファージをウェルに加えて、RTで1時間、インキュベートした。結合ファージクローンを検出するために、M13に対するHRP標識2次抗体(HRP conjugated secondary antibodies)(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダー(TECAN Spectrafluor plate reader)で測定した。陽性のファージクローンを重鎖及び軽鎖遺伝子の配列決定用に選択した。
組換ヒトCD47/マウスFc融合タンパク質またはビオチン化CD47タンパク質(Acrobiosystems)を、RTで2時間、マイクロタイタープレートにPBSにおける1μg/mLで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、RTで1時間、1% BSAを含むPBS/0.05% Tween(PBST)でブロックした。ウェルをPBSTで洗浄した後、PBSで希釈した抗体をウェルに加え(5μg/mL)、RTで1時間、インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトFcに対するHRP標識2次抗体(HRP conjugated secondary antibodies)(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダー(TECAN Spectrafluor plate reader)で測定した。
組換ヒトCD47-Fc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、4℃で16時間、マイクロタイタープレートにPBSにおける1μg/mLで被覆した。RTで1時間、PBSTにおける1% BSAでブロックした後、1μg/mLのSIRPα-Hisタンパク質を、RTで1時間、CD47抗体(10μg/mL)の不存在下でまたは存在下で添加した。次に、プレートを3回洗浄し、RTで1時間、HRP標識抗His2次抗体(HRP-conjugated anti-His secondary antibody)と共にインキュベートした。洗浄後、TMB溶液を30分間各ウェルに加え、反応を2.0M H2SO4で停止し、ODを490nmで測定した。
直接結合および競合スクリーニング後、本発明のCD47抗体である1F8を、2つの既存の参照抗体と比較して、本試験に選んだ。ビオチン化CD47タンパク質(Acrobiosystems)を、RTで2時間、マイクロタイタープレートにPBSにおける1μg/mLで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、RTで1時間、1% BSAを含むPBS/0.05% Tween(PBST)でブロックした。ウェルをPBSTで洗浄した後、異なる濃度のCD47抗体をウェルに添加して、RTで1時間、インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトFcに対するHRP標識2次抗体(HRP conjugated secondary antibodies)(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダー(TECAN Spectrafluor plate reader)で測定した。
実施例4で使用した3種のCD47抗体(即ち、1F8、5F9、及び2A1)を本研究でも使用した。
3種のCD47抗体(即ち、1F8、5F9、及び2A1)を本研究でも使用した。
3種のCD47抗体(即ち、1F8、5F9、及び2A1)を本研究にも使用した。
いて同様の活性を示し、さらに同様の用量依存パターンを示した。
3種のCD47抗体(即ち、1F8、5F9、及び2A1)を本研究でも使用した。
ヒトRBCをPBSに10%になるように希釈し、底の丸い96ウェルプレートである力価のCD47抗体と共に(with a titration of CD47 antibodies)37℃で2時間、インキュベートした。赤血球凝集の兆候が、赤血球凝集しないRBCの点状赤色ドットと比較したヘーズとして現れる、沈降しないRBC(non-settled RBC)の存在によって示される(図7aおよび図8a参照)。図7b及び図8bのグラフは、IgGコントロールのものに対して正規化された、抗体の存在下でのRBCペレットの領域を定量化することによって測定される「凝集係数(agglutination index)」で表わされる、赤血球凝集アッセイの定量化結果を示す。
ヒトRBCに対するCD47抗体の結合をフローサイトメトリーによって試験した。ヒトRBCをCD47抗体(10μg/mL)と共に4℃で1時間インキュベートした後、APC標識2次抗体を4℃で30分間添加した。
CD47抗体の添加によるRBC凝集を分析するために、6人の男性及び6人の女性個体からRBCを集めた。図10a及び図10bは、IgGコントロールまたは参考抗体のものに対して正規化された、抗体の存在下でのRBCペレットの領域を測定することによって測定される「凝集係数(agglutination index)」で表わされる、赤血球凝集アッセイの滴定結果を示す。
ヒト血小板に対する本発明のCD47抗体の結合をフローサイトメトリーによって試験した。ヒト末梢全血を本発明の試験CD47抗体(10μg/mLで)またはSIRPα-Ig融合タンパク質と共にインキュベートし、CD61を血小板に対する表面マーカーとして染色した。CD61陽性集団(血小板)でゲーティングし(gating)、さらにCD47またはSIRPα-Ig融合タンパク質の結合の割合(%)を試験することによって、CD47抗体またはSIRPα-Ig融合タンパク質の結合を測定した。
