JP6964127B2 - Ｈｅｒ−２結合抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはポリペプチドに特異的ＨＥＲ２結合性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドに関する。本発明は、がん、自己免疫疾患、炎症性障害、および感染性疾患などの疾患の診断、予後および療法において、前記抗体およびそれらを含む組成物を使用する方法にも関する。

受容体型チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２は、ＣＤ３４０（分化抗原群３４０）、癌原遺伝子Ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ２（げっ歯類）、またはＥＲＢＢ２（ヒト）としても公知であり、ヒトにおいてはＥＲＢＢ２遺伝子にコードされるタンパク質であり、またＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２から）またはＨＥＲ２／ｎｅｕとも呼ばれる。

ＨＥＲ２はヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーのメンバーである。公知の癌原遺伝子であるＨＥＲ２は、ヒト第１７染色体の長腕（１７ｑ１２）に位置する。この癌遺伝子の増幅または過剰発現が、特定の悪性型乳がんの発症および進行において重要な役割を果たすことが示されている。近年、このタンパク質は、乳がん患者の約３０％にとって重要なバイオマーカーおよび療法の標的となっている。

ＥｒｂＢファミリーは、４種の細胞膜結合受容体型チロシンキナーゼからなる。そのうちの１つがｅｒｂＢ−２であり、その他のメンバーは、上皮増殖因子受容体、ｅｒｂＢ−３（ニューレグリン結合性；キナーゼドメインを欠く）、およびｅｒｂＢ−４である。４種全てが、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および数多くのシグナル伝達分子と相互作用してリガンド依存性およびリガンド非依存性活性の両方を示すことができる細胞内ドメインを含む。ＨＥＲ２はその他３種の受容体のいずれかとヘテロ二量体化することができ、その他のＥｒｂＢ受容体の好ましい二量体化のパートナーであると考えられる。

二量体化により、受容体の細胞質ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化がもたらされ、様々なシグナル伝達経路が開始される。これらには、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）経路、ホスホリパーゼＣγ経路、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）経路、およびシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）経路が含まれる。したがって、受容体のＥｒｂＢファミリーを介したシグナル伝達は、細胞増殖を促進し、アポトーシスに対抗し、それゆえに、制御されない細胞増殖の発生を防止するため厳格に調節されなければならない。

乳がんの約１５〜３０％には、ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅または過剰発現が存在する。これは、疾患再発の増加および予後不良と強く関連する。過剰発現は、卵巣がん、胃がん、および子宮漿液性子宮内膜癌などの悪性型の子宮がんにも存在することが知られている。例えばＨＥＲ−２は、胃がん患者の約７〜３４％および唾液腺管癌患者の３０％で過剰発現している。

この受容体のリガンド非依存性の興奮を引き起こす多様な構造上の変化を特定し、受容体過剰発現の非存在下でも同様に特定した。

ＨＥＲ２は様々な腫瘍に見られ、これらの腫瘍のいくつかはＨＥＲ２の膜貫通ドメインを指定する配列に点突然変異を有する。膜貫通ドメインのグルタミン酸をバリンで置換すると、リガンド非存在下でこのタンパク質の構成的な二量体化が起こる場合がある。ＨＥＲ２突然変異は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）でも見出されており、治療を方向付けることができる。

ＨＥＲ２はモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチンとして市販されている）の標的である。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰発現されているがんにのみ有効である。化学療法も受けているＨＥＲ２−陽性乳がん患者全員に、１年間のトラスツズマブ療法が推奨されている。トラスツズマブがＨＥＲ２に結合することの重要な下流効果は、細胞増殖を停止させるタンパク質、ｐ２７の増加である。

別のモノクローナル抗体、ペルツズマブは、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３受容体の二量体化を阻害するものであり、２０１２年６月にＦＤＡによりトラスツズマブとの併用が承認された。

さらに、ＮｅｕＶａｘ（Ｇａｌｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）は、「キラー」Ｔ細胞を標的に指向させ、ＨＥＲ２を発現するがん細胞を破壊するペプチドベースの免疫療法である。これは第３相臨床試験に入っている。

予後を評価し、トラスツズマブ療法への適合性を決定するため、乳がん患者においてＨＥＲ２試験が実施されている。トラスツズマブは高価であり、かつ心臓毒性と関連するため、ＨＥＲ２−陽性の個人に限定されることが重要である。ＨＥＲ２−陰性の腫瘍では、トラスツズマブのリスクがベネフィットを明らかに上回る。

したがって、トラスツズマブ（および化学療法）による至適の療法の結果が満足のいくものでない場合に、または既存の抗体と組み合わせる代替として、フォローアップ療法に使用可能な、新規のより有効な抗体を開発する必要がある。

本発明の根本的な研究目的は、トラスツズマブおよびペルツズマブなどの既存の抗体および療法と比較して新規の作用機構を有する新たな分子を見出すため、ＨＥＲ２に対する多量の高親和性抗体を生成することであった。

本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはポリペプチドに特異的ＨＥＲ２結合性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドであって、前記抗体は、ヒトＦｃ受容体に結合してＦｃＲ媒介性シグナル伝達経路を誘導する、抗体に関する。

一部の実施形態において、本発明による抗体は、トラスツズマブとは異なるエピトープに結合する。

本発明は、薬学的に有効な量の本発明による抗体を患者に投与するステップを含む、患者のＨＥＲ−２媒介性疾患を治療する方法にも関する。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体、および治療有効量の本発明による抗体を含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、本発明に従ってＨＥＲ−２媒介性疾患を治療する方法において、患者に投与されうる。

定義
本発明による用語「ウサギ」は、分類学上ウサギ目（ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｏｒｄｅｒ）のメンバーの動物を意味し、それはファミリー（ノウサギおよびウサギ）およびナキウサギ科（Ｏｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ）（ナキウサギ）、好ましくはアナウサギ属（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ）を含む。

用語「抗体」は、全抗体および本発明による特性を示す限り、抗体断片を含むがそれに限定されない様々な形態の抗体構造を包含する。

本発明による用語「ウサギモノクローナル抗体」は、ウサギを免疫することによって産生され、前記ウサギの抗原産生細胞から単離されるモノクローナル抗体、ならびに本発明による特徴的な特性が保持される限り、さらに修飾されるような抗体、好ましくはヒト化抗体、キメラ抗体、その断片、またはさらに遺伝子操作および組換え産生された抗体を意味する。好ましくは、抗体は、前記ウサギのＢ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞由来である。

本発明による用語「抗体産生細胞」は、抗体を産生するウサギＢ細胞、好ましくはＢ細胞またはウサギハイブリドーマ細胞を意味する。

「天然の抗体」は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される通常ヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方でジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖は、規則正しく間隔を置いて配置されている鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインとの間にインターフェイスを形成すると考えられている。

ペプチドまたはポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じて最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後に、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内にある様々な方法で達成され得る。

本明細書で用いられる用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するヒト受容体を指す。ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体の対立遺伝子バリアントならびに選択的スプライシング形態を含めた受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４（１９９７）の総説を参照のこと）。ＦｃＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）は、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃＲについては、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５〜３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．ＣＨｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）に概説されている。これらおよび他の全てのＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語は、胎児への母体ＩｇＧの移動に関与し（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、より遅い異化、したがってより長い半減期を媒介する新生児受容体、ＦｃＲｎも含む。

「定常ドメイン（定常部分）」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、例えばエフェクター機能をも示す。ヒトＩｇＧ１に対応する重鎖定常領域はγ１鎖と呼ばれる。ヒトＩｇＧ３に対応する重鎖定常領域はγ３鎖と呼ばれる。ヒト定常γ重鎖については、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）、およびＢｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．、ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１〜１３６１；Ｌｏｖｅ，Ｔ．Ｗ．、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８（１９８９）５１５〜５２７に詳細に記載されている。ＩｇＧ１またはＩｇＧ３型の定常ドメインは、Ａｓｎ２９７でグリコシル化されている。本発明による「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の軽度の配列変動に基づけば、Ａｓｎ２９７は数アミノ酸（通常、アミノ酸＋３個以下）上流または下流に位置していてもよい。

本明細書では用語「抗体エフェクター機能」または「エフェクター機能」とは、ＩｇＧのＦｃエフェクタードメイン（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）によって付与される機能を指す。そのような機能は、例えば、食細胞もしくは溶解活性を持つ免疫細胞のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメインの結合または補体系の成分へのＦｃエフェクタードメインの結合によって生じ得る。典型的なエフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣである。

「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、それだけには限らないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体がある。

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する、逆に言えば、競合アッセイにおいて参照抗体が、その抗原への抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指す。例示的な競合アッセイが、本明細書に提供される。

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞に結合している抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞に媒介される反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。

造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ， ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（１９９１）４５７−４９２の４６４ページの表３に要約されている。用語「抗体依存性細胞食作用」および「ＡＤＣＰ」とは、抗体被覆細胞が、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）によって全体または一部のいずれかが内部移行される過程を指す。

「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと一緒に補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えばＱｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから商業的に購入することができる。

抗体の「クラス」とは、重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの大きな抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_５およびＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。

薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、必要な投薬量および期間で、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効な量を指す。

用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために本明細書において使用される。用語は、天然配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。
本明細書において特に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に記載のＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番方式にしたがう。

