JP6985402B2 - ヒアルロン酸塩フィルムの製造方法及びこれにより製造されたヒアルロン酸塩フィルム - Google Patents

Description

本発明は、ヒアルロン酸塩フィルムの製造方法及びこれにより製造されたヒアルロン酸塩フィルムに関し、より詳細には、溶媒キャスティング（Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｃａｓｔｉｎｇ）または大量生産が容易な自動塗布機によるヒアルロン酸塩フィルムの製造方法、これにより製造されて化粧品用マスクパック、医薬品及び医療機器用パッチ、フィルム型癒着防止剤などとして活用可能なヒアルロン酸塩フィルムに関する。

ヒアルロン酸塩（Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）は、真皮層に存在するムコ多糖類であって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）とＤ−グルクロン酸（Ｄ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）がβ−１，４グルコシド結合で構成された二糖類がヒアルロン酸塩鎖を形成するためにβ−１，３グルコシド結合で連結されている生体高分子物質である。
ヒアルロン酸塩は、白色の粉末であるが、水に溶ければ透明の液体となり、分子内に多くの水酸基（−ＯＨ）により高い水分保持力を有し、分子量が０．５〜３．０ＭＤａ程度と非常に大きいため、高い粘弾性を示す。
また、ヒアルロン酸塩は、人体の結合組織、上皮および神経組織などに均一に分布しており、さまざまな生理活性を有する生体適合性材料として皮膚の再生、保湿、弾力維持、及びシワ改善についての効果が証明されることにより、最近、これを含有する抗老化関連化粧品、食品、医薬品、医療機器用フィラー等への需要が急激に増加している。
水分が最小化されたヒアルロン酸塩粉末製品は、分子内鎖が非常に剛直に連結されて微生物または外部環境の変化に対してより少なく敏感であって安定性に優れるものの、ヒアルロン酸塩粉末内の水分含有量が増加すると、分子内鎖が柔軟になって微生物汚染と分子量低下による物性変化などが促進されて安定性が急激に低下する。
現在市販されているヒアルロン酸塩完成品は、ほとんどが液状の形態であって過量の水を含有しており、微生物汚染の懸念により製品化の際に無菌設備で製造するか、或いは安全性の面で懸念される防腐剤を必ず使用しなければならないので、汎用性と安全性の観点から産業用途への拡大が難しいという問題点がある。
特に、ヒアルロン酸塩を主原料とする関節注射剤やフィラーなどの場合は、製品内のヒアルロン酸塩の含有量が１〜３％程度の微量であり、９７〜９９％程度の水を含み、体内への投入時に速く分解されて頻繁な投与が求められる。また、これらの製品の場合は、粘性が非常に大きいため、注射剤の形で皮膚内に注入する際、高圧力により患者に苦痛を与え、施術部位のアザなどを誘発するという欠点がある。
米国登録特許第６，６３０，１６７号は、ヒアルロン酸塩と毒性架橋剤を用いたゲルタイプの癒着防止剤を開示しており、韓国公開特許第２００９−００１２４３９号は、ヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロース複合体フィルムの表面に架橋活性化剤及び架橋活性補助剤を反応させて誘導体化した、Ｎ−アシル尿素ペンダント形態と自動架橋結合形態とが混在したヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロース複合体誘導体フィルム及びその製造方法を開示している。しかし、これらの特許は、ゲル製造後に毒性の架橋剤などを完全に除去していないので、これによる副作用の懸念があった。
上述したように、様々な生理活性を有するヒアルロン酸塩への需要は増加しているが、未だヒアルロン酸塩フィルムについての研究は全くない状況である。
そこで、本発明者らは、様々な用途に活用可能なヒアルロン酸塩フィルムを製造するために鋭意検討した結果、自動塗布機キャスティングまたは溶媒キャスティング方法を用いた場合にヒアルロン酸塩フィルムを製造することができることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明は、生体適合性と抗老化機能を有するため様々な分野で活用されているヒアルロン酸塩フィルムの製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ヒアルロン酸塩を高濃度で含有し、表面が均一なヒアルロン酸塩フィルム及びこれを大量に生産する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、微生物に対する抵抗性と優れた機械的物性を有するヒアルロン酸塩フィルム及びこれを含むマスクパック、パッチ、医療機器用人工皮膚および癒着防止剤を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ヒアルロン酸塩を溶媒で溶解させてヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、（ｂ）ヒアルロン酸塩溶液を溶媒キャスティングまたは自動塗布機キャスティング方法で乾燥させるステップとを含むことを特徴とするヒアルロン酸塩フィルムの製造方法を提供する。
本発明において、前記溶媒キャスティングは、（ａ）ヒアルロン酸塩を溶媒で溶解させて０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、（ｂ）前記製造されたヒアルロン酸塩溶液を型枠に注入し、相対湿度３０〜７０％、乾燥温度３０〜５０℃の条件で乾燥させるステップとを含むことを特徴とする。
本発明において、前記自動塗布機キャスティングは、（ａ）ヒアルロン酸塩を溶媒で溶解させて０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、（ｂ）前記製造されたヒアルロン酸塩溶液を自動塗布機に注入し、０．０２５〜５ｍｍの厚さでフィルムをキャスティングするステップと、（ｃ）キャスティングされたフィルムを３０〜５０℃の条件で乾燥させるステップとを含むことを特徴とする。
また、本発明は、分子量０．１〜２．５ＭＤａのヒアルロン酸塩で製造され、１５〜３２０Ｍｐａの引張強さ及び３〜６８％の伸び率を有することを特徴とするヒアルロン酸塩フィルムを提供する。

