JP6992699B2 - 光散乱検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、液体試料を通液する試料セルを保持するためのセルホルダ、および液体試料中に分散している微粒子の分子量や回転半径（サイズ）等を測定するための微粒子検出装置に利用される光散乱検出装置に関する。

液体試料中に分散しているタンパク質等の微粒子を分離するための手法として、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）やゲルろ過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）が知られている。近年、クロマトグラフィ検出装置としては、紫外線（ＵＶ）吸光度検出装置や示差屈折率検出装置に加え、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出装置が用いられている。ＭＡＬＳ検出装置は、測定試料の分子量や粒子径が算出可能であるという特長がある（特許文献１および２参照）。

図５は、原点に散乱光発生光源を配置した場合の散乱光放射方向の座標系を示している。図５に示すように、ＸＹ面上においてＸ方向正方向に光が入射し、ＸＹ面上における光の進行方向からの散乱角度をθ、ＸＹ面上からの角度をφと定義する。

次に、図６は、ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の平面図を、図７は側面図を示している。図６および図７において、３１０は試料セル、３１１は液体試料、３２０は光源、３２１は集光レンズ、３４０はスリット板、３５０は結像レンズ、３６０はアパーチャ板、３７０は検出器である。

図６および図７に示すように、円筒体状の試料セル３１０の内部に液体試料３１１を通液し、試料セル３１０および流路中心を通るように光源３２０から光を照射する。光源としては、通常、可視レーザ光が用いられる。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義され、異なる散乱角を検出するように試料セル３１０および流路中心を通る水平面上（ＸＹ平面上）に検出器３７０が複数配置される。図６は、θ１，θ２の配置角度で検出器３７０を２個配置した例である。

図８は、従来構造のセルホルダの模式図である。図８に示すように、試料セル３１０は、下部ホルダ４２０と上部ホルダ４３０とで固定される。下部ホルダ４２０および上部ホルダ４３０の内部には流路４７０が形成されており、チューブ４４０と試料セル３１０の流路３１２とを接続する。チューブ４４０は、フィッティング４５０により、下部ホルダ４２０および上部ホルダ４３０に固定される。ＸＹ面上での試料セル３１０の流路３１２の中心軸と入射光の光軸中心とを一致させるとともに、チューブ４４０と流路３１２の中心軸とを一致させために、下部ホルダ４２０および上記ホルダ４３０のそれぞれの保持部にはＯリング４６０が装着される。

特開平０７－７２０６８号公報、 特開２０１５－１１１１６３号公報 「光散乱法によるタンパク質の絶対分子量と複合体形成の解析」、尾高雅文、生物工学８９巻

ＭＡＬＳ検出装置は、測定を重ねるごとに試料セルの流路内面に試料が付着し、バックグラウンド信号が増加する。バックグラウンド信号の増加量は、検出器配置角度により異なり、低散乱角に配置した検出器ほど顕著である。バックグラウンド信号の増加は、測定精度を低下させる。流路内面に付着した試料の除去は、ブラッシングで洗浄することが効果的である。セルホルダ内の流路内径がφ１．０ｍｍ～φ１．５ｍｍと小さいため、セルホルダを介した状態で、内径がφ１．５ｍｍ～φ２．０ｍｍのセル流路をブラッシングすることはできない。そのため、ブラッシング洗浄する際には、セルホルダから試料セルを取り外す必要があった。しかし、一旦、試料セルを取り外すと、光学系を再度調整する必要があり、光学系の再度調整に非常に手間が掛かるという問題があった。

そこで、本発明は、試料セルを取り外すことなく、試料セルの流路内面を良好かつ効率よく洗浄することができるセルホルダ、およびこれを備えた光散乱検出装置を提供することを目的とする。

本発明の一態様に係る液体試料中の微粒子を検出するための光散乱検出装置であって、 液体試料を保持する試料セルと、前記試料セルにコヒーレント光を照射する光源と、前記試料セルからの光を検出する検出器と、前記試料セルの両端部を保持する一対のホルダのうち、少なくとも一方のホルダは二重フランジ構造を有し、前記二重フランジ構造は、前記試料セルを受ける第１フランジ部と、前記試料セルに接続されるチューブを保持し、前記第１フランジ部に対し着脱可能に設けられた第２フランジ部と、を備える、光散乱検出装置。

