JP7074303B2

JP7074303B2 - マイクロプレート

Info

Publication number: JP7074303B2
Application number: JP2018038204A
Authority: JP
Inventors: 志浩梅林; 勝典木村
Original assignee: Tottori Institute of Industrial Technology
Current assignee: Tottori Institute of Industrial Technology
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2018-03-05
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2038-03-05
Also published as: JP2019149975A

Description

本発明は、細胞培養や各種分析に好適なマイクロプレートに関する。

従来、マルチウェルプレートとも称されるマイクロプレートは、細胞培養試験にも用いられ、培養液の交換や試薬の滴下などをピペットでおこなっていた。これにより、同一条件で多数の培養試験をおこなうことができ、各種の検討、評価をおこなうことが可能となっている。

しかしながら、従来の技術では以下の問題点があった。
細胞の種類や培養環境によっては、底面にくっついた細胞が、ピペットで培養液を注入するときに剥がれたり、めくれ上がったりしてしまうことがある。従って、細胞からの分泌物の定量を目的とする場合や細胞数の変化を測定する場合など、培養条件の均一性が損なわれてしまうという問題点があった。
細胞培養でなくても、ピペットからの試薬注入により、意図しない系の攪拌が生じ、評価に影響を与える場合もある。また、ピペットによる試薬吸い取り等の際、存置させたい目的物の意図しない吸引が生じる場合もある。

特表２００４－５２１６４４ＷＯ２０１２／１２４３５３特開２０１６－１８５１２７ＷＯ２００２／１０２９６２実用新案登録第３２０８６１０実開平５－８８３００

本発明は上記に鑑みてなされたものであって、系（使用域）の撹乱を生じさせず、安定的な液の注入や吸引を実現可能なマイクロプレートを提供することを目的とする。

請求項１に記載のマイクロプレートは、ウェルの底面を第２底面と主たる使用面である第１底面とに分ける分割壁であって、ピペットを第２底面に導いた際の液の勢いを第２底面内に留めることができる所定高さの分割壁と、ウェル側周の深さ方向に第２底面にまで至る溝であってピペット先端を案内し、第２底面にピペット先端を突き当てさせるガイド溝と、を具備し、ピペット先端の第２底面への密着を回避する凹凸部を第２底面に設け、分割壁は第１底面側に凸に円弧を描く突条として設け、液を均等に分散して第１底面側に流出させることを可能としたことを特徴とする。

すなわち、請求項１に係る発明は、ピペットを第２底面に導き、分割壁により液の勢いを第２底面内にとどめ、第１底面へは穏やかに液を導入させることができる。
また、ピペット先端の過度の狭窄やピペット先端の底面への密着による液の噴出を回避し、第１底面に穏やかに液を導入させることができる。
また、第１底面への液の滲出の分散性を高めることができ、第１底面への液の均等な導入が可能となる。仮にピペットから液が噴出したとしても噴出方向に事実上依存せず緩衝し、第１底面へ液が導入される。

細胞培養に関しては、積極的にピペットのあたりないし掛かりをつけて、剥がれの生じる領域を第２底面に納める細胞培養用マイクロプレート、ということができる。
ウェルの数は特に限定されず、たとえば、９６穴とすることができる。
各ウェル中の第１底面、第２底面、分割壁、ガイド溝は、基本的に、同形同サイズで同位相に設けてあるものとする。
第２底面は緩衝底面、分割壁は緩衝壁と称することもできる。
分割壁の高さは適宜設定できるが、例えば、細胞の一層培養である場合には、１０μｍ以上とすることが好ましい。
ガイド溝は、ウェル側周に上面から第２底面に至るまで設けられていることが好ましいが、使用の態様により第２底面に近いところに部分的に設けても良い。

凹凸部は広義であって凹および／または凸があり、ピペット先端の狭窄や密閉が回避される形状であれば特に限定されない。たとえば、ピペット先端の一部と干渉する干渉凸部として形成しても、ピペット先端の一部とは干渉しない否干渉凹部として形成することもできる。また、第２底面全体に凹凸加工が施されている場合も含む。

請求項２に記載のマイクロプレートは、請求項１に記載のマイクロプレートにおいて、円弧の中心角は９０°～１８０°であることを特徴とする。

請求項３に記載のマイクロプレートは、請求項１または２に記載のマイクロプレートにおいて、分割壁両端部はともにウェル側周とは離間しており、分割壁両端間隔が第２底面の開口幅以上であることを特徴とする。

すなわち、請求項３に係る発明は、第２底面の開口部を分割壁で事実上おおって第１底面に穏やかに液を導入させることができるとともに、液が第２底面側へ引き戻されることにより吸引を容易化する。なお、第２底面の高さを第１底面より低くしても良い。

