JP6980206B2 - 標識タンパク質の製造方法、標識ペプチドの製造方法、及びキット - Google Patents

Description

本発明は、標識タンパク質の製造方法、標識ペプチドの製造方法、及びキットに関する。

タンパク質は、様々な機能を有するため、医薬品や診断薬及び食品加工用酵素等の様々な産業利用がなされており、特定の元素で標識した標識タンパク質は特に有用である。例えば、抗体は多種多様な分子と特異的に結合できることから、標識抗体は体内外診断や治療等の様々な用途で利用されている。具体的には、ポジトロン標識抗体は、ポジトロン断層法（以下、「ＰＥＴイメージング」という。）の有力な画像化プローブになり得る。また、ペプチドやタンパク質のＮＭＲによる解析等でも、有用なプローブとなり得る元素で標識した標識タンパク質が利用される。

抗体等のタンパク質やペプチドを標識する方法としては、例えば、放射性同位体により標識する方法が提案されている。放射性同位体によりタンパク質やペプチドを標識する方法としては、例えば、ペプチドやタンパク質にキレート化させた^６８Ｇａや^６４Ｃｕを結合させる方法が提案されている（特許文献１）。この方法では、様々なペプチドやタンパク質を^６８Ｇａや^６４Ｃｕで標識してＰＥＴイメージングに供することができるものの、キレート剤の分子が大きいことから、標識したペプチドやタンパク質の性質が天然型の性質とは異なる場合がある。特に分子量の小さいペプチドを標識する場合は、大きなキレート剤の誘導体化部分が局在や動態に与える影響が大きい。

また、マレイミド基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖及び^１８Ｆを有する標識用試薬を、ペプチドやタンパク質のシステイン残基のチオール基に作用させて^１８Ｆで標識する方法が提案されている（特許文献２）。該方法で用いる標識用試薬は、ＰＥＧ領域を有するために親水性や生体内安定性に優れるが、標識によりペプチドやタンパク質の構造が天然型から大きく変わるため、特に低分子のペプチドにおいて局在や動態への影響が大きい。また、ペプチドやタンパク質においては、それらの機能に分子内のシステイン残基が重要な役割を果たしている場合が多く、標識によってシステイン残基が修飾されると悪影響が生じやすい。

また、［^１１Ｃ］メチオニン、［^１１Ｃ］メチオニン誘導体、［^１８Ｆ］プロリン、［^１８Ｆ］フロロエチオニン、又は［^１８Ｆ］プロリン誘導体を用いて無細胞タンパク質合成系でタンパク質を合成し、^１１Ｃ又は^１８Ｆで標識した標識タンパク質を得る方法が提案されている（特許文献３、非特許文献１）。該方法は、前記のキレート剤や標識用試薬を用いる方法に比べて、標識によるペプチドやタンパク質の構造変化が小さく、それらの局在や動態に与える影響が小さい。

特開２０１４−６５７２５号公報 特表２０１２−５１９１７６号公報 特開２０１０−２６３８０９号公報

Ｍａｔｓｕｄａ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１２． ２０： ６５７９−６５８２．

しかし、^１１Ｃの半減期が２０分と短いことから、特許文献３において［^１１Ｃ］メチオニンや［^１１Ｃ］メチオニン誘導体を用いる方法は、タンパク質の合成と精製に要する時間を考慮すると実用に不向きである。これに対して、^１８Ｆは半減期が比較的長く、^１８Ｆによる標識は疾病診断や創薬研究等に有用である。しかし、［^１１Ｃ］メチオニンや［^１１Ｃ］メチオニン誘導体はタンパク質に容易に取り込まれる一方、［^１８Ｆ］プロリンや［^１８Ｆ］プロリン誘導体はタンパク質への取込効率が悪い。そのため、［^１８Ｆ］プロリンや［^１８Ｆ］プロリン誘導体を用いて充分な量の標識タンパク質を得ようとすると、過剰な合成反応が必要となり、経済面や放射線暴露量の点で不利である。

本発明は、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質や標識ペプチドを短時間に容易に製造できる標識タンパク質の製造方法及び標識ペプチドの製造方法、ＰＥＴ用試薬及びその製造方法、標識タンパク質又は標識ペプチドを高効率に製造できるキット、並びに、標識トラスツズマブ、医薬組成物及びＨＥＲ２タンパク質検出キットを提供することを目的とする。