本発明のヒアルロン酸塩フィルムの製造方法は、大量生産が容易であり、ヒアルロン酸塩の粘度およびフィルムの厚さ調節によって物性を容易に調節することができる。

ヒアルロン酸塩の濃度に応じて溶媒キャスティング方法で製造されたヒアルロン酸塩フィルムの写真である。 乾燥方法によって溶媒キャスティング方法で製造されたヒアルロン酸塩フィルムの写真である。 通常の自動塗布機の説明図である。 ヒアルロン酸塩の粘度に応じて自動塗布機キャスティング方法で製造されたヒアルロン酸塩フィルムの写真である。 アプリケータの厚さに応じて自動塗布機キャスティング方法で製造されたヒアルロン酸塩フィルムの写真である。

本発明では、水またはエタノール水溶液でヒアルロン酸塩を溶解させた後、特定の恒温恒湿条件で乾燥させる溶媒キャスティング法を用いる場合に、生産、保管、流通及び使用段階で微生物により容易に汚染される既存の液状のヒアルロン酸塩製品の問題点を解決することができるヒアルロン酸塩フィルムを製造することができることを確認しようとした。
本発明の実施形態では、ヒアルロン酸塩の分子量、濃度および乾燥方法をさまざまな条件にしてフィルムを製造し、これらの製品化のための機械的強度及び微生物に対する安定性を評価した。
その結果、分子量０．１〜２．５ＭＤａのヒアルロン酸塩０．１〜３０重量％溶液を３０〜７０％の相対湿度および３０〜５０℃の温度条件で乾燥させた場合、表面が滑らかであり且つ機械的強度及び微生物に対する安定性にも優れるフィルムを製造することができることを確認することができた。また、製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、一般的なハサミやナイフで所望の形状に容易に成形することができるほどに機械的物性に優れ、作業室内の水分に対する安定性にも優れることを確認することができた。

また、本発明では、ヒアルロン酸塩溶液を自動塗布機に注入し乾燥させる場合に、様々な厚さのヒアルロン酸塩フィルムを均一かつ大量に製造することができ、ヒアルロン酸塩溶液の粘度と厚さの調節によって物性の調節が可能であることを確認しようとした。
本発明では、水またはエタノール水溶液でヒアルロン酸塩を溶解させて０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液を製造した後、自動塗布機に注入させ、様々な厚さにキャスティングした後、３０〜５０℃の条件で乾燥させてヒアルロンロン酸塩フィルムを製造した。その結果、０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液（３００〜１００，０００ｃＰｓ）を自動塗布機でキャスティングした後、３０〜５０℃の温度条件で乾燥させると、表面が均一なヒアルロン酸塩フィルムを大量に製造することができることを確認することができた。また、製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、機械的物性に優れるため、一般的なハサミ、ナイフおよび一般的な成形モールドを用いて所望の形状に容易に成形することが可能であることをも確認することができた。