上記光散乱検出装置の構成において、上記試料セルは鉛直方向に沿って配置され、上記一対のホルダのうち、上部ホルダが上記二重フランジ構造に形成されていることが好ましい。

また、前記第１フランジ部は、その下部に封止部材を介して、前記試料セルを保持するボス部を有すると共に、その上部に前記第２フランジ部に保持された前記チューブを収容するチューブ収納凹部を有し、前記第２フランジ部は、前記第１フランジ部上に着脱可能に接続されることが好ましい。

さらに、上記第２フランジ部は、上記チューブのプローブ部を収容するためのチューブ収納凹部を有することが好ましい。

また、前記試料セルと前記検出器との間に配置され、前記試料セルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系をさらに備えることが好ましい。

本発明によれば、試料セルを取り外すことなく、試料セルの流路内面を良好かつ効率よく洗浄することができるセルホルダ、およびこれを備えた光散乱検出装置を提供することができる。

本実施形態に係る光散乱検出装置の側面図である。 本実施形態に係るセルホルダの組立状態の模式図である。 本実施形態に係るセルホルダの分解状態の模式図である。 本実施形態において、試料セルの流路内面の洗浄前後の状態の説明図である。 原点に散乱光発生光源を配置した場合の散乱光放射方向の座標系である。 ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の平面図である。 ＭＡＬＳ検出装置の基本構成例の側面図である。 従来構造のセルホルダの模式図である。

以下、本発明に係るセルホルダおよび光散乱検出装置の一実施形態について図面を参照して説明する。なお、各図において、同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。

〔光散乱検出装置の構成〕
まず、図１を参照して、本実施形態に係るセルホルダを組み込む光散乱検出装置について説明する。図１は、本実施形態に係る光散乱検出装置の側面図である。図１に示すように、本実施形態に係る光散乱検出装置１は、液体試料中に分散しているタンパク質等の微粒子の分子量や回転半径（サイズ）を検出する装置である。光散乱検出装置１は、試料セル１０、光源２０、スリット板４０、結像光学系５０、アパーチャ板６０および検出器７０を備える。以下、各構成要素ごとに説明する。

試料セル１０は、内部の流路に液体試料を保持する透明な円筒体状のセルである。試料セル１０は、例えば、無色透明な石英ガラスによって形成されている。この試料セル１０は、後述する本実施形態のセルホルダ１００によって保持されている。

光源２０は、試料セル１０にコヒーレント光を照射する。「コヒーレント光」とは、光束内の任意の２点における光波の位相関係が時間的に不変で一定に保たれており、任意の方法で光束を分割した後、大きな光路差を与えて再び重ね合わせても完全な干渉性を示す光をいう。光源２０としては、例えば、可視光レーザを照射するためのレーザ光源が採用される。自然界には完全なコヒーレント光は存在せず、シングルモードで発振するレーザ光はコヒーレント状態に近い光である。

光源２０から試料セル１０に至る入射光の光路Ｌ１には、集光光学系２１が配置されている。集光光学系２１としては、例えば、単一の集光レンズが採用されている。この集光レンズは、平凸レンズであり、光源２０からの光の入射側が凸面で、出射側が平面に形成されている。本実施形態では、集光光学系２１として、単一の集光レンズを採用しているが、集光光学系２１は複数の複合レンズや集光ミラーを組み合わせて構成してもよい。

光源２０および集光光学系２１は、光源２０から試料セル１０に入射するコヒーレント光の光軸が、試料セル１０及び検出器７０を含む平面（ＸＹ平面）から所定の角度（チルト角度α）で傾斜するように配置されている。具体的には、試料セル１０に対して入射光が斜め上方から入射するように、光源２０および集光光学系２１が配置されている。試料セル１０に対して入射光をチルト（角度α）させることによって、試料セル１０のガラスと空気との界面及びガラスと流路との界面（以下、「セル界面」と総称する。）での反射光による迷光を低減させることができる。光源２０から照射されたレーザ光は、集光光学系２１を通過した後、試料セル１０の中心軸付近に集光する。

