JP6982231B2 - 細胞の集合構造体の作製装置 - Google Patents

Description

本発明は細胞の集合構造体の作製装置に関し、詳しくは培養液を収容した培養容器の内部に細胞凝集塊を整列させ、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置に関する。

損傷を受けた生体機能を幹細胞などを用いて修復する再生医療においては、複数の細胞を凝集して複数の細胞凝集塊を作製し、これら複数の細胞凝集塊を融合させて細胞の集合構造体を作製して、生体機能の欠損部などの修復に使用している。
このような細胞の集合構造体を得るため、培養液を収容した培養容器の内部に細胞凝集塊の拡散を規制する規制枠部を設け、この枠内に複数の細胞凝集塊を投入して培養することにより細胞の集合構造体として作製する方法が知られている（特許文献１）。

特開２０１６−２９号公報

ここで、上記細胞凝集塊を構成する細胞の培養には培養液が必要であるが、特許文献１のように細胞凝集塊を規制枠部に収納させた場合、全ての細胞凝集塊に十分な培養液が行き渡りにくく、特に集合構造体の中央部分においては、培養液の流動性が低下するため培養不良が発生しやすく、細胞凝集塊同士の融合が行われずに所要の形状を有した集合構造体が得られないという問題があった。
このような問題に監み、本発明は全ての細胞凝集塊に十分な培養液を行き渡らせるようにして、より確実に細胞培養塊を培養して相互に融合させることが可能な細胞の集合構造体の作製装置を提供するものである。

すなわち請求項１の発明にかかる細胞の集合構造体の作製装置は、培養液を収容した培養容器の内部に細胞凝集塊を整列させ、当該培養容器内の複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に立設させた複数の棒状部材を備え、当該複数の棒状部材の間に上記細胞凝集塊を保持することにより、上記複数の細胞凝集塊を個々に所定の整列位置に保持する保持手段と、複数の培養液流出口を備えて上記各整列位置の細胞凝集塊に向けて培養液を流出させる培養液供給手段を設け、
上記複数の棒状部材により細胞凝集塊を下方に隙間を形成して保持し、培養中に上記培養液流出口から上記各整列位置の細胞凝集塊における隣接する細胞凝集塊との接触部分に対して培養液を流出させるようにしたことを特徴としている。
また請求項２の発明にかかる細胞の集合構造体の作製装置は、培養液を収容した培養容器の内部に細胞凝集塊を整列させ、当該培養容器内の複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に立設させた複数の棒状部材を備え、当該複数の棒状部材に上記細胞凝集塊を突き刺して保持することにより、上記複数の細胞凝集塊を個々に所定の整列位置に保持する保持手段と、複数の培養液流出口を備えて上記各整列位置の細胞凝集塊に向けて培養液を流出させる培養液供給手段を設け、
上記複数の棒状部材により細胞凝集塊を下方に隙間を形成して保持し、培養中に上記培養液流出口から上記各整列位置の細胞凝集塊における隣接する細胞凝集塊との接触部分に対して培養液を流出させるようにしたことを特徴としている。

上記請求項１および請求項２の発明によれば、培養中に各整列位置の細胞凝集塊に対して培養液を流出させることが可能となり、培養不良により細胞の融合が不十分となることを防止することができる。

細胞の集合構造体の作製装置が設けられるアイソレータとインキュベータの外観図 細胞の集合構造体の作製装置の構成図 収容容器および吸引ノズルについての断面図 第１実施例における培養容器内の細胞凝集塊の保持手段を説明する図 第１実施例における培養容器内の細胞凝集塊の保持状態を示す平面図 第１実施例における棒状部材の断面図 第２実施例における培養容器内の細胞凝集塊の保持手段を説明する図 第３実施例における培養容器内の細胞凝集塊の保持手段を説明する図 第４実施例における培養容器内の細胞凝集塊の保持手段を説明する図

以下、図示実施例について説明すると、図１〜図６は第１実施例にかかる細胞の集合構造体の作製装置１を説明するものであって、複数の細胞凝集塊２（スフェロイド：図３参照）を培養容器３の内部に整列させ、上記細胞凝集塊２が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体としての癒合パッド４（図４（ｂ）参照）を作製するものとなっている。
上記細胞凝集塊２は、例えば特許第４５１７１２５号に開示される方法で作製することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで凝集して細胞凝集塊２が形成され、これらがさらに融合することで外径寸法が１００〜５００μｍ程度の略球状の細胞凝集塊２が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル（略半球状の収容部）で培養することにより容易に細胞凝集塊２を得ることができる。なお、細胞凝集塊２の作製方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞凝集塊２とは略球状の細胞集合体を指し、これらの細胞凝集塊２を平面的または立体的に接触または接近させて配置すると、各細胞凝集塊２を構成する細胞が隣接する細胞凝集塊２と融合し、平面的または立体的な細胞の集合構造体が得られるようになっている。
本実施例で作製する癒合パッド４は、軟骨等に癒合させるために用いることができ、複数の細胞凝集塊２を平面的に配置して融合させたものとなっている。厚さは用いる細胞凝集塊２の寸法に応じて１００μｍ〜１ｍｍ程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞凝集塊２の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記癒合パッド４は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。

