JP7007422B2 - 抗cd47薬の処理上有効量を達成するための方法 - Google Patents
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Description
抗CD47薬
本明細書で使用される用語「抗CD47薬」は、CD47(例えば、標的細胞)のSIRPα(例えば、貪食細胞)への結合を減少させる任意の物質を意味する。好適な抗CD47薬の非限定的な例は、高親和性SIRPαポリペプチド、抗SIRPα抗体、可溶性CD47ポリペプチド、及び抗CD47抗体または抗体フラグメントを含むがこれらに限定されないSIRPα薬を含む。実施形態によっては、好適な抗CD47薬(例えば、抗CD47抗体、SIRPα薬等)は、CD47に特異的に結合してCD47のSIRPαへの結合を減少させる。実施形態によっては、好適な抗CD47薬(例えば、抗SIRPα抗体、可溶性CD47ポリペプチド等)は、SIRPαに特異的に結合してCD47のSIRPαへの結合を減少させる。SIRPαに結合する好適な抗CD47薬は、(例えば、SIRPα発現貪食細胞において)SIRPαを活性化しない。好適な抗CD47薬の効果は、(更に以下に記載の)物質をアッセイすることによって評価され得る。例示的なアッセイでは、標的細胞は、候補物質の存在下または非存在下でインキュベートされる。本発明の方法で使用するための物質は、該物質の非存在下での貪食と比べて、少なくとも10%(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも120%、少なくとも140%、少なくとも160%、少なくとも180%または少なくとも200%)、貪食を上方調節するだろう。同様に、SIRPαのチロシンリン酸化のレベルのためのインビトロアッセイは、候補物質の非存在下で観察されたリン酸化と比べて、少なくとも5%(例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または100%)、リン酸化の減少を示すだろう。
SIRPα薬は、通常、シグナル配列及び膜貫通型ドメインとの間に存在する、認識できる親和性でCD47と結合するために十分であるSIRPαの部分、または結合活性を維持するそのフラグメントを含む。好適なSIRPα薬は、天然型タンパク質SIRPαとCD47との間の相互作用を減少(例えば、遮断、抑制等)する。SIRPα薬は、通常、SIRPαの少なくともd1ドメインを含むことになる。実施形態によっては、SIRPα薬は、例えば第2ポリペプチドとインフレームで融合された、融合タンパク質である。実施形態によっては、第2ポリペプチドは、例えば、該融合タンパク質が循環から急速に除去されないように、該融合タンパク質の大きさを増加させることができる。実施形態によっては、第2ポリペプチドは、免疫グロブリンのFc領域の一部または全部である。Fc領域は、高親和性SIRPα薬によって提供された「ドント・イートミー」シグナルの遮断を亢進する、「イートミー」シグナルを提供することによって貪食を助ける。他の実施形態では、第2ポリペプチドは、例えば、増大したサイズ、多量体化ドメイン、及び/または結合の付加またはIg分子との相互作用を提供する場合には、Fcに実質的に類似した任意の好適なポリペプチドである。
実施形態によっては、本題の抗CD47薬は、CD47に特異的に結合する抗体(すなわち、抗CD47抗体)であり、1つの細胞(例えば、感染細胞)上のCD47と別の細胞(例えば、貪食細胞)上のSIRPαとの間の相互作用を減少させる。実施形態によっては、好適な抗CD47抗体は、結合時に、CD47を活性化しない。好適な抗体の非限定的な例は、クローンB6H12、5F9、8B6及びC3を含む(例えば、本明細書で参照によって具体的に引用されている国際特許出願公開第WO2011/143624号に記載されている)。好適な抗CD47抗体は、かかる抗体の完全なヒト、ヒト化またはキメラ体を含む。ヒト化抗体(例えば、hu5F9-G4)は、その低抗原性のために、ヒトでのインビボ適用のために特に有用である。同様に、イヌ化(caninized)、ネコ化(felinized)等の抗体は、それぞれ、イヌ、ネコ等の抗体は、それぞれ、イヌ、ネコ及び他の種での適用に特に有用である。本題の抗体は、ヒト化抗体、またはイヌ化、ネコ化、ウマ化、ウシ化、ブタ化等の抗体、及びそれらの変異体を含む。