本発明は、一態様において、（ａ）ヒアルロン酸塩を溶媒で溶解させてヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、（ｂ）ヒアルロン酸塩溶液を溶媒キャスティングまたは自動塗布機キャスティング方法で乾燥させるステップとを含むことを特徴とするヒアルロン酸塩フィルムの製造方法に関する。
本発明において、前記溶媒キャスティングは、（ａ）ヒアルロン酸塩を溶媒で溶解させて０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、（ｂ）前記製造されたヒアルロン酸塩溶液を型枠に注入し、相対湿度３０〜７０％、乾燥温度３０〜５０℃の条件で乾燥させるステップとを含むことを特徴とする。
本発明において、ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸に塩が結合しているものであって、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸カリウムなどを例示することができるが、これに限定されるものではない。
前記ヒアルロン酸塩は、分子量によって皮膚透過、吸収、機械的物性が異なりうるので、分子量０．１〜２．５ＭＤａのものを使用することが好ましい。ヒアルロン酸塩は、分子量が０．１ＭＤａ未満の場合にはフィルム形成が難しく、分子量が２．５ＭＤａを超える場合には高粘性であってフィルムの表面が不均一であるという問題がある。

前記溶媒は、ヒアルロン酸塩を溶解させるためのものであって、１００％の水またはエタノール水溶液を使用することができ、エタノール水溶液は、エタノールの含有量が０．０１〜２９体積％であることが好ましい。水を単独で用いてヒアルロン酸塩を溶解させる場合には、微生物汚染防止のために多くの注意が必要であるが、エタノール水溶液でヒアルロン酸塩を溶解させる場合には、エタノールの含有量が増加することにより、微生物汚染防止効果に優れ、フィルム形成時間を短縮させることができるという効果がある。しかし、エタノールの含有量が３０体積％以上である場合には、ヒアルロン酸塩の分子量が増加することにより、フィルムが不透明になるか或いはフィルムが形成されないという問題点がある。

本発明の溶媒キャスティング方法において、前記ヒアルロン酸塩溶液の濃度は０．１〜３０重量％であることが好ましい。前記ヒアルロン酸塩溶液の濃度が０．１重量％未満の場合には、フィルム成形が困難となり、前記ヒアルロン酸塩溶液の濃度が３０重量％を超える場合には、高粘性によりフィルムの表面が不均一になるおそれがある。
本発明では、ヒアルロン酸塩フィルムを製造するためのヒアルロン酸塩溶液を型枠に注入し、相対湿度３０〜７０％、乾燥温度３０〜５０℃の条件で６〜１２時間乾燥させるステップを行う。
前記型枠は、ヒアルロン酸塩溶液を収容することができるものであれば、特別な制限なく使用が可能であり、アクリル、ガラスまたはＳＵＳ素材のモールドを例示することができる。
本発明の溶媒キャスティング方法において、乾燥は、前記相対湿度及び乾燥温度条件を満足させることができれば制限なく行うことができるが、恒温恒湿機で行うことが好ましい。相対湿度または乾燥温度条件が上記の範囲を外れる場合には、フィルムが形成されないか、或いは不均一な表面のフィルムが形成されるおそれがある。
前記乾燥時間は、ヒアルロン酸塩溶液の濃度及び型枠の大きさに応じて上記の範囲内で適切に調節することができる。
本発明において、「溶媒キャスティング」という用語は、フィルムの製造時に広く使用される方法で有機物を溶媒に完全に溶かした後、溶媒を揮発させて有機物を固める方法を意味する。

前記溶媒キャスティング法で製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、引張強さおよび伸び率に優れることを特徴とする。例えば、ヒアルロン酸塩の分子量が０．１〜２．５ＭＤａである場合、引張強さが約３０〜３２０．０Ｍｐａであり、伸び率は約１２〜６８％であって、従来の液状のヒアルロン酸塩製品とは異なり、微生物汚染がなく、管理及び使用が容易であるため、さまざまな用途に利用可能である。
本発明によって製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、５〜２０重量％の水分を含有することを特徴とする。前記水分の含有量が５重量％未満である場合には、表面が硬化して破損し、使い勝手が悪く、前記水分の含有量が２０重量％を超える場合には、フィルムの形態を維持することができないという問題点がある。
また、本発明によって製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、厚さが０．０２５〜５ｍｍであり、表面が均一で色が透明であることを特徴とする。ヒアルロン酸塩フィルムは、厚さに応じてその用途を異にすることができるが、ヒアルロン酸塩以外の他の成分が含有される場合には、厚さ０．０２５〜５ｍｍのフィルムを製造することができない。しかし、本発明のヒアルロン酸塩フィルムは、水分を除いた成分中のヒアルロン酸塩の含有量が１０〜１００重量％なので、０．０２５〜５ｍｍの厚さを有することができる。