「バリアントＦｃ領域」は、本明細書において定義した「アミノ酸修飾」の少なくとも１つによって「天然」または「野生型」配列のＦｃ領域と異なるアミノ酸配列を含む。

本明細書では用語「Ｆｃバリアント」は、Ｆｃドメインに修飾を含むポリペプチドを指す。本発明で述べられる全ての位置について、番号付けは、ＥＵインデックスにしたがう。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ番号付けスキームとしてのＥＵインデックスとは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３（１９６９）７８〜８５、参照により全体を本明細書に組み込む）。修飾は、付加、欠失または置換であり得る。置換は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含み得る。バリアントは、非天然のアミノ酸を含み得る。

用語「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域を含む抗体またはイムノアドヘシン（下の定義を参照のこと）などのポリペプチドを指す。

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記述するために使用される。ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体の対立遺伝子バリアントならびに選択的スプライシング形態を含めた受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（１９９７）２０３〜２３４の総説を参照のこと）。ＦｃＲについては、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（１９９１）４５７〜４９２；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５〜３４；およびＨａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０〜４１に概説されている。将来に同定されるものを含めて、他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。用語は、胎児への母体ＩｇＧの移動に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４９）。

本明細書では、「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成するあらゆる生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、それだけには限らないが、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃｌｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲがある。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲに相同なＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も含む。（Ｄａｖｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９０（２００２）１２３〜１３６、全体を参照により組み込む）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書では、「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成するあらゆる生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。

本明細書では、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃｇａｍｍａＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされているタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいてこのファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢおよびＦｃγＲＩＣを含めたＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩＡ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ−１およびＦｃγＲＩＩＢ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含めたＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡ（アロタイプＶＩ５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＢ−ＮＡ２を含む）を含めたＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２（２００２）５７〜６５、全体を参照により組み込む）、加えて未発見のあらゆるヒトＦｃγＲもしくはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含むが、これに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲは、それだけには限らないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに未発見のあらゆるマウスＦｃγＲもしくはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含む。

本明細書では、「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも一部コードされているタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれに限定されない任意の生物由来であり得る。当技術分野で公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。特に明記しない限り本明細書において、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質とは、ベータ２−ミクログロブリンとＦｃＲｎ重鎖の複合体を指す。

「イムノコンジュゲート」は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素、別の抗体または放射性同位元素など、１つまたは複数の細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗体を意味する。

「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変領域または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、Ｆａｂ断片および一本鎖抗体分子がある。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６〜８８に記述されている。

本明細書では用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

「ヒト化抗体」または「抗体のヒト化形態」という語は、抗体工学の結果として重鎖および軽鎖の両方がヒト化された抗体を指す。ヒト化された鎖は通常、Ｖ領域アミノ酸配列が、全体的に分析すると、起源となった種の生殖細胞系配列よりもヒト生殖細胞系配列に相同性が近くなるように変更された鎖である。ヒト化の評価は、生じたアミノ酸配列に基づき、技法それ自体には基づかない。

本明細書では用語「標的に対して特異的に結合する、または抗標的抗体」とは、ＥＬＩＳＡによって測定されるそれぞれの抗原（標的）または抗原発現細胞への抗体の結合を指し、前記ＥＬＩＳＡは、固体支持体にそれぞれの抗原をコーティングすること、それぞれの抗原またはタンパク質と免疫複合体を形成できる条件下で前記抗体を添加すること、本発明による抗体に結合する二次抗体およびペルオキシダーゼに媒介される発色を使用して光学密度値（ＯＤ）を測定することにより前記免疫複合体を検出することとを好ましくは含む。

本発明による用語「抗原」とは、免疫化に使用される抗原またはそのタンパク質配列の一部として前記抗原を含むタンパク質のことを指す。例えば、免疫化の場合、タンパク質の細胞外ドメインの断片（例えば最初の２０アミノ酸）を使用することができ、検出／アッセイなどの場合、タンパク質または完全長タンパク質の細胞外ドメインを使用することができる。

本明細書において用語「特異的に結合する」または「特異的に認識される」は、抗体が、抗原にかなりの親和性を呈し、好ましくは、有意な交差反応性を呈しないことを意味する。

「かなりの」結合親和性は、少なくとも１０^−７Ｍ、特に少なくとも１０^−８Ｍ、さらに特に少なくとも１０^−９Ｍまたはよりさらに特に少なくとも１０^−１０Ｍの親和性による結合を含む。

「有意な交差反応性を呈しない」抗体は、望ましくない他のタンパク質に目に見えて結合することがない抗体である。特異的結合は、そのような結合を決定するための当業者に認識されている任意の手段、例えば競合結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により決定することができる。

本明細書では全てのタンパク質用語は、ヒトタンパク質を指す。別の種由来のタンパク質を意味する場合、これは明確に言及される。

本明細書では「本発明による抗体の可変領域（またはドメイン）」（軽鎖の可変領域［ＶＬ］、重鎖の可変領域［ＶＨ］）は、抗体が抗原に結合するのに直接関係する軽および重鎖領域の対の各々を意味する。可変軽および重鎖領域は同じ全体構造を有し、各領域は、配列が広く保存され、３つの相補性決定領域、ＣＤＲによって接続されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。

「抗体の抗原結合部分」という語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、好ましくは「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）に従って規定される。この付番システムを使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変領域のＦＲまたはＣＤＲの短縮、またはこれらへの挿入に対応する、アミノ酸の減少または追加を含んでいてよい。例えば、重鎖可変領域は、Ｈ２の残基５２の次に単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の次に挿入残基（Ｋａｂａｔによれば例えば残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでいてよい。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番された配列と、抗体の配列の相同な領域において並べることにより決定可能である。

本明細書では用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん(stomach cancer)、胃部がん(gastric cancer)、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、上皮小体のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、上記がんのいずれかの難治性バージョン、または上記がんの１つまたは複数の組合せを含むものであり得る。好ましくは、このようながんは乳がん、大腸がん、肺がん、または膵臓がんである。

後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。 後段で詳述。

本発明は、様々な特性を有する多量の多様な分子の産生を可能にする、発明者らによって確立された技術を使用することに由来する。

発明者らは、４０，０００を超えるＢ細胞上清を産生してこれらを試験し、そこから、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてモノまたはオリゴ特異的にＨＥＲ受容体に結合する７，５００を超える抗体を特定した。

分子５６４個のＲＮＡおよびアミノ酸配列を決定して、各抗体をクローニングし、発現させ精製して、約３００の組換えキメラ抗体を生成させた。この抗体の遺伝子改変および精製により、規定量の抗体の特異的生化学試験、それゆえに適切な定量的評価が可能となり、その結果、望ましくない免疫防御反応が最小限となるためｉｎ ｖｉｖｏでの使用が可能となる。

組換えモノクローナル抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験し、比較した。驚くべきことに、ＪＩＭＴ−１細胞において、トラスツズマブ／ハーセプチンと比較してＦｃγＲＩＩＩａ媒介性活性の少なくとも２倍の増大、すなわちより大きなＮＦＡＴ経路活性化を示すいくつかの分子が見出された。さらに、抗体のいくつかは、乳がん療法における至適の抗体であるトラスツズマブ（ＴＺ）およびペルツズマブ（ＰＺ）とは異なるエピトープに結合することが判明した。

したがって、本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはポリペプチドに特異的ＨＥＲ２結合性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドであって、
ａ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
ＣＤＲ−Ｈ１領域が、配列番号１３〜１８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｈ２領域が、配列番号１９〜２４の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｈ３領域が、配列番号２５〜３０の群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨと、
ｂ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
ＣＤＲ−Ｌ１領域が、配列番号３１〜３６の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、配列番号３７〜４２の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、配列番号４３〜４８の群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬと
を含む、抗体に関する。

さらに、本発明による抗体は、
ａ）フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、およびＦＲ−Ｈ４を含み、
ＦＲ−Ｈ１領域が、配列番号４９〜５４の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＦＲ−Ｈ２領域が、配列番号５５〜６０の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＦＲ−Ｈ３領域が、配列番号６１〜６６の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＦＲ−Ｈ４領域が、配列番号６７〜７２の群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
ｂ）フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、およびＦＲ−Ｌ４を含み、
ＦＲ−Ｌ１領域が、配列番号７３〜７８の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＦＲ−Ｌ２領域が、配列番号７９〜８４の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＦＲ−Ｌ３領域が、配列番号８５〜９０の群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ＦＲ−Ｌ４領域が、配列番号９１〜９６の群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含んでいてよい。

一実施形態において、本発明による抗体はモノクローナルＩｇＧ抗体である。

好ましくは、本発明による抗体はモノクローナルＩｇＧ１抗体である。

本発明によるモノクローナル抗体は、配列番号１〜６および配列番号１００〜１０１の重鎖可変（ＶＨ）領域からなる群から選択されるＶＨ領域と少なくとも９０％同一であるＶＨ領域、ならびに配列番号７〜１２および配列番号１０２〜１０４の軽鎖可変（ＶＬ）領域からなる群から選択されるＶＬ領域と少なくとも９０％同一であるＶＬ領域を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはＨＥＲ２結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドである。

本発明による抗体において、重鎖可変（ＶＨ）領域は、配列番号１〜６および配列番号１００〜１０１のＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一であってよい。

一実施形態において、本発明による抗体は、本発明による重鎖可変領域（ＶＨ）配列の群、すなわち配列番号１〜６および配列番号１００〜１０１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。

好ましくは、抗体は、配列番号４の重鎖可変（ＶＨ）領域と少なくとも９０％同一であるＶＨ領域を含み、好ましくは、ＶＨ領域は配列番号４と９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、最も好ましくは、ＶＨ領域は配列番号４を含む。

