JP7057919B2 - 下痢性貝毒ジノフィシストキシン1(DTX1)高生産能を有する有毒渦鞭毛藻Prorocentrum株 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は下記の通りである:
[2]ジノフィシストキシン1産生能を有する、受託番号FERM P-22358で表されるプロロセントラム・リマ株。
[3][1]又は[2]記載のプロロセントラム・リマ株の培養物。
[4][1]又は[2]記載のプロロセントラム・リマ株の培養物からジノフィシストキシン1及び/又はオカダ酸を単離することを含む、ジノフィシストキシン1及び/又はオカダ酸の製造方法。
受託番号FERM P-22357で表されるプロロセントラム・リマ株及び受託番号FERM P-22358で表されるプロロセントラム・リマ株は、それぞれ、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター (NPMD)に寄託されている(受託日:平成30年2月21日)。
(1)細胞は扁平で縦長の楕円形をしており、前端は後端と比較してやや尖っている。
(2)細胞の長さは30-60μm程度、横幅は20-50μm程度である。
(3)色は黄褐色から茶褐色である。
1.1 海藻試料採取と培養株の確立
2014年から2015年にかけて、日本沿岸域の7地点 (秋田県男鹿市船川港台島鵜ノ崎、宮城県石巻市荻浜、千葉県鋸南町岩井袋、高知県室戸市甲浦、高知県香南市手結岬、沖縄県うるま市中城湾および沖縄県本部町石川)より海藻試料を採取し、それに付着するProrocentrum limaと思われる細胞を単離・培養することにより培養株を作成した。具体的には、各沿岸海域において、海藻試料をそれぞれ5 g程度採取し、ポリビン (広口角型規格瓶 500 ml, 三商社製)に入れ密封した。この際、可能な限り、1種類の海藻と400 ml程度の現場海水をポリビンに入れ、保冷箱に梱包し研究室へ持ち帰った。これら海藻試料に付着しているProrocentrum limaと思われる細胞を剥離させるために、本海藻試料を含むポリビンを勢いよく200回程度振った。次に、ポリビン内の海水を150 μm (もしくは200 μm)のナイロンメッシュにて濾過することにより150 μm (もしくは200 μm)以上の堆積物等を取り除き、続いてその濾液を20 μm (もしくは10 μm)のナイロンメッシュを用いて濾過することにより、そのメッシュ上に海藻付着性微細藻画分を集めた。この後、上記の処理を行った海藻を含むポリビンに、あらかじめガラス繊維ろ紙GF/F (粒子保持能 0.7 μm, ワットマン社製)を用いて濾過した高知県室戸市より採取した海洋深層水 (塩分: 33 PSU程度)を約100 mL加え、再度同様に処理することにより同ナイロンメッシュ上に海藻付着性微細藻画分を集めた。この一連の作業工程を、剥離処理後のポリビン内の試水が透明となるまで繰り返し行い、最終的に10 mLの濃縮付着性微細藻画分を調製した。次に、本濃縮画分を6穴マイクロプレート (AGCテクノグラス社製)の穴に分注した。この際、本微細藻画分に含まれる藻体量に応じて100-3,000 μL程度の範囲で分注した。また、分注した濃縮液量が少ない場合には、これらの穴に前述した濾過海水を加え、最終的にその液量を1穴当たり2,000-3,000 μL程度になるように調整した。
冷凍保存した各Prorocentrum 属培養株の懸濁液について、LC-MS/MSによる下痢性貝毒 (DTX1およびOA)量の分析を行った。すなわち、培養株の懸濁液を解凍し、超音波処理した後にポリフッ化ビニリデン膜 (PVDF膜 0.2 μm メルクミリポア社製)を用いて濾過した。得られた濾液を1 mLのバイアルに分注し、LC-MS/MS分析により、OAおよびDTX1を定量した (Suzuki et al., 2011)。LCとして島津社製のNexcera XRを用い、MS/MSとしてAB SCIEX社製の4500Qtrapを用いた。カラムはHypersil BDS C8 (50 mm× 2.1 mm I.D., Thermo Fisher Scientific社製)を用いた。移動相はA液として50 mMギ酸, 2 mMのギ酸アンモニウムを含む超純水、B液として50 mMギ酸, 2 mMのギ酸アンモニウムを含むアセトニトリル:超純水 (95:5, v/v)の二相を用いたグラジエント溶出法により、OA/DTX1を分離した。クロマトグラムのOA/DTX1のピーク面積から培養株の懸濁液中に含まれるOA/DTX1の濃度 (ng/mL)を算出した。
下痢性貝毒、とりわけDTX1の大量生産に至適な株を選抜するため、培養試験を行った。Prorocentrum属供試株には、秋田県男鹿市船川港台島鵜ノ崎より分離したAOF55P株、宮城県石巻市荻浜より分離したMIO12P株およびMIO34P株、ならびに沖縄県本部町石川より分離したOMI29P株の計4株を用いた。まず、培養株の生育段階を統一するため、前培養を行った。すなわち、オートクレーブ滅菌を行ったガラス器具およびマイクロチップを用いて、クリーンベンチ内にて100 mL容フラスコにオートクレーブ滅菌したmetals mix SWII培地を49.5 mL分注した。さらに、これに最終濃度が1%になるように0.5 mLのトコロテン抽出液を無菌的に加えることにより50 mLのmetals mix SWII+GJ1培地調製した。その後、各供試株の対数増殖期の細胞を、前述した培地にそれぞれ接種し、(1.1)と同様の培養条件下にて対数増殖期に達するまで約2週間培養した。