実施形態によっては、本題の抗CD47薬は、SIRPαに特異的に結合する抗体(すなわち、抗SIRPα抗体)であり、1つの細胞(例えば、感染細胞)上のCD47と別の細胞(例えば、貪食細胞)上のSIRPαとの間の相互作用を減少させる。好適な抗SIRPα抗体は、SIRPαの活性化がおそらく貪食を阻害するので、SIRPαを介するシグナル伝達を活性化または刺激せずにSIRPαに結合し得る。代わりに、好適な抗SIRPα抗体は、正常細胞を超えて損傷細胞の選択的貪食を促進する。他の細胞(例えば、非感染細胞)と比べてCD47(例えば、感染細胞)のより高度なレベルを発現するこれらの細胞は、選択的に貪食されることになる。したがって、好適な抗SIRPα抗体は、(貪食を阻害するためのシグナル応答を十分に活性化/刺激することなく)SIRPαに特異的に結合し、SIRPαとCD47との相互作用を遮断する。好適な抗SIRPα抗体は、かかる抗体の完全なヒト、ヒト化またはキメラ体を含む。ヒト化抗体は、その低い抗原性に因ってヒトでのインビボ適用のために特に有用である。同様に、イヌ化(caninized)、ネコ化(felinized)等の抗体は、それぞれ、イヌ、ネコ及び他の種での適用に特に有用である。本題の抗体は、ヒト化抗体、またはイヌ化、ネコ化、ウマ化、ウシ化、ブタ化等の抗体、及びそれらの変異体を含む。
実施形態によっては、本題の抗CD47薬は、SIRPαに特異的に結合し、1つの細胞(例えば、感染細胞)上のCD47と別の細胞(例えば、貪食細胞)上のSIRPαとの間の相互作用を減少させる、可溶性CD47ポリペプチドである。好適な可溶性CD47ポリペプチドは、SIRPαの活性化はおそらく貪食を阻害するので、SIRPαを介したシグナル伝達を活性化または刺激しないで、SIRPαに結合し得る。代わりに、好適な可溶性CD47ポリペプチドは、正常細胞を超えて損傷細胞の選択的貪食を促進する。正常な非標的細胞(例えば、正常細胞)と比べてCD47(例えば、感染細胞)のより高度なレベルを発現するこれらの細胞は、選択的に貪食されることになる。したがって、好適な可溶性CD47ポリペプチドは、貪食を阻害するためのシグナル応答を十分に活性化/刺激することなく、SIRPαに特異的に結合する。
本明細書で使用する用語「刺激剤」は、抗CD47薬の治療上有効量の将来的投与のために対象を刺激する物質を意味する。本発明者らは、(例えば、マウス及び非ヒト霊長類(NHP)モデルで以下に示すように)刺激剤を最初に投与しないで抗CD47薬の治療上有効量が対象に投与されると、高用量は赤血球(erythrocyte)(赤血球(red blood cell)、RBC)の用量依存的減少を引き起こし得ることを発見した。当業者は、RBCの減少を測定する方法を容易に理解するだろう。例えば、RBCの減少は、例えばヘマトクリット値のパーセンテージ変化を長期間測定することによって及び/または長期間のヘモグロビン(例えば、長時間のパーセント変化、g/dL等)を測定することによって監視され得る(図1~図3及び図7~図9)。よって、RBC減少によって起こる貧血の重度(場合によって、死)は、抗CD47薬の治療上有効量の使用を不可能にすることがある。しかしながら、抗CD47薬の治療上有効量の投与前に刺激剤を投与することによって、対象は、刺激剤の投与後に起こり得る一時的で低度の貧血を超える逆効果を経験しない。したがって、刺激剤の投与は、抗CD47の治療上有効量の将来的投与のために対象を刺激するのに役立つ。
抗CD47薬の治療量で対象を治療する方法が提供される。本方法は、対象に刺激剤を投与するステップに続いて、抗CD47薬の治療上有効量を該対象に投与するステップを含む。実施形態によっては、治療上有効量を投与するステップは、刺激剤の投与開始後、少なくとも約3日(例えば、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日、または少なくとも約10日)後に行われる。この期間は、例えば、個体による亢進された網状赤血球産生を提供するために十分である。
実施形態によっては、刺激剤の投与が効果的であったか否かを決定するステップは、抗CD47薬の治療上有効量を対象に投与するステップの前に行われる。刺激剤の投与が効果的でない場合には、刺激剤を改めて再度投与することが望ましい。かかる場合には、異なった用量及び/または異なった刺激剤が使用されるか、あるいは同一の用量及び同一の刺激剤が使用され得る。刺激剤の投与が効果的である場合(すなわち、以下に詳述するように、網状赤血球計数は、投与が効果的であることを示す)、抗CD47薬の治療上有効量が送達され得る。
本方法で使用するためのキットも提供される。本キットは、刺激剤及び抗CD47薬を含む。実施形態によっては、キットは、2またはそれ以上の刺激剤を含む。実施形態によっては、キットは、2またはそれ以上の抗CD47薬を含む。実施形態によっては、刺激剤は、投薬剤形(例えば、刺激投薬剤形)で提供される。実施形態によっては、刺激剤は、2またはそれ以上の異なった投薬剤形(例えば、2またはそれ以上の異なった刺激投薬剤形)で提供される。実施形態によっては、抗CD47薬は投薬剤形(例えば、治療上有効量の投薬剤形)で提供される。実施形態によっては、抗CD47薬は、2またはそれ以上の異なった投薬剤形(例えば、2またはそれ以上の異なった治療上有効量の投薬剤形)で提供される。キットの文脈で、刺激剤及び/または抗CD47薬は液体または固体形態で任意の慣用の包装(例えば、スティックパック、ドーズパック等)で提供され得る。