本発明は、以下の構成を有する。
［１］無細胞タンパク質合成系で、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールと、Ｌ−セリン、又はピルビン酸及びアンモニウムイオンとから^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンを合成させ、さらに前記無細胞タンパク質合成系で前記標識トリプトファンを用いて^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質を合成する、標識タンパク質の製造方法。
［２］前記標識タンパク質が、トラスツズマブにおけるトリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識トラスツズマブである、［１］に記載の標識タンパク質の製造方法。
［３］［１］又は［２］に記載の標識タンパク質の製造方法により、トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識タンパク質からなるＰＥＴ用試薬を製造する、ＰＥＴ用試薬の製造方法。
［４］無細胞タンパク質合成系で、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールと、Ｌ−セリン、又はピルビン酸及びアンモニウムイオンとから^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンを合成させ、さらに前記無細胞タンパク質合成系で前記標識トリプトファンを用いて^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識ペプチドを合成する、標識ペプチドの製造方法。
［５］無細胞タンパク質合成系を備える、^１８Ｆ若しくは^１９Ｆで標識された標識タンパク質又は標識ペプチドを合成するためのキット。
［６］トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識タンパク質からなるＰＥＴ用試薬。
［７］トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識トラスツズマブ。
［８］［７］に記載の標識トラスツズマブを含む医薬組成物。
［９］［５］に記載のキットを含むＨＥＲ２タンパク質検出キット。

本発明によれば、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質、標識ペプチド、ＰＥＴ用試薬、標識トラスツズマブ、医薬組成物及びＨＥＲ２タンパク質検出キットを短時間に容易に製造できる。

例１〜５における標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）の量を示した図である。 例６における標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）の量を示した図である。 例７における標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）の量を示した図である。 例９における正常なモデルマウスのＰＥＴ撮像試験の撮像結果を示した図である。 例９における腫瘍モデルマウスのＰＥＴ撮像試験の撮像結果を示した図である。 例１０におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ オートラジオグラフィによる腫瘍組織切片の観察結果を示した図である。

［標識タンパク質の製造方法］
本発明の標識タンパク質の製造方法は、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質を製造する方法である。
本発明において、「タンパク質」とは、２５個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物と定義する。また、「^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質」とは、分子内に^１８Ｆ又は^１９Ｆを有するタンパク質と定義する。

本発明の標識タンパク質の製造方法においては、無細胞タンパク質合成系を用いて、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質を合成する。
「無細胞タンパク質合成系」とは、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系とを含む無細胞転写翻訳系、並びに無細胞翻訳系の両方を包含する。

無細胞タンパク質合成系には、無細胞タンパク質合成系に必要な成分を含む細胞から抽出した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液（以下、単に「細胞抽出液」という。）、あるいはタンパク質合成に必要な因子を個別に精製し混合した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を用いることができる。

細胞抽出液としては、リボソーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に関与する翻訳系に必要な成分、又は、転写系及び翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞から抽出した細胞抽出液が挙げられる。例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等からの細胞抽出液が挙げられる。
細胞抽出液の具体例としては、大腸菌Ｓ３０細胞からの細胞抽出液が挙げられる。Ｓ３０細胞抽出液は、公知の方法で調製したものを使用してもよく、市販品を使用してもよい。

細胞抽出液の調製方法としては、公知の方法を採用でき、例えば、細胞をフレンチプレスやグラスビーズにて破砕し、タンパク質成分やリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えてホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈殿させて分離する方法が挙げられる。

本発明の標識タンパク質の製造方法においては、例えば、細胞抽出液に、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドール、トリプトファン以外の１９種のアミノ酸、エネルギー源、目的の標識タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸等を添加する。これにより、無細胞タンパク質合成系の反応液内では、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、標識インドールとＬ−セリンから、側鎖のインドール環が^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンが合成される。また、無細胞タンパク質合成系でさらに該標識トリプトファンを用いたタンパク質合成が進行し、標識トリプトファンが取り込まれることで、トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質が得られる。