本実施例の細胞の集合構造体の作製装置１は、図１に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ５と、当該アイソレータ５に接続可能に設けられたインキュベータ６との内部に設けられている。また、アイソレータ５には、搬入物を除染するためのパスボックス５ａが設けられている。
図２は上記アイソレータ５の内部の構成を示し、細胞凝集塊２を収容する収容容器７を支持する収容容器支持部８と、上記培養容器３を支持する培養容器支持部９と、上記細胞凝集塊２を収容容器７から培養容器３へと移送する細胞凝集塊移送手段１０とが備えられている。
一方、図４（ａ）は上記インキュベータ６の内部の構成を示し、培養容器３の細胞凝集塊２もしくは癒合パッド４に培養液を供給する培養液供給手段１１が備えられている。
なお、以下の説明において、図２における図示左右方向をＸ方向、前後方向をＹ方向、上下方向をＺ方向とし、図５では図示左右方向をＸ方向、上下方向をＹ方向とする。

上記アイソレータ５は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ５の正面には作業者が装着可能なグローブ５ｂが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ５の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、これらの作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ６は、内部が無菌環境に維持されるとともに、癒合パッド４の培養に適した所定の温度、湿度ならびにガス濃度に維持され、細胞凝集塊２が融合して癒合パッド４へと形成される間、上記インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、当該アイソレータ５より離れた場所に載置することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ５とインキュベータ６とは接続手段１２によって接続されており、例えば特許第４６５６４８５号公報に記載されるような、インキュベータ６とアイソレータ５とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段１２を使用することができる。

図３は上記収容容器７の断面図を示し、上述したウエルプレートを使用することができる。収容容器７は平面視において縦横に複数の収容凹部７ａを備え、各収容凹部７ａの内部には培養液とともに略球状の細胞凝集塊２が一個ずつ収容されている。
上記収容容器７の収容凹部７ａは、平面視におけるＸ方向およびＹ方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器３において作製する癒合パッド４を構成する細胞凝集塊２のＸ方向およびＹ方向の個数と同数、すなわちＸ方向に５個、Ｙ方向に５個それぞれ設けられている。

図４に示すように、培養容器３は有底箱状を有しており、内部には所定の深さで培養液Ｆが収容され、当該培養容器３の内部には複数の細胞凝集塊２を個々に所定の整列位置に保持する保持手段２０が設けられている。
上記保持手段２０は、培養容器３の底面に設置された台座２１と、当該台座２１に立設された複数の棒状部材２２と、上記棒状部材２２に沿って上下に移動する支持プレート２３とから構成され、これらは全て培養容器に収容された培養液Ｆ中に水没させて設けられている。
上記棒状部材２２は上記台座２１の上面にそれぞれＺ方向を向くように規則的に立設され、図５に示すようにＸ方向およびＹ方向にそれぞれ５個の細胞凝集塊２を平面的に整列させるようになっている。
具体的には、上記棒状部材２２は各細胞凝集塊２の周囲に位置するように設けられており、４本の棒状部材２２が四隅に位置する略正方形の保持部Ｈを構成するようになっている。これにより、複数の細胞凝集塊２を個々に所定の整列位置に保持することができるようになっている。
当該保持部Ｈを構成する４本の棒状部材２２のうち、各対角位置の２本の棒状部材２２の間隔は、保持する細胞凝集塊２の直径よりも短くなるように配置され、換言すると、使用する細胞凝集塊２の直径が各対角位置の２本の棒状部材２２の間隔よりも大きくなるよう、当該細胞凝集塊２の培養が行われるようになっている。
このような構成により、４本の棒状部材２２の間に細胞凝集塊２を挿入すると、当該４本の棒状部材２２の間で細胞凝集塊２を挟み込んで保持することができ、図４に示すように上記保持部Ｈを上記棒状部材２２の先端と根元との間の上下中間部分に設定することが可能となっている。

上記支持プレート２３は上記台座２１上に載置されるとともに、上記台座２１を挟んで対向した位置に設けられた２本の棒状のガイド部材２４に沿って上下に移動可能に設けられ、かつ支持プレート２３には上記棒状部材２２が貫通する貫通孔２３ａが穿設されている。
上述した様に、上記棒状部材２２における上記細胞凝集塊２を保持する保持部Ｈは上記棒状部材２２の上下中間部分に設定されているため、図４（ａ）に示す支持プレート２３を下降位置に位置させた場合には、上記保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２と支持プレート２３の表面との間には隙間ｇが形成されるようになっている。
一方、図４（ｂ）に示すように、支持プレート２３を上昇させて位置を固定することで、支持プレート２３は支持部材として上記保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２を下方から支持することができ、さらに上記支持プレート２３を上昇させることで、培養された癒合パッド４を上記棒状部材２２から離脱させることができる。

次に、図２を用いて上記細胞凝集塊移送手段１０について説明すると、上記細胞凝集塊２を吸着保持する吸引ノズル３１と、当該吸引ノズル３１を移動させるノズル移動手段３２と、上記収容容器支持部８を構成するＹ方向テーブル８ａと、上記培養容器３を支持する培養容器支持部９を構成するＹ方向テーブル９ａとから構成されている。