本方法及びキットは、標的細胞(例えば、癌細胞、感染細胞等)が、同種の正常細胞と比べてCD47の増加した発現を示す、任意の障害(infliction)を治療するために使用され得る。投与される抗CD47薬は、SIRPα(例えば、マクロファージ上のSIRPα)と標的細胞(例えば、癌細胞、感染細胞等)上のCD47との間の相互作用を阻害し、それによって該標的細胞のインビボ貪食を増加させる。本方法は、抗CD47薬の治療上有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含み、それは、該医薬と他の薬物(例えば、抗癌剤、抗感染症剤等)との組合せを含むがこれに限定されない。
好適な抗CD47薬及び/または刺激剤は、治療的使用のため、例えばヒト治療のために好適な医薬組成物で提供される。実施形態によっては、本発明の医薬組成物は、1またはそれ以上の本発明の治療物質またはその薬学的に許容される塩、エステル、またはその溶媒和物を含む。実施形態によっては、抗CD47薬または刺激剤の使用は、別の治療剤(例えば、別の抗感染症剤または別の抗癌剤)と組み合わせた使用を含む。1またはそれ以上の本発明の抗CD47薬及び/または刺激剤を含む治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する抗CD47薬または刺激剤を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって保存のために調製される(レミントンのPharmaceutical Sciences 第16版,Osol,A.著(1980年))。抗CD47薬または刺激剤の組成物は、優れた医療業務に一致した方法で調合され、投薬され及び投与されることになる。この文脈で考慮する因子は、治療されるべき具体的な疾患、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、該薬の送達部位、投与方法、投与計画、及び医療者に公知の他の因子を含む。
以下の例を提示し、当業者に完全な開示及び本発明の生産及び使用方法の説明を提供する。また、以下の例は、発明者が発明とみなすものの範囲を制限する意図もないし、下記の実験が実施した全ての、または唯一の実験であることを表す意図もない。使用した数字(例えば、量、温度など)に関して正確さを確保するための試みがなされているが、一部の実験誤差及び偏りは当然に含まれる。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
野生型マウスにおける抗CD47抗体の単回投与
MIAP410(IgG1アイソタイプ)またはMIAP470(IgG2aアイソタイプ)の単回250μgIP注入を野生型マウスに施した。この抗体用量は、およそ10mg/kg用量と等価である。血液を眼窩後叢から収集し、CBC分析をHemaTrue血液分析計で抗体注入の後1、3、6日目に実施した。ヘマトクリット(HCT)及び赤血球(RBC)値の百分率変化を図1に示す。全ての抗CD47mAb処理マウスが貧血を発生し、その最低値が投与の約3日後に生じた。MIAP470はより顕著な貧血を誘発する。これはIgG1及びIgG2aアイソタイプによって誘発される特異的なFcR仲介作用に起因する可能性がある。
CD47-/-マウスをJackson Laboratoryから入手し、250μgの対照マウスIgG、MIAP410またはMIAP470をIPに注入した。血液を収集し、mAb注入の72時間後に分析した。投与したCD47-/-マウスのいずれにも貧血は観察されなかった。ヘモグロビンの百分率変化を図2に示す。これは、野生型マウスで観察された貧血はCD47に結合した抗CD47抗体の直接的な結果であったことを示す。
WTマウスに、250μgの対照マウスIgG、MIAP410またはMIAP740を3日に1回与えた(図3に破線縦線で表した)。赤血球の毒性を各々の注入前にCBC分析で監視した。HCTの急激な低下は最初の抗体注入と同時(0日目)に発生した。二回目の注入(3日目)はヘマトクリットの更なる低下をもたらさなかった。マウスは、その後の注入に対し耐性になったように思われ、最終的に対照IgG治療マウスと類似した範囲に戻った。抗CD47抗体の反復投与は初期貧血を悪化させないという発見は、非ヒト霊長類における以降の実験の基本である。
非ヒト霊長類(NHP)における投与戦略の検証
Hu5F9-G4抗CD47抗体(及び、その親5F9)はヒトCD47に結合するが、マウスCD47には結合しない。適切な毒性種を特定するために、マカク(カニクイザル)非ヒト霊長類(NHP)CD47の配列をヒトCD47用いて整列した。そして、2つの配列が細胞外ドメインで僅か3個のアミノ酸の相違を含むことが明らかになった(図4)。3個の非保存アミノ酸は全てSIRP-alpha相互作用領域外に位置することが、刊行物のX線結晶構造によって明らかになった。