ある特定の実施形態において、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して、置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含み、それによっても、抗体は本発明に従って特異的に各抗原に結合する能力を維持する。ある特定の実施形態では、前記ＶＨ配列のそれぞれにおいて、計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失している。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外の領域（すなわちＦＲ）に発生する。

好ましい実施形態において、重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、配列番号１〜６および配列番号１００〜１０１のＶＨ領域からなる群から選択される。

さらにより好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１００または１０１である。最も好ましくは、ＶＨ配列は配列番号４である。

本発明による抗体において、軽鎖可変（ＶＬ）領域は、配列番号７〜１２および配列番号１０２〜１０４のＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一であってよい。

一実施形態において、本発明による抗体は、本発明による軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬを含む。

好ましくは、抗体は、配列番号１０の軽鎖可変（ＶＬ）領域と少なくとも９０％同一であり、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＶＬ領域を含み、最も好ましくは、ＶＬ領域は配列番号１０を含む。

一部の実施形態において、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して、置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含み、それによっても、抗体は各抗原に特異的に結合する能力を維持する。ある特定の実施形態では、前記ＶＬ配列において、計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失している。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外の領域（すなわちＦＲ）に発生する。

好ましい実施形態において、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列は、配列番号７〜１２および配列番号１０２〜１０４のＶＬ領域からなる群から選択される。

さらにより好ましくは、重鎖可変領域（ＶＬ）配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１０２、配列番号１０３または１０４である。

最も好ましくは、ＶＬ配列は配列番号１０である。

本発明によるＶＬ配列が９０位に突然変異を含むことがさらに好ましい。好ましくは、配列番号１０、１０２、１０３および１０４の群の配列を含むＶＬ配列が、９０位に突然変異を含む。好ましくは、突然変異はシステインからセリンへの突然変異である。しかし、これは異なるアミノ酸置換であってもよい。ＶＬ配列は、当然のことながら、先に詳述したようにさらなる突然変異を含んでいてもよい。

本発明は、ＶＨ領域が配列番号１＋ｎのＶＨ領域と少なくとも９０％同一であり、ＶＬ領域が配列番号７＋ｎのＶＬ領域と少なくとも９０％同一であり、ｎが０〜５からなる群から選択される数である、抗体にも関する。

本発明は、配列番号１＋ｎのＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含み、ＶＬ領域が配列番号７＋ｎのＶＬ領域からなる群から選択され、ｎが０〜５からなる群から選択される数である、抗体にも関する。

本発明は、配列番号１３＋ｎのＣＤＲ−Ｈ１領域、配列番号１９＋ｎのＣＤＲ−Ｈ２領域、および配列番号２５＋ｎのＣＤＲ−Ｈ３領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域を含み、ｎが０〜５からなる群から選択される数である、抗体にも関する。

さらに、本発明による抗体は、配列番号３１＋ｎのＣＤＲ−Ｌ１領域、配列番号３７＋ｎのＣＤＲ−Ｌ２領域、および配列番号４３＋ｎのＣＤＲ−Ｌ３領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含んでいてよく、ｎは０〜５からなる群から選択される数である。

本発明による抗体は、配列番号１３＋ｎのＣＤＲ−Ｈ１領域、配列番号１９＋ｎのＣＤＲ−Ｈ２領域、および配列番号２５＋ｎのＣＤＲ−Ｈ３領域を含むＶＨ領域の群から選択されるＶＨ領域も含んでいてよく、配列番号３１＋ｎのＣＤＲ−Ｌ１領域、配列番号３７＋ｎのＣＤＲ−Ｌ２領域、および配列番号４３＋ｎのＣＤＲ−Ｌ３領域を含むＶＬ領域の群から選択されるＶＬ領域を含み、ｎは０〜５からなる群から選択される数である。

本発明による「ｎは０〜５の群から選択される数である」は、０、１、２、３、４、および５の群から選択される数を意味する。本発明による数「ｎ」は、同一の抗体、その重鎖および軽鎖、その可変領域およびＣＤＲ領域では同一であることが意図される。

さらに、本発明による抗体は、Ｃ０７４、Ｃ０３１、Ｂ１０６、Ｂ１００、ＡＫ５７、Ｂ１１５からなる群から選択される抗体の、各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、ならびに各ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４領域を含む、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含んでいてよい。

好ましくは、抗体は、Ｂ１００と呼ばれる抗体（ＭＡＢＤ Ｂ１００に相当）の各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域、ならびに各ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４領域を含む、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。

好ましくは、Ｂ１００はヒト化抗体である。

好ましくは、本発明による抗体は配列番号１および７を含む。別の実施形態では、本発明による抗体は配列番号２および８を含む。本発明による抗体は、配列番号３および９または配列番号４および１０、または配列番号５および１１、または配列番号６および１２を含んでいてもよい。

本発明によるさらなる好ましい実施形態において、抗体は配列番号１、７、および９８を含む。別の実施形態では、本発明による抗体は配列番号２、８、および９８を含む。本発明による抗体は、配列番号３、９、および９８、または配列番号４、１０、および９８、または配列番号５、１１、および９９、または配列番号６、１２、および９８を含んでいてもよい。

本発明によるさらなる好ましい実施形態において、抗体は配列番号１、７、および９７を含む。別の実施形態では、本発明による抗体は配列番号２、８、および９７を含む。本発明による抗体は、配列番号３、９、および９７、または配列番号４、１０、および９７、または配列番号５、１１、および９７、または配列番号６、１２、および９７を含んでいてもよい。

本発明によるさらなる好ましい実施形態において、抗体は配列番号１、７、９７および９８を含む。別の実施形態では、本発明による抗体は配列番号２、８、９７および９８を含む。本発明による抗体は、配列番号３、９、９７および９８、または配列番号４、１０、９７および９８、または配列番号５、１１、９７および９９、または配列番号６、１２、９７および９８を含んでいてもよい。

本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはＨＥＲ２結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドであって、
ａ）ＦＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１領域が、式：
（Ｓ／Ｎ）_１−（Ｙ／Ｓ）_２−（Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｙ）_３−（Ｍ／Ｖ／Ｙ）_４−（Ｇ／Ａ／Ｓ／Ｍ）_５−（０／Ｃ）_６
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｈ２領域が、式：
（Ｉ／Ｃ）_１−（Ｉ）_２−（Ｎ／Ｓ／Ｙ）_３−（Ｈ／Ａ／Ｓ／Ｇ）_４−（Ｇ／Ｉ／Ｓ）_５−（Ｄ／Ｇ／Ｓ）_６−（Ｎ／Ｔ／Ｆ／Ｄ／Ｓ）_７−（Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｓ）_８−（Ｙ／Ｈ／Ｔ／Ｓ）_９−（Ｔ／Ｙ／Ｗ）_１０−（Ｆ／Ａ／Ｙ）_１１−（Ｓ／Ａ／Ｙ）_１２−（Ｗ／Ａ／Ｓ）_１３−（Ｗ／Ａ／Ｓ）_１４−（Ｋ／Ａ／Ｗ）_１５−（Ｇ／Ａ／Ｋ）_１６−（０／Ｇ／Ｋ）_１７−（０／ＡＧ）_１８
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｈ３領域が、式：
（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｄ）_１−（Ａ／Ｙ／Ｄ／Ｖ／Ｌ／Ｑ）_２−（Ａ／Ｔ／Ｄ／Ｖ／Ｙ／Ｉ）_３−（Ｐ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｙ）_４−（Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｄ）_５−（Ｄ／Ｇ／Ｓ／Ｙ）_６−（Ｇ／Ｔ／Ｎ／Ｌ／Ｓ）_７−（Ｒ／Ａ／Ｇ）_８−（Ｙ／Ｆ／Ｌ／Ｇ）_９−（０／Ｎ／Ｇ／Ｙ）_１０−（０／Ｉ／Ｙ／Ｌ）_１１−（０／Ｆ）_１２−（０／Ｓ）_１３−（０／Ｌ）_１４
によるアミノ酸配列を含む、
重鎖可変領域（ＶＨ）、
ｂ）ＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３、およびＦＲ−Ｌ４を含み、
ＣＤＲ−Ｌ１領域が、式：
（Ｑ）_１−（Ａ）_２−（Ｓ）_３−（Ｑ）_４−（Ｓ）_５−（Ｉ）_６−（Ｇ／Ｓ／Ｙ）_７−（Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｉ）_８−（Ｙ／Ａ／Ｌ）_９−（Ｌ）_１０−（Ｇ／Ａ／Ｓ）_１１
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、式：
（Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｋ）_１−（Ａ）_２−（Ｓ）_３−（Ｎ／Ｓ／Ｔ）_４−（Ｌ）_５−（Ｅ／Ａ）_６−（Ｆ／Ｓ）_７
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、式：
（Ｑ）_１−（Ｃ／Ｎ／Ｓ）_２−（Ｓ／Ｔ／Ｎ）_３−（Ａ／Ｄ／Ｎ／Ｙ）_４−（Ｙ／Ｖ／Ａ／Ｇ）_５−（Ｇ／Ｓ）_６−（Ｇ／Ｓ）_７−（Ｒ／Ｎ／Ｖ／Ｙ／Ｓ）_８−（Ｙ／Ｓ）_９−（Ｖ／Ｓ／Ｌ）_１０−（Ｇ／Ａ／Ｗ）_１１−（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｆ／Ｅ）_１２−（０／Ｇ）_１３−（０／Ａ）_１４
によるアミノ酸配列を含む、
軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体にも関する。