本発明の標識タンパク質の製造方法では、ピルビン酸及びアンモニウムイオンを細胞抽出液に添加してもよい。無細胞タンパク質合成系では、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、標識インドールとピルビン酸とアンモニウムイオンからでも、側鎖のインドール環が^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンが合成される（Nakazawa, H. Enei, H. Okamura, S. Yamada, H. Agr. Biol. Chem. 1972. 36: 2523-2528 及び Watanabe, T. Snell, E. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972. 69: 1086-1090）。例えば、塩化アンモニウムを添加することにより、反応液にアンモニウムイオンが添加される。

反応液中の細胞抽出液の含有量は、反応液の総質量に対して、１０〜４０体積％が好ましい。

^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールとしては、４位、５位又は６位の水素原子が^１８Ｆ又は^１９Ｆに置換されたインドールが好ましく、５位の水素原子が^１８Ｆ又は^１９Ｆに置換された５−フルオロインドールがさらに好ましい。標識インドールとしては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
標識インドールは、公知の方法により製造することができる。例えば、無保護のインドールボロン酸をＫ^１８Ｆで処理することにより、５位の水素原子が^１８Ｆに置換された標識インドールが得られる。

反応液中の標識インドールの含有量は、反応液の総量に対して、０．００１〜２０ｍＭが好ましく、０．０１〜３．０ｍＭがより好ましく、０．０４〜１．５ｍＭがさらに好ましい。標識インドールの含有量が前記範囲の下限値以上であれば、標識タンパク質が合成されやすい。標識インドールの含有量が前記範囲の上限値以下であれば、標識タンパク質がより高収量で合成できる。

本発明における無細胞タンパク質合成系では、標識インドールと、Ｌ−セリン、又はピルビン酸及びアンモニウムイオンとを原料とする標識トリプトファンの合成にトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼが利用される。無細胞タンパク質合成系の細胞抽出液には、通常はトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼが含まれているため、必ずしもトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼを添加する必要はない。ただし、標識トリプトファンの合成効率を高め、標識タンパク質をより高効率に製造する目的で、反応液にトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼをさらに添加してもよい。

反応液へのトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼの添加量は、反応液の総量に対して、０，００１〜１．０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．０５〜０．４ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼの添加量が前記範囲内であれば、添加前と比較し、標識タンパク質をより高収量で合成できる。

トリプトファン以外のアミノ酸は、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のうちのトリプトファン以外の１９種類である。具体的には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミンが挙げられる。
なお、本発明においては、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、Ｌ−トリプトファンを用いてもよい。

反応液中におけるトリプトファン及びＬ−セリン以外の１８種類の各々のアミノ酸の含有量は、０．０１〜２０ｍＭが好ましく、１．０〜５．０ｍＭがより好ましい。各々のアミノ酸の含有量が前記範囲の下限値以上であれば、標識トリプトファンが組み込まれたタンパク質が合成される。各々のアミノ酸の含有量が前記範囲の上限値以下であれば、標識トリプトファンが組み込まれたタンパク質がより高収量で合成できる。

Ｌ−セリンは標識トリプトファンの合成に使用されるため、反応液中のＬ−セリンは他のアミノ酸に比べて多いことが好ましい。
反応液中のＬ−セリンの含有量は、０．００１〜２０ｍＭが好ましく、０．０１〜５．０ｍＭがより好ましい。Ｌ−セリンの含有量が前記範囲の下限値以上であれば、標識タンパク質を高効率に製造しやすい。Ｌ−セリンの含有量が前記範囲の上限値以下であれば、標識タンパク質をより高効率に製造しやすい。

エネルギー源は、生体内でエネルギー源として利用される物質であれば特に限定されず、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、クレアチンホスフェート、ホスホエノールピルビン酸等の高エネルギーリン酸結合を有する物質が好ましい。エネルギー源としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
反応液中のエネルギー源の含有量は、細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成する標識タンパク質の種類等によって適宜設定することができる。

目的のアミノ酸配列をコードする核酸としては、目的のアミノ酸配列をコードし、転写及び翻訳され得る適切な配列のＤＮＡ、又は、目的のアミノ酸配列をコードし、翻訳され得る適切な配列のＲＮＡを使用できる。本発明では、目的の標識タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを無細胞転写翻訳系に加えて標識タンパク質を合成してもよく、目的の標識タンパク質のアミノ酸配列をコードするＲＮＡを無細胞翻訳系に加えて標識タンパク質を合成してもよい。
例えば、トラスツズマブのアミノ酸配列をコードする核酸を用いることで、トラスツズマブにおけるトリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識トラスツズマブを製造することができる。