請求項４に記載のマイクロプレートは、請求項１、２または３に記載のマイクロプレートにおいて、ガイド溝は、ウェル上部に向けて拡径していることを特徴とする。

すなわち、請求項４に係る発明は、ピペットが案内されやすく、操作性を高める。

なお、拡径とは、底面に平行に断面をとっていった場合、ガイド溝の断面積が上方にいくにつれて大きくなることをいう。

本発明によれば、撹乱を生じさせず各ウェルが均質であって、安定的な液の注入や吸引を実現可能なマイクロプレートを提供することができる。

本発明のマイクロプレートを部分拡大した平面模式図である。図１に示したマイクロプレートの一つのウェルの拡大図である。ピペットを第２底面にあてがった際の断面図およびその拡大図である。ウェル上部に向けて拡径しているガイド溝の構成例を示した概要図である。凸部の配置の他の構成例を示した説明図である。また、分割壁は、その両端がウェル側周と離間しており、分割壁の第２底面側が傾斜もした例としても示している。分割壁の他の構成例を示した平面図ａと、その断面図ｂである。本発明品と従来相当品の剥離の様子を示した写真ａと、剥離率ｂを示した図である。

以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。ここでは各ウェルが基板面から立設している態様のマイクロプレートについて説明するが、各ウェルが基盤面から沈み込んで形成されている態様であってもよい。
図１は、本発明のマイクロプレートを部分拡大した平面模式図である。図２は、図１に示したマイクロプレートの一つのウェルの拡大図である。図３は、ピペットを第２底面にあてがった際の断面図およびその拡大図である。

マイクロプレートＭは９６穴であり、各ウェル１には、ウェル側周２０の深さ方向にガイド溝２１が設けられ、ガイド溝２１の突き当たりにともない、小円と大円とが接合した形状に底面１０が構成されている。すなわち、小円部分はピペットＰの先端Ｔを突きあてる第２底面１２を、大円部分は主たる使用面である第１底面１１を、それぞれ形成している。本実施の形態ではいずれも正円（の一部）である。なお、大円と小円との大きさは特に限定されるものでないが、直径比が５～１５の範囲とすることができる。また、小円の中心角としては、１８０°～２７０°とする例を挙げることができる。

なお、マイクロプレートＭの平面視において、ガイド溝２１および第２底面１２は、同位相に形成されている（図１）。図では、１８０°の位置に設けられている。同位相にすることにより特にマルチチャンネルピペット（８連など）使用の際や自動分注の際の作業性が向上する。

なお、本実施の形態ではガイド溝２１および第２底面１２は、各ウェル１に一つであるが、複数箇所に設けられていても良い。たとえば、０°と１８０°の位置に設け、０°側は培養液の注入用、１８０°側は培養液の吸引用として使い分けることもできる（第２底面をそれぞれの用途に適したように形成することができる）。

また、第１底面１１と第２底面１２との境界には、概ね第２底面１２の円周を補うように、平面視において円弧となっている所定高さの突条が分割壁３０として設けられている。第２底面１２のガイド溝２１の突き当たり部分には、また、凸部１３が設けられている。この凸部１３は、ピペットＰを突きあてても先端Ｔに間隙が確保される大きさとしている。

この構成により、まず、ピペットＰの先端Ｔが第２底面１２に密着し、内圧が高まって液が噴出してしまうようなことが抑制される。
次に、液の流れが分割壁３０により緩衝されるので、１箇所から集中してまたは１箇所から勢い良く第１底面１１側に液が流れ込むようなことがなく、均等に分散して穏やかに液を第１底面１１側に導入させることが可能となる。
また、分割壁３０により底面１０が分割されているので、ピペットＰによる吸引の際、たとえば第１底面１１にある培養細胞を吸い上げてしまうことがなく、各ウェル１の培養ばらつきをなくすことも可能となる。
すなわち、注入でも吸引でも、マイクロプレートＭでは第２底面１２が緩衝帯となって、第１底面１１が影響を受けないようにしている。

なお、第１底面１１、第２底面１２、分割壁３０、凸部１３は、大円の中心と小円の中
心とを結ぶ線を基準にして線対称に形成しており、この点からも方向依存性のない緩やかな第１底面１１への液の導入を実現している。

マイクロプレートＭは以上の構成であるので、自動であれ手動であれ、ピペットＰを第２底面１２へ円滑かつ確実に導き、凸部１３により噴出を抑制し、分割壁３０により液の勢いを第２底面１２内にとどめ、第１底面１１への液の静穏な導入を実現する。これにより、意図しない攪乱を抑制でき、たとえば、培養細胞の剥離を防止できる。

なお、ウェル１は上記の態様に限定されない。まず、ピペットＰの案内をより確実にすべく、ガイド溝２１は深さ方向に先細りにしてもよい（上方に向けて大きくなるように形成してもよい）。これにより、案内がより迅速確実となり、例えば、自動分注する際の駆動速度を上げることが可能となる。図４は、ウェル１上部に向けて拡径しているガイド溝２１の構成例を示した概要図である。