多くのNHP研究を、専売グルタミンシンテターゼ(GS)発現系を使用してLonzaによって作製された精製Hu5F9-G4抗体を用いて行った。Hu5F9-G4を、0.1、0.3、1、3、10または30mg/kgで単回投与として投与し、臨床病理学パラメータを、全血球数及び代謝パネルを含めて監視した。網赤血球増加及び球状赤血球症を伴う用量依存的貧血が肝臓または腎臓機能障害を伴わずに観察された(図7)。遊離血漿ヘモグロビンは検出がなく、血管内溶血の不在を示した。血清レベルの測定による薬物動態のモニタリングは、短半減期をもたらす大きな抗原シンクが存在することを示した(図7)。単回投与によって、異種移植研究では僅か10及び30mg/kgで血清レベルが一過的に効力を伴う範囲に達することができた。したがって、適切な投与が貧血を最小化しながら治療的に有効な抗CD47剤レベルを達成し、維持することができる。
本発明者らは、エリスロポエチン(EPO)の前投与が若いRBC産生を刺激することで貧血を弱めると推測した。これらの考慮から、本発明者らは初期の低用量が老化RBCの損失を弱め、低感受性の若いRBCの産生を刺激し、それによって以降のより多くの用量の耐性を容易化する可能性があるとの仮説に基づいてNHPで別々の用量増加試験を行った(図8)。2頭の動物を本研究に登録し、1週間の間隔で投薬した。1頭はEPO前処理(3、10、30、100及び300mg/kg)し、1頭は非前処理(1、3、10、30及び100mg/kg)とした。どちらの場合も、NHPは初期投薬で軽度な貧血を示し、反復投与によって悪化しなかった。実際、ヘモグロビンだけがEPO前処理なしでもヒトでの輸血の上限に達した。動物は100及び300mg/kgを含めて全ての用量に良好な耐容性を示し、更なる血液または代謝異常を伴わなかった。研究の終了時点で、両方の動物を安楽死させて、解剖及び組織病理学解析から異常がないことが分かった。
正常組織に発現したCD47の大きな抗原シンクの存在と一致して、初期の低用量Hu5F9-G4は24時間の半減期で血清から迅速に取り除かれた(図9)。対照的に、高用量Hu5F9-G4は持続した血清レベルを生み出して抗原シンクの飽和を示した。300mg/kgで投薬した動物は、5mg/mlのピークレベルを有し、ほぼ2週間1mg/ml超のレベルを維持した。
これらの研究は、Hu5F9-G4が主要な毒作用を伴わずに長期にわたる治療的血清レベルを達成することが可能な用量でNHPに投与し得ることを示した。潜在的な臨床投与戦略をモデル化するために、本発明者らは負荷維持投薬手法を用いた別のNHP研究を行った。本研究では、Hu5F9-G4を、グレード3の毒性を伴わない軽い貧血及び網状赤血球増加症を刺激し得る負荷投与で投与する。本発明者らの単回投与データ(上記を参照のこと)から、負荷投与として1日に1または3mg/kgのいずれかを選択した。1週間後、10または30mg/kgのいずれかの維持用量を投与し、毎週3投与を継続した。両方の負荷投与は共に、30mg/kgの維持用量でも貧血の重症度を軽減し、グレード3の毒性の発生はなかった。第一維持用量の後のPKデータは動物が治療レベルを達成することを示す。本研究は、負荷-維持戦略が潜在的に治療的な薬物レベルを達成しながら貧血を軽減(グレード3の毒性を防止する)することを示唆する。図10は、抗CD47剤(この場合はhu5F9-G4抗体)の種々の用量と関連する網状赤血球増加症レベルを実証する網状赤血球計数データを示す。
異物移植アッセイにおける抗CD47抗体の治療有効性
本発明者らは、ブロッキング抗CD47モノクローナル抗体(クローンB6H12、マウスIgG1)は、乳房、膀胱、結腸、卵巣、グリア芽細胞腫、平滑筋肉腫及び頭頸部扁平上皮癌を含む固形腫瘍増殖及び転移の阻害に有効であることを以前に報告した(PMID:22451913、22451919)。抗CD47モノクローナル抗体も、血液学的腫瘍増殖の類似した阻害を引き起こした(PMID:21177380、20813259、19632179、19632178)。本発明者らは、ヒト化抗体(例えば、上記の研究で用いたヒト化抗CD47抗体、hu5F9-G4)も固形腫瘍増殖の阻害及び転移排除に非常に有効であることを確認した(図11)。
カニクイザルの以前の毒性学的実験では、本発明者らのヒト化抗CD47モノクローナル抗体(Hu5F9-G4)の単回注入が、10mg/kg以上で投薬すると容認できないレベルの貧血(Hb>7g/dL)を引き起こした。本発明者らの前臨床医学モデル(100-200ug/ml)では、10mg/kg未満のHu5F9-G4用量は治療有効性を伴う血清レベルを生み出すには不十分である。本新研究は、5mg/kgの単一の初回(priming)用量は、それ以外の場合では毒性の可能性があるレベル(おそらく致死レベル)での以降の維持(maintenance)用量からカニクイザルを保護するのに十分であることを明らかにした。(研究デザインを参照:図13)。
本研究では水平破線は毒性限界用量を表す(Hb<7)。本グラフ上の各々の点は個別の動物を表す。異なる維持用量レベルでのHbレベルに統計的差異はない。初回刺激量(5mg/kg)は、後続用量の高低にかかわらず防止効果がある。
群3-4は、有効性を伴う最小濃度(目標範囲)を十分に上回るHu5F9-G4の血清中濃度を達成する。
