JP5438777B2 - 水性転写緩衝液 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2009年2月23日に出願された米国仮出願第61/154,711号、および2010年2月19日に出願された米国特許出願第12/709,325号の恩典を主張し、上述の各々の内容はすべての目的のために参照により本明細書に明白に組み入れられる。

発明の背景
1．発明の分野
本発明は、タンパク質および核酸などの巨大分子の電気泳動転写（electrophoretic transfer）の分野に属し、ならびに、さらなる検出および特徴決定のための、ポリペプチド種が分離された電気泳動後のマトリックスから第2の基質へのポリペプチド種の転写に特に関する。

2．先行技術の説明
電気泳動は、生物学研究の最新の研究室における基本的な手段である。典型的に、タンパク質および核酸などの巨大分子は、電場において固体マトリックス中を移動するため、電気泳動の間に分離される。電気泳動手順の終わりに、巨大分子は、分子量および電荷などの分子の特徴に依存して、マトリックスの別個の位置において見出される。そのような巨大分子のさらなる研究はしばしば、より良好な反応条件が許容される第2の基質へ分子を移転させることを必要とする。電気ブロッティングは、電気泳動後の転写の1つの例である。

電気ブロッティングの多数の方法が周知であり、当技術分野において頻繁に実践される。転写過程は通常、液体または半液体環境において行われ、そこで、ポリアクリルアミドゲルなどの電気泳動マトリックス内の巨大分子が、ニトロセルロース、ナイロンなどの膜のような、さらなる解析に適した第2のマトリックスへ転写される。電気泳動マトリックスから解析用マトリックスへの巨大分子の移動は、転写の効率において重要な役割を果たす水性転写緩衝液により促進される。

種々の刊行物が、電気ブロッティングの目的のために有用な転写緩衝液を記載しており、例えば、Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354（非特許文献1）; Timmons and Dunbar (1990) Methods in Enzymology 182:679-688（非特許文献2）を参照されたい。本発明者らは、特に相対的に低分子量範囲のポリペプチドのために改善された転写効率を提示する新たな水性転写緩衝液を提供する。

Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 Timmons and Dunbar (1990) Methods in Enzymology 182:679-688

発明の簡単な概要
1つの局面において、本発明は、電気泳動に使用されたマトリックスから追加の解析に適切な第2の基質への、タンパク質および核酸などの生体分子の電気泳動転写に有用である水性緩衝液に関する。一般に、本発明の水性緩衝液は、少なくとも300mMの濃度でトリスを含有し、かつ少なくとも300mMの濃度でグリシンを含有する。いくつかの態様において、緩衝液は、20重量％を超えない濃度でエタノールまたはメタノールをさらに含み得る。または、緩衝液は、0.1重量％を超えない濃度でSDSなどの界面活性剤をさらに含み得る。

いくつかの態様において、緩衝液は、約300mMの濃度でトリスを含有し；または約300mMの濃度でグリシンを含有し得る。いくつかの場合において、緩衝液のpHは約9.0である。特定の例において、緩衝液は、約300mMのトリス、約300mMのグリシン、および約9.0のpHを有する。別の場合において、トリスの濃度は約400mMであり、グリシンの濃度は約400mMであり、かつ溶液は約9.0のpHを有する。1つのさらなる例は、約500mMのトリス、約500mMのグリシン、および約9.0のpHを有する緩衝液である。

他の態様において、本発明の緩衝液は、約1Mまたはより高い濃度でトリスまたはグリシンの少なくとも1つを含有する。例えば、緩衝液は、約1Mでトリス、約1Mでグリシンを含有し得、かつそのpHは約9.0である。別の例として、緩衝液は、約250mMのトリス、約1.92Mのグリシンを含有し、かつ約8.3のpHを有する。