本明細書では、「０」はその位置に必ずしもアミノ酸がなくてもよいことを示している。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ−Ｌ３の２位にセリンを含む。

最も好ましくは、本発明による抗体は、配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｈ１領域、配列番号２２を含むＣＤＲ−Ｈ２領域、配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ３領域、ならびに配列番号３４を含むＣＤＲ−Ｌ１領域、配列番号４０を含むＣＤＲ−Ｌ２領域、および配列番号４６を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含む。

本発明によるモノクローナル抗体はウサギ抗体であってよい。好ましい実施形態において、本発明の抗体はウサギ／ヒトキメラ抗体である。さらなる好ましい形態において、抗体はヒト化抗体である。

したがって、好ましい実施形態において、本発明による抗体は、
ａ）ＦＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４を含み、
ＣＤＲ−Ｈ１領域が、式：
（Ｓ／Ｎ）_１−（Ｙ／Ｓ）_２−（Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｙ）_３−（Ｍ／Ｖ／Ｙ）_４−（Ｇ／Ａ／Ｓ／Ｍ）_５−（０／Ｃ）_６
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｈ２領域が、式：
（Ｉ／Ｃ）_１−（Ｉ）_２−（Ｎ／Ｓ／Ｙ）_３−（Ｈ／Ａ／Ｓ／Ｇ）_４−（Ｇ／Ｉ／Ｓ）_５−（Ｄ／Ｇ／Ｓ）_６−（Ｎ／Ｔ／Ｆ／Ｄ／Ｓ）_７−（Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｓ）_８−（Ｙ／Ｈ／Ｔ／Ｓ）_９−（Ｔ／Ｙ／Ｗ）_１０−（Ｆ／Ａ／Ｙ）_１１−（Ｓ／Ａ／Ｙ）_１２−（Ｗ／Ａ／Ｓ）_１３−（Ｗ／Ａ／Ｓ）_１４−（Ｋ／Ａ／Ｗ）_１５−（Ｇ／Ａ／Ｋ）_１６−（０／Ｇ／Ｋ）_１７−（０／ＡＧ）_１８
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｈ３領域が、式：
（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｄ）_１−（Ａ／Ｙ／Ｄ／Ｖ／Ｌ／Ｑ）_２−（Ａ／Ｔ／Ｄ／Ｖ／Ｙ／Ｉ）_３−（Ｐ／Ａ／Ｓ／Ｇ／Ｙ）_４−（Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｄ）_５−（Ｄ／Ｇ／Ｓ／Ｙ）_６−（Ｇ／Ｔ／Ｎ／Ｌ／Ｓ）_７−（Ｒ／Ａ／Ｇ）_８−（Ｙ／Ｆ／Ｌ／Ｇ）_９−（０／Ｎ／Ｇ／Ｙ）_１０−（０／Ｉ／Ｙ／Ｌ）_１１−（０／Ｆ）_１２−（０／Ｓ）_１３−（０／Ｌ）_１４
によるアミノ酸配列を含む、
重鎖可変領域（ＶＨ）、
ｂ）ＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３、およびＦＲ−Ｌ４を含み、
ＣＤＲ−Ｌ１領域が、式：
（Ｑ）_１−（Ａ）_２−（Ｓ）_３−（Ｑ）_４−（Ｓ）_５−（Ｉ）_６−（Ｇ／Ｓ／Ｙ）_７−（Ｔ／Ｎ／Ｓ／Ｉ）_８−（Ｙ／Ａ／Ｌ）_９−（Ｌ）_１０−（Ｇ／Ａ／Ｓ）_１１
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、式：
（Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｋ）_１−（Ａ）_２−（Ｓ）_３−（Ｎ／Ｓ／Ｔ）_４−（Ｌ）_５−（Ｅ／Ａ）_６−（Ｆ／Ｓ）_７
によるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲ−Ｌ３領域が、式：
（Ｑ）_１−（Ｃ／Ｎ／Ｓ）_２−（Ｓ／Ｔ／Ｎ）_３−（Ａ／Ｄ／Ｎ／Ｙ）_４−（Ｙ／Ｖ／Ａ／Ｇ）_５−（Ｇ／Ｓ）_６−（Ｇ／Ｓ）_７−（Ｒ／Ｎ／Ｖ／Ｙ／Ｓ）_８−（Ｙ／Ｓ）_９−（Ｖ／Ｓ／Ｌ）_１０−（Ｇ／Ａ／Ｗ）_１１−（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｆ／Ｅ）_１２−（０／Ｇ）_１３−（０／Ａ）_１４
によるアミノ酸配列を含む、
軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ＦＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むヒト化抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはＨＥＲ２結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドである。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＤＲ−Ｌ３の２位にセリンを含む。

好ましくは、本発明による抗体は、配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｈ１領域、配列番号２２を含むＣＤＲ−Ｈ２領域、配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ３領域、ならびに配列番号３４を含むＣＤＲ−Ｌ１領域、配列番号４０を含むＣＤＲ−Ｌ２領域、および配列番号４６を含むＣＤＲ−Ｌ３領域を含むヒト化抗体である。

本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合する抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはＨＥＲ２結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドであって、ヒトＦｃ受容体に結合してＦｃＲ媒介性シグナル伝達経路を誘導する、抗体も包含する。

好ましくは、本発明による抗体は、市販の抗体と比較すると、ＦｃＲ媒介性シグナル伝達経路の誘導の増大を示す。

驚くべきことに、発明者らは、トラスツズマブより、ＦｃγＲＩＩＩａ媒介性活性の少なくとも５０の倍率増大（ＦｏＩ：誘導倍率）（図２ｃ）、実施例１参照）、すなわち少なくとも２倍高いＮＦＡＴ経路活性化を示すいくつかの分子を特定した。トラスツズマブは最大２６の誘導倍率（ＦｏＩ）を示す（図２ａ）参照）。

より具体的には、本発明による抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａアッセイにおいて、Ｆｃ受容体シグナル伝達活性を少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは７０倍またはそれを上回って増大させることができる（実施例１、図２ｂ）ｃ）参照）。

本発明による抗体が、ＦｃγＲＩＩＩａアッセイにおいて、Ｆｃ受容体シグナル伝達活性を１７倍、好ましくは２２倍、より好ましくは５０倍、最も好ましくは７０倍増大させることが好ましい。

本発明による抗体は、市販の抗体より強力でもある。

ＳＢＫＲ−３細胞では、本発明による抗体は、５２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で、好ましくは１００倍超、より好ましくは１１０倍超、１２０倍超、より好ましくは１３０倍超のＦｃＲシグナル伝達刺激を示す。好ましい抗体は、ＦｃＲシグナル伝達を５２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で１３２倍増大させることができる（図６参照）。このことは、トラスツズマブよりはるかに高いシグナル伝達効力を反映している。トラスツズマブは、８１ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で同等のシグナル伝達増大を示す。

がん療法に使用される従来の抗体と比較したこの活性増大は、ＨＥＲ２媒介性疾患の治療での使用にあたって優位であることおよび際立った潜在能力を明らかに示している。

市販の、がん療法に従来使用されてきたモノクローナル抗体よりも有効な新規のモノクローナル抗体を見出すため、発明者らは最も有望な候補抗体を選択し、競合アッセイでこれらを試験した（実施例２）。

驚くべきことに、いくつかの分子が、乳がん療法における至適の抗体であるトラスツズマブ（ＴＺ）およびペルツズマブ（ＰＺ）とは異なるエピトープに結合する、すなわち異なる独自の作用様式を示すことが判明した。ＮＦＡＴ経路刺激アッセイにおける上記分子による活性増大（実施例１、図２）と組み合わせて、示差的な結合特性により、上記分子はＨＥＲ２媒介性疾患を治療するのに使用するための理想的な新規の試薬となる。

したがって、本発明による抗体は、トラスツズマブとは異なるエピトープに結合する。好ましくは、本発明による抗体は、ペルツズマブとも異なるエピトープに結合する。

このことは、本発明による抗体が、エピトープ競合アッセイ（図３）でトラスツズマブと競合しないことを意味する。

エピトープ競合アッセイでペルツズマブと競合しない、本発明による抗体も好ましい。Ｂ１０６およびＢ１１５と呼ばれる抗体を除き、抗体はエピトープ競合アッセイ（図３）でペルツズマブと競合しないことが好ましい。

本発明による抗体は、標的への結合に関して非常に強力であるという利点を有する。これらは、抗原であるＨＥＲ２に対し強い結合能力を示すが、その他の受容体に対しては示さない。抗体の結合特性については、生化学的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ−実施例３および４参照）で研究を行い、図４、５および７に図示する。

本発明による好ましい抗体は、実施例３）に記載される実験で、半最大有効濃度（ＥＣ５０）８ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは６ｎｇ／ｍｌ超を示す。好ましい抗体、ＭＡＢＤ Ｂ１００は、トラスツズマブおよびペルツズマブのＥＣ５０と同等の５．２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示す（図４参照）。

際立ったことに、本発明による抗体は、ＨＥＲ２がＳＫ−ＢＲ−３細胞株で発現された実験でも、抗原への非常に強い結合を示す（実施例５参照）。好ましくは、抗体は１００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは８０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を示す。本発明による好ましい抗体、ＭＡＢＤ Ｂ１００は、トラスツズマブおよびペルツズマブのＥＣ５０と同等の７８ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示す。