オス及びメスのカニクイザル(cyno monkey)のRBCをPBSに10%になるように希釈し、底の丸い96ウェルプレートで所定の濃度のCD47抗体と共に37℃で2時間、インキュベートした。図12aに示されるように、赤血球凝集の兆候が、赤血球凝集しないRBCの点状赤色ドットと比較したヘーズとして現れる、沈降しないRBC(non-settled RBC)の存在によって示された。図12bは、IgGコントロールのものに対して正規化された、抗体の存在下でのRBCペレットの領域を測定することによって決定される「凝集係数(agglutination index)」で表わされる、赤血球凝集アッセイの滴定結果を示す。
AML患者(AML-PB003F)の初期PBMC(Primary PBMC)を1μM CFSEで10分間標識した後、5:1の腫瘍細胞:食細胞の割合でMDMに添加し、所定のCD47抗体を様々な濃度で添加した。3時間インキュベート後、取り込まれない(non-phagocytosed)標的細胞をPBSで洗い流し、残った食細胞をかきおとし、CD47抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用は、CD14+細胞でゲーティングし(gating)、さらにCFSE+細胞の割合(%)を評価することによって測定した。食作用を前記と同様にして測定した。
NSGマウスに、尾静脈注射により100万細胞/マウスの濃度でRaji Luc-EGFPを移植した。マウスをインビボで撮像し、移植してから5日目に移植レベルを測定した。CD47抗体(即ち、1F8、5F9、及び2A1)の処置を、10mg/kgの用量で同日に開始した。すべてのマウスに腹腔内注射により1日おきに注射した。マウスを、IVIS Lumina IIIイメージングシステム(IVIS Lumina III imaging system)により以下の時点でインビボで撮像した:抗体処置の0日目、処置後2日目、処置後6日目、及び処置後9日目。インビボライブイメージングシステム(in vivo live imaging system)により生物発光輝度(bioluminescent radiance)を分析することによって、マウスの腫瘍成長を測定した。
腫瘍を有するマウスのマクロファージの極性化を誘導できた。
54個のPDXサンプル(7種のヒト癌タイプ)を、免疫-組織学染色によってCD47の発現について分析した。様々なPDXサンプルにおけるCD47染色のレベルを形状(geometry)および染色強度によって採点した(score)。図16a、図16bおよび図16cから、CD47抗体による処置後に様々な発現レベルのCD47が示される。
投薬を受けていない(Naive)カニクイザル(cyno monkey)の静脈内にベヒクル(n=2)、1F8(n=3、15mg/kg)および5F9(n=3、15mg/kg)を注入した。血液採取してから24時間以内に、注射前に2回ならびに抗体投与してから3、6、10、14及び21日目に、血液学(CBC)を分析した。赤血球数(Erythrocyte count)(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、絶対網状赤血球数(Absolute Reticulocytes Counts)及び血小板数を含むCBCパラメーターを試験した。結果を図17a~17dに示すが、これから、1F8処置はカニクイザルの血液パラメーターに影響を及ぼさなかったことが示される。
投薬を受けていない(Naive)カニクイザル(cyno monkey)の静脈内に抗体13H3(20mg/kg)を単回投与および繰り返し投与(毎週投与)で注入した。抗体投与してから所定の時期に、赤血球数(Erythrocyte count)(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、血小板数及びリンパ球数を含む血液学(CBC)パラメーターを試験した。
CD47抗体のエピトープビニングを、競合ELISAによって評価した。CD47 ECDタンパク質及び第1抗CD47抗体を予めインキュベートして、ストレプトアビジン-HRP抗体によって検出されるビオチン化第2抗CD47抗体に添加した。第1抗CD47抗体が第2抗体へのCD47 ECDの結合に対して競合した場合には、双方の抗体を同じまたは重複するエピトープビン(epitope bins)に入れた。競合しない場合には、非重複エピトープビン(non-overlapping epitope bin)に入れた。図18a及び図18bに示される結果から、本発明のCD47抗体である1F8は参考抗体5F9及び2A1とは異なるエピトープを有することが示される。
抗ヒトCD47抗体を得るために、BALB/C、C57/BL6またはSJLマウスを含む6~8週齢の異なる種を組換ヒトCD47細胞外ドメインタンパク質で数ラウンド免疫処置した。免疫処置後、十分な力価の抗CD47 IgGを有するマウスを、同じ抗原で追加免疫した後、融合した(fusion)。ハイブリドーマ上清について、ELISAスクリーニングによってヒトCD47 ECDタンパク質との直接結合およびCD47へのSIRPα結合の競合を試験した。一連のスクリーニングアッセイにより、34C5が上記したアッセイに従うヒト化およびさらにインビトロでの特性化(characterization)用に選択された。