別の局面において、本発明はまた、本明細書において説明されるような水性転写緩衝液を含有する電気泳動転写装置に関する。さらなる局面において、本発明は、本明細書において説明される水性転写緩衝液を利用する、電気泳動転写の方法に関する。
[本発明1001]
少なくとも300mMの濃度でトリスを含み、かつ少なくとも300mMの濃度でグリシンを含む、水溶液。
[本発明1002]
20重量％を超えない濃度でエタノールまたはメタノールをさらに含む、本発明1001の溶液。
[本発明1003]
0.1重量％を超えない濃度で界面活性剤をさらに含む、本発明1001の溶液。
[本発明1004]
界面活性剤がSDSである、本発明1003の溶液。
[本発明1005]
トリスの濃度が300mMである、本発明1001の溶液。
[本発明1006]
グリシンの濃度が300mMである、本発明1001の溶液。
[本発明1007]
約9.0のpHを有する、本発明1001の溶液。
[本発明1008]
トリスの濃度が300mMであり、グリシンの濃度が300mMであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、本発明1001の溶液。
[本発明1009]
トリスの濃度が400mMであり、グリシンの濃度が400mMであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、本発明1001の溶液。
[本発明1010]
トリスの濃度が500mMであり、グリシンの濃度が500mMであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、本発明1001の溶液。
[本発明1011]
トリスまたはグリシンの濃度が1Mまたはそれより高い、本発明1001の溶液。
[本発明1012]
トリスの濃度が1Mであり、グリシンの濃度が1Mであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、本発明1011の溶液。
[本発明1013]
トリスの濃度が250mMであり、グリシンの濃度が1.92Mであり、かつ、溶液が約8.3のpHを有する、本発明1011の溶液。

SYPRO Ruby強度により測定し、6種類の異なる転写緩衝液を用いて9種類のタンパク質の転写効率を比較する。タンパク質の分子量は以下である：ミオシン−200kDa；β-ガラクトシダーゼ−116kDa；ホスホリラーゼB−97kDa；ウシ血清アルブミン−66kDa；オボアルブミン−45kDa；炭酸脱水酵素−31kDa；トリプシンインヒビター−21.5kDa；リゾチーム−14.4kDa；アプロチニン−6.5kDa。以下の緩衝液を使用した：Towbin−25mMトリス、192mMグリシン、pH8.3；Timmons−250mMトリス、192mMグリシン、pH8.9；300mM Tris/Gly＋M＋S−300mMトリス、300mMグリシン、20％MeOH、0.05％SDS pH9.0；300mM Tris/Gly−300mMトリス、300mMグリシン pH9.0；Tim＋SDS＋MeOH−250mMトリス、192mMグリシン、20％MeOH、0.05％SDS pH8.9；Towbin＋SDS＋MeOH−25mMトリス、192mMグリシン、20％MeOH、0.05％SDS pH8.3 SYPRO Ruby強度により測定し、（トリスおよびグリシンを含有する）3種類の異なる転写緩衝液を用いて9種類のタンパク質の転写効率を比較する。 SYPRO Ruby強度により測定し、（20％メタノールおよび0.05％SDSをさらに含有する）3種類の異なる転写緩衝液を用いて9種類のタンパク質の転写効率を比較する。 SYPRO Ruby染色により測定し、6種類の異なる緩衝液を用いて9種類のタンパク質の転写効率を比較する。以下の緩衝液を使用した：400mM Tris/Gly−400mMトリス、400mMグリシン pH9.0；500mM Tris/Gly−500mMトリス、500mMグリシン pH9.0；1M Tris/Gly−1,000mMトリス、1,000mMグリシン pH9.0；10X Towbin−250mMトリス、1,920mMグリシン pH8.3；300mM Tris/Gly−300mMトリス、300mMグリシン pH9.0；iBlot−使用した専売消耗品、正確な緩衝液組成は不明である。 図2に示した定量化に使用したブロットを示す。 6種類の異なる転写緩衝液を使用した転写の間の電圧曲線を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質および核酸を含む巨大分子、特に相対的に低分子量のタンパク質の電気泳動転写において改善された性能を有する水性転写緩衝液に関する。