上記吸引ノズル３１は、図３に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部３１ａと、当該本体部３１ａの下端部に設けられた管状の吸着部３１ｂとを備えている。
上記吸着部３１ｂの内径は上記細胞凝集塊２より小径となっており、当該吸着部３１ｂの先端に細胞凝集塊２を吸着保持した際に、細胞凝集塊２が当該吸着部３１ｂの内部に吸い込まれないようになっている。
そして上記ノズル移動手段３２は、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９にかけてＸ方向に設けられたＸ方向レール３３と、当該Ｘ方向レール３３に沿って吸引ノズル３１をＸ方向に移動させるＸ方向移動手段３４と、当該Ｘ方向移動手段３４に設けられてＺ方向に吸引ノズル３１を昇降させるＺ方向移動手段３５とによって構成されている。

また本実施例の吸引ノズル３１はＸ方向に５個整列して設けられ、これら吸引ノズル３１は間隔変更手段３６によってＸ方向にその間隔が変更されるようになっている。
具体的には、図２（ａ）に示すように、上記吸引ノズル３１が収容容器支持部８の上方に位置した際には、間隔変更手段３６は上記収容容器７におけるＸ方向に整列した収容凹部７ａと同じ間隔に上記吸引ノズル３１の間隔を変更する。
一方、図２（ｂ）に示すように、吸引ノズル３１が培養容器支持部９の上方に位置した際には、間隔変更手段３６は上記培養容器３の内部でＸ方向に整列した棒状部材２２と棒状部材２２とによって形成された保持部Ｈと同じ間隔に吸引ノズル３１の間隔を変更する。

上記収容容器７を支持する収容容器支持部８と、上記培養容器３を支持する上記培養容器支持部９とは、それぞれ上記細胞凝集塊移送手段１０を構成するＹ方向テーブル８ａおよびＹ方向テーブル９ａによって構成され、それぞれ収容容器７および上記培養容器３をＹ方向に移動させるようになっている。
上記吸引ノズル３１はＸ方向に５個設けられており、またノズル移動手段３２によってＸ方向およびＺ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Ｙ方向テーブル８ａ、９ａが収容容器７および培養容器３をＹ方向に移動させることで、吸引ノズル３１を収容容器７および培養容器３に対してＸＹＺの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に吸引ノズル３１と収容容器７との移動を説明すると、最初に上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７の１列目の収容凹部７ａを吸引ノズル３１の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部７ａから吸引ノズル３１が細胞凝集塊２を吸着保持すると、Ｙ方向テーブル８ａが１列分だけＹ方向に収容容器７を移動させて、２列目の収容凹部７ａを吸引ノズル３１の下方に位置させるようになっている。
なお、吸引ノズル３１と培養容器３との移動については、吸引ノズル３１と収容容器７との移動と同様となるため説明を省略する。

そして、上記Ｘ方向レール３３にはＸ方向に移動するカメラ３７が設けられており、上記カメラ３７は上記吸引ノズル３１によって細胞凝集塊２が保持部Ｈに保持されると、培養容器支持部９の上方まで移動して培養容器３内の保持部Ｈを撮影するようになっている。
撮影された画像により、上記全ての保持部Ｈに細胞凝集塊２が保持されているか否かが確認され、必要に応じて細胞凝集塊２の保持されていない保持部Ｈに対して細胞凝集塊２を供給するよう、指示することができる。
またカメラ３７は、上記ノズル移動手段３２が吸引ノズル３１を培養容器支持部９の上方に位置させる際には、吸引ノズル３１との接触を避けるために培養容器支持部９の上方から退避するようになっている。

次に、図４に示すインキュベータ６の内部に設けられた上記培養液供給手段１１について説明すると、インキュベータ６の内部には送液ポンプ４１および当該送液ポンプ４１に接続された配管４２が設けられている。
そして、本実施例の培養容器３に設けられた上記台座２１および棒状部材２２は上記培養液供給手段１１を構成しており、上記培養容器３が上記アイソレータ５からインキュベータ６内に移送されると、上記配管４２の一端が上記台座２１に接続されるようになっている。
上記台座２１には培養液Ｆが流通可能な中空部２１ａが形成され、また当該台座２１に立設された上記棒状部材２２は、図６に示すように中空の管状部材となっており、内部には培養液Ｆを流通させる培養液通路４３が形成され、側面には上記培養液通路４３に連通する複数の培養液流出口４３ａが形成されている。
上記培養液流出口４３ａは、上記保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２の高さに合わせて、当該細胞凝集塊２が保持される高さと、細胞凝集塊２の上方および下方に隣接した位置にそれぞれ開口するように設けられている。
また上記培養液流出口４３ａは、上記棒状部材２２から図５のＸ方向およびＹ方向の四方に向けて培養液Ｆを流出させるように設けられており、これにより、各培養液流出口４３ａの前方側に位置する隣接した各整列位置の細胞凝集塊２、具体的には細胞凝集塊２と細胞凝集塊２との接触部分に向けて培養液Ｆが流出されるようになっている。
ここで、上記棒状部材２２としてはステンレス等の金属を採用することができ、中空の管状部材としてはステンレス製丸パイプなどの細管の一端を閉鎖し、外周面に培養液流出口４３ａを開口させることで形成することができる。

上記構成を有する培養液供給手段１１によれば、培養容器３がインキュベータ６内に移動されると、上記配管４２の一端が上記台座２１に接続され、他端が培養容器３における培養液Ｆの液中に挿入されるようになっている。
そして上記送液ポンプ４１を作動させると、上記配管４２の他端より培養容器３内の培養液Ｆが吸引され、その後当該培養液Ｆは配管４２の一端より上記台座２１の中空部２１ａに供給されることとなる。
そして、培養液Ｆは上記台座２１の中空部２１ａから、当該台座２１に立設された上記棒状部材２２の培養液通路４３を流通した後、上記培養液流出口４３ａより培養容器３に収容された培養液Ｆ中に流出されるようになっている。