アカゲザル及び/またはカニクイザルで研究を行った。アカゲザルとカニクイザルは共に薬理学的に関連する動物種(アカゲザルのCD47はカニクイザルのCD47と100%の配列相同性を共有する)とみなされる。
CD47は赤血球上で発現し、老化赤血球上で作用するため、Hu5F9-G4がヒトまたはサル(アカゲザル及びカニクイザル)の赤血球の直接血管内溶血を誘発するかどうかを評価する試験を読取として遊離ヘモグロビンを使用して行った。Hu5F9-G4は、ヒトまたはサル(アカゲザルまたはカニクイザル)赤血球のいずれも溶血も誘発しなかった。
本研究の目的は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)におけるHu5F9-G4による潜在的サイトカイン放出誘導を評価することであった。この生体外実験では、3個の別々のドナーから収集した培養PMBCを、Hu5F9-G4(20g/mlをプレートに結合した)、または非特異的ヒトIgG4抗体(陰性対照)、または抗CD3/抗CD28抗体(陽性対照)と共にインキュベートした。サイトカインストームに関連する多くの炎症促進性サイトカイン(例えば、 TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6)を含む50の異なるサイトカインをルミネックス(Luminex)多重化分析で評価した。評価した異なるサイトカインのうちHu5F9-G4はヒトPBMCsでサイトカイン放出を誘導しなかった。加えて、サイトカイン放出症候群の臨床徴候はいずれのサルの研究でも観察されなかった。Hu5F9-G4によるヒトPBMCの治療は、非特異的IgG4抗体またはCD3/CD28抗体で治療したPBMCと比較してIL1-RA、MIP1b/CCL4、IL-8及びENA-78/CXCL5のレベルの減少をもたらした。CD47とこれらの4つのサイトカインとの関係は明白でないが、サイトカインレベルの減少と直接的に関連する可能性がある何らの治療関連効果の証拠もサル研究では観察されなかった。
本研究の目的は、オスのカニクイザルに1時間IV注入による単回投与として投与したHu5F9-G4の潜在的毒性及び毒物動態を評価することであった。本研究では、Hu5F9-G4を、1日目に単一のオスサルに10mg/kgの用量で投与した。サルを、臨床徴候、摂食量、体重及び臨床病理学パラメータ(血液学、凝固(coagulation)、血液学、臨床化学)の変化について評価した。試料を、研究の継続期間全体で毒物動態分析のために収集した。動物を14日目に試験施設動物コロニーに戻した。
本研究を実施して、カニクイザルの研究が行われた同じ試験施設(ネバダ州レノ、チャールスリバー研究所)でアカゲザルに投与した場合の血液学及び臨床化学パラメータに及ぼすHu5F9-G4の潜在的な効果を評価した。この研究では、Hu5F9-G4を、3mg/kgで1時間IV注入してメスアカゲザル(N=2)に単回投与した。動物を14日間評価した後に施設動物コロニーに戻した。
本研究の初期目的は、髄腔内レザバー(intrathecal reservoir)で移植したアカゲザルにおける1時間IV注入として、または髄こう内投与によって投与したHu5F9-G4の薬物動態及び潜在的効果を評価することであった。しかし、1時間IV注入によってHu5F9-G4を投与された第一サルで観察された重症貧血のため髄こう内投与段階を含む残りの研究要素を断念した。本研究では、1頭のオスアカゲザルに、0日目に3mg/kg初回刺激量として、1時間IV注入によってHu5F9-G4を投与し、次いで15日目及び22日目に1mg/kg維持用量を投与した(初期研究設計での維持用量は8、15、22及び29日目に30mg/kgを投与した)。
以前の単回投与研究で観察された貧血は、RBCに発現したCD47結合の結果としてのHu5F9-G4の薬理作用と関係する可能性がある。RBCが老化するにつれて、RBCは徐々にCD47発現を失い、糖タンパク質及び糖脂質からシアル酸を失い、おそらくプロ食作用(pro-phagocytic)シグナルを蓄積し、結果的に食作用による排除に至る方法で膜リン脂質を再編成する(Danon、1988)。本発明者らは、Hu5F9-G4の投与は、CD47の段階的な損失を老化RBC上のCD47の即時遮断で置き換えることによって老化RBCの排除過程を加速させると仮定する。老化RBCの成熟前喪失(premature loss)は、続く網状赤血球増加症によって補償される。そして、初期貧血は老化RBCが若い細胞で置き換えられるにつれて治癒し、RBCプールの年齢構成がより若い細胞へシフトする。これらの考察に基づいて、本研究を、i)初期の低用量Hu5F9-G4は、網状赤血球増加症の十分な誘導にもかかわらず老化RBCの限定的損失を引き起こし、それによって、より低感受性の若いRBCの産生を刺激し、動物を重症貧血から保護する;及び、ii)エリスロポエチン(EPO;RBC産生を刺激する赤血球形成(erythropoiesis)刺激剤)による前処理が低感受性の若いRBCの産生を誘導し、それによってHu5F9-G4投与後に老化RBCの一掃を補償する可能性があるかどうかを評価するために実行した。