反応液中の核酸の含有量は、細胞抽出液のタンパク質合成活性、合成する標識タンパク質の種類等によって適宜設定でき、例えば、０．５〜１０μｇ／ｍＬ程度とすることができる。

反応液には、必要に応じて、ＡＴＰ再生に関与する酵素（例えば、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ、又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせ）、各種のＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ等）、タンパク質が三次元構造を形成するのを助ける働きを持つシャペロンタンパク質類（例えば、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ及びＨＳＰ７０等）を添加してもよい。

また、反応液には、必要に応じて、非タンパク質性成分を補強することができる。非タンパク質性成分は、もともと細胞抽出液中に含まれている成分であるが、別途添加することでタンパク質合成能を向上させることができる成分であり、例えばｔＲＮＡが挙げられる。

さらに、反応液には、必要に応じて、タンパク質やＲＮＡの保護及び／又は安定化のための各種の添加剤を含有させてもよい。添加剤としては、例えば、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）阻害剤（ＲＮａｓｅインヒビター等）、還元剤（ジチオトレイトール等）；ＲＮＡ安定化剤（スペルミジン等）、プロテアーゼ阻害剤（フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等）、塩類（酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム等）、抗菌剤（アジ化ナトリウム、アンピシリン等）等が挙げられる。
反応液中の添加剤の含有量は、使用する細胞抽出液のタンパク質合成活性、目的の標識タンパク質の種類等に応じて適宜設定すればよい。

本発明における標識タンパク質の合成は、従来公知のバッチ法を用いてもよく、透析法を用いてもよい。
バッチ法を用いる場合、例えば、細胞抽出液に、目的の標識タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドール、トリプトファン以外の１９種のアミノ酸を含むアミノ酸組成物、ピルビン酸及びアンモニウムイオン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、緩衝液、塩類、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤の他、必要によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）、ｔＲＮＡ等を加えて反応液とする。

反応条件は、使用する細胞抽出液、合成する標識タンパク質等によって適宜設定すればよい。
反応温度は、バッチ法、透析法の両方で２０〜４０℃が好ましく、２３〜３７℃がより好ましい。
反応時間は、バッチ法の場合、９０分以内が好ましく、５〜９０分がより好ましい。透析法の場合、１〜２４時間が好ましく、５〜１６時間がより好ましい。

透析法を用いて標識タンパク質を製造する場合、反応液を透析内液とし、反応液の５〜１０倍容量の透析外液に対して透析を行い、生成した標識タンパク質を透析内液から回収する。透析は、撹拌しつつ行うことが好ましい。また、透析は、目的の標識タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を定期的に反応液に補給しつつ行ってもよい。透析は、透析膜で内液と外液とを隔てた状態で、振とう又は撹拌（回転撹拌等）が可能な透析装置を用いることで実施できる。

透析外液としては、例えば、透析内液の組成から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、核酸、ＲＮＡポリメラーゼ、ピルビン酸キナーゼあるいはクレアチンキナーゼ等を除いたものを使用できる。具体的には、例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、塩類、アミノ酸等を含む液を透析外液として使用できる。

透析内液と透析外液を隔てる透析膜の分画分子量は、３，５００〜１００，０００が好ましく、１０，０００〜５０，０００がより好ましい。
透析の温度は、２０〜４０℃が好ましく、２３〜３７℃がより好ましい。
振とう速度又は撹拌速度は、例えば、１００〜３００ｒｐｍとすることができる。
透析法の場合の反応時間は、目的の標識タンパク質の生成を監視しながら適当に選択することができる。

標識タンパク質を合成した後は、標識タンパク質を精製することが好ましい。標識タンパク質の精製方法としては、公知のタンパク質の精製方法を採用でき、例えば、硫酸アンモニウム若しくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト、等電点クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング等が挙げられる。これらの精製方法は、単独で行ってもよく、２つ以上を組み合わせて行ってもよい。また、合成時に標識タンパク質にタグ（ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合性タグ等）を付加し、該タグを特異的に認識した吸着を利用するアフィニティー精製法を使用してもよい。
得られた標識タンパク質の同定及び定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析等により、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。