ここで、上記培養容器３内で複数の細胞凝集塊２を接触して集合させた状態では、細胞凝集塊２を構成する細胞への培養液Ｆの供給が不十分となり、細胞の培養が進まずに細胞凝集塊２同士の融合が行われず、結果として所要の癒合パッド４が得られない場合がある。
これは、特に集合した細胞凝集塊２のうち、中央部分に位置した細胞凝集塊２おいて多くみられ、培養完了後に当該中央部分の細胞凝集塊２だけが脱落してしまう現象が発生する。
すなわち、上記中央部分に位置する細胞凝集塊２の近傍においては培養液Ｆの流通が滞っているためであり、本発明では各整列位置の細胞凝集塊２に向けて培養液流出口４３ａを配置し、当該培養液流出口４３ａから培養液Ｆを流出させるようになっている。
その結果、各細胞凝集塊２の近傍で培養液Ｆを流動させることが可能となり、全ての細胞凝集塊２が十分な量の培養液Ｆに接触できるようにすることで、上記中央部分の細胞凝集塊２も確実に培養するものである。
上記第１実施例では、上記棒状部材２２の内部に培養液通路４３を形成するとともに、当該棒状部材２２の側面に培養液流出口４３ａを設けることで、上記保持部Ｈに収容された細胞凝集塊２のそれぞれに対して培養液Ｆが流出されるようにし、全ての細胞凝集塊２の近傍で培養液Ｆを流動させて、細胞凝集塊２を構成する細胞の培養を促進するようになっている。

以下、上記構成を有する細胞の集合構造体の作製装置１を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。
最初に、図２（ａ）示すように、上記パスボックス５ａを介して上記細胞凝集塊２が収容された収容容器７や培養容器３を上記アイソレータ５内に搬入する準備工程を行う。このとき培養容器３には所定量の培養液Ｆを収容し、支持プレート２３は下降位置に位置させておく。
上記準備工程が完了したら、続いて上記細胞凝集塊移送手段１０により上記収容容器７から培養容器３へと細胞凝集塊２を移動させる供給工程を行う。
具体的には、上記ノズル移動手段３２が吸引ノズル３１を移動させ、また間隔変更手段３６が吸引ノズル３１の間隔を変更して、上記収容容器支持部８に載置された収容容器７の収容凹部７ａから細胞凝集塊２を吸着保持する。
続いて、ノズル移動手段３２が吸引ノズル３１を培養容器支持部９へと移動させ、また間隔変更手段３６が上記保持部Ｈの間隔に合わせて吸引ノズル３１の間隔を変更し、吸引ノズル３１を下降させる（図２（ｂ））。
これにより、吸引ノズル３１に保持された各細胞凝集塊２は上記保持部Ｈを構成する４本の棒状部材２２の間に挿入され、上記棒状部材２２の上下中間位置に設定された保持部Ｈの高さで保持されることとなる。
上記供給工程により、培養容器３の内部で複数の細胞凝集塊２が縦横に規則正しい整列位置で整列することとなり、また隣接する細胞凝集塊２同士が接触した状態で保持されることとなる。
そして全ての保持部Ｈに細胞凝集塊２が保持されると、その後上記カメラ３７が培養容器支持部９の上方に移動して培養容器３内の細胞凝集塊２を撮影し、細胞凝集塊２が全ての保持部Ｈに保持されていることを確認する。

このようにして供給工程が終了すると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養容器３はインキュベータ６に移送され、当該培養容器３内の細胞凝集塊２を培養する培養工程が行われる。
まず上記培養容器３をインキュベータ６に移送したら、作業者は上記培養液供給手段１１を構成する配管４２の一端を台座２１に接続するとともに、他端を培養液Ｆの液中に位置させる。
その後、インキュベータ６を閉鎖して上記アイソレータ５より分離し、さらにインキュベータ６をアイソレータ５より離隔した位置へと移動させ、内部を所定の温度、湿度に維持するとともに、所定の炭酸ガスや酸素の濃度を維持する。
インキュベータ６の内部では上記培養液供給手段１１の送液ポンプ４１が作動し、上記配管４２の他端より培養容器３内の培養液Ｆを吸い上げ、吸い上げた培養液Ｆを台座２１の中空部２１ａへと送液する（図４（ａ））。
これにより、上記全ての棒状部材２２の培養液通路４３に連通した上記培養液流出口４３ａからは、上記各保持部Ｈに保持されて所定の整列位置に整列した細胞凝集塊２に向けて培養液Ｆが流出され、上記各整列位置の細胞凝集塊２に対して培養液Ｆを流出させることが可能となる。
特に、整列した細胞凝集塊２の中央部分に位置する細胞凝集塊２の近傍で培養液Ｆを流動させることができるため、当該部分における細胞凝集塊２の培養を促進することができる。

