JP7058275B2 - 電気泳動による精子の分離 - Google Patents
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Description
・ポリマー溶液の調製ステップ、
・適切なキャスティング装置/タンクでのキャスティングステップ、
・膜の乾燥ステップ、
・適切な温度のオーブン中でのアニーリングステップ、および
・冷却および貯蔵ステップ
を含む。
・ポリマー溶液の調製ステップ、
・適切なキャスティング装置/タンクでのキャスティングステップ、
・非溶媒誘起転相ステップ、
・適切な温度のオーブン中でのアニーリングステップ、および
・冷却および貯蔵ステップ
を含む。
第1の制限膜と第2の制限膜との間に配された分離膜を含む膜スタックに第1の溶液を提供するステップであり、制限膜がPVAを含み、第1の溶液が、第1の制限膜と分離膜との間に位置し、かつ、分離膜が、予め選択された孔径を有する、提供するステップ、および
スタックにわたって電場を印加するステップ
を含み、
負電荷を有しかつ予め選択された孔径より小さい第1の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、分離膜を通過して、分離膜と第2の制限膜との間に位置する第2の溶液中に移動する。
分離膜によって第1の溶液および第2の溶液を分離するステップであり、分離膜が、PVAを含み、かつ予め選択された孔径を有する、分離するステップ、
第1の溶液および第2の溶液にわたって電場を印加するステップであり、負電荷を有しかつ予め選択された孔径より小さい第1の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、分離膜を通過して第2の溶液中に移動する、印加するステップ
を含む。
第1の液体チャンバーおよび第2の液体チャンバーを画定する2つの制限膜の間に配された分離膜であり、制限膜がPVAを含む、分離膜、および
第1の液体チャンバーから第2の液体チャンバーへと分離膜を通過する電場を提供するための手段
を含む。
適合性かつ中性であり、低い電気浸透(膜にわたって印加された電位によって引き起こされる膜を通じたバルク液体の流れ)での膜の製作(fabrication)を補助する。
(a)第1の電解質チャンバー、
(b)第2の電解質チャンバー、
(c)第1の電解質チャンバーと第2の電解質チャンバーとの間に配された第1の試料チャンバー、
(d)第1の電解質チャンバーと第2の電解質チャンバーとの間に配された第1の試料チャンバーに隣接して配された第2の試料チャンバー、
(e)第1の試料チャンバーと第2の試料チャンバーとの間に配され、第1の試料チャンバーおよび第2の試料チャンバーの内容物の実体的な対流混合(convective mixing)を防止する、分離膜、
(f)第1の電解質チャンバーと第1の試料チャンバーとの間に配され、第1の電解質チャンバーおよび第1の試料チャンバーの内容物の実体的な対流混合を防止する、第1の制限膜、
(g)第2の試料チャンバーと第2の電解質チャンバーとの間に配され、第2の電解質チャンバーおよび第2の試料チャンバーの内容物の実体的な対流混合を防止する、第2の制限膜、および
(h)第1の電解質チャンバー中および第2の電解質チャンバー中に配された電極
を含む。
(i)電解質リザーバー、
(j)第1の試料リザーバーおよび第2の試料リザーバー、
(k)電解質リザーバーから第1の電解質チャンバーおよび第2の電解質チャンバーに電解質を供給するための手段、および
(l)少なくとも第1の試料リザーバーから第1の試料チャンバーに、または第2の試料リザーバーから第2の試料チャンバーに試料または液体を供給するための手段
の1つまたは複数をさらに含んでもよい。
(m)第1の電解質リザーバーおよび第2の電解質リザーバー、および
(n)第1の電解質リザーバーから第1の電解質チャンバーに電解質を、および第2の電解質リザーバーから第2の電解質チャンバーに電解質を供給するための手段
をさらに含んでもよい。
電解質チャンバーを通るように電解質リザーバーから電解質を循環させて、電解質チャンバー中に電解質ストリームを形成するための手段、および
各々の第1の試料チャンバーおよび第2の試料チャンバーを通るように第1の試料リザーバーおよび第2の試料リザーバーのそれぞれから内容物を循環させて、各々の試料チャンバー中に第1の試料ストリームおよび第2の試料ストリームを形成するための手段、
第1の試料リザーバー中または第2の試料リザーバー中の試料を除去しかつ置換するための手段、および
電解質および試料溶液の温度を維持するための手段
の1つまたは複数をさらに含んでもよい。