試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上には、検出光学系３０が配置されている。本実施形態の検出光学系３０は、スリット板４０、結像光学系５０、アパーチャ板６０および検出器７０から構成されている。

結像光学系５０は、試料セル１０から周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する。結像光学系５０としては、例えば、単一の結像レンズが採用されている。この結像レンズは、平凸レンズであり、試料セル１０からの散乱光の入射側が平面で、出射側が凸面に形成されている。本実施形態では、結像光学系５０として、単一の結像レンズを採用したが、結像光学系５０は複数の複合レンズや結像ミラーを組み合わせて構成してもよい。

スリット板４０は、試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上において、試料セル１０と結像光学系５０との間に配置されている。スリット板４０は、結像光学系５０に入射する散乱角範囲を制限する。すなわち、スリット板４０に開口されたスリット４１は、水平方向の散乱角を制限し、且つ、鉛直方向の光束を多く取り込むために、鉛直方向に縦長であって、少なくとも鉛直方向に沿った辺が直状である。具体的には、スリット４１は、鉛直方向に縦長の長方形状や長孔形状を呈している。

アパーチャ板６０は、試料セル１０からの出射光の光路Ｌ２上において、検出器７０よりも結像光学系側に配置されている。アパーチャ板６０は、その開口部６１の開口幅で迷光を制限する機能を有する。アパーチャ板６０の開口部６１は、検出器７０の受光面前で開口している。

検出器７０は、結像光学系５０からの集光を受光する。すなわち、結像光学系５０の焦点に、検出器７０の受光面が位置している。本実施形態の検出器７０としては、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）を採用しているが、２次元ＣＭＯＳ等のアレイ検出器を採用してもよい。

〔セルホルダの構成〕
次に、図２を参照して、本実施形態に係るセルホルダ１００の構成について説明する。図２は、本実施形態に係るセルホルダの組立状態の模式図である。

図１に示すように、本実施形態に係るセルホルダ１００は、光散乱検出装置１の試料セル１０を保持するための装置である。本実施形態に係るセルホルダ１００は、一対のホルダ１１０、２１０、第１フランジ部１２０、第２フランジ部１３０および第３フランジ部２２０を備える。以下、各構成要素ごとに説明する。

一対のホルダ１１０、２１０は、試料セル１０の両端部を保持する。本実施形態の試料セル１０は、内部の流路１２に液体試料を保持する透明な円筒体状のセルである。この試料セル１０は、鉛直方向に沿って配置される。したがって、本実施形態に係るセルホルダ１は、試料セル１０の下端部を保持する下部ホルダ２１０と、試料セル１０の上端部を保持する上部ホルダ１１０と、の一対を備える。

下部ホルダ２１０は、例えば、ステンレス鋼等の金属により形成されている。第３フランジ部２２０は、径方向外方に張り出したリング状張出部であって、下ボス部２３０および上ボス部２４０が一体形成されている。第３フランジ部２２０には、その周方向に沿って等間隔に複数のボルト挿通孔２２１が穿孔されている。

下ボス部２３０には、チューブ収納凹部２３１およびフィッティング装着凹部２３２が上下に形成されている。フィッティング装着凹部２３２は、チューブ収納凹部２３１よりも内径が拡径して形成されている。チューブ収納凹部２３１およびフィッティング装着凹部２３２は、それぞれの鉛直方向の中心軸が一致しており、連通している。チューブ収納凹部２３１内には、フィッティングＦを介して、チューブＴのプローブ部Ｐが装着される。チューブ収納凹部２３１内にチューブＴのプローブ部Ｐが装着された状態で、フィッティング装着凹部２３２内にフィッティングＦが装着される。

上ボス部２４０には、試料セル１０の下端部を収容するためのセル保持部２４１が形成されている。セル保持部２４１は、円柱状の凹部として形成されている。セル保持部２４１の内径は、試料セル１０の外径よりも若干大きく形成されている。セル保持部２４１の内周壁には、ＯリングＯＲを装着するためのリング溝２４２が形成されている。ＯリングＯＲは、試料セル１０の流路１２の中心軸と入射光の光軸中心とを一致させるとともに、チューブＴと流路１２の中心軸とを一致させために、試料セル１０を周囲から付勢する。セル保持部２４１のセル当接面には、チューブ収納凹部２３１と連通する流路２４３が形成されている。セル保持部２４１のセル当接面と試料セル１０の下端面との間には、パッキンＰＫが装着される。