このようにして培養工程を行うことにより、培養容器３内において隣接する細胞凝集塊２が相互に融合し、これにより細胞凝集塊２が平面的に配置された形状を維持した細胞の集合構造体としての癒合パッド４を得ることができる。
つまり、細胞凝集塊２を配置した通りに任意の形状の癒合パッド４を作製することが可能であり、また細胞凝集塊２は上記保持部Ｈによって隙間なく配置されているため、形成された癒合パッド４の厚さは略均一となる。
また各細胞凝集塊２は上記保持部Ｈに保持されて移動が規制されているため、形成される癒合パッド４の寸法を、はじめに細胞凝集塊２を配置した際の大きさと略同一にすることができる。
また培養工程では、培養液Ｆの交換のため数日毎にインキュベータ６をアイソレータ５に接続して、培養容器３をアイソレータ５に移動させて、培養液Ｆの交換を行う。

上記培養工程により細胞凝集塊２が培養されて癒合パッド４が作製されると、インキュベータ６をアイソレータ５に接続して培養容器３をアイソレータ５に移動し、当該癒合パッド４を培養容器３から回収する回収工程を行う。
回収工程では、図４（ｂ）に示すように上記培養容器３の内部で上記支持プレート２３をガイド部材２４に沿って上昇させ、これにより支持プレート２３は癒合パッド４を下方から支持しながら、癒合パッド４を棒状部材２２の間から離脱させることができる。
このように支持プレート２３を上昇させて癒合パッド４が棒状部材２２の間から離脱したら、当該癒合パッド４を所要の容器に移し替えて回収することができる。

図７は第２実施例における細胞凝集塊２の保持手段２０を説明する図であり、（ａ）はアイソレータ５の内部で供給工程を行う際の状態を示しており、（ｂ）はインキュベータ６の内部で培養工程を行う際の状態を示している。
本実施例の培養容器３には、上記保持手段２０として、内部に中空部２１ａが形成された台座２１と、当該台座２１に立設されて内部に培養液通路４３の形成された複数の棒状部材２２と、上記棒状部材２２およびガイド部材２４に沿って上下に移動する支持プレート２３と、整列した細胞凝集塊２の上部に載置される押さえプレート２５とが設けられる。

本実施例において、上記細胞凝集塊２は上記第１実施例と同様の配列で保持部Ｈに収容されて培養されるが、本実施例では上記支持プレート２３が所要の高さに固定されており、細胞凝集塊２は当該支持プレート２３の上面に載置されるようになっている。
図７（ｂ）に示すように、本実施例の棒状部材２２の先端部は上記所要の高さに固定された支持プレート２３の上面に突出するようになっており、その際当該棒状部材２２の先端部は整列した細胞凝集塊２の最大径部よりも下方に位置するようになっている。
これにより、本実施例の保持部Ｈは、第１実施例のように４本の棒状部材２２によって細胞凝集塊２を挟持するようにはなっておらず、上記支持プレート２３によって下方から支持しながら４本の棒状部材２２によって細胞凝集塊２の移動を阻止するようになっている。
ここで、本実施例の支持プレート２３の上面に細胞非接着性のコーティングを形成したり、支持プレート２３を低接着性素材によって製造することで、上記細胞凝集塊２がある程度培養されて密着していても、当該細胞凝集塊２を容易に離脱させることが可能となっている。

そして本実施例の棒状部材２２は、ステンレス製丸パイプ等の細管で構成され、内部に培養液通路４３を備えるとともに、上端部に培養液流出口４３ａを備えており、上記台座２１の中空部２１ａから培養液通路４３へと流通した培養液Ｆは、上記培養液流出口４３ａから上方に向けて流出されるようになっている。
上述した様に、図７（ｂ）のように支持プレート２３を上昇位置に位置させた状態では、上記棒状部材２２の先端は細胞凝集塊２の最大径部の下方に位置するようになっている。
これにより、各培養液流出口４３ａは各整列位置の４個の細胞凝集塊２の中央に形成された隙間の下方に位置するようになっている。従って各培養液流出口４３ａからは周囲に位置した４個の細胞凝集塊２に対して培養液Ｆを流出させるとともに、培養液Ｆの流通が滞りやすい上記隙間にも培養液Ｆを流通させることが可能となっている。

上記押さえプレート２５は、上記支持プレート２３と同様、上記ガイド部材２４に沿ってＺ方向に昇降可能に設けられており、必要に応じて上記保持部Ｈに整列された細胞凝集塊２の上方に載置されるようになっている。
このように支持プレート２３と押さえプレート２５とによって細胞凝集塊２を挟むことで、培養容器３をアイソレータ５からインキュベータ６へと移動させる際や、細胞凝集塊２同士が融合していない状態における細胞凝集塊２の移動を阻止するものとなっている。
また押さえプレート２５には、上下に貫通する貫通孔２５ａが棒状部材２２の位置に対応させて設けられており、当該貫通孔２５ａを介して培養液Ｆを押さえプレート２５の上下に流通させることが可能となっている。
さらに、押さえプレート２５は、上記支持プレート２３と同様、細胞凝集塊２と接触する裏面側に細胞非接着性のコーティングが形成されるか、または低接着性素材により製造されており、上記細胞凝集塊２がある程度培養されて密着していても、当該押さえプレート２５を容易に離脱させることが可能となっている。
また、これら支持プレート２３および押さえプレート２５を、多孔質素材やメッシュ部材から構成して、培養液Ｆが通過できるように構成してもよい。