前記ヒアルロン酸塩フィルムは、化粧品用マスクパック、パッチ、医療機器用癒着防止剤などとして活用可能である。
癒着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）は、通常、炎症の治癒過程で見られるもので、肉芽組織または瘢痕（ｓｃａｒ）を形成するときに互いに絡み付いたり、多量に析出される線維素が凝り固まったりすることを意味する。一般に、開腹手術後に６７〜９３％程度の頻度で癒着が発生し、このうちの一部は自発的に分解されることもあるが、ほとんどの場合は傷の治癒後にも癒着が存在して各種の後遺症を誘発するので、手術後の傷口を覆いかぶせるか、或いは薬物学的作用などにより周囲組織との癒着の発生を物理的、化学的に遮断するために癒着防止剤を使用する。
一方、本発明において、前記自動塗布機キャスティングは、（ａ）ヒアルロン酸塩を溶媒で溶解させて０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、（ｂ）前記製造されたヒアルロン酸塩溶液を自動塗布機に注入し、０．０２５〜５ｍｍの厚さにフィルムをキャスティングするステップと、（ｃ）キャスティングされたフィルムを３０〜５０℃の条件で乾燥させるステップとを含むことを特徴とする。

本発明において、ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸に塩が結合しているものであって、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸カリウムなどを例示することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の自動塗布機キャスティング方法において、ヒアルロン酸塩の分子量は、特に制限なく使用することができるが、０．１〜２．５ＭＤａであることが好ましい。また、前記ヒアルロン酸塩溶液のヒアルロン酸塩の含有量は０．１〜３０重量％であることを特徴とする。すなわち、前記ヒアルロン酸塩溶液の濃度が０．１重量％未満の場合には、フィルム成形の困難さがあり、前記ヒアルロン酸塩溶液の濃度が３０重量％を超える場合には、高い粘度のため、フィルムの表面が不規則になるおそれがある。ちなみに、上記範囲のヒアルロン酸塩溶液の粘度は３００〜１００，０００ｃＰｓに該当する。低分子量のヒアルロン酸の場合には高濃度で溶解させて前記基準粘度を合わせなければならず、高分子量のヒアルロン酸の場合には低濃度で溶解させて前記基準粘度を合わせてこそ均一なフィルムを製造することができる。
ヒアルロン酸塩を溶解させるための溶媒の種類及び使用量は、先に説明したのと同様である。

前記キャスティングステップは５〜２０ｍｍ／ｓの速度で一定に行うことが好ましい。
本発明において、自動塗布機は、一般フィルムの製造時に広く使用される機器であって、図３に示すように、本体とフィルムの厚さを調節するアプリケータ及び厚さ調節ダイヤルを含む。
本発明において、ヒアルロン酸塩フィルムの厚さは０．０２５〜５ｍｍであることが好ましい。ヒアルロン酸塩フィルムの厚さが０．０２５ｍｍ未満の場合には、フィルム形成が難しく、ヒアルロン酸塩フィルムの厚さが５ｍｍを超える場合には、フィルムの厚さが厚くなるにつれて流動性が大きくなり、表面にシワが発生し、乾燥に長時間がかかるという欠点がある。
本発明において、キャスティングされたフィルムの乾燥は、３０〜５０℃の条件で６〜２４時間行うことが好ましい。前記乾燥は、３０〜５０℃で行われる限り、特別な制限なく様々な乾燥方法で行うことができる。
ちなみに、溶媒キャスティング方法でヒアルロン酸塩フィルムを乾燥させる場合には、恒温恒湿乾燥条件ではフィルムが形成されるが、循環乾燥条件ではフィルムが形成されないという問題点がある。
前記乾燥時間は、ヒアルロン酸塩溶液の濃度及び自動塗布機内のアプリケータの調節によって上記の範囲内で適切に調節することができる。
前記自動塗布機キャスティング法で製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、分子量０．１〜２．５ＭＤａのヒアルロン酸塩で製造され、３０〜３２０Ｍｐａの引張強さ、１２〜６８％の伸び率を有することを特徴とし、ヒアルロン酸塩フィルムの物性は、ヒアルロン酸塩溶液の粘度及び厚さに応じて調節が可能である。