本発明による抗体は、その結合特性も非常に特異的である。これらはＨＥＲ２に対しては強い結合を示すが、相同な受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４に対しては示さない。このことは図７で図示される。際立ったことに、発明者らはこのことが、使用した濃度とは無関係であることを発見した。試験された抗体は全て、１ｎｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内でＨＥＲ２への特異的な結合を示す。ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡでのＥＣ５０の１００倍を超える濃度であっても、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４への結合シグナルは検出されなかった。

発明者らは、本発明による抗体が、ヒトＨＥＲ２に結合するだけでなくＨＥＲ２オルソログにも結合可能であることも発見した。本発明による抗体が、ヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２受容体への強い結合を示すことが好ましい。これらは、ラットＨＥＲ２受容体に対しては部分的な結合を示しうる。図７ｂ）に示すように、本発明による各種抗体の、ヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２受容体への結合は同様のＥＣ５０値で同等の強度であり、試験された抗体はラットＨＥＲ２に対しても部分的な反応性を示した（ＥＣ５０＞１００ｎｇ／ｍＬ）が、マウスＨＥＲ２に対しては反応性を示さなかった。

驚くべきことに、市販の抗体および先行技術の抗体とは対照的に、発明者らは、本発明の抗体が、カンプトテシンなどの細胞毒性薬物と同等の有効性でアポトーシスを誘導可能であることを発見した。これは、異なる作用様式を有するその他のＨＥＲ２抗体の活性に加えての、際立った活性である。さらなる毒性のリスクはない。トラスツズマブおよびペルツズマブとは対照的に、本発明の抗体は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞株実験において、陽性対照カンプトテシンと比較して、細胞の少なくとも６０％、好ましくは６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、最も好ましくは８５％超でアポトーシスを誘導することができる。本発明の一実施形態において、トラスツズマブではわずか１０％およびペルツズマブではわずか１２％であったのとは対照的に、抗体は細胞の７５％でアポトーシスの誘導を示す（図８）。

先に述べたように、本発明によるモノクローナル抗体はウサギ抗体であってよい。好ましくは、これはウサギ／ヒトキメラ抗体である。さらなる好ましい形態では、抗体はヒト化抗体である。

本発明による抗体のヒト化形態は、そのキメラ形態の好適な特性を維持している。例えばこれらは、強い結合能力および効力を保つ。本発明による好ましいヒト化抗体は１０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を示す。他の実施形態において、抗体は９ｎｇ／ｍｌ未満、８ｎｇ／ｍｌ未満、７ｎｇ／ｍｌ未満または６ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０、最も好ましくは５．３ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示す。図９は本発明の好ましい抗体のいくつかの例およびその効力を示す。

また、本発明による抗体のヒト化形態は、ＳＫ−ＢＲ−３実験で強い結合能力を示す（例えば図１０、実施例４参照）。本発明による好ましいヒト化抗体は８０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を示す。他の実施形態において、抗体は７０ｎｇ／ｍｌ未満、６０ｎｇ／ｍｌ未満、５０ｎｇ／ｍｌ未満または４０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０、または最も好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を示す。図１０は本発明の好ましい抗体のいくつかの例およびその効力を示す。

本発明によるヒト化抗体は、強いＦｃγ−受容体シグナル伝達を誘導することもできる。好ましくは、Ｆｃｙシグナル伝達は、抗体のキメラ形態のシグナル伝達と同等であるかより強力である。Ｆｃｙシグナル伝達の誘導が、市販の抗体より強いことも好ましい。本発明のある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、３００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ未満、１００ｎｔ／ｍｌ未満、９５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０、最も好ましくは６０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を有する。

先に注記されたように、市販の抗体および先行技術の抗体とは対照的に、本発明の抗体はアポトーシスを誘導することができる。このことは、抗体のヒト化形態にも当てはまる。本発明のヒト化抗体は、少なくとも６０％、好ましくは６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、最も好ましくは８５％超のアポトーシス誘導を示す（図１２、実施例７）。

際立ったことに、市販の抗体とは対照的に、発明者らは驚くべきことに、本発明の抗体が、マウスにおいて腫瘍量を著しく減少させることができることを発見した。ＨＴＭ−ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍モデルにおいて、本発明による抗体は、トラスツズマブおよびペルツズマブとは対照的に、腫瘍サイズおよびがん細胞量を劇的に減少させることができる。

本発明の好ましい抗体は、トラスツズマブと比較して、腫瘍細胞数を８０％超、好ましくは８５％超、最も好ましくは９０％超減少させることができる（図１３参照）。

発明者らは、様々な組織の組織切片および腫瘍細胞数をフローサイトメトリーで分析することでも、本発明による抗体の強い抗腫瘍および転移抑制活性を見出した。トラスツズマブおよびペルツズマブなどの市販の抗体、ならびに先行技術のその他の抗体とは対照的に、本発明の抗体は腫瘍細胞数を強力に減少させる。例えば、前記抗体による治療後、肺、肝臓および脳組織で腫瘍細胞数が減少する（図１４ａ）およびｂ）参照）。

さらに、本発明の抗体は、市販の抗体および先行技術のその他の抗体とは対照的に、腫瘍細胞の転移を効率的に阻害することができる。例えば、抗体は、トラスツズマブおよびペルツズマブとは対照的に、腫瘍細胞の骨髄への広がりを阻害することができる（図１５）。

特定の好適な特性により、本発明による抗体は、その標的抗原の調節不全が根本的な原因である疾患の治療に特に適している。これらの特定の特性により、これらは市販の抗体および先行技術のその他の抗体よりはるかに適している。

したがって、本発明による抗体は、ＨＥＲ２の調節不全が根本的な原因である疾患の治療に特に有用である。

したがって、本発明は、ＨＥＲ−２媒介性疾患の治療に使用するための、本発明による抗体も包含する。

したがって、本発明は、薬学的に有効な量の本発明による抗体を患者に投与するステップを含む、患者のＨＥＲ−２媒介性疾患を治療する方法にも関する。

さらに、本発明は、薬学的に許容される担体、および本発明による治療有効量の抗体を含む医薬組成物に関する。

本明細書では、「医薬用担体」は、生理的に適合性がある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、等のいずれか及び全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適している。

本発明の組成物は、当業者に公知の様々な方法によって投与され得る。当業者に認識されるであろうように、投与の経路および／または様式は、所望の結果によって変化することになる。特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物を、不活化を防止する材料でコーティングする、または化合物を、その材料と同時投与する必要がある場合がある。例えば、化合物は、適当な担体、例えば、リポソームまたは希釈剤中で対象に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝液がある。医薬用担体は、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液もしくは分散液および無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当業者に公知である。

本明細書では句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、腸内および局所投与以外の投与の様式を意味し、通常注射により、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入を含むが、これに限定されない。

これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有することができる。微生物の存在の防止は、上記殺菌手順と様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。組成物に例えば糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましい場合もある。加えて、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらすことができる。選択される投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業技術者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって有毒であることなく、特定の患者、組成物および投与の様式に関して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出率、処置期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、年齢、性別、体重、症状、全体的な健康および処置される患者の以前の病歴、ならびに医術において周知の因子などを含めた様々な薬物動態学的因子に依存することになる。

本発明の一態様は、本出願において定義される、がんの処置に使用するための本発明による医薬組成物である。

本発明の別の態様は、患者に本発明による医薬組成物を投与する工程を含む、患者においてＨＥＲ−２媒介性疾患を処置する方法である。このようなＨＥＲ−２媒介性疾患にはがんが含まれ得る。

本明細書では用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、胃部がん、大腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、上皮小体のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎細胞がん、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、上記がんのいずれかの難治性バージョン、または上記がんの１つもしくは複数の組合せを含むものであり得る。好ましくはそのようながんは、乳がん、大腸がん、肺がんまたは膵臓がんである。最も好ましくは、がんは乳がんである。

実施例
図および表と併せて、以下の実施例を使用して本発明について例示する。

ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達アッセイ
例えばＰｒｏｍｅｇａから市販されているＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達アッセイにより、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体シグナル伝達の早期検出、それにより有効な抗体候補の選択が可能となる。

アッセイ原理：
各抗原（ＨＥＲ２）を提示する標的細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、試料抗体およびＪＩＭＴ−１細胞とともにインキュベートする。Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片に対し高い親和性を有するＦｃγＲＩＩＩａ受容体Ｖ１５８を安定に発現し、ＮＦＡＴ−ＲＥ−プロモーター部位を含み、それによりルシフェラーゼ発現の誘導を可能にする。抗体が標的（ＨＥＲ２発現）細胞に結合すると、抗体がＦｃγＲＩＩＩａ受容体にＦｃ媒介性結合することにより、ＮＦＡＴ経路、ゆえにルシフェラーゼ発現を活性化する。ルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）を添加すると、フォトルミネセンスを生じる経路が活性化され、これを測定し、抗体の受容体への結合すなわちその免疫学的活性と定性的かつ半定量的に相関させることができる。ルシフェラーゼのシグナル強度は、活性化された受容体の数と相関する。

アッセイ手順
１日目
− マイクロタイタープレートの各ウェルに、例えば培地２５μｌ中のＪＩＭＴ−１細胞７５００または１５０００個を添加する。
− 細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で２０〜２４時間インキュベートする。
２日目
− ルシフェラーゼアッセイ緩衝液およびルシフェラーゼ基質を室温に平衡化する。