上記第２実施例における、細胞凝集塊２の保持手段２０を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。なお、第１実施例と共通する工程については説明を省略する。
まずアイソレータ５内における準備工程では、第１実施例の場合と同様、図２（ａ）に示すように、培養容器３内において上記支持プレート２３は下降位置に位置させておく。
続いて供給工程において、吸引ノズル３１に保持された各細胞凝集塊２を、培養容器３の内部の保持部Ｈを構成する４本の棒状部材２２の間に挿入するが、本実施例においては、供給時の各細胞凝集塊２の大きさは４本の棒状部材２２の対角位置の２本の棒状部材２２の間隔より小さく、細胞凝集塊２は棒状部材２２の間で保持されることなく支持プレート２３の表面に載置される（図７（ａ））。
続いて、吸引ノズル３１を上方に退避させたら、押さえプレート２５の各貫通孔２５ａにそれぞれ棒状部材２２を貫通させながら、当該押さえプレート２５をガイド部材２４に沿って下降させ、支持プレート２３に載置された細胞凝集塊２の上に載置する。
そして、上記細胞凝集塊２を支持プレート２３と押さえプレート２５で挟んだ状態で棒状部材２２に沿って上昇させて、図７（ｂ）に示すように、支持プレート２３から突出する棒状部材２２の先端部が、各細胞凝集塊２の最大径部であり隣接する細胞培養塊２との接触部分よりも下方に位置する状態とし、その状態で支持プレート２３を下降しないように固定する。
これにより、支持プレート２３と４本の棒状部材２２の先端部により保持部Ｈが形成され、細胞凝集塊２が保持部Ｈに保持された状態となる。なお、これらの操作は、人手によりもしくは図示しない自動化装置により行うことができる。

このようにして培養容器３内に細胞凝集塊２が整列されると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養容器３はインキュベータ６に移送され、図７（ｂ）の状態を維持したまま培養工程が行われる。
本実施例においても、作業者が上記培養液供給手段１１を構成する配管４２の一端を台座２１に接続するとともに、他端を培養液Ｆの液面近くに位置させ、その後上記送液ポンプ４１を作動させる。
これにより上記送液ポンプ４１によって培養容器３内の培養液Ｆが吸い上げられるとともに、吸い上げられた培養液Ｆは台座２１の中空部２１ａおよび上記棒状部材２２の培養液通路４３を介して上記培養液流出口４３ａから上方に流出される。
上記棒状部材２２の培養液流出口４３ａは細胞凝集塊２の最大径部の下方、かつ４個の細胞凝集塊２による隙間の下方に位置することから、上記培養液流出口４３ａから流出された培養液Ｆは上記隙間を流通することとなり、培養液Ｆの滞りやすい中央部分に培養液Ｆを流通させて、当該部分における細胞の培養を促進することができる。

このようにして培養容器３内において細胞凝集塊２が培養され、隣接する細胞凝集塊２が相互に融合すると、回収工程に移行し、押さえプレート２５を取り除いて、形成された癒合パッド４を回収することができる。
また、ある程度隣接する細胞凝集塊２が融合し、棒状部材２２の先端部によって下方から支持されるようになったら、支持プレート２３を下降位置に移動させるようにしてもよい。これにより、第１実施例と同様支持プレート２３との間に隙間ｇが形成され、当該部分への培養液Ｆの供給が行われることとなる。
なお本実施例では、保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２の最大径部の下方に棒状部材２２の先端が位置しているため、作製途中の癒合パッド４には棒状部材２２による貫通孔が形成されないこととなる。
また本実施例の供給工程において、上記細胞凝集塊２ごと支持プレート２３を上昇させる際に、各細胞凝集塊２の最大径部が棒状部材２２の先端部を超えないような高さで支持プレート２３を固定するようにしてもよい。この場合には、培養に伴って細胞凝集塊２が第１実施例と同様に複数の棒状部材２２の間に保持されることとなる。

図８は第３実施例における細胞凝集塊２の保持手段２０を説明する図であり、インキュベータ６の内部で培養工程を行う際の状態を示している。
本実施例の培養容器３には、内部に中空部２１ａが形成された台座２１と、当該台座２１に立設された複数の棒状部材２２と、上記棒状部材２２およびガイド部材２４に沿って上下に移動する支持プレート２３が設けられている。
台座２１に立設された複数の棒状部材２２は、第１実施例の場合と同様に配置されて細胞凝集塊２を保持する保持部Ｈを形成しており、細胞凝集塊２と支持プレート２３との間には隙間ｇが形成されている。
本実施例の棒状部材２２には、第１実施例や第２実施例の場合のように内部に培養液通路４３は形成されておらず、その代わりに台座２１の上面に形成した開口に流出ノズル６１が設けられている。
上記流出ノズル６１は台座２１の上面に立設された複数の棒状部材２２の間に設けられており、上端に形成された培養液流出口６１ａが上方の各棒状部材２２の間に向けて設けられている。これにより、上記棒状部材２２の間の保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２に向けて、下方から培養液Ｆを流出させることができるようになっている。
ここで、上記流出ノズル６１を２本の棒状部材２２の間に設けた場合、培養液流出口６１ａの上方で隣接した各整列位置に整列した２個の細胞凝集塊２に対して、これらの隣接箇所に向けて培養液Ｆを流出させ、他方流出ノズル６１を４本の棒状部材２２の中央部に設けた場合、培養液流出口６１ａの上方に位置する１個の細胞凝集塊２に対して培養液Ｆを流出させるようになっている。
さらに、上記支持プレート２３には、上記棒状部材２２が貫通する貫通孔２３ａと、上記流出ノズル６１が挿入される流出孔２３ｂとが形成されており、上記流出ノズル６１から流出された培養液Ｆは、上記流出孔２３ｂを通過して上方に吹き出されるようになっている。
なお、流出ノズル６１は流出孔２３ｂを貫通して、支持プレート２３の上方に突出させるようにしてもよく、また流出ノズル６１を設けずに、上記台座２１の上面に各棒状部材２２の間に向けて開口を形成し、これを培養液流出口６１ａとしてもよく、この培養液流出口６１ａから流出された培養液Ｆが上記支持プレート２３の流出口２３ｂを通過するようにしてもよい。