本発明によって製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、５〜２０重量％の水分を含有することを特徴とする。前記水分の含有量が５重量％未満である場合には、表面が硬化して破損し、使い勝手が悪く、前記水分の含有量が２０重量％を超える場合には、フィルムの形態を維持することができないという問題点がある。
前記ヒアルロン酸塩フィルムは、化粧品用マスクパック、パッチ、医療機器用人工皮膚、癒着防止剤などとして活用可能である。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎない。本発明の範囲がこれらの実施例に限定されると解釈されないことは、当業分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例１：溶媒キャスティングを用いたヒアルロン酸塩フィルムの製造
１−１：分子量の変化によるフィルム形成能の確認
ヒアルロン酸塩の分子量によるフィルム形成能を確認するために、分子量０．１ＭＤａ、０．８ＭＤａ、１．２ＭＤａ、２．５ＭＤａの合計４種のヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸塩（Ｈｉ−Ａｑｕａ^ＴＭ）、（株）ジヌバイオ）を２０体積％のエタノール水溶液に０．５〜１０．０重量％の濃度で溶解させた後、それぞれをアクリルモールドに注入し、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０％、温度４０℃）で６〜２４時間乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造した。
その結果、分子量が０．８、１．２、２．５ＭＤａの場合には、０．５％以上の濃度でフィルムがよく形成されたが、分子量が０．１ＭＤａの場合には、５％以上の濃度で溶解してこそフィルムがよく形成されることを確認することができた。
製造されたヒアルロン酸塩フィルムの水分含有量を水分含有量測定器で測定した結果、０．１ＭＤａのフィルムは１１重量％、０．８ＭＤａのフィルムは１３重量％、１．２ＭＤａのフィルムは１５重量％、２．５ＭＤａのフィルムは３０重量％の水分を含有していることが分かった。ＨＡ自体の優れた水分含有量により、水分含有量１０％未満のフィルムは製造が不可能であり、フィルム内の水分含有量はヒアルロン酸の分子量に応じて１０〜３０％程度であることが分かった。

１−２：溶媒の条件によるフィルム形成能の確認
溶媒の条件によるフィルム形成能を確認するために、分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウムを０〜３０体積％のエタノール水溶液に１．０重量％の濃度で溶解させた後、それぞれをアクリルモールドに注入し、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０％、温度４０℃）で１２時間乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造した。
その結果、エタノール水溶液中のエタノールの濃度が０〜２０体積％である場合には、透明なフィルムが非常によく形成されるが、これに対し、エタノールの濃度が３０体積％である場合には、ヒアルロン酸塩がよく溶解されないためフィルムがよく形成されないことを確認することができた（図１）。
また、１００％の水のみを用いてフィルムを製造する場合には、間欠的に微生物に汚染されてフィルムが不透明に形成されるが、これに対し、エタノールの含有量が５％以上の場合には、フィルム化過程で微生物汚染がほとんど発生しなかった。
エタノール水溶液中のエタノールの濃度が増加することにより、より速い時間内にフィルムが形成されることが分かった。溶媒として精製水のみを使用する場合には、約２４時間の乾燥時間が必要であるが、エタノール水溶液を使用する場合には、１２時間以内にフィルム形成が可能であることを確認することができた。

１−３：乾燥条件によるフィルム形成能の確認
乾燥条件によるフィルム形成能を確認するために、分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウムを２０体積％のエタノール水溶液に１．０重量％の濃度で溶解させ、それぞれをアクリルモールドに注入した後、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０〜９０％と温度３０〜６０℃）で１２時間以上乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造した。
その結果、相対湿度８０％以上では２４時間以上乾燥させてもフィルムが形成されておらず、温度が３０℃から４０℃に高くなるほどより速い時間（１２時間から２４時間）内にフィルムが形成されることが分かった。
ヒアルロン酸塩は、５０℃以上の温度で長時間放置したときに分子量が減少して機械的物性が低下するおそれがあるので、５０℃以下で乾燥させることが好ましい。