ヒトGM-CSFサイトカインを、(GGGGS)3、(GGGGS)6、(GGGGS)9、IGD(F30)、IGD(F64)、IGD(R30)、IGN(R64)、IGD(R30-Cys)、およびIGD(R64-Cys)をを含む様々な長さのリンカーを介して、またはリンカーなしで抗CD47抗体(1F8)の重鎖C末端に融合した。次に、軽鎖および重鎖発現ベクターをCHO細胞にコトランスフェクトした。一過性トランスフェクション後、融合タンパク質をタンパク質アフィニティークロマトグラフィーにより培地から精製した。
以下の表は、リンカーなしの、またはいくつかの異なるリンカーのうちの1つを用いた、本発明の融合タンパク質のいくつかの例のアグレファット(agrefats)、メインピーク、フラグメント、および収率を示す。
本発明の融合タンパク質である1F8-GMCSFのビオチン化ヒトCD47-ECDタンパク質(1μg/ml@100μl)へのELISA結合の用量反応について試験を行った。この試験では、ビオチン化CD47タンパク質(Acrobiosystems)をPBS中1μg/mlでマイクロタイタープレート上に室温で2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で1時間室温でブロックした。PBSTでウェルを洗浄した後、異なる濃度の1F8-GMCSF融合分子をウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートした。結合抗体の検出のために、ヒトFcに対するHRP結合二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、続いて蛍光発生基質(Roche)を添加した。全てのインキュベーション工程の間に、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。TECAN Spectrafluorプレートリーダーで蛍光を測定した。CD47抗体1F8自体を参照として使用した。
CD47-SIRPα相互作用の遮断は、製造元のプロトコル(Cisbio)に従って行われた。簡単には、CD47-SIRα結合アッセイは、HTRF(均一系時間分解蛍光)技術を利用してハイスループットフォーマットでCD47-SIRPα相互作用の検出を可能にした。抗体作業溶液および希釈緩衝液中のTag1-CD47/Tag-2SIRPαタンパク質を調製した。CD47抗体または抗CD47-GMCSF融合分子を384ウェルプレートに添加し、続いてTag1-CD47およびTag2-SIRPαを添加した。混合物を25℃で15分間インキュベートし、コンジュゲートプレ混合物を添加した後さらに25℃で1時間インキュベートした。次にプレートシーラーを取り除き、蛍光データをPerkinElmer Envisionプレートリーダーで読み取った。
ヒトRBCをPBS中で10%に希釈し、丸底96ウェルプレート中に1F8または1F8-GMCSF融合タンパク質を滴定して、37℃で2時間インキュベートした。赤血球凝集の証拠は、非赤血球凝集RBCの点状の赤い点と比較して曇りとして現れ、沈殿していないRBCの存在によって証明されるであろう。この研究の結果は、1F8および1F8-GMCSFの両方が必要を示す濃度でRBC凝集を誘導しなかったことを示した。
PBMCをヒト血液から単離し、単球を6日間でマクロファージに分化させた。単球由来マクロファージ(MDM)を掻き取り、24ウェルディッシュに再プレーティングし、24時間付着させた。CD47を内因的に発現するヒト腫瘍細胞株Rajiを標的細胞として選択し、10分間1μMのCFSEで標識し、次いで食細胞あたり5:1の腫瘍細胞の比率でMDMに添加した。1F8、GM-CSFタンパク質、または1F8-GMCSF融合タンパク質を様々な用量で添加した。3時間インキュベートした後、非食作用性標的細胞をPBSで洗い流し、残りの食細胞を掻き取り、マクロファージマーカーCD14抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。食作用は、CD14+細胞をゲーティングし、次いでCFSE+細胞の割合を評価することによって測定した。
融合タンパク質1F8-GMCSFのヒトGM-CSF受容体タンパク質(2μg/ml@100μl)へのELISA結合の用量反応を決定するために試験を行った。組み換えGM-CSF Rアルファタンパク質(R&D Systems)を室温で2時間マイクロタイタープレート上にPBS中2μg/mLでコートした。抗原をコーティングした後、ウェルを室温で1時間1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で1時間室温でブロックした。PBSTでウェルを洗浄した後、異なる濃度の1F8-GMCSF融合タンパク質をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトFcに対するHRP結合二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、続いて蛍光発生基質(Roche)を添加した。全てのインキュベーション工程の間に、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。TECAN Spectrafluorプレートリーダーで蛍光を測定した。参照として、組み換えヒトGM-CSFタンパク質を使用した。