上記第３実施例における、細胞の集合構造体の作製装置１を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。なお、第１実施例と共通する工程については説明を省略する。
まずアイソレータ５内における準備工程では、第１実施例の場合と同様に、図２（ａ）に示すように培養容器３内において上記支持プレート２３は下降位置に位置させておく。
続く供給工程についても第１実施例と同様であり、保持部Ｈを構成する４本の棒状部材２２の間に細胞凝集塊２を挿入させ、棒状部材２２の上下中間位置に設定した保持部Ｈに保持させる。
また培養工程についても第１実施例と同様であり、インキュベータ６内で上記培養液供給手段１１により培養容器３内で培養液Ｆを流動させて培養を行うが、本実施例の場合は、下方の流出ノズル６１の培養液流出口６１ａから上方の複数の棒状部材２２の間に向けて培養液Ｆを流出させるようになっており、これにより各培養液流出口６１ａに対応する上方の保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２に向けて、培養液Ｆを流出させるようになっている。
そして、所定期間の培養が終わると、第１実施例の場合と同様の回収工程により、形成された癒合パッド４を回収することができる。

図９は第４実施例における細胞凝集塊２の保持手段２０を説明する図であり、インキュベータ６の内部で培養工程を行う際の状態を示している。
本実施例の培養容器３の台座２１には、上記第１〜３実施例のような中空部２１ａは形成されておらず、また本実施例の棒状部材２２は、上記第３実施例の場合と同様に内部に培養液通路４３は形成されておらず、先端が鋭く尖っており細胞凝集塊２を突き刺して保持するようになっている。
具体的には、複数本の棒状部材２２が所定の配置で台座２１の上面に立設され、各棒状部材２２に細胞凝集塊２を突き刺すことで、当該棒状部材２２の上下中央部分を上記保持部Ｈとして、細胞凝集塊２を整列させることが可能となっており、この状態で細胞凝集塊２培養を行うようになっている。
なお、このように複数本の棒状部材２２に細胞凝集塊２を突き刺した状態で保持し培養する手法は、特許第５８９６１０４号において公知であり、ここでは詳細な説明を省略する。

そして本実施例における培養液供給手段１１は、上記第１〜第３実施例と異なり、各整列位置の細胞凝集塊２に対して上方から培養液Ｆを流出させる培養液流出管５１を備えている。
上記培養液流出管５１は、上記配管４２の一端に接続されたマニホールド５０に所定の間隔で下方に向けて設けられており、先端部には複数の棒状部材２２の間に向けて設けられた培養液流出口５１ａが形成され、当該培養液流出口５１ａは培養容器３の培養液Ｆ中に位置させるようになっている。
ここで、培養液流出管５１を２本の棒状部材２２の中間部の上方に配置し、培養液流出口５１ａを２本の棒状部材の間に向けて設けた場合、培養液流出口５１ａの下方に位置する隣接する各整列位置の細胞凝集塊２を対象に、２個の細胞凝集塊２の隣接箇所に向けて培養液Ｆを流出させることとなる。
他方、培養液流出管５１を４本の棒状部材２２の中央部の上方に配置し、培養液流出口５１ａを４本の棒状部材２２で取り囲まれる範囲に向けて設けた場合、培養液流出口５１ａの下方に位置する４個の細胞凝集塊２を対象に、それら４個の細胞凝集塊２の隣接箇所に向けて培養液Ｆを流出させるようになっている。
つまり、培養液流出口５１ａは上記第１実施例と同様、２個の細胞凝集塊２の隣接箇所に向けて培養液Ｆを流出させることが可能であり、また上記第２実施例と同様、保持部Ｈによって保持された４個の細胞凝集塊２によって形成された隙間に対して培養液Ｆを流出させることが可能となっており、培養液Ｆの滞りやすい当該箇所に培養液Ｆを良好に流通させることができる。

上記第４実施例における、細胞凝集塊２の保持手段２０を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。なお、第１実施例と共通する工程については説明を省略する。
まずアイソレータ５内における準備工程では、第１実施例の場合と同様に、図２（ａ）に示すように培養容器３内において上記支持プレート２３は下降位置に位置させておく。
続く供給工程は第１〜３実施例とは異なるものであり、細胞凝集塊２を吸着した吸引ノズル３１の間隔を、間隔変更手段３６により棒状部材２２と同じ間隔に変更し、この状態で吸引ノズル３１を下降させて細胞凝集塊２に棒状部材２２を突き刺す。
その後、吸引ノズル３１の下降を継続させると、棒状部材２２が細胞凝集塊２を貫通して吸引ノズル３１の内部に挿入されるようになる。そして吸引ノズル３１を所定量だけ下降させることにより、棒状部材２２の上下中間位置に設定された保持部Ｈで細胞凝集塊２が保持された状態となる。

