JP6960524B2 - マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物及びそれを用いたマイコスポリン様アミノ酸の生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物及び前記微生物を用いたマイコスポリン様アミノ酸の生産方法に関する。
太陽から放出される紫外線は、ＵＶ Ａ（紫外線Ａ，約３２０〜４００ｎｍの領域）と、ＵＶ Ｂ（紫外線Ｂ，約２９０〜３２０ｎｍの領域）と、ＵＶ Ｃ（紫外線Ｃ，約１００〜２８０ｎｍの領域）とから構成されている。太陽光線のうち、紫外線Ａ及びＢは約６％が地表面に到達するのに対して、紫外線Ｃは地上のオゾン層と大気圏で吸収、散乱されて地表面には到達しない。
これらの紫外線は、体内でのビタミンＤの合成、皮膚病の治療、殺菌効果などの有利な面もあるが、日光皮膚炎（Sunburn）、皮膚癌、皮膚老化、光線過敏性皮膚症、突然変異誘発などの有害な面もある。紫外線Ａは真皮層まで侵入して主に色素沈着及び皮膚老化を誘発し、光線過敏性皮膚症の発生に関与し、紫外線Ｂは高エネルギー光線であり、表皮と真皮の上部に侵入して日光皮膚炎、色素沈着及び皮膚癌の発生に関与することが知られている。
太陽光線のこれらの副作用を防止するために、日光を遮断しようとする試みがなされている。紫外線遮断剤の種類としては、化学的紫外線遮断剤（Chemical sunscreen agent）と、物理的紫外線遮断剤（Physical sunscreen agent）が挙げられるが、化学的紫外線遮断剤は主に日光の吸収により、物理的紫外線遮断剤は反射及び散乱により、日光の侵入を防止する。
化学的紫外線遮断剤は、紫外線を吸収する成分を少なくとも１つ含み、紫外線Ｂを主に吸収するＰＡＢＡ、ＰＡＢＡエステル（Amyl dimethyl PABA, octyl dimethyl PABA）、ケイ皮酸塩（Cinnamates: Cinoxate）、サリチル酸塩（Salicylate: Homomenthyl salicylate）、ショウノウ（Camphor）などや、紫外線Ａを主に吸収するベンゾフェノン（Benzophenone: Oxybenzone, Dioxybenzone, Suliso benzene）、ジベンゾイルメタン（Dibenzoyl methane）、アントラニル酸塩（Anthranilate）などが知られている。このような化学的紫外線遮断剤は紫外線を吸収して遮断する効果が得られるが、これらのうちの一部は皮膚や目に刺激を与えることがあり、特にＰＡＢＡ、ＰＡＢＡエステル、ベンゾフェノン、ケイ皮酸などは接触性皮膚炎を誘発することが知られている。また、一部は皮膚の光過敏性反応を誘発するなどの問題が報告されており、一部の国では化学的紫外線遮断剤の使用やその使用量を制限している。
物理的紫外線遮断剤は、自然に存在する成分であり、皮膚に侵入する紫外線を反射、散乱することにより皮膚を保護する。例えば、二酸化チタン（Titanium dioxide）、タルク（Talc; Magnesium silicate）、酸化マグネシウム（Magnesium oxide）、酸化亜鉛（Zinc oxide）、カオリン（Kaolin）などの物理的紫外線遮断剤は、紫外線ＡとＢの両方の紫外線遮断効果を発揮する。これらは接触性皮膚炎などの副作用がなく、水に流されにくいという利点があるが、所望の剤形にすると同時に有効な含有量を維持することは困難であり、皮膚に塗布すると白濁現象などが現れるという欠点がある。
マイコスポリン様アミノ酸（Mycosporine-like amino acids: MAAs）は、自然生物体に存在する物質であり、ＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０ｍｍ）を効果的に吸収することが知られている。ＭＡＡｓは、前駆体であるアミノ酸、シクロヘキサノン（cyclohexanone）又はシクロヘキセンイミン（cyclohexenimine）環の種類によって自然界に３５種以上存在することが知られている（非特許文献４，１５