比較例１：循環乾燥機を用いたフィルム形成能の確認
恒温恒湿乾燥機の代わりに循環乾燥機（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ）を用いて４０℃で１２時間以上一般乾燥させた以外は、実施例１−３と同様にしてヒアルロン酸塩フィルムを製造した。製造されたフィルムの形態を確認した結果、表面にシワができ、一部の気泡が含有されたフィルムが形成されたことを確認することができた。
比較例２：真空乾燥機を用いたフィルム形成能の確認
恒温恒湿乾燥機の代わりに真空乾燥機（〜０．０５ｍｂａｒ）を用いて４０℃で１２時間以上乾燥させた以外は、実施例１−３と同様にしてヒアルロン酸塩フィルムを製造した。製造されたフィルムの形態を確認した結果、表面にシワができ、両端の捲れたフィルムが形成されたことを確認することができた。

実験例１：ヒアルロン酸塩フィルムの機械的物性の測定
分子量０．８ＭＤａ、１．２ＭＤａ及び２．５ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸塩（Ｈｉ−Ａｑｕａ^ＴＭ）、（株）ジヌバイオ）を２０体積％のエタノール水溶液に１．０重量％の濃度で、分子量０．１ＭＤａのヒアルロン酸を５重量％の濃度でそれぞれ溶解させ、それぞれをアクリルモールドに注入した後、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０％、温度４０℃）で１２時間乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造した。
製造されたヒアルロン酸塩フィルムの機械的物性を測定するために、ＴＡ−ＸＴ２ｉ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＫ）を用いて製造されたフィルムを３ｃｍ×５ｃｍに切り、引張グリップ（Ｔｅｎｓｉｌｅ ｇｒｉｐｓ）部分に装着した後、引張強さ及び伸び率を測定し、その結果を表１に示した。

表１から分かるように、分子量０．１ＭＤａのヒアルロン酸塩フィルムの引張強さは１５．１Ｍｐａであり、伸び率は３％であり、分子量０．８ＭＤａのヒアルロン酸塩フィルムの引張強さは１１１．１Ｍｐａであり、伸び率は３５％であり、分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸塩フィルムの引張強さは１５１．５Ｍｐａであり、伸び率は４５．５％であり、分子量２．５ＭＤａのヒアルロン酸塩フィルムの引張強さは３００．０Ｍｐａであり、伸び率は６５．０％であった。すなわち、製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、機械的物性に優れ、分子量が増加するにつれて引張強さ及び伸び率が増加することが分かった。

実験例２：ヒアルロン酸塩フィルムの微生物に対する安定性の測定
総菌数は、検体中に存在する細菌のうち、標準寒天培地内で発育することができる菌の数をいう。ヒアルロン酸塩フィルムの微生物に対する汚染安定性を評価するために、検体と標準寒天培地をペトリ皿に混合凝固させ、培養した後に発生した細菌の集落数から検体中の生菌数を算出した。
（１）試液及び試薬の準備
−標準寒天培地（Ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔ ａｇａｒ）
Ｔｒｙｐｔｏｎｅ５．０ｇ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ：２．５ｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ１．０ｇおよびＡｇａｒ１５．０ｇに蒸留水を加えて１，０００ｍＬに作り、ｐＨ７．０±０．２に調整した後、１２１℃で１５分間滅菌した。
−滅菌生理食塩水
０．９％塩化ナトリウム水溶液で１２１℃にて１５分間滅菌して使用した。
（２）試験方法
実験例１で製造された分子量１．２ＭＤａを用いたヒアルロン酸塩固体フィルムと分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸塩を一般精製水に１％体積で溶解させた液状製品をそれぞれ一般実験室に１５日間暴露させた。
次に、ヒアルロン酸塩フィルムと、ヒアルロン酸塩液０．５ｇをそれぞれ滅菌生理食塩水５０ｍＬに溶解させた後、４３〜４５℃の滅菌された標準寒天培地２５０ｍＬに投入し、振とうして混合した。
培地が固まる前にペトリ皿に混合液を注ぎ、冷却凝固させた後、３５±１℃で２４〜４８時間培養した。培養後、生成された集落（コロニー）の数を測定し、これを０．５ｇに分けて総菌数を測定した後、その結果を表２に示した。