そして培養工程では、上記棒状部材２２の中間位置を保持部Ｈとして複数の細胞凝集塊２を整列させた状態で培養を行い、第１〜３実施例と同様、インキュベータ６内で上記培養液供給手段１１により培養容器３内で培養液Ｆを流動させて培養を行うようになっている。
本実施例では、上記培養液供給手段１１に設けた上記培養液流出管５１から培養液Ｆを流出させて、各培養液流出管５１の培養液流出口５１ａに対応する細胞凝集塊２に向けて、上方から培養液Ｆが流動するようになっている。
所定期間の培養が終わると、第１実施例の場合と同様の回収工程により、形成された癒合パッド４を回収することができる。

本発明にかかる培養液供給手段１１の構成としては、上記第１〜第４実施例に記載した構成に限定されるものではなく、例えば第１〜第３実施例の培養液供給手段１１の構成に、さらに第４実施例で示した培養液流出管５１を備えた構成を付加することも可能である。
これと同様、第１、第２、第４実施例の培養液供給手段１１の構成に、第３実施例で示した流出ノズル６１備えた培養液供給手段１１の構成を付加することも可能であり、さらには第２実施例における保持手段２０に、第３実施例や第４実施例の培養液供給手段１１の構成を採用することも可能である。
また上記第２実施例で使用する押さえプレート２５については、第１、第３、第４実施例の各培養工程において、上記第２実施例で使用する押さえプレート２５を必要に応じて常時または一時的に使用することも可能である。
ここで、押さえプレート２５と第４実施例の上記培養液流出管５１とを組み合わせる場合には、第３実施例の支持プレート２３と同様に、培養液流出管５１が挿入される流出孔を形成して、この流出孔を介して押さえプレート２５の下方の細胞凝集塊２に培養液Ｆを流出するようにし、また培養液流出管５１の先端を当該流出孔に嵌合させて、押さえプレート２５と一体化した構成とすることも可能である。
さらに上記細胞凝集塊２を保持する棒状部材２２について、第４実施例の棒状部材２２を、第１、第２実施例の場合と同様に中空の管状部材から構成し、周囲面に培養液流出口４３ａを設けたり、上端部に培養液流出口４３ａを設けるようにしてもよい。
なお、上記何れの実施例においても、上記インキュベータ６の内部に設けられた培養液供給手段１１は、送液ポンプ４１により培養容器３に収容された培養液Ｆを循環させるようにしているが、上記送液ポンプ４１により新鮮な培養液Ｆを供給する構成としてもよい。

１ 細胞の集合構造体の作製装置 ２ 細胞凝集塊
３ 培養容器 ４ 癒合パッド（細胞の集合構造体）
１１ 培養液供給手段 ２０ 保持手段
２１ 台座 ２２ 棒状部材
２３ 支持プレート ２５ 押さえプレート
４１ 送液ポンプ ４２ 配管
４３ 培養液通路 ４３ａ 培養液流出口
５１ 培養液流出管 ５１ａ 培養液流出口
６１ 流出ノズル ６１ａ 培養液流出口
Ｆ 培養液 Ｈ 保持部
ｇ 隙間

Claims (4)

1. 培養液を収容した培養容器の内部に細胞凝集塊を整列させ、当該培養容器内の複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
   上記培養容器の内部に立設させた複数の棒状部材を備え、当該複数の棒状部材の間に上記細胞凝集塊を保持することにより、上記複数の細胞凝集塊を個々に所定の整列位置に保持する保持手段と、複数の培養液流出口を備えて上記各整列位置の細胞凝集塊に向けて培養液を流出させる培養液供給手段を設け、
   上記複数の棒状部材により細胞凝集塊を下方に隙間を形成して保持し、培養中に上記培養液流出口から上記各整列位置の細胞凝集塊における隣接する細胞凝集塊との接触部分に対して培養液を流出させるようにしたことを特徴とする細胞の集合構造体の作製装置。
2. 培養液を収容した培養容器の内部に細胞凝集塊を整列させ、当該培養容器内の複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
   上記培養容器の内部に立設させた複数の棒状部材を備え、当該複数の棒状部材に上記細胞凝集塊を突き刺して保持することにより、上記複数の細胞凝集塊を個々に所定の整列位置に保持する保持手段と、複数の培養液流出口を備えて上記各整列位置の細胞凝集塊に向けて培養液を流出させる培養液供給手段を設け、
   上記複数の棒状部材により細胞凝集塊を下方に隙間を形成して保持し、培養中に上記培養液流出口から上記各整列位置の細胞凝集塊における隣接する細胞凝集塊との接触部分に対して培養液を流出させるようにしたことを特徴とする細胞の集合構造体の作製装置。
3. 上記棒状部材を中空管状に形成して内部に培養液通路を形成し、当該棒状部材に当該培養液通路に連通する上記培養液流出口を上記細胞凝集塊が保持される高さに合わせて設けたことを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の細胞の集合構造体の作製装置。
4. 上記培養液供給手段の培養液流出口を、それぞれ上記複数の棒状部材の間に向けて設けたことを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の細胞の集合構造体の作製装置。

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