別の抗体候補(FD6-IgG2)を本研究で評価したがこのINDの考察はしない。本研究では、オスカニクイザルに1mg/kgでの単回投与として、または4週間(1、8、15、22日目)、3mg/kgで週1回、1時間IV注入によってHu5F9-G4を投与した。Hu5F9-G4の用量を週1回投与した1頭のサルに、5日目にIV注入(17,000U/kg)によってエリスロポエチン(EPO)で前処理し、EPOでの前処理が以前に観察されたHu5F9-G4関連貧血を低減するかどうかを評価した。加えて、Hu5F9-G4の用量を週1回投与した1頭のサルに、1、2、5、8、9、12、15、16、19、22、23及び26日目にIV注入(0.5mg/kg)でデキサメタゾン、筋肉内(IM)注入(5mg/kg)でベネドリル(Benadryl)も投与(デキサメタゾンとベネドリルは同時に投与した)し、デキサメタゾン及びベネドリルがHu5F9-G4関連貧血を低減するかどうかを評価した。研究設計を表3に示す。
本研究の目的は、5週間にわたる用量漸増で1時間IV注入を介してメスカニクイザルに投与した時のHu5F9-G4の潜在的毒性及び毒物動態を評価することであった(FD6-IgG2は本研究で評価した別の抗体候補であった)。本研究では、1頭のサルに5日目にEPO(17,000U/kg)、次いで週1回の1、8、15、24及び31日目にHu5F9-G4の用量を最大300mg/kgまで漸増して投与した。他のサルに、週1回の1、8、15、24及び31日目にHu5F9-G4の用量を最大100mg/kgまで(EPOによる前処理なし)漸増させて投与した。標準安全性パラメータを本研究に組み込んだ。また、動物は両方とも43日目(最後のHu5F9-G4投与後の13日目)に終端処理した。研究設計を表4に示す。
以前の研究に基づいて、より低用量でのHu5F9-G4の初期投与は、カニクイザルで許容され、それ以降のより高用量の投与を可能にする。本研究の目的は、低用量レベルでの初回刺激量として、次いでより高用量レベルでの反復維持用量として投与した場合にHu5F9-G4の潜在的毒性及び毒物動態を評価することであった。加えて、本研究は初回刺激量/維持薬注療法を用いた有望な臨床薬注予定をモデル化するように設計した。本研究では、メスカニクイザルにリン酸緩衝食塩水(PBS)、または1日目に単一初回刺激量として1時間IV注入によるHu5F9-G4用量を漸増(0.1~30mg/kgの範囲)して投与した(群A及びH)。群B-Fの動物に、1日目にPBSまたは初回刺激量としてHu5F9-G4、次いで、PBSの複数の維持用量または種々のHu5F9-G4の用量レベルを投与した。群D(10501)及び群F(12501)における1頭の動物に、68日目に第二初回/維持用量サイクル(3mg/kgの初回刺激量)の投与を開始し、次いで75、78、82及び85日目に2週間、週2回維持用量(30mg/kg)を投与した。動物No.10501について1日目の第一初回刺激量は1mg/kgであったが、68日目の第二初回刺激量は3mg/kgに増加し、初回刺激量レベルの増加が許容されるかどうかを評価した(動物No.12501については1日目と68日目の初回刺激量は3mg/kgであった)。初回/維持用量予定で投与するよりはむしろ、群Gの動物には1、8、15及び22日目に10mg/kgで週1回Hu5F9-G4を投与した(低赤血球量のため15日目の用量は投与しなかった)。研究設計を表7に示す。
Hu5F9-G4(群A及びH)の単回投与を施した動物で血液学的変化が注目された。赤血球(RBC)量の可変的減少は、群Aの動物(0.1~30mg/kgの範囲で初回刺激量を漸増して投与した)において、≧0.3mg/kgの投与群で3日目から14日目までの間で観察された(0.1mg/kgでは変化は観察されなかった)。赤血球(RBC)量の減少は、0.3mg/kgでは予備研究レベルの最大0.73倍、1及び10mg/kgでは予備研究の0.63倍、30mg/kgでは予備研究の0.53倍に及んだ(表8)。興味深いことに、群Hの動物についての赤血球(RBC)量は、動物に最高の初期用量(30mg/kg)を投与した場合であっても予備研究レベル以下に僅かしか減少しなかった。しかし、これらの減少は群A及びHでは最終評価時点まで回復傾向の継続を示した。全動物(対照を含めて)で、反応性赤血球形成を示す網状赤血球数が増加した。加えて、MCHC(≧0.3mg/kg)及びRDW(≧0.1mg/kg)の増加が注目され、MCHCは予備研究値の最大1.2倍、RDWは予備研究値の最大2倍増加した。MCVの減少も用量≧0.3mg/kgで注目され、予備研究値の最大0.91倍に及んだ。遊離血漿ヘモグロビンは任意の動物で検出されなかった。リンパ球数は用量0.3mg/kgで増加し、予備研究値の1.19~1.86倍に及ぶ値であった;リンパ球の増加は白血球数に対応し、予備研究の最大2.5倍に及んだ。RBC形態変化 は、6日目及び10日目に評価して用量≧0.1mg/kgで注目された;これらの変化は高用量ほど(0.3~30mg/kg)重度が増加し、軽微から顕著に至る大赤血球、小赤血球、赤血球大小不同、多染性及び球状赤血球症を包含した。