以上説明したように、本発明の標識タンパク質の製造方法においては、無細胞タンパク質合成系で、標識インドールを用いて系内で合成した標識トリプトファンを取り込ませて標識タンパク質を合成するため、標識タンパク質を容易に製造できる。
具体的には、標識アミノ酸を合成する場合は、複数の保護基が必要となるうえ、標識アミノ酸の精製に長時間を要する問題がある。これに対して、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識した標識インドールは、無保護で合成できるうえ、疎水性が高いためにシリカゲルやＯＤＳ等の簡易カラムで容易に精製することができる。本発明では、原料として標識インドールを用い、標識トリプトファンを経て標識タンパク質まで一度に合成できるため、複数の保護基を使用して標識トリプトファンを合成する必要がなく、標識トリプトファンを一旦精製する必要もない。このように、煩雑な合成及び精製を経ずに、短時間で容易に^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質を製造することができる。
また、標識インドールは、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンに比べて低コストで製造できるため、低コストに標識タンパク質を製造できる。

また、本発明の製造方法によって得られる標識タンパク質は、特許文献１、２のようなキレート剤や標識用試薬を用いる方法に比べて、標識によるタンパク質の構造変化が小さく、標識がタンパク質の局在や動態に与える影響が小さい。また、無細胞タンパク質合成系を採用することから、入手し難いタンパク質を含めて様々な種類のタンパク質を標識できる。そのため、例えばＰＥＴイメージング等による様々な疾患の画像診断や抗体医薬開発に貢献できる。

［ペプチドの製造方法］
本発明の標識ペプチドの製造方法は、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識ペプチドを製造する方法である。
本発明において、「ペプチド」とは、２個以上２５個未満のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物と定義する。また、「^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識ペプチド」とは、分子内に^１８Ｆ又は^１９Ｆを有するペプチドと定義する。

本発明の標識ペプチドの製造方法においては、無細胞タンパク質合成系を用いて、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識ペプチドを合成する。本発明の標識ペプチドの製造方法は、本発明の標識タンパク質の製造方法と同様に、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールを用いる。

本発明の標識ペプチドの製造方法は、目的の標識化合物においてペプチド結合により結合しているアミノ酸数が２個以上２５個未満である以外は、標識タンパク質の製造方法と同様に行える。具体的には、本発明の標識ペプチドの製造方法は、目的の標識タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の代わりに、目的の標識ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を用いる以外は、本発明の標識タンパク質の製造方法と同様の方法で行える。

本発明の標識ペプチドの製造方法においては、本発明の標識タンパク質の製造方法と同様に、原料として標識インドールを用い、標識トリプトファンを経て標識タンパク質まで一度に合成できるため、標識ペプチドを短時間で容易に製造することができる。また、標識によるペプチドの構造変化が小さく、標識がペプチドの局在や動態に与える影響が小さい。

［キット］
本発明のキットは、^１８Ｆ若しくは^１９Ｆで標識された標識タンパク質又は標識ペプチドを合成するためのキットであって、無細胞タンパク質合成系を備える。無細胞タンパク質合成系としては、前記した細胞抽出液を備えてもよく、細胞抽出液に代えて、前記した再構成型無細胞タンパク質合成法に用いられる溶液を備えてもよい。
本発明のキットは、前記した成分のうち、標識トリプトファン又は標識インドール、及び、目的の標識タンパク質又は標識ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸以外の成分を含有していることが好ましい。具体的には、本発明のキットは、トリプトファン以外の１９種のアミノ酸、エネルギー源等を含有していることが好ましい。

本発明のキットに、側鎖のインドール環が^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファン、及び^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールの少なくとも一方と、目的の標識タンパク質又は標識ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を添加することで、目的の標識タンパク質又は標識ペプチドを簡便に製造することができる。

キット中のトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼの含有量は、０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．０５〜０．４ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼの添加量が前記範囲の下限値以上であれば、添加前と比較し、標識されたタンパク質が効率よく製造できる。トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼの添加量が前記範囲の上限値以下であれば、標識されたタンパク質がより高効率に製造できる。