CD14陽性マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用して、CD14+単球をヒト末梢血から精製した。精製した単球を37℃で30分間、異なる濃度の融合タンパク質1F8-GMCSFで刺激した。インキュベーション後、細胞を集め、FACS緩衝液(1×PBS+2%FBS)で洗浄し、2%PFAにより固定し、続いて氷冷メタノールを用いて細胞透過処理を行った。次いで、PE結合抗pSTAT5抗体を4℃で30分間のさらなるインキュベーションのために細胞に添加し、フローサイトメトリーによって分析した。MFIの倍率変化は、試験サンプルのMFI/IgG対照処理のMFIによって計算した。
GMCSF刺激の前に、TF-1細胞をRPMI1640基本培地で洗浄し、一晩飢餓状態にした。2日目に、これらの飢餓細胞を収集し、次いで平底96ウェルプレートの1ウェルあたり50μL中に3×105細胞/mlの濃度で播種した。異なる濃度の1F8-GMCSF融合タンパク質をTF-1細胞培養物に添加し、37℃で72時間インキュベートした。製造業者のプロトコルに従ってCellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assayにより細胞増殖を測定した。
ヒトインビトロ分化マクロファージを、マクロファージ当たり5:1の腫瘍細胞の比でRaji細胞と共培養した。IgG、1F8、GMCSFまたは1F8-GMCSF融合タンパク質を培養物に添加し、8時間インキュベートした。インキュベーション後、培養上清をLuminexによるIL-6、IL-12およびTNF-αの産生について分析し、細胞をフローサイトメトリーによってCD80の発現について分析した。これら4つのパラメーターすべてがM1マクロファージ活性化の特徴的なマーカーであった。
Raji細胞をNSGマウスの皮下に移植し、100mm3に成長させた。次いで、これらのマウスを、1週間に2回、マウス1匹あたり70nmolのIgG、1F8単独、GMCSF単独、1F8およびGMCSFコンボ、1F8-GMCSF融合タンパク質で処置した。精密キャリパーを用いて腫瘍サイズを二次元で測定した。
融合タンパク質13H3-GMCSFを作製するために、ヒトGM-CSFサイトカインを抗CD47抗体(13H3)の重鎖C末端に直接融合させた。次に、軽鎖および重鎖発現ベクターをCHO細胞にコトランスフェクトした。一過性導入後、融合タンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより培地から精製した。
Raji細胞をNSGマウスの皮下に移植し、100mm3に成長させた。次いで、これらのマウスを、1週間に2回、マウス1匹あたり70nmolのIgG、13H3単独、GMCSF単独、13H3およびGMCSFコンボ、13H3-GMCSF融合タンパク質で処置した。精密キャリパーを用いて腫瘍サイズを二次元で測定した。
未処置カニクイザル(n=2)に、融合タンパク質13H3-GMCSFを20mg/kgの用量で静脈内注射した。それらの血液は、異なる時点で抗凝固剤なしで静脈穿刺によってチューブに集められた。融合タンパク質13H3-GMCSFの血清レベルをコーティング試薬としてCD47タンパク質を用いたELISAにより測定し、続いて抗GMCSF二次抗体で検出した。カニクイザルにおける20mg/kgの単回投与後の13H3-GMCSFの血清レベルの濃度-時間曲線を図40に示す。薬物動態学的パラメーターをWinolinによって分析し、以下の表に示した。
未処置カニクイザルに、反復投与(週1回投与)の融合タンパク質13H3-GMCSF(20mg/kg)を静脈内注入した。融合タンパク質投与後の示された時点での赤血球(RBC)、血小板および白血球(WBC)、好中球および単球のカウントを含めて、血液学(CBC)パラメーターを調べた。
Claims (18)
- モノクローナル抗体およびサイトカインを含む、融合タンパク質であって、
前記モノクローナル抗体は、ヒトCD47に結合し、前記モノクローナル抗体は、
(a)配列番号:31のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン(VH)のVH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3、ならびに配列番号:32のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン(VL)のVL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含む、または
(b)配列番号:3のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン(VH)のVH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3、ならびに配列番号:4のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン(VL)のVL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含み、
前記サイトカインは、顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)であり、
前記サイトカインは、前記モノクローナル抗体と前記サイトカインとの間のリンカーの有無にかかわらず前記モノクローナル抗体のC-末端で融合する、融合タンパク質。 - 前記VH CDR1は、配列番号:31のアミノ酸配列の31~35番目のアミノ酸を含み、
前記VH CDR2は、配列番号:31のアミノ酸配列の50~68番目のアミノ酸を含み、
前記VH CDR3は、配列番号:31のアミノ酸配列の101~107番目のアミノ酸を含み、
前記VL CDR1は、配列番号:32のアミノ酸配列の24~40番目のアミノ酸を含み、