また、凸部１３は１箇所でなく、図５に示した様に２箇所対称に設けるようにしても良い。第２底面１２におけるピペットＰ先端Ｔの密閉（内圧上昇）が抑制できるのであれば特に限定されず、このほか、例えば、底面１２全体が凹凸加工されている態様であってもよい。

また、図示したように、分割壁３０の両端を、ともにウェル側周２０とは離間して形成することができる。これにより、培養液が第２底面１２側に戻ってくるため、ピペットＰによる吸引を効率化することができる。なお、分割壁３０を離間して形成する際には、分割壁３０の両端間隔が第２底面１２の開口幅以上とするのが好ましい。これにより、ピペットＰによる注入位置から間隙部分が事実上遮蔽され、液が間隙から勢いよく第１底面１１に流出してしまうことがない。

分割壁３０は、更に、第２底面１２側が傾斜していても良く、また、突条上面自体が傾斜していても良い。これにより、仮に突条自体に液が強く当たってもしぶきになって第２底面１２側のウェル側周２０に付着してしまうことを避け、なめらかに液を第１底面１１側に流入させることができる。特に少量の液の注入の際にウェル１間のばらつきを抑えることができる。

さらには、分割壁３０を突条でなくし、第２底面１２となめらかに接続する斜面として形成しても良い。これは、第２底面１２が分割壁３０までせりのぼる斜面様に形成されたと言い換えることもできる。図６ａに斜面の平面図を、図６ｂに斜面の断面図（Ａ－Ａ断面）を示した。断面図に示すように、第２底面１２は第１底面１１より低くしてあり、分割壁３０の両端部に間隙を設けておけば、液の吸引をより効率化することができる（なお、培養液の注入に際しては、第２底面１２側の液だまりも考慮した容量を注入して細胞培養に影響が出ないようにする。

このほか、第１底面や第２底面の形状を円形でなく、楕円形や四角形としてもよい。この場合も、対称性を持たせることが好ましい。

＜実施例＞
４８穴相当の大きさのウェルを３Ｄプリンタで試作し、細胞培養をおこなった。第１底面の直径は約１０ｍｍ、第２底面の直径は約１．５ｍｍ、第２底面の中心角は１８０°、分割壁３０は、第２底面に接続する円弧とし、高さは約０．３ｍｍ、厚み（幅）は約０．５ｍｍとした。なお、比較のため、第１底面のみのウェルも作成した（従来相当品と称することとする）。

底面全面にひろがるに一層の細胞を培養したのち、ピペットで細胞培養液を、吸引してから注入し、これを３回繰り返した。なお、本発明品については、ピペット先端は、ガイド溝に沿わせて第２底面におろし、また、従来相当品については、ピペットをウェル側周と底面にあてがって、実験をおこなった。

結果を図７ａに示す。図示したように、本発明品では、細胞剥離は第２底面のみでとどまっており、第１底面には剥離が見られなかった。一方、従来相当品では、広い範囲で剥離が生じていた。剥離細胞の割合を図７ｂに示す。従来相当品では８％以上の剥離が見られる。本発明品でごくわずかな剥離があるがこれは第２底面の剥離由来であって、事実上比較すべき第１底面における剥離細胞は０％であった。すなわち、従来相当品と本発明品では、剥離に顕著な差異が認められ、本発明品は有用であることが確認できた。更に、実質的に剥離がないので、各ウェルで細胞培養等の比較の際も均質性が担保され、各種実験における同一条件性が担保されるマイクロプレートであるといえる。

本発明は、特に細胞培養に用いる場合は、細胞培養用マイクロプレートということができる。

本発明によれば、ウェル側周に飛散・付着してしまうことなく、注入液をなめらかに第１底面に導入できるので、たとえば、微量試薬を注入しての吸光分析などを精度良く測定可能となり、細胞培養に限らず、化学分野等にも広く適用することができる。吸引の際も、第２底面を第１底面より低くするなどして正確な吸引を実現できる。

Ｍマイクロプレート
１ウェル
１０底面
１１第１底面
１２第２底面
１３凸部
２０ウェル側周
２１ガイド溝
３０分割壁
Ｐピペット
Ｔ先端

Claims

ウェルの底面を第２底面と主たる使用面である第１底面とに分ける分割壁であって、ピペットを第２底面に導いた際の液の勢いを第２底面内に留めることができる所定高さの分割壁と、
ウェル側周の深さ方向に第２底面にまで至る溝であってピペット先端を案内し、第２底面にピペット先端を突き当てさせるガイド溝と、
を具備し、
ピペット先端の第２底面への密着を回避する凹凸部を第２底面に設け、
分割壁は第１底面側に凸に円弧を描く突条として設け、液を均等に分散して第１底面側に流出させることを可能としたことを特徴とするマイクロプレート。
円弧の中心角は９０°～１８０°であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロプレート。
分割壁両端部はともにウェル側周とは離間しており、分割壁両端間隔が第２底面の開口幅以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロプレート。
ガイド溝は、ウェル上部に向けて拡径していることを特徴とする請求項１、２または３に記載のマイクロプレート。