キット中のＬ−セリンの含有量は、０．００１〜２０ｍＭが好ましく、０．０１〜３．０ｍＭがより好ましい。Ｌ−セリンの含有量が前記範囲の下限値以上であれば、標識タンパク質を高効率に製造しやすい。Ｌ−セリンの含有量が前記範囲の上限値以下であれば、標識タンパク質をより高効率に製造しやすい。

［ＰＥＴ用試薬］
本発明のＰＥＴ用試薬は、トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識タンパク質からなるＰＥＴ用試薬である。ＰＥＴ用試薬は、ＰＥＴイメージングに用いる試薬、すなわちＰＥＴイメージングの画像化プローブとなるポジトロン標識抗体である。
本発明のＰＥＴ用試薬は、前述した本発明の標識タンパク質の製造方法により製造することができる。

ＰＥＴ用試薬に用いる標識タンパク質としては、特に限定されず、例えば、トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識トラスツズマブ（［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ）が挙げられる。
トラスツズマブは、ヒト癌遺伝子ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）の遺伝子産物であるＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合するため、標識トラスツズマブは、ＰＥＴ用試薬として有用である。

［医薬組成物、ＨＥＲ２タンパク質検出キット］
本発明の医薬組成物は、標識トラスツズマブを含む。本発明の医薬組成物は、標識トラスツズマブ以外の他の成分を含んでいてもよい。医薬組成物に含まれる他の成分としては、例えば、安定化剤、可溶化剤、アフィニティカラム精製用バッファー等が挙げられる。

本発明のＨＥＲ２タンパク質検出キットは、前記したキットを含むものであり、少なくとも無細胞タンパク質合成系を含む。また、本発明のＨＥＲ２タンパク質検出キットは、さらに、トラスツズマブ鋳型ＤＮＡ、トリプトファナーゼ、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドール、並びにＬ−セリン又はピルビン酸及びアンモニウムイオンを含んでいてもよい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）の定量］
各例で製造した標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）の定量は、Ｗ．Ｖ．Ｓｈａｗらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３５−７５５， １９７５参照）に従って行った。すなわち、アセチルコエンザイムＡとクロラムフェニコールを基質としてＣＡＴタンパク質によるクロラムフェニコールのアセチル化反応を行い、その結果生じた還元型コエンザイムＡを５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＮＴＢ）を用いて発色定量した。３０℃、４１２ｎｍにおける吸光度の単位時間当たりの増加量よりＣＡＴタンパク質の活性を定量し、これを指標としてＣＡＴタンパク質の量を決定した。

［例１（実施例）］
表１に示す組成の反応液を調製し、３７℃で１時間反応させ、５位の水素原子が^１９Ｆに置換された標識インドール（５−^１９Ｆ−インドール）を含む無細胞タンパク質合成系で、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴタンパク質）を^１９Ｆで標識した標識タンパク質を製造した。細胞抽出液としては、木川らの方法（国際公開第２００３／０５３９１０号、特許第３３１７９８３号公報、特許第３１４５４３１号公報、Ｔｕｇａｒｉｎｏｖ，Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００３） ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１３８６８−１３８７８．）により、大腸菌から抽出したＳ３０抽出液を用いた。Ｓ３０抽出液にはトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼが含まれている。鋳型ＤＮＡとしてはｐＵＣ−ＣＡＴ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３９， ８８１−８８６， １９９６参照）を用いた。

［例２（実施例）］
反応液中の標識インドール（５−^１９Ｆ−インドール）の濃度を３．０ｍＭに変更した以外は、例１と同様にして標識タンパク質を製造した。

［例３（実施例）］
反応液中の標識インドール（５−^１９Ｆ−インドール）の濃度を７．５ｍＭに変更した以外は、例１と同様にして標識タンパク質を製造した。

［例４（参考例）］
標識インドール（５−^１９Ｆ−インドール）の代わりに、Ｌ−トリプトファンを１．５ｍＭの濃度となるように反応液に添加した以外は、例１と同様にして標識タンパク質を製造した。