(1.3)において選抜した2株 (MIO12P株およびAOF55P株)について、それぞれの培養株を継代維持している試験管から培養液各1 mLをとり、これを1.5 mL容遠沈管 (Greiner Bio-one社製)に移し、マイクロ冷却遠心機 (KUBOTA3740, ローター番号: KUBOTA AF-2536A, KUBOTA社製)を用いて遠心分離 (10,000 rpm×2 min, 20℃)した。その後、上清を捨て、下記の要領により細胞を洗浄した。すなわち、得られた沈殿画分に含まれる塩類を出来るだけ除くために、本画分に200 μLの注射用水 (ニプロファーマ社製)もしくはオートクレーブ滅菌した超純水を加えた。ボルテックス・ミキサー (Vortex-Genie 2, model G560; サイエンティフィックインダストリーズ社製)により細胞を懸濁させた後、遠心分離 (10,000 rpm×2 min、20℃)を行った後、その上清を捨てた。
(1.3)において選抜した2株 (MIO12P株およびAOF55P株)の培養液を各1 mLずつとり、倒立型システム顕微鏡 IX-70 (オリンパス社製)のもとでこれに含まれる培養細胞の明視野観察を行った。また、Nikon 1 J1 (ニコン社製)を用いてこれらの細胞の写真を撮影した。撮影した画像データについて、細胞の大きさを測定した。これらの測定には、画像処理ソフトウェアのImageJ 1.42q (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA)を用いた。
2.1 培養株の確立
海藻試料を採取した全ての地点よりProrocentrum属藻類を確認し、P. limaと思われる計108株を確立することに成功した。
確立したP. limaと思われる計108株について、LC-MS/MSによる下痢性貝毒量の分析を行った。まず、それぞれの培養株の1細胞当たりのDTX1含量を比較した結果、AOF55P株およびMIO12P株が他の株と比較して高いことが明らかとなった (図1A)。次に、培地1 mL当たりのDTX1収量を比較した結果、MIO34P株およびMIO12P株が他の株と比較して高いことが明らかとなった (図1B)。さらに、培地1 mL当たりの細胞収量を比較した結果、OMI29P株が他の株と比較して高いことが明らかとなった (図1C)。以上の結果を考慮して、AOF55P株、MIO12P株、MIO34P株およびOMI29P株の4株を選抜株として、以降に述べる精密な培養試験に供し、その下痢性貝毒産生能を評価した。
選抜したP. limaと思われる4株 (AOF55P株、MIO12P株、MIO34P株およびOMI29P株)について、培養試験により毒産生能を評価した。まず、培地1mL当たりのDTX1収量および同OA収量の変動について検討した結果、いずれの毒についても用いた4株は培養60日目にて最大値を示すことが明らかとなった (図2)。
高効率なDTX1生産に適する株と判断した2株 (MIO12P株およびAOF55P株)について、分子生物学的な観点から特徴付けを行うため、それらのLSU rDNA D1/D2領域の塩基配列を決定し、BLASTによる相同性検索を行った。その結果、Prorocentrum lima TIO124株 (アクセッションナンバー: KY010250)が最も両株との相同性が高かった (99%)。次に、日本産2株の塩基配列と近縁株のそれらをNCBIより取得し、分子系統解析を行った。その結果、いずれの株もP. lima株が形成するクレードに属した (図5)。このことより、日本産2株 (MIO12P株およびAOF55P株)は分子系統学的にP. limaであると判断した。
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Claims (4)
- ジノフィシストキシン1産生能を有する、受託番号FERM P-22357で表されるプロロセントラム・リマ株。
- ジノフィシストキシン1産生能を有する、受託番号FERM P-22358で表されるプロロセントラム・リマ株。
- 請求項1又は請求項2記載のプロロセントラム・リマ株の培養物。
- 請求項1又は請求項2記載のプロロセントラム・リマ株の培養物からジノフィシストキシン1及び/又はオカダ酸を単離することを含む、ジノフィシストキシン1及び/又はオカダ酸の製造方法。
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生物工学,2017年,第95巻、第12号,P.764-766 |
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