1日目に初回刺激量、次いでHuF59-G4の反復維持投与(群B-F)及びHuF59-G4の週1回投与した動物で観察された血液学的変化は、単回投与動物(群A及びH)で観察されたものと一貫した。赤血球(RBC)量(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット)の可変的減少が初回刺激量≧1mg/kg及び維持用量≧10mg/kgを投与した群で観察された(表9-10)。これらの赤血球(RBC)量の減少はより早い時点(5日、8日、12日)でより大きくなる傾向を示した。加えて、赤血球(RBC)量の減少は、初回/維持用量予定で投与した他の動物と比較して週1回10mg/kgを投与した動物でより大きかった(動物No.13501;群G)。興味深いことに、動物No.10501(群D)のヘモグロビンレベルは1日目の1mg/kgでの第一初回刺激量の後に減少したが、68日目の、より高い第二初回刺激量、または75、78、82及び85日目の第二周期の維持用量の後はヘモグロビンレベルの低下はなかった(表9-10)。更に、第二周期の初回/維持用量を投与した他の動物(No.12501;群F)のヘモグロビンレベルは第二周期の間に予備研究レベルを維持した。これらのデータは、10mg/kg以下の初回刺激量で生じた貧血が初回刺激量10mg/kgと比較して重症ではなく、また、初期用量が低いほどカニクイザルによって許容されるHu5F9-G4の維持用量の連続投与を可能にすることを示す。更に、これらのデータは、初回/維持用量予定は週1回の用量予定で観察された程の重症度を生じないことを示す(群G)。全ての初回刺激量/維持群で研究の終了までに赤血球(RBC)量は回復傾向を示した。動物13501(群G、1週間に1回10mg/kg)は、低赤血球(RBC)量(ヘモグロビンレベルが12日目に6.5g/dLであった)のため15日目に投与を中止した。しかし、ヘモグロビンレベルが19日に回復を開始したため、この動物に投与を再開し、22日目に最終投与を施した(表9-10)。動物No.13501のヘモグロビンレベルは着実に回復への傾向を維持し、最終時点(71日)までに予備研究レベルを僅かに超えるまで戻った。網状赤血球数は全ての群(B-F、対照を含む)で増加したが、これは反応性赤血球形成を示す。MCHC及びRDWは初回/維持用量≧1/10mg/kgで増加し、MCHCの値は予備研究の1.21倍、RDWの値は予備研究の2.41倍に至った。MCVの可変的な減少(予備研究の最大0.90倍)も観察された。赤血球(RBC)量の変化と同様に、MCHC、RDW及びMCVで観察された変化は、初回/維持用量予定を投与した他の動物と比較して、週1回10mg/kgを投与した動物No.13501(群G)でより顕著であった。MCHC、RDW及びMCVの変化が予備研究レベルまで、または近くまで連続した回復傾向を示し、これらの変化は可逆的であることを示した。重要なことに、遊離血漿ヘモグロビンは任意の動物で観察されなかった。RBC形態変化 (血液学的パラメータの変化と一致する)も観察され、赤血球大小不同、大赤血球、小赤血球(3/30mg/kgの初回/維持用量で観察されなかった)、多染性及び球状赤血球症が含まれた。全体として、これらの変化の発生率及び重症度は用量依存的には起こらなかった。また、評価時点に基づいて研究終了までに部分的または完全な回復傾向を示した。リンパ球数も初回/維持用量≧1/10mg/kgで増加し、予備研究値の1.25~2.01倍に及び、他のパラメータと一貫して、全体的に回復傾向を示した。
単回投与動物(群A及びH)では用量≧1mg/kgで総ビリルビンの増加が注目され、6日目に増加が起こり、予備研究値の1.56~3.29倍に及んだ。総ビリルビンの増加は用量依存的に起こらず、また回復傾向を示した。ALT及びASTの増加は、6日目に30mg/kgを投与した単一動物(動物14501;群H)で注目されたが、これらの増加は最終時点までに回復傾向を示した。ハプトグロビンは用量≧0.1mg/kgで減少したが、ハプトグロビンは42日目に2頭のHu5F9-G4治療動物及び1頭のPBS対照動物の予備研究を含めて、全動物について3~4時点で検出レベル未満であった。したがって、ハプトグロビンの減少はこの研究ではHu5F9-G4の単一用量投与と不確定な関係があるとみなされた。
単回投与群と同様に、総ビリルビンは初回/維持用量予定を投与した全群で増加した。しかし、総ビリルビンのレベルは研究全体で1mg/dL未満のままであった(表11)。総ビリルビンの増加は研究の最終で回復傾向を示した。ハプトグロビンレベルは全群で減少し、研究の最終で回復傾向を示した(表11)。ALT、AST及びLDHの散発的な変化は研究過程のいくつかの時点で2、3の動物に起こった。しかし、これらの変化は、研究期間の間で僅か1日または2日に起きた正常範囲内(試験施設の歴史的データベースに基づいて)であり、事実上一過性であった。