［例５（参考例）］
標識インドールの代わりにインドールを用いる以外は、例１と同様にしてＣＡＴタンパク質を製造した。

例１〜３及び例４、５の結果を図１に示す。図１に示すように、^１９Ｆで標識したインドールを用いた例１〜３では、^１９Ｆで標識された標識タンパク質が高効率で得られた。例１〜３の標識タンパク質の製造効率は、天然型のＬ−トリプトファンやインドールを用いた例４、５と比べても充分なものであった。また、例１〜３の比較では、５−^１９Ｆ−インドールの濃度が１．５ｍＭの例１で標識タンパク質の合成量が最も高かった。
このように、無細胞タンパク質合成系に内在するトリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼの作用により、５−^１９Ｆ−インドールから標識トリプトファンが合成され、さらにタンパク質合成に組み込まれて標識タンパク質が得られることが確認された。

［例６］
反応液にトリプトファナーゼをそれぞれ０．０５、０．１、０．４ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間反応させた以外は、例１と同様にして標識タンパク質を製造した。また、例１及び例５と同様にしてＣＡＴタンパク質を製造した。結果を図２に示す。

図２に示すように、Ｓ３０抽出液を用いた反応液に、さらにトリプトファナーゼを５０μｇ／ｍＬ以上添加することにより、標識タンパク質の合成量が向上した。

［例７］
標識インドール（５−^１９Ｆ−インドール）の代わりに、２−メチルインドール、４−ニトリインドール、５−アミノ−２−メチルインドール、５−アミノインドール、５−ブロモインドール、５−シアノインドール、５−フルオロインドール（５−^１８Ｆ−インドール）、５−ヒドロキシインドール、５−メトキシインドール、６−シアノインドール、又はインドールを用い、３７℃で１時間反応させた以外は、例１と同様にして標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）を製造した。また、反応液にトリプトファナーゼを０．０５ｍｇ／ｍＬを添加して同様に標識タンパク質（ＣＡＴタンパク質）を製造した。結果を図３に示す。

図３に示すように、５−フルオロインドール以外の修飾インドールではＣＡＴタンパク質が合成されなかった。これに対して、５−フルオロインドールを用いた場合には、無細胞タンパク質合成系において、標識トリプトファンが合成され、該標識トリプトファンがＣＡＴタンパク質に取り込まれて、標識タンパク質が効率的に合成されることが確認された。

［例８（実施例）］
以下の表２に示す組成の反応液（全量５００μＬ）を調製し、３７℃で３０分間加温することにより、トリプトファン残基のインドール環の５位の水素原子が^１８Ｆで置換された標識トラスツズマブ（［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ）を製造した。得られた［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖは、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖに結合しているＳＢＰタグとアフィニティカラムの親和性を利用して精製した。

［例９］
トラスツズマブは、細胞の悪性化に関与しているＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合することで抗腫瘍効果を発揮する抗癌剤であり、ＳＫ−ＯＶ−３にはＨＥＲ２タンパク質が存在している。
例８で製造された［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖの腫瘍部位への集積を確かめるため、正常マウス及びＳＫ−ＯＶ−３細胞を移植して人工的に腫瘍を作らせたＩＣＲマウス（メス、１３週齢、腫瘍モデル：ＢＡＬＢ／ｃ Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ、ＳＫ−ＯＶ−３移植後３０日）に、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ溶液２００μＬ（８．６〜９．２ＭＢｑ）を尾静脈から注入し、ＰＥＴ撮像試験を行った。ＰＥＴ撮像試験はイソフルラン麻酔下（流量：１．０Ｌ／分、濃度：１．０％）で行い、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ溶液の投与後９０分間マウスを撮像した。撮像機器としてＣｌａｉｒｖｉｖｏ ＰＥＴを用い、表示画像は最大値投影表示（ＭＩＰ）とした。結果を図４に示す。
また、腫瘍を作らせていない正常なＩＣＲマウス（オス、６週齢、３０〜３２ｇ）についても、同様にして［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ溶液２００μＬ（３．０〜５．３ＭＢｑ）を尾静脈から注入し、ＰＥＴ撮像試験を行った。ＰＥＴ撮像試験は、イソフルラン麻酔下（流量：１．５Ｌ／分、濃度：１．５％）で行い、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ溶液の投与後６０分間マウスを撮像した以外は、腫瘍を作らせたマウスの場合と同様に行った。結果を図５に示す。