第３フランジ部２２０は、下部架台２５０に着脱可能に固定される。下部架台２５０には、円柱状の貫通孔２５１が開口されている。貫通孔２５１の周囲には、第３フランジ部２２０のボルト挿通孔２２１に対応する部位に雌ねじ部２５３が形成されている。貫通孔２５１内に下ボス部２３０を落とし込み、第３フランジ部２２０を下部架台２５０上に配置する。第３フランジ部２２０のボルト挿通孔２２１と下部架台２５０の雌ねじ部２５３とを位置合わせして、ボルトＢを締結することにより、第３フランジ部２２０が下部架台２５０上に固定される。

他方、上部ホルダ１１０は、試料セル１０を保持する第１フランジ部１２０と、試料セル１０に接続されるチューブＴを保持する第２フランジ部１３０と、の二重フランジ構造１４０に形成されている。上部ホルダ１１０は、下部ホルダ２１０と同様に、例えば、ステンレス鋼等の金属により形成されている。

第１フランジ部１２０は、その中央下部に突き出した試料セル１０を保持する第１ボス部１２１を有する。第１ボス部１２１の下部には、試料セル１０の上端部を保持するためのセル保持部１２２が形成されている。セル保持部１２２は、円柱状の凹部であって、試料セル１０の外径よりも若干大きな内径に形成されている。セル保持部１２２の内周壁には、ＯリングＯＲを装着するためのリング溝１２３が形成されている。ＯリングＯＲは、試料セル１０の流路１２の中心軸と入射光の光軸中心とを一致させるとともに、チューブＴと流路１２の中心軸とを一致させるために、試料セル１０を周囲から付勢する。セル保持部１２２のセル当接面には、不図示の貫通孔が形成されている。セル保持部１２２のセル当接面と試料セル１０の上端面との間には、パッキンＰＫが装着される。

第１ボス部１２１の上部には、第２フランジ部１３０の下部に突き出した第２ボス部１３１を収容するための凹部１２５が形成されている。この凹部１２５の下方部分は縮径され、凹部１２５とセル保持部１２２とは、連通している。

上述したように、第２フランジ部１３０の中央下部には第２ボス部１３１が突き出すように形成されている。第２ボス部１３１内には、チューブＴのプローブ部Ｐを収容するためのチューブ収納凹部１３２が形成されている。チューブ収納凹部１３２の底面には、チューブＴを挿通させるための流路１３３が開口されている。フィッテッングＦは、チューブＴのプローブ部Ｐ上に配置される。

第１フランジ部１２０の外径は、第２フランジ部１３０の外径よりも大きく設定されている。第１フランジ部１２０には、その周方向に沿って等間隔に２列のボルト挿通孔１２７、１２８が複数穿孔されている。外側のボルト挿通孔１２８は、上部架台１５０に第１フランジ部１２０を着脱可能に固定するための孔である。内側のボルト挿通孔１２７は、第２フランジ部１３０を第１フランジ部１２０に着脱可能に接続するための孔である。

第１フランジ部１２０は、下部架台１５０に着脱可能に固定される。下部架台１５０には、円柱状の貫通孔１５１が開口されている。貫通孔１５１の周囲には、第１フランジ部１２０のボルト挿通孔１２７、１２８に対応する部位に雌ねじ部１５３、１５４が形成されている。貫通孔１５１内に第１フランジ部１２０の第１ボス部１２１を落とし込み、第１フランジ部１２０を下部架台１５０上に配置する。第１フランジ部１２０のボルト挿通孔１２８と下部架台１５０の雌ねじ部１５４とを位置合わせして、ボルトＢを締結することにより、第１フランジ部１２０が下部架台１５０上に固定される。