転写溶液の成分
本発明の転写緩衝液は、少なくとも2つの成分：トリスおよびグリシンを含有する水溶液である。2つの成分の各々は、少なくとも300mMの濃度で転写溶液に存在する。1つの例において、本発明の転写緩衝液は9.0のpHを有し、かつ300mMトリスおよび300mMグリシンを含有する。当技術分野における緩衝液と比較して、本緩衝液は、電気泳動ゲルからブロッティング膜へ広範囲の分子量（例えば、約200kDa〜約6.5kDa）のタンパク質を横切って転写する段階において、特に約20kDa未満のタンパク質の転写において驚くべき高効率を示している。トリスおよびグリシンの濃度は溶液においてより高くあることができ（例えば、各々少なくとも約400mM、500mM、または1M）、ならびにそれぞれの溶解性と同じ高さであってもよい：トリスについては4M、およびグリシンについては3.3M。しかしながら、一般に、転写溶液におけるトリスおよびグリシン濃度が各々300mMより次第に高くなる時、溶液はより小さなタンパク質（例えば、約20kDaもしくはそれ未満、約15kDaもしくはそれ未満、約20kDa〜約6.5kDa、または約15kDa〜約6.5kDa）に関して高い転写効率を維持する傾向にあるが、より大きなタンパク質（例えば、約20kDaまたは約50kDaより大きい）の徐々に減少する転写効率を示し得る。

任意で、追加の成分も転写緩衝液中に含まれ得る。SDS、エタノール、およびメタノールがそのような任意の成分の例である。いくつかの例において、溶液におけるSDSの濃度は、0.025重量％〜0.1重量％に及ぶことができ、例えば、0.1重量％以下、例えば0.05重量％である。他の例において、溶液におけるエタノールまたはメタノールの濃度は、5％〜20％に及ぶことができ、例えば、20重量％以下、例えば10重量％である。

転写溶液のpH
本発明の転写緩衝液は、約8.0〜約9.5、例えば約8.8〜約9.2のpH範囲を有する。例示的な態様において、転写溶液は約9.0のpHを有する。当技術分野において周知であるように、溶液のpHは、必要に応じて希釈されたHClまたはNaOH水溶液により調整され得る。本出願において使用される時、「約」という語は、「約」の直後に示された値の＋/−10％の範囲を意味する。

転写溶液を使用する方法および装置
本発明の転写緩衝液は、当技術分野において公知である電気泳動ブロッティング法において、および／または電気泳動ブロッティングのために現在利用可能である装置との組み合わせで現在使用される種々の転写緩衝液に取って代わることができる。一般に、電気泳動ブロッティングの過程は、電気泳動に使用され、かつ分離されたタンパク質を含有するマトリックスを、さらなる試験のためにタンパク質が転写されるべき第2の基質と直接接触させて置く段階を含む。電気泳動に使用されるマトリックスは、SDSゲルなどのポリアクリルアミドゲルであり得、第2の基質は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニルジフルオリド、または同様の材料で作製された膜であり得る。マトリックスおよび基質の集合体を転写緩衝液において浸水状態かまたは飽和状態にし、その後、第2の基質へ向かってタンパク質を移動させる電場中に置く。転写システムにおける電圧、電流、および実行時間は、経験的に決定され得る。いくつかの場合において、過熱および可能性のあるタンパク質の変性を予防するために、転写集合体全体を温度が制御された環境に維持することが望ましいことがある。

以下の実施例は、例証としてのみ提供され、限定としては提供されない。当業者は、本質的に同一または同様の結果を生じるように変化または修飾され得る様々な重大でないパラメーターを容易に認識するであろう。

実施例1：タンパク質転写効率へのトリス／グリシン濃度の影響
方法
SDS-PAGE Broad Range standardsの希釈系列を、電気泳動によりCriterion 4-20％ゲル上で分離した。ゲルを0.2μMニトロセルロース膜へブロットした。高いイオン強度緩衝液に固有の低い抵抗値に適応するため、Acopian Technical Companyにより造られた特別注文のパワーサプライを使用した。電流を2.5Aに設定し、電圧データを毎分記録した。ブロットをSYPRO Rubyで染色し、VersaDoc 4000上で画像化した。

各場合において、EcoClothパッドを用いて10分間ブロッティングを行った（USSN 11/955,955, "Polymeric Sorbent Sheets as Ion Reservoirs for Electroblotting"に記載されている）。Towbin緩衝液、Timmons緩衝液、および本発明の緩衝液を比較する実験について、Towbin緩衝液を用いた転写が過熱しないように2.5Aの制限を伴って電圧を25Vで一定に保った。しかしながら、Timmons緩衝液および本発明の緩衝液については、2分未満後に2.5A制限に達し、残りの転写の間、本質的に一定値のままであった。増加する濃度のトリス／グリシンを比較する実験については、電流を2.5Aで一定に保った。