前記VL CDR2は、配列番号:32のアミノ酸配列の56~62番目のアミノ酸を含み、
前記VL CDR3は、配列番号:32のアミノ酸配列の95~103番目のアミノ酸を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記VH CDR1は、配列番号:3のアミノ酸配列の31~35番目のアミノ酸を含み、
前記VH CDR2は、配列番号:3のアミノ酸配列の50~68番目のアミノ酸を含み、
前記VH CDR3は、配列番号:3のアミノ酸配列の101~107番目のアミノ酸を含み、
前記VL CDR1は、配列番号:4のアミノ酸配列の24~40番目のアミノ酸を含み、
前記VL CDR2は、配列番号:4のアミノ酸配列の56~62番目のアミノ酸を含み、
前記VL CDR3は、配列番号:4のアミノ酸配列の95~103番目のアミノ酸を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記モノクローナル抗体は、配列番号:31のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号32のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、配列番号:3のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号4のアミノ酸配列を含むVLを含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、キメラまたはヒト化である、請求項1~5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、ヒトCD47がシグナル調節タンパク質α(SIRPα)と相互作用することを防止する、請求項1~6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、CD47発現細胞のマクロファージが介する食作用を促進する、請求項1~7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、有意なレベルの赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない、請求項1~8のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない、請求項1~9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記モノクローナル抗体は、(G4S)3、(G4S)6、(GS)9、IGD(F30)、IGD(F64)、IGD(R30)、IGN(R64)、IGD(R30-Cys)、およびIGD(R64-Cys)からなる群から選択されるリンカーで前記サイトカインと融合する、請求項1~10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、ヒトCD47とヒトSiRPαとの間の相互作用を阻害する、請求項1~11のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、小分子治療薬または標識をさらに含み、
前記小分子治療薬または標識は、前記モノクローナル抗体、または前記サイトカインとコンジュゲートする、請求項1~10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記小分子治療薬は、抗癌または抗炎症剤であり、前記標識は、酵素、ラジオアイソトープまたは蛍光化合物である、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質および製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物。
- 癌、線維症、食作用の阻害に関連する病気、または血小板凝集に関連する病気を処置するために使用される、請求項1~14のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
- 前記癌は、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病(HCL)、T細胞前リンパ球性白血病(T-PLL)、大型顆粒リンパ球白血病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、骨髄腫、単球性白血病、B細胞白血病、T細胞白血病、B細胞由来リンパ腫、T細胞由来リンパ腫、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、および固形腫瘍からなる群より選択され;前記線維症は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、喘息、嚢胞性線維症、気管支炎、および喘息からなる群より選択され;前記食作用の阻害に関連する病気は、心血管疾患であり;前記血小板凝集に関連する病気は、グランツマン血小板無力症(Glanzmann Thrombasthenia)、出血時間延長、免疫性血小板減少症(ITP)、フォン・ヴィレブランド病(vWD)である、請求項16に記載の組成物。
- 前記心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、および静脈血栓症からなる群より選択される、請求項17に記載の組成物。
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