他方、第２フランジ部１３０には、その周方向に沿って等間隔に複数のボルト挿通孔１３５が数形成されている。第２フランジ部１３０のボルト挿通孔１３５は、第１フランジ部１２０内側のボルト挿通孔１２７に対応する部位に穿孔されている。第２フランジ部１３０のボルト挿通孔１３５と、第１フランジ部１２０内側のボルト挿通孔１２７と、下部架台１５０の雌ねじ部１５３と、を位置合わせして、ボルトＢを締結することにより、第２フランジ部１３０が第１フランジ部１２０および下部架台１５０上に固定される。

下部ホルダ２１０、試料セル１０、上部ホルダ１１０、チューブＴおよびフィッティングＦの組立に際しては、試料セル１０の流路１２の中心軸と入射光の光軸中心とを一致させるとともに、チューブＴと流路１２の中心軸とを一致させるように、試料セル１０および光学系が芯出し調整される。

〔光散乱検出装置およびセルホルダの作用〕
次に、図１から図３を参照して、本実施形態に係る光散乱検出装置１およびセルホルダ１００の作用について説明する。図１に示すように、円筒体状の試料セル１０の流路１２に液体試料が通液される。液体試料の通液が完了すると、光源２０から集光光学系２１を介してコヒーレント光である可視レーザ光が照射される。可視レーザ光は、光路Ｌ１に沿って進むことにより、レーザ光が試料セル１０の流路内の液体試料に入射する。液体試料にレーザ光が入射されると、その光は液体試料に含まれる微粒子に当たって所定の散乱角を以て散乱する。そして、試料セル１０から出射した散乱光は、スリット板４０のスリット４１を通過した後、結像光学系５０およびアパーチャ板６０を経て、検出器７０の受光面上に受光される。

試料セル１０から散乱光が出射する際、試料セル１０のセル界面において、反射光が迷光として生じる。結像光学系５０の入射側にはスリット板４０が設けられているので、スリット板４０の板部分で反射光（迷光）を制限することができる。また、アパーチャ板６０がさらに迷光を制限するので、分析に必要な散乱光が検出器７０の受光面に受光される。

光散乱検出装置１は、測定を重ねるごとに試料セル１０の流路１２の内面に試料が付着し、バックグラウンド信号が増加する。上述したように、流路１２の内面に付着した試料の除去は、ブラッシング洗浄することが効果的である。セルホルダ１００内の流路１３３の内径がφ１．０ｍｍ～φ１．５ｍｍと小さいため、セルホルダ１００を介した状態で、内径がφ１．５ｍｍ～φ２．０ｍｍの流路１２をブラッシングすることはできない。

図２に示すように、本実施形態に係るセルホルダ１００は、上部ホルダ１１０が試料セル１０を保持する第１フランジ部１２０と、試料セル１０に接続されるチューブＴを保持する第２フランジ部１３０と、の二重フランジ構造１４０に構成されている。したがって、試料セル１０の流路１２の内面をブラッシング洗浄する際には、第２フランジ部１３０に締結されたボルトＢを取り外して、第１フランジ部１２０から第２フランジ部１３０を脱離させる。第１フランジ部１２０の凹部１２５には、第２フランジ部１３０の第２ボス部１３１が収容されている。第２フランジ部１３０の第２ボス部１３１内にチューブ収納部１３５が形成されており、このチューブ収納部１３５内にはチューブＴのプローブ部Ｐが収容されている。

よって、図２および図３に示すように、第１フランジ部１２０から第２フランジ部１３０を取り外すと、当該第２フランジ部１３０とともに、チューブＴのプローブ部ＰおよびフィッティングＦを取り外すことができる。

図３は、本実施形態に係るセルホルダの分解状態の模式図である。図３に示すように、試料セル１０は、下部ホルダ２１０のセル保持部２４１と、上部ホルダ１１０における第１フランジ部１２０のセル保持部１２２との間に保持されている。上述したように、第２フランジ部１３０の第２ボス部１３１に形成された流路１３３の内径はφ１．０ｍｍ～φ１．５ｍｍであるが、第２ボス部１３１は第２フランジ部１３０と一体形成されているので、図３の分解状態では存在しない（図２参照）。