試験した緩衝液
1．400mMトリス、400mMグリシン、pH9.0
2．500mMトリス、500mMグリシン、pH9.0
3．1Mトリス、1Mグリシン、pH9.0
4．10x Towbin緩衝液（250mMトリス、1.92Mグリシン）、pH8.3
5．300mMトリス、300mMグリシン、pH9.0

図面の簡単な説明の節において、追加の緩衝液が提供される。

結果
ブロット転写効率
図1〜4は、種々の異なる緩衝液製剤を用いたブロット由来のSYPRO Rubyシグナル強度を比較する。全体的に、緩衝液におけるトリスおよびグリシンの濃度は転写効率に有意な影響を有する。300mMより高いトリス／グリシン濃度は、14kDaより大きなタンパク質について全体的な転写効率を低下させる。加えて、1Mトリス／グリシンのブロットは、膜を横切る不均質な転写を示す（図5）。試料における2つの最も小さなタンパク質であるリゾチーム（14.4kDa）およびアプロチニン（6.5kDa）については、2つの最も高いトリス／グリシン濃度（1M、ならびに250mMトリスおよび1.92Mグリシンを含有する10x Towbin）が転写効率において有意な増加を示す。このことは、高いイオン強度が膜を通した低分子量タンパク質の移動を阻止するのに役立ち得ることを示唆する。しかしながら、500mMトリス／グリシン緩衝液は、300mMトリス／グリシンと同様の低分子量転写効率を示し、400mMトリス／グリシン緩衝液は、最も乏しい転写効率を有する。

転写電圧
予想されたように、緩衝液濃度は、試験の間に生成される電圧プロファイルに大きな影響を有した。一般に、電流を一定に保つ時、トリスおよびグリシンの濃度が増加するにつれて、転写の間に生成される電圧は減少する。興味深いことに、1Mトリス／グリシンは、10x Towbin（250mMおよび1.92Mグリシン）より有意に低い泳動電圧（run voltage）を保ち、泳動電圧に対してトリスがグリシンより有意な影響を有し得ることを示唆した。

結論
転写緩衝液においてトリス／グリシン濃度を増加させると、20kDaまたはより小さい（例えば、14kDaまたはより小さい）ような相対的に小さい分子量のタンパク質について転写効率を増加させる。1Mトリス／グリシンおよび10x Towbin緩衝液は、小さなタンパク質の転写効率において増強を提供し、一方、より大きなタンパク質は、相対的により低いブロッティング品質および転写効率を有する傾向がある。

本出願において引用されたすべての特許、特許出願、および他の刊行物は、すべての目的のために全体として参照により組み入れられる。

Claims (15)

1. 少なくとも300mMの濃度でトリスを含み、かつ少なくとも300mMの濃度でグリシンを含む水溶液であって、トリスの濃度がグリシンの濃度とほぼ同じであり、かつ該溶液は電気泳動転写の過程で転写緩衝液として使用されるものである、水溶液。
2. 20重量％を超えない濃度でエタノールまたはメタノールをさらに含む、請求項1記載の溶液。
3. 0.1重量％を超えない濃度で界面活性剤をさらに含む、請求項1記載の溶液。
4. 界面活性剤がSDSである、請求項3記載の溶液。
5. SDSの濃度が0.05重量％である、請求項４記載の溶液。
6. トリスの濃度が300mMであり、かつグリシンの濃度が300mMである、請求項1記載の溶液。
7. 約9.0のpHを有する、請求項1記載の溶液。
8. トリスの濃度が300mMであり、グリシンの濃度が300mMであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、請求項1記載の溶液。
9. トリスの濃度が400mMであり、グリシンの濃度が400mMであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、請求項1記載の溶液。
10. トリスの濃度が500mMであり、グリシンの濃度が500mMであり、かつ、溶液が約9.0のpHを有する、請求項1記載の溶液。
11. トリスまたはグリシンの濃度が1Mまたはそれより高い、請求項1記載の溶液。
12. 20重量％の濃度のメタノールおよび0.05重量％の濃度のSDSをさらに含む、請求項８記載の溶液。
13. 電気泳動転写装置を用いた電気泳動転写において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の溶液。
14. 電気泳動転写の過程における、請求項１〜１２のいずれか一項記載の溶液の使用。
15. 電気泳動転写の過程がタンパク質を転写する工程を含む、請求項１４記載の使用。

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