ＦｃγＲＩＩＩａアッセイ緩衝液の作製：
− ３７℃のウォーターバスで、少量ＩｇＧ含有ＦＣＳ（「低ＩｇＧ ＦＣＳ」Ｈｙｃｌｏｎｅ ｄｅｒ Ｆｉｒｍａ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＨ ３０８９８．０３）を解凍する。
− 「低ＩｇＧ ＦＣＳ」をＤＭＥＭ細胞培養培地（最終濃度：４％）に添加する
− ウォーターバスで３７℃に温める。

付随物：
− ピペットロボット（ＣｙＢｉ−Ｗｅｌｌ ｖａｒｉｏ、ＣｙＢｉｏ）で、各ウェルから培地２３μＬを除去する。
− 試料抗体（「低ＩｇＧ ＦＣＳ」培地で希釈）１６μＬおよびエフェクター細胞懸濁液（ｃ＝５０００００／ｍＬ、４０００細胞／ウェル）８μＬを添加する。
− ６時間インキュベートし、その後ルシフェラーゼアッセイ試薬（緩衝液および基質、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）２０μＬを添加し、室温で１０分間インキュベートする。
− 発光を光度測定（Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ）する
− ＮＦＡＴ経路の非特異的な自発的活性化から生じるランダムな発光を差し引く

ＦｏＩ＝（ＲＬＵ試料−ＲＬＵブランク）：（ＲＬＵエフェクター−ＲＬＵブランク）
試料：抗体試料
ブランク：ブラインド値（緩衝液のみ）
エフェクター：抗体不含の培地／緩衝液中のエフェクター細胞
ＦｏＩ：ｘ倍活性化としてのシグナル対ブランク比（誘導倍率）
ＲＬＵ：光度計の尺度（相対的な発光単位）

後のキメラ抗体生成のため、ＦｃγＲＩＩＩａ活性化のそれぞれの誘導倍率（ＦｏＩ）に関して候補抗体を選択した。次いで、生じた組換え抗体をフォローアップ実験で試験した。

エピトープ競合アッセイ
アッセイ原理
− モノクローナル参照抗体に結合する抗ヒトＦｃで、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルマイクロタイタープレートをコーティングする。このプレートを「アッセイプレート」と呼ぶ。
− 標的抗原（ここでは：ＨＥＲ２、Ｈｉｓタグで標識）および抗ｈｉｓ抗体（ＰＯＤで標識）とともに試料抗体を事前インキュベートする
− 事前インキュベーション混合物をアッセイプレートに添加する。

材料：
プレート：プレート１：３８４ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；カタログ番号４６４７１８（アッセイプレート）
プレート２：事前インキュベート用プレート：ＡｘｙｇｅｎまたはＤｅｅｐｗｅｌｌ ３８４プレートのいずれかからのＰＰ−プレート
コーティングＡｂ：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）；Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｉ２１３６；アッセイ濃度：０．５μｇ／ｍｌ
タンパク質：組換えヒトＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２ Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号１１２９−ＥＲ；作用濃度：体積次第（アッセイ濃度０．３μｇ／ｍＬ）
基準Ａｂ：ハーセプチン；Ｒｏｃｈｅ；濃度：希釈次第；
検出Ａｂ：モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート；Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ａ７０５８；作用濃度：体積次第（５．１．１を参照のこと／アッセイ濃度０．５μｇ／ｍＬ／例えば（９０＋５＋５）μＬでは＝２０*０．５μｇ／ｍＬ＝６μｇ／ｍＬ）
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ、Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ：ウシ血清由来ウシ血清アルブミンフラクションＶ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｐ１３７９
ＴＭＢ：ＴＭＢ溶液；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号ＣＬ０７
ＨＣｌ：１Ｍ Ｔｉｔｒｉｐｕｒ塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡ緩衝液：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ

アッセイ手順
１．ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）のＰＢＳ溶液２０μｌでＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートをコーティングし、室温で１時間インキュベートする（プレート１）。
２．１プレートあたり洗浄緩衝液９０μｌで洗浄ステップ３回
３．ブロッキング緩衝液９０μｌとともにプレートを室温で１時間インキュベートする
４．１プレートあたり洗浄緩衝液９０μｌで洗浄ステップ３回
５．一次抗体（０．２μｇ／ｍｌ）のＥＬＩＳＡ緩衝液溶液２０μｌとともにプレートをＲＴで１ｈインキュベートする。同時に、異なるプレート（プレート２）で、事前インキュベーション混合物を作製する：試料抗体のＥＬＩＳＡ緩衝液溶液（作用濃度：＞２μｇ／ｍｌ；対照抗体でも同一濃度）、ＥＬＩＳＡ緩衝液のみ（ブランク）それぞれ９０μｌを、ＨＩＳ−タグ含有タンパク質（例えばＨＥＲ２−ＨＩＳ−タグ）５μｌと混合する。抗ＨＩＳ ＰＯＤ−抗体５ｍｌを添加し、混合物を室温で１ｈインキュベートする。
６．一次抗体含有プレートを洗浄緩衝液９０μｌで３回洗浄する。
７．事前インキュベーション混合物２０μｌをプレート２からプレート１のウェルに添加し、室温で１ｈインキュベートする
８．洗浄緩衝液で６回洗浄する
９．ウェルそれぞれにＴＭＢ２５μｌを添加する。
１０．十分に発色させた後、ＨＣｌ２５μｌで反応を停止させる。
１１．４５０ｎｍ／６２０ｎｍでの吸収を測定する。

ＨＥＲ２生化学的ＥＬＩＳＡ（プロトコール１）
材料：
プレート：３８４ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート；ＮＵＮＣ；カタログ番号４６４７１８
コーティングタンパク質：ヒトＨｅｒ１（組換えヒトＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１ Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号３４４−ＥＲ）
ヒトＨｅｒ２（組換えヒトＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２ Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号１１２９−ＥＲ）
ヒトＨｅｒ３（組換えヒトＥｒｂＢ３／Ｈｅｒ３ Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号３４８−ＲＢ）
ヒトＨｅｒ４（組換えヒトＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４ Ｆｃキメラ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号１１３１−ＥＲ）
ｃｙｎｏ Ｈｅｒ２（カニクイザルＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２タンパク質；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；カタログ番号９０２９５−Ｃ０８Ｈ）
ラットＨｅｒ２（ラットＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２タンパク質；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；カタログ番号８００７９−ＲＣＣＨ）
マウスＨｅｒ２（マウスＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２タンパク質；Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＥＲ２−Ｍ５２２０）
一次Ａｂ：トラスツズマブ
ペルツズマブ
ＭＡＢＤ Ｂ１００
ＭＡＢ−１６−０１６０
ＭＡＢ−１６−０１６１
ＭＡＢ−１６−０１６３
ＭＡＢ−１６−０１６５
検出Ａｂ：抗ヒトＦａｂ２ ＰＯＤ−抗体；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ；ＳＴＡＲ１２６Ｐ
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ、Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
ＢＳＡ：ウシ血清由来ウシ血清アルブミンフラクションＶ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１０７３５０８６００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｐ１３７９
ＴＭＢ：ＴＭＢ溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＳＢ０２
ＨＣｌ：１Ｍ Ｔｉｔｒｉｐｕｒ塩酸；Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０９０５７１０００
ＥＬＩＳＡ緩衝液：ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
試料：ＥＬＩＳＡ緩衝液での希釈はプロジェクト次第である（高濃度ＩｇＧでは１：２希釈が推奨される）

手順：
１．望ましいコーティングタンパク質をＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに希釈し、１２．５μＬを３８４ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに添加する。
２．室温で１ｈインキュベートする。
３．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
４．各ウェルにブロッキング緩衝液９０μＬを添加し、室温で１ｈインキュベートする。
５．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
６．ＥＬＩＳＡ緩衝液で希釈された望ましい一次抗体１２．５μＬを望ましい濃度になるまで添加する。
７．室温で１ｈインキュベートする。
８．洗浄緩衝液で３回洗浄する。
９．ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：５０００に希釈された検出抗体１２．５μＬを添加し、室温で１ｈインキュベートする。
１０．洗浄緩衝液で６回洗浄する。
１１．ＴＭＢ１５μＬを添加する。
１２．十分な発色時間の後にＨＣｌ１５μＬを添加する。
１３．４５０ｎｍ／６２０ｎｍでの吸光度を読み取る。
１４．Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（Ｆｉｔ Ｍｏｄｅｌ：２０５、４つのパラメータ全てについてＰｒｅ−Ｆｉｔであり、いずれのパラメータにも制約はない。ＥＣ_５０＝パラメータＣ）でデータを分析する

ＳＫ−ＢＲ−３への細胞結合（プロトコール２）
材料：
細胞培養プレート：黒色、３８４ウェル、透明平底Ｃｏｒｎｉｎｇ細胞培養プレート；Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３７６４
細胞：ＳＫ−ＢＲ−３；ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−３０
一次Ａｂ：トラスツズマブ
ペルツズマブ
ＭＡＢＤ Ｂ１００
ＭＡＢ−１６−０１６０
ＭＡＢ−１６−０１６１
ＭＡＢ−１６−０１６３
ＭＡＢ−１６−０１６５
検出Ａｂ：ＡＦ４８８−ｃｏｎｊ．ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ α−ＨｕＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Ｆｒａｇｍ．Ｓｐｅｃｉ．；Ｄｉａｎｏｖａ；カタログ番号１０９−５４６−００３
蛍光色素：Ｈｏｅｃｈｓｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｈ３５７０
ＦＣＳ：既定ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎児血清；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＳＨ３００７０．０３
細胞培地：安定グルタミン、２．２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３含有ＭｃＣｏｙ’ｓ；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号Ｐ０４−０６５００＋１０％ＦＣＳ
ＰＢＳ：Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ａ Ｂｏｘ、Ｐｒｅｍｉｘｅｄ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｘ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号１１６６６７８９００１
Ｔｗｅｅｎ２０：Ｔｗｅｅｎ２０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｐ１３７９
細胞洗浄緩衝液：ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ

手順：
１．細胞培養プレートに、望ましい濃度になるまで細胞培地で希釈された一次抗体２０μＬを添加する。
２．同一のウェルに、細胞培地２０μＬ中の細胞（１，０００細胞／ウェル）を播種する。
３．３７℃および５％ＣＯ２で４ｈまたは一晩インキュベートする。
４．細胞洗浄緩衝液７５μｌで３回洗浄する。
５．濃度２５０ｎｇ／ｍＬになるまで細胞培地で検出抗体を希釈し、２０μｌを試験ウェルに添加する。
６．３７℃および５％ＣＯ２で４ｈインキュベートする。
７．濃度２２．５μｇ／ｍＬになるまで細胞培地で蛍光色素を希釈し、５μｌを試験ウェルに添加する。
８．室温で１０分〜１ｈインキュベートする。
９．ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（１ウェルあたりの最少対象物：細胞２５０個）で、抗体の細胞への結合について分析する
１０．Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（Ｆｉｔ Ｍｏｄｅｌ：２０５、４つのパラメータ全てについてＰｒｅ−Ｆｉｔであり、いずれのパラメータにも制約はない。ＥＣ_５０：パラメータＣ）でデータを分析する

Ｆｃｙ−受容体シグナル伝達（プロトコール３）
材料：
プレート：蓋付き白色平底３８４ウェルアッセイプレート；Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３５７０
標的細胞：ＳＫＢＲ−３；ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−３０
エフェクター細胞：ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７０１１
基準ｍＡｂ：トラスツズマブ
ペルツズマブ
ＭＡＢＤ Ｂ１００
ＭＡＢ−１６−０１６０
ＭＡＢ−１６−０１６１
ＭＡＢ−１６−０１６３
ＭＡＢ−１６−０１６５
ＡＤＣＣアッセイ緩衝液：ＲＰＭＩ１６４０培地および低ＩｇＧ血清；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７０１０
ＦＣＳ：既定ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎児血清；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号ＳＨ３００７０．０３
標的細胞培地：安定グルタミン、２．２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３含有ＭｃＣｏｙ’ｓ；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号Ｐ０４−０６５００＋１０％ＦＣＳ
ルシフェラーゼアッセイ試薬：ＢｉｏＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液およびＢｉｏＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質；Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ７０１０

手順：
１日目：
１．標的細胞を播種する：標的細胞培地２５μＬ中２５００細胞／ウェル
２．３７℃、５％ＣＯ２で２０〜２４ｈインキュベートする。
２日目：
３．製造業者の説明書に従ってルシフェラーゼアッセイ試薬を調製する。
４．製造業者の説明書に従ってＡＤＣＣアッセイ緩衝液を調製する。
５．アッセイプレートの全てのウェルから培地２３μＬを除去する。１ウェルあたり８μＬの事前に温めたＡＤＣＣアッセイ緩衝液をプレートに穏やかに添加する。
６．望ましい濃度になるまでＡＤＣＣアッセイ緩衝液で望ましい一次抗体を希釈し、ウェルに抗体希釈液８μＬを添加する。ブランクとしてＡＤＣＣアッセイ緩衝液を添加する。プレートをベンチで保存する。
７．ウォーターバス３７℃でエフェクター細胞を解凍する（１３ｘ１０^６細胞／バイアル；反転しない）。
８．ピペッティングにより細胞を穏やかに混合する。細胞懸濁液６３０μＬを事前に温めたＡＤＣＣアッセイ緩衝液２４．５７ｍＬに添加する。
９．１ウェルあたり８μＬのエフェクター細胞懸濁液をプレートに添加する（４０００細胞／ウェル）。
１０．プレートを覆い、３７℃、５％ＣＯ２で６ｈインキュベートする。
１１．インキュベーターからプレートを取り出し、室温に平衡化する（１５分）。
１２．試験中のウェル全てにルシフェラーゼアッセイ試薬２０μＬを添加する。
１３．室温で５〜３０分間インキュベートする。
１４．プレートリーダーを使用して発光を測定し、ＢｉｏＧｌｏ（商標）アッセイの製造業者の説明書に従って結果を算出する。
１５．Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（Ｆｉｔ Ｍｏｄｅｌ：２０５、４つのパラメータ全てについてＰｒｅ−Ｆｉｔであり、いずれのパラメータにも制約はない。ＥＣ５０：パラメータＣ）でデータを分析する

アポトーシスアッセイ（プロトコール５）
材料：
細胞培養プレート：６ウェル細胞培養プレート、Ｎｕｎｃｌｏｎ表面；Ｎｕｎｃ；カタログ番号：１４０６８５
アッセイプレート：９６−ＤＷＰ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄプレート；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；カタログ番号：００３０６０２．３０７
細胞：ＳＫＢＲ−３；ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−３０
ＦＣＳ ウシ胎児血清南アフリカ低ＩｇＧ（ＰＡＮ；カタログ番号１５５２−Ｐ１２０９０９）
細胞およびアッセイ培地：ＤＭＥＭ；ＰＡＮ；Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｐ０４−０４５１０＋５％ＦＣＳ
一次Ａｂ：ペルツズマブ
トラスツズマブ
ＭＡＢＤ Ｂ１００
ＭＡＢ−１６−０１６０
ＭＡＢ−１６−０１６１
ＭＡＢ−１６−０１６３
ＭＡＢ−１６−０１６５
試薬：（Ａ）アネキシンＶ ＦＩＴＣ−コンジュゲート；Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ；カタログ番号：３１４９００１３Ｘ２
（Ｃ）カンプトテシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号：Ｃ９９１１
（Ｄ）ＤＲＡＱ７（商標）；Ａｂｃａｍ；カタログ番号：ａｂ１０９２０２
結合緩衝液：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ；Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号：１５６３０−１０６＋１．４Ｍ ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ；カタログ番号：Ｓ７６５３−１ｋｇ＋２５ｍＭ ＣａＣｌ２；Ｆｌｕｋａ；カタログ番号：２１１１４−１Ｌ

プロトコール：
１．細胞培養プレート１ウェルあたり２ｍＬの細胞培地中に細胞を播種する（８ｘ１０^４細胞／ウェル）。７２ｈ；３７℃；５％ＣＯ２でインキュベートする。
２．培地を除去する。
３．プレートに、アッセイ培地（対照ウェル）またはアッセイ培地で望ましい濃度になるまで希釈された一次抗体２ｍＬを添加する。
４．４８ｈ；３７℃；５％ＣＯ２でインキュベートする。
５．陽性対照として、１つまたは複数のウェルにカンプトテシン（２ｍＭ）５μｌを添加する。
６．２４ｈ；３７℃；５％ＣＯ２でインキュベートする。
７．各ウェルの上清を別々の１５ｍｌチューブに移行する
８．ＰＢＳ１．５ｍｌで各ウェルを洗浄し、同一の各１５ｍｌチューブに上清を移行する。
９．各ウェルにトリプシン０．５ｍｌを添加し、３７℃でインキュベートし、次いで細胞培地１．５ｍｌで停止させ、液体を全て各１５ｍｌチューブに移行する。
１０．各１５ｍｌチューブにＰＢＳ５ｍｌを添加する。
１１．１５ｍｌチューブを３００ｇ、３分間、４℃で遠心処理し、上清を捨てる。
１２．事前に冷却した結合緩衝液（４℃）１４０μＬを添加し、再懸濁して７０μＬをアッセイプレートに移行する。
１３．事前に冷却したアネキシン（４℃）５μＬを添加し、混合して氷上／暗所で２０分間インキュベートする。
１４．結合緩衝液で１：１００に希釈されたＤＲＡＱ７（商標）２μＬを添加する。
１５．事前に冷却した結合緩衝液（４℃）１２０μＬを添加し、混合して氷上／暗所で７分間インキュベートする。フローサイトメトリー分析を実施する。

［図面の簡単な説明］
［図１］配列（１文字コードでのアミノ酸）
可変領域（ＶＲ）の全配列：
重鎖：ＶＨ全配列：配列番号１〜６および配列番号１００〜１０１
軽鎖：ＶＬ全配列：配列番号７〜１２および配列番号１０２〜１０４
ＶＬ配列は９０位にシステインからセリンへの突然変異を含んでいてよい。
相補性決定領域（ＣＤＲ）：
重鎖：ＣＤＲ−Ｈ１：配列番号１３〜１８
ＣＤＲ−Ｈ２：配列番号１９〜２４
ＣＤＲ−Ｈ３：配列番号２５〜３０
軽鎖：ＣＤＲ−Ｌ１：配列番号３１〜３６
ＣＤＲ−Ｌ２：配列番号３７〜４２
ＣＤＲ−Ｌ３：配列番号４３〜４８
フレームワーク領域（ＦＲ）：
重鎖：ＦＲ−Ｈ１：配列番号４９〜５４
ＦＲ−Ｈ２：配列番号５５〜６０
ＦＲ−Ｈ３：配列番号６１〜６６
ＦＲ−Ｈ４：配列番号６７〜７２
軽鎖：ＦＲ−Ｌ１：配列番号７３〜７８
ＦＲ−Ｌ２：配列番号７９〜８４
ＦＲ−Ｌ３：配列番号８５〜９０
ＦＲ−Ｌ４：配列番号９１〜９６
定常領域（ＣＲ）：
軽鎖：ＣＲ−Ｌ：配列番号９７
重鎖：ＣＲ−Ｈ：配列番号９８〜９９