本研究の目的は、以前の研究で評価されなかった用量レベルで、初回/維持用量予定として1時間IV注入で投与する際にHu5F9-G4の潜在的毒性及び毒物動態を評価することであった。本研究では、1日目に5mg/kgで初回刺激量としてHu5F9-G4をオスカニクイザルに投与し、次いで、8、11、15、18、22及び25日目に週2回、150mg/kgで維持用量を投与した。研究設計を表12に示す。
GLP試験の目的は、カニクイザルに初回刺激量、次いで反復維持用量を投与した場合にHu5F9-G4の潜在的毒性及び毒物動態を評価することであった。以前の研究で観察された動物No.1037での5/150mg/kg初回/維持用量による重症貧血により、本研究では使用する初回刺激量及び最大維持用量を5/100mg/kgとし、臨床研究で提案した用量の合理的安全域を提供した。賦形剤(vehicle)またはHu5F9-G4(5mg/kg)を1時間IV注入によって投与した。1日目に5mg/kgで初回刺激量を投与し、次いで5、10、50または100mg/kgの用量で賦形剤またはHu5F9-G4を維持用量として連続7週間、週2回投与した(8、11、15、18、22、25、29、32、36、39、43、46、50及び53日目)。群5では初回刺激量及び維持用量は同じ投与レベル(5mg/kg)を用いた。回収した動物を賦形剤及び高投与群に含めて任意の治療関連効果の可逆性を評価した。研究設計を表14に示す。
小分子製剤で通常実施される遺伝毒性学研究の規模とタイプはバイオテクノロジー製品に適用できない[ICH S6(R1)]。Hu5F9-G4のようなモノクローナル抗体はDNAまたは他の染色体材料と直接的に相互作用することはないと考えられている。したがって、変異原性試験は不適当とみなし計画しない。
Hu5F9-G4による発癌性研究を実施していない。Hu5F9-G4の作用機構に基づいて、Hu5F9-G4は発癌性ではないと考えられる。更に、Hu5F9-G4は増殖因子でも免疫抑制剤でもない。したがって、予想される患者の規模及び機構的懸念がないことを想定すれば、発癌性研究は予定(有効な毒物動態評価を含めて)されない。
Hu5F9-G4による生殖・発生毒性試験を実行していない。形式的であるが、自立型繁殖試験を実行しない。治療関連の影響は、8週間の毒性学研究において雌雄生殖臓器の顕微鏡試験で注目されなかった。Hu5F9-G4の潜在的な奇形発生効果はたとえあったとしても実験動物で知られていないため、Hu5F9-G4を妊婦に投与するべきではない。妊娠を避けるために、提案された第一期臨床試驗に登録された男性及び出産の可能性のある女性に適切な予防措置が(例えば、女性は陰性妊娠反応を示さなければならないし、患者は十分な避妊予防措置などに同意しなければならない)。
自立型局所忍容性試験を実行しなかった。しかし、ICH S6(R1)と一貫して、Hu5F9-G4の局所忍容性の評価(注入部位由来組織試料の臨床観察、肉眼検査及び顕微鏡検査)を反復用量毒性試験の一部として実行した。
提案した臨床試験ではHu5F9-G4の投与を支持して包括的な一連の毒性学研究を行った。これらの研究として、試験管内溶血研究、アカゲザル及びカニクイザルにおける単回及び反復投与研究、並びにヒト組織集団における組織交叉反応性研究が挙げられる。
Claims (5)
- CD47とSIRPαとの相互作用を遮断する抗CD47抗体の治療量を含み、対象の癌の治療の方法に使用するための医薬組成物であって、
前記方法は、
(a)前記抗CD47抗体としての第1の抗CD47抗体、前記第1の抗CD47抗体とは種類が異なる第2の抗CD47抗体、及びそれらの組み合わせから選択された刺激剤を、前記対象に、前記抗CD47抗体の治療上有効量の供与に伴う赤血球の減少に因る毒性を減少させるように治療上有効量よりも少ない準治療量だけ供与すること、及び
(b)前記第1の抗CD47抗体の治療上有効量を癌治療のために前記対象に供与すること
を含み、
ステップ(b)は、ステップ(a)の開始後、3日~21日の範囲で行われ、前記準治療量は1mg/kg~10mg/kgである、
医薬組成物。 - 前記準治療量は1mg/kg~7.5mg/kgである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記準治療量は1mg/kg~5mg/kgである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記準治療量は1mg/kg~4mg/kgである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記準治療量は1mg/kg~3mg/kgである、請求項1に記載の医薬組成物。
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