PVAストック溶液を調製するために、既知量の高純度の水を丸底フラスコに加えた。フラスコをサーモスタット制御した油浴(90℃)中に入れ、還流下で攪拌した。既知の質量のPVAを所望の濃度(%w/w)が達成されるまで加えた。溶解していないゲルが観察されなくなるまで90℃でスラリーを攪拌し、粘性の溶液を形成させた。その後、溶液を還流下でさらに30分攪拌してPVAの完全な溶解を確実にした。溶液を穏やかに混合すると共に室温にゆっくりと冷却させた後、計量した。必要な場合、高純度の水を加えて正味質量を開始質量に戻して、所望の濃度(%w/w)とした。その後、溶液を室温で30分間穏やかに攪拌した後、攪拌せずに終夜静置して、同伴した泡を除去した。
制限PVA膜について記載した通りにPVA、PEGおよびPVPONストック溶液を調製した。
NuSep CS10電気泳動装置を使用してPAmおよびPVA制限膜を比較する試験を実行した。CS10装置の構成の模式図を図3に示す。CS10装置は、実行時間、電圧および循環緩衝液の速度の精密な制御を可能とし、広範な試料の処理のために好適である。
8μmのポリカーボネート分離膜および、(a)PAm制限膜または(b)PVA制限膜のいずれか、を用いてCS10装置でウシ精子試料の電気泳動を行った。試料を35ボ
ルト、50mAの最大電流および5分の実行時間で処理した。オリジナルの試料、回収試料および保持/残留試料をエオシン-ニグロシン(EN)で染色して精子生存能力を評価し、またアニリンブルー(AB)で染色してDNA断片化を評価した。100倍の光学顕微鏡下で目視により運動性を評価した。
8μmのポリカーボネート分離膜および、(a)PAm制限膜または(b)PVA制限膜のいずれか、を用いてCS10装置でヒト精子試料の電気泳動を行った。上記の通りに試料を処理し、解析した。
Claims (13)
- 電気泳動による精子の分離における少なくとも1つの物理架橋された生体適合性ポリマー膜の使用であって、前記膜がポリ(ビニルアルコール)(PVA)を含む、前記使用。
- PVAを含む前記膜が、ポリアクリルアミド(PAm)を含有しない、請求項1に記載の使用。
- PVAを含む前記膜が、電場の通過を許容するが精子の通過を許容しない膜(制限膜)である、請求項1または請求項2に記載の使用。
- 前記制限膜が、15kDa未満の分画分子量(MWCO)を有する、請求項3に記載の使用。
- 前記制限膜が、キャスティングおよびアニーリング法によって作製されたものである、請求項4に記載の使用。
- PVAを含む前記膜が、多孔性サイズ排除膜(分離膜)である、請求項1または請求項2に記載の使用。
- 前記分離膜が、10μm未満の孔径を有する、請求項6に記載の使用。
- 前記分離膜が、非溶媒誘起転相法(non-solvent induced phase inversion method)およびその後のポストアニーリングによって作製されたものである、請求項6または請求項7に記載の使用。
- 精子を第1の溶液から第2の溶液中に分離する方法であって、
PVAを含む第1の物理架橋された生体適合性ポリマー制限膜と第2の物理架橋された生体適合性ポリマー制限膜との間に配された分離膜を含む膜スタックに前記第1の溶液を提供するステップであり、前記第1の溶液が、前記第1の制限膜と前記分離膜との間に位
置し、かつ、前記分離膜が、予め選択された孔径を有する、前記提供するステップ、および
前記スタックにわたって電場を印加するステップ
を含み、
負電荷を有しかつ前記予め選択された孔径より小さい前記第1の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、前記分離膜を通過して、前記分離膜と前記第2の制限膜との間に位置する前記第2の溶液中に移動する、
前記方法。 - 前記制限膜および前記分離膜が、PAmを含有しない、請求項9に記載の方法。
- 前記分離膜が、PVAを含む物理架橋された生体適合性ポリマー分離膜である、請求項9または請求項10に記載の方法。
- 精子を第1の溶液から第2の溶液中に分離する方法であって、
PVAを含む物理架橋された生体適合性ポリマー分離膜によって前記第1の溶液および前記第2の溶液を分離するステップであり、前記分離膜が、予め選択された孔径を有する、前記分離するステップ、
前記第1の溶液および前記第2の溶液にわたって電場を印加するステップであり、負電荷を有しかつ前記予め選択された孔径より小さい前記第1の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、前記分離膜を通過して前記第2の溶液中に移動する、前記印加するステップ
を含む、前記方法。 - 前記分離膜が、PAmを含有しない、請求項12に記載の方法。
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