［図２］ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達アッセイによる抗体選択
アッセイ手順の詳細については実施例１で開示されている。ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達の誘導倍率（ＦｏＩ）に関して候補抗体を選択した。
ａ）抗体濃度に応じた、トラスツズマブによるＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達のＦｏＩ。最大ＦｏＩは約２６である。
ｂ）選択された候補抗体によるＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達のＦｏＩ。最大ＦｏＩは７５超である。
ｃ）組換えキメラ抗体を産生するため、それぞれのＦｏＩに従って候補抗体を選択した。フォローアップ実験における、キメラ抗体のＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達結果が示される。

［図３］エピトープ競合アッセイ
選択された本発明による抗体はいずれも、そのエピトープについてトラスツズマブと競合しないが、ハーセプチン（陽性対照）ではＰＯＤシグナルが８０％超低下する（＋＋＋）。陽性対照として、事前インキュベーション混合物中にペルツズマブが存在すると、濃度依存的にＰＯＤシグナルが８０％超低下する（＋＋＋）。Ｂ１０６はペルツズマブとのエピトープ競合を示し、Ｂ１１５はペルツズマブエピトープについて部分的な競合を示す。エピトープ競合は、選択されたその他の本発明による候補抗体ではいずれとも観察されない。

［図４］ＨＥＲ２生化学的ＥＬＩＳＡ
示される結果は、実施例３に記載される実験で得られた。
本発明による好ましい抗体、ＭＡＢＤ Ｂ１００は、トラスツズマブおよびペルツズマブのＥＣ５０と同等の５．２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示す。

［図５］ＳＫ−ＢＲ−３細胞株への結合
示される結果は、実施例４に記載される実験のものである。
本発明による好ましい抗体、ＭＡＢＤ Ｂ１００は、トラスツズマブおよびペルツズマブのＥＣ５０と同等の７８ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示す。

［図６］Ｆｃγ−受容体シグナル伝達
示される結果は、実施例５に記載される実験で得られた。
本発明による好ましい抗体、ＭＡＢＤ Ｂ１００は、５２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で１３２倍のＦｃＲシグナル伝達刺激を示す。トラスツズマブは、８１ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で同等のシグナル伝達強度を示す。このことは、市販の抗体を上回る効力の改善を強調している。

［図７］ＥＬＩＳＡ実験における受容体結合
生化学的ＥＬＩＳＡ実験で、様々な受容体への抗体結合について試験した。実験は、実施例３で詳述されるプロトコール（プロトコール１）に従って実施した。
ａ）ホモログＨＥＲ受容体への結合
試験された抗体は全て、１ｎｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内でＨＥＲ２への特異的な結合を示す。ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡでのＥＣ_５０の１００倍を超える濃度であっても、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４への結合シグナルは検出されなかった。
ｂ）ＨＥＲ２オルソログへの結合
本発明による抗体の、ヒトおよびカニクイザルＨＥＲ２受容体への結合は、同様のＥＣ_５０値で同等であった。抗体はラットＨＥＲ２に対しても部分的な反応性を示した（ＥＣ_５０＞１００ｎｇ／ｍＬ）が、マウスＨＥＲ２に対しては反応性を示さなかった。

［図８］ＳＫ−ＢＲ−３細胞株におけるアポトーシス誘導
図８は、実施例７のプロトコールに従って実施された実験の結果を示す。ｉｎ−ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後のアネキシン染色としてアポトーシス誘導を測定した。陽性対照としてカンプトテシンを使用した（１００％に設定）。トラスツズマブ（１０％）およびペルツズマブ（１２％）とは対照的に、ＭＡＢＤ Ｂ１００は唯一強いアポトーシス誘導を示す（７５％）。

［図９］ヒト化バリアントのＨＥＲ２生化学的ＥＬＩＳＡ
実施例３に従って実施された実験の結果が示される。
４種の好ましいヒト化モノクローナル抗体候補は、キメラ形態の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を維持している。

［図１０］ヒト化ＭａｂバリアントのＳＫ−ＢＲ−３細胞株への結合
実施例４に記載されるプロトコールに従って実験を実施した。
４種のヒト化リードは、キメラ形態のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を維持している。

［図１１］ヒト化ＭａｂバリアントのＦｃγ−受容体シグナル伝達
実施例５に記載されるプロトコールに従って実験を実施した。４種のヒト化リードは、キメラ形態のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を維持している。

［図１２］ヒト化Ｍａｂバリアントのアポトーシス誘導
実施例７に記載されるプロトコールに従って実験を実施した。陽性対照としてカンプトテシン（２列目）を使用した（１００％に設定）。本発明による好ましいヒト化抗体は、際立って強いアポトーシス誘導を示す（６８％〜８３％）。

［図１３−１５］ｉｎ ｖｉｖｏでの実験
十分に確立されたヒト移植マウスモデル（ＨＴＭ）（Ｗｅｇｅら２０１１／２０１４／２０１６）で、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施した。具体的には、ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍細胞株を有するＨＴＭモデルを使用した。このモデルはトラスツズマブ治療に対し抵抗性であり、強い広がりおよび転移を示す。実験は、９週間の免疫系、腫瘍および転移の確立、ならびに１２週間の、抗体またはプラセボによる５ｍｇ／ｋｇ／週、ｉ．ｐ．での治療を含んでいた。

［図１３］ＭＡＢＤ Ｂ１００のｉｎ ｖｉｖｏプロファイル：治療後の腫瘍量
機能するヒト免疫系を有する動物を、治療終了時に分析した。
本発明による好ましい抗体、ＭＡＢＤ Ｂ１００による治療で、対照、トラスツズマブおよびペルツズマブ抗体による治療と比較して腫瘍量の強い減少が生じた。
ＭＡＢＤ Ｂ１００治療による寛解（４／５）または９５％超の減少（１／５）：対照に対してのｐ＝０．０３７
トラスツズマブおよびペルツズマブ治療での効果はなし：有意でない

［図１４］ＭＡＢＤ Ｂ１００のｉｎ ｖｉｖｏプロファイル：抗腫瘍および転移抑制活性
ＨＴＭ−ＳＫ−ＢＲ−３モデルにおいて実験を実施し、結果を定性的に評価した
（Ｙ／Ｎ）：ＩＨＣ（ａ）およびフローサイトメトリー（ｂ）による転移
ａ）組織切片におけるＨＥＲ２＋腫瘍細胞
ｂ）フローサイトメトリーで分析されたＨＥＲ２＋腫瘍細胞
２列目：対照：治療終了時の、機能するヒト免疫系を有する動物
３列目：トラスツズマブによる治療
４列目：ＭＡＢＤ Ｂ１００による治療
５列目：ペルツズマブによる治療
６＋７列目：Ｗｅｇｅら２０１６より含まれる過去データ

［図１５］ＭＡＢＤ Ｂ１００のｉｎ ｖｉｖｏプロファイル：腫瘍細胞の骨髄への広がり
ＨＴＭ−ＳＫ−ＢＲ−３モデルにおいて実験を実施し、結果を定性的に評価した（Ｙ／Ｎ）。骨髄から細胞を単離し、培養した。拡張させた後、ＦＡＣＳにより治療に対する抵抗性について細胞を試験した。
対照：治療終了時の、機能するヒト免疫系を有する動物。
ＭＡＢＤ Ｂ１００は、腫瘍細胞の骨髄への広がりに対する効率的な阻害を示す。

Claims (12)

1. ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片もしくは誘導体、またはＨＥＲ２結合特異性を付与するのに十分な前記抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドであって、前記抗体、抗体の前記断片もしくは抗体の前記誘導体が、
   ａ）配列番号４の重鎖可変（ＶＨ）領域と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１６のＣＤＲ−Ｈ１領域、配列番号２２のＣＤＲ−Ｈ２領域及び配列番号２８のＣＤＲ−Ｈ３領域を含む、ＶＨ領域、および
   ｂ）配列番号１０の軽鎖可変（ＶＬ）領域と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号３４のＣＤＲ−Ｌ１領域、配列番号４０のＣＤＲ−Ｌ２領域及び配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ３領域を含む、ＶＬ領域
   を含む、抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
2. 抗体または断片もしくは誘導体が、ヒトＦｃ受容体にも結合してＦｃＲ媒介性シグナル伝達経路を誘導する、請求項１に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
3. 抗体または断片もしくは誘導体が、ＦｃγＲＩＩＩａアッセイにおいて、Ｆｃ受容体シグナル伝達活性を少なくとも１０倍増大させる、請求項１または２に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
4. 抗体または断片もしくは誘導体が、トラスツズマブとは異なるエピトープに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
5. 抗体または断片もしくは誘導体が、エピトープ競合アッセイにおいてトラスツズマブと競合しない、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
6. 抗体または断片もしくは誘導体が、エピトープ競合アッセイにおいてペルツズマブと競合しない、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
7. 抗体または断片もしくは誘導体が、アポトーシスを誘導することができる、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
8. 抗体がヒト化抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
9. 抗体または断片もしくは誘導体が、腫瘍量、腫瘍の広がりおよび転移を減少させることができる、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
10. ＨＥＲ−２媒介性疾患の治療に使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチド。
11. 薬学的に許容される担体、および治療有効量の請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体、断片もしくは誘導体、またはポリペプチドを含む医薬組成物。
12. ＨＥＲ−２媒介性疾患の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
    

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