図５に示すように、正常なモデルマウスにおいては、尿、腎臓、肝臓及び血液のみへの［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖの集積が確認された。一方、図４に示すように、腫瘍モデルマウスにおいては、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖのＳＫ−ＯＶ−３細胞への集積が確認され、腫瘍イメージング剤としての利用可能性が示された。

［例１０］
ＭＣＦ７にもＨＥＲ２タンパク質が存在している。ＳＫ−ＯＶ−３（ＨＥＲ２高発現）及びＭＣＦ７（ＨＥＲ２低発現）の腫瘍細胞株をそれぞれ用いて作成した腫瘍モデルの腫瘍組織切片に、例８で製造された［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖ（１００μＬ、０．２ＭＢｑ）を添加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ オートラジオグラフィによる３０分後の結合状態を観察した。ＳＫ−ＯＶ−３の腫瘍細胞株を用いた腫瘍組織切片の結果を図６Ａ、ＭＣＦ７の腫瘍細胞株を用いた腫瘍組織切片の結果を図６Ｂに示す。
また、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖを添加する６０分前に、非標識のトラスツズマブを添加してＨＥＲ２タンパク質をブロックした以外は、同様にして各腫瘍組織切片における結合状態を観察した。ＳＫ−ＯＶ−３の腫瘍細胞株を用いた腫瘍組織切片（ＨＥＲ２ブロック）の結果を図６Ｃ、ＭＣＦ７の腫瘍細胞株を用いた腫瘍組織切片（ＨＥＲ２ブロック）の結果を図６Ｄに示す。

図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ＨＲＲ２タンパク質をブロックしていない腫瘍組織断片では、ＳＫ−ＯＶ−３とＭＣＦ７のいずれの腫瘍細胞株を用いた場合も、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖのＨＲＲ２タンパク質への結合が確認された。一方、図６Ｃ及び図６Ｄに示すように、ＨＲＲ２タンパク質をブロックした腫瘍組織断片では、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖに由来するオートラジオグラフィが得られなかった。これらの結果から、［^１８Ｆ］ｔｒａ−ｓｃＦｖは、非標識のトラスツズマブと同じくＨＥＲ２タンパク質を認識していることが示され、^１８Ｆ標識が抗原結合部位の構造や機能に変化を与えないことが示された。

Claims (8)

1. 無細胞タンパク質合成系で、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールと、Ｌ−セリン、又はピルビン酸及びアンモニウムイオンとから^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンを合成させ、
   さらに前記無細胞タンパク質合成系で前記標識トリプトファンを用いて^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識タンパク質を合成する、標識タンパク質の製造方法。
2. 前記標識タンパク質が、トラスツズマブにおけるトリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識トラスツズマブである、請求項１に記載の標識タンパク質の製造方法。
3. 請求項１又は２に記載の標識タンパク質の製造方法により、トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識タンパク質からなるＰＥＴ用試薬を製造する、ＰＥＴ用試薬の製造方法。
4. 無細胞タンパク質合成系で、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識インドールと、Ｌ−セリン、又はピルビン酸及びアンモニウムイオンとから^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識トリプトファンを合成させ、
   さらに前記無細胞タンパク質合成系で前記標識トリプトファンを用いて^１８Ｆ又は^１９Ｆで標識された標識ペプチドを合成する、標識ペプチドの製造方法。
5. 無細胞タンパク質合成系を備えるキットであって、トリプトファナーゼ又はトリプトファンシンターゼにより、 ^１８ Ｆ又は ^１９ Ｆで標識された標識インドールと、Ｌ−セリン、又はピルビン酸及びアンモニウムイオンとから ^１８ Ｆ又は ^１９ Ｆで標識された標識トリプトファンを合成させ、さらに前記無細胞タンパク質合成系で前記標識トリプトファンを用いて ^１８Ｆ若しくは^１９Ｆで標識された標識タンパク質又は標識ペプチドを合成するためのキット。
6. トリプトファン残基の側鎖のインドール環が^１８Ｆで標識された標識トラスツズマブ。
7. 請求項６に記載の標識トラスツズマブを含む医薬組成物。
8. 請求項５記載のキットを含む、ＨＥＲ２タンパク質検出キット。

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