よって、第１フランジ部１２０の凹部１２５を介して、試料セル１０の流路１２の内面をブラッシング洗浄することができる。試料セル１０をセルホルダ１００から取り外さずに、流路１２の内面をブラッシング洗浄することができるので、光学系を再度調整し直す必要がない。

〔洗浄実験〕
本実施形態の作用効果を確認すべく、洗浄実験を実施した。図４は、本実施形態において、試料セルの流路内面の洗浄前後の状態の説明図である。図４に示すように、本実施形態に係るセルホルダに試料セルを保持したまま図３の状態で、洗浄前と洗浄後の検出器出力（ｍＶ）を検出器配置角度（θ）ごとに測定した。３０度未満の低配置角度では検出器出力の若干の低下が観られたが、配置角度が３０度を超えると検出器出力は洗浄前後で一致しており、高い洗浄効果を確認することができた。このように、セルホルダに試料セルを保持した状態で洗浄状態の確認実験を行うことができる。

以上、説明したように、本実施形態に係るセルホルダ１００によれば、試料セルを取り外すことなく、試料セルの流路内面を良好かつ効率よく洗浄することができる。

また、当該セルホルダ１００を備えた光散乱検出装置１によれば、試料セル１０の流路１２に付着物が生じてバックグラウンド信号が増加した場合に、上記ホルダ１１０においてチューブＴを保持する第２フランジ部１３０を取り外すだけで、流路１２の内面をブラッシング洗浄することが可能となる。試料セル１０の内部は、気密性が担保されている。したがって、溶媒の封入状態でブラッシング洗浄することが可能となり、付着物を除去してバックグラウンド信号を低下させることができる。

洗浄時、試料セル１０を保持するセルホルダ１００は架台１５０、２５０に固定されているため、試料セル１０の位置が変動することはなく、光学系の調整し直しは不要である。また、光学系の調整が不要であるため、背景光を確認することで洗浄効果を確認することができる。さらに、洗浄時に、洗浄効果が高まる界面活性剤等の溶液を試料セル１０の流路１２に封入することにより、効率的に洗浄することができる。

上記の実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。実施形態が備える各要素並びにその配置、材料、条件、形状及びサイズ等は、例示したものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。また、異なる実施形態で示した構成同士を部分的に置換し又は組み合わせることが可能である。

１…光散乱検出装置
１０…試料セル
１２…流路
２０…光源
５０…結像光学系
７０…検出器
１００…セルホルダ
１１０…上部ホルダ
１２０…第１フランジ部
１２１…第１ボス部
１３０…第２フランジ部
１３５…チューブ収納凹部
１４０…二重フランジ構造
２１０…下部ホルダ
Ｔ…チューブ
Ｐ…プローブ部
ＰＫ…パッキン

Claims (5)

1. 液体試料中の微粒子を検出するための光散乱検出装置であって、
   液体試料を保持する試料セルと、
   前記試料セルにコヒーレント光を照射する光源と、
   前記試料セルからの光を検出する検出器と、
   前記試料セルの両端部を保持する一対のホルダのうち、少なくとも一方のホルダは二重フランジ構造を有し、
   前記二重フランジ構造は、
   前記試料セルを受ける第１フランジ部と、
   前記試料セルに接続されるチューブを保持し、前記第１フランジ部に対し着脱可能に設けられた第２フランジ部と、
   を備える、光散乱検出装置。
2. 前記試料セルは鉛直方向に沿って配置され、前記一対のホルダのうち、上部ホルダが前記二重フランジ構造に形成されている、請求項１に記載の光散乱検出装置。
3. 前記第１フランジ部は、その下部に封止部材を介して、前記試料セルを保持するボス部を有すると共に、その上部に前記第２フランジ部に保持された前記チューブを収容するチューブ収納凹部を有し、
   前記第２フランジ部は、前記第１フランジ部上に着脱可能に接続される、請求項１または請求項２に記載の光散乱検出装置。
4. 前記第２フランジ部は、前記チューブのプローブ部を収容するためのチューブ収納凹部を有する、請求項３に記載の光散乱検出装置。
5. 前記試料セルと前記検出器との間に配置され、前記試料セルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を集光する結像光学系をさらに備える、請求項１から４のいずれか１項に記載の光散乱検出装置。

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