表２から分かるように、１５日間空気暴露後、１％ヒアルロン酸塩溶液の場合には、微生物は１，５００〜５，０００ｃｆｕ程度であるが、ヒアルロン酸塩フィルムの場合には、微生物は０〜８ｃｆｕ程度であって暴露前とほぼ変化がない。

実施例２：自動塗布機キャスティングを用いたヒアルロン酸塩フィルムの製造
２−１：分子量の変化によるフィルム形成能の確認
ヒアルロン酸塩の分子量によるフィルム形成能を確認するために、分子量０．１ＭＤａ、０．８ＭＤａ、１．２ＭＤａ、１．５ＭＤａ及び２．５ＭＤａの合計５種のヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｉ−Ａｑｕａ^ＴＭ）（（株）ジヌバイオ）を２０体積％のエタノール水溶液に０．１〜３０重量％の濃度で溶解させた後、３００ｃＰｓ未満（低粘度）、３００〜１００，０００ｃＰｓ（最適粘度）および１００，０００ｃＰｓ超過（高粘度）で製造した後、自動塗布機（ＣＯＡＤ４１１、義王機械、韓国）のアプリケータを調節して厚さ０．０２５〜５ｍｍのフィルムをキャスティングし、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０％、温度４０℃）で６〜２４時間乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造し、粘度によるフィルムの状態を図４に示した。
自動塗布機を用いたフィルムの製造のためのヒアルロン酸塩の粘度は、次の条件の下で測定した。
測定機器Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶ−ＩＩ粘度計（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｎｏ．７、１２ｒｐｍ、２５℃）
図４に示すように、ヒアルロン酸塩の分子量に関係なく、ヒアルロン酸塩溶液の粘度値が３００ｃＰｓ未満（低粘度）である場合には、フィルムが形成されておらず、３００〜１００，０００ｃＰｓ（最適粘度）である場合には、自動塗布機によって表面が均一なフィルムの製造が可能であったが、１００，０００ｃＰｓ超過（高粘度）である場合には、表面が互いに凝集して不均一な外形を持つためフィルムが形成されないことを確認することができた。

２−２：乾燥条件によるフィルム形成能の確認
乾燥条件によるフィルム形成能を確認するために、分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウムを１０体積％のエタノール水溶液に２．０重量％の濃度で溶解させた後、自動塗布機内のアプリケータでフィルムの厚さを０．１ｍｍに調節してキャスティングし、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０〜９０％と温度３０〜６０℃）と循環乾燥機（温度３０〜６０℃）で６〜２４時間乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造し、乾燥条件によるフィルムの状態を確認した。
その結果、自動塗布機によって製造されたヒアルロン酸塩フィルムは、恒温恒湿乾燥機だけでなく、循環乾燥機においてもフィルムの表面が非常に均一によく形成されることが確認することができた。
また、循環乾燥機を用いる場合には、恒温恒湿乾燥機でより乾燥時間が１２時間以上短縮され、より迅速にヒアルロン酸塩フィルムを生産することができることを確認することができた。

比較例３：ヒアルロン酸塩溶液の粘度によるフィルム形成能の確認
ヒアルロン酸塩溶液の粘度によるフィルムキャスティングによるフィルム形成能を確認するために、分子量０．１〜２．５ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｉ−Ａｑｕａ^ＴＭ）（（株）ジヌバイオ）を１０体積％のエタノール水溶液に０．１〜３０重量％の濃度で溶解させた後、自動塗布機のアプリケータでフィルムの厚さを０．１ｍｍに調節してキャスティングし、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０％と温度５０℃）で２４時間以上乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造し、粘度によるフィルムの状態を確認した。
その結果、ヒアルロン酸塩の分子量に関係なく、ヒアルロン酸塩溶液の粘度値が３００ｃＰｓ未満（低粘度）の場合には、フィルム形成が不可能であり、ヒアルロン酸塩溶液の粘度値が１００，０００ｃＰｓを超える（高粘度）場合には、過度な粘性により、表面が均一なフィルム形成が不可能であるが、最適粘度での乾燥時に表面が均一なフィルムが形成されることを確認することができた。

比較例４：フィルムの厚さによるフィルム形成能の確認
自動塗布機のアプリケータの厚さ調節によるヒアルロン酸塩のフィルム形成能を確認するために、分子量１．２ＭＤａのヒアルロン酸ナトリウムを１０体積％のエタノール水溶液に２．０重量％の濃度で溶解させた後、フィルムアプリケータでフィルムの厚さを０．０２４〜５．００１ｍｍに調節してキャスティングし、恒温恒湿乾燥機（相対湿度５０％と温度５０℃）で２４時間以上乾燥させてヒアルロン酸塩フィルムを製造し、乾燥条件によるフィルムの状態を確認した。
図５に示すように、フィルムの厚さが０．０２５ｍｍ未満の場合には、フィルムの表面に凹凸があって活用が困難であり、フィルムの厚さが５ｍｍを超える場合には、成形が不可能な状態にキャスティングされ、成形がなされてもフィルムの表面が均一ではなく、乾燥時間も長くかかってフィルムの製造に適さないことを確認することができた。

実験例３：ヒアルロン酸塩フィルムの機械的物性の測定
実施例２−１で製造されたヒアルロン酸塩フィルムの機械的物性を測定するために、ＴＡ−ＸＴ２ｉ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＫ）を用いて製造されたフィルム（厚さ：１ｍｍ）を３ｃｍ×５ｃｍに切り、引張グリップ（Ｔｅｎｓｉｌｅ ｇｒｉｐｓ）部分に装着した後、引張強さ及び伸び率を測定し、その結果を表３に示した。

ヒアルロン酸塩フィルムの機械的物性測定結果、機械的物性は、ヒアルロン酸塩の濃度またはヒアルロン酸の溶液の粘度には影響されず、分子量に影響されるということが分かった。
表３より、ヒアルロン酸塩の分子量が高くなるほど、引張強さが３０から３２１ＭＰａに増加し、伸び率は１２％から６８％に増加したことが分かった。

実験例４：ヒアルロン酸塩フィルムの水分含有量の測定
実施例２−１で製造されたヒアルロン酸塩フィルムの水分含有量を測定するために、製造されたフィルム（厚さ：１ｍｍ）の水分含有量を水分測定器で測定し、その結果を表４に示した。

表４に示すように、製造されたヒアルロン酸塩フィルムの水分含有量を水分含有量測定器で測定した結果、１２〜３０重量％であることを確認することができた。実施例１−３の溶媒キャスティングによるフィルムと同様に、ＨＡ自体の優れた水分含有量により、水分含有量１０％未満のフィルムは製造が不可能であり、フィルム内の水分含有量はヒアルロン酸の分子量に応じて１０〜３０重量％程度になることが分かった。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したので、当業分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるというべきである。

本発明のヒアルロン酸塩フィルムは、従来の液状の製品とは異なり、表面が乾燥しているフィルムなので、微生物汚染の心配が全くなく、生産／管理／流通／使用が容易であるだけでなく、機械的物性にも優れて化粧品、医薬品、医療機器用パック、パッチ、人工皮膚などの様々な用途に適用可能である。

Claims (3)

1. （ａ）分子量０．１〜２．５ＭＤａのヒアルロン酸塩を０．０１〜２９体積％のエタノール水溶液で溶解させて０．１〜３０重量％のヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、
   （ｂ）前記製造されたヒアルロン酸塩溶液を型枠に注入し、相対湿度３０〜７０％、乾燥温度３０〜５０℃の条件の恒温恒湿機で乾燥させるステップとを含む、溶媒キャスティングによるヒアルロン酸塩フィルムの製造方法。
2. （ａ）分子量０．１〜２．５ＭＤａのヒアルロン酸塩を０．０１〜２９体積％のエタノール水溶液で溶解させて、粘度が３００ｃＰｓ以上１６００ｃＰｓ未満であり、ヒアルロン酸塩を０．１〜３０重量％含有するヒアルロン酸塩溶液を製造するステップと、
   （ｂ）前記製造されたヒアルロ ン酸塩溶液を自動塗布機に注入し、０．０２５〜５ｍｍの厚さにフィルムをキャスティングするステップと、
   （ｃ）キャスティングされたフィルムを３０〜５０℃の条件で乾燥させるステップとを含む、自動塗布機を用いたヒアルロン酸塩フィルムの製造方法。
3. 得られたヒアルロン酸塩フィルムが、３〜６８％の伸び率及び微生物汚染防止能を有する請求項１又は２に記載のヒアルロン酸塩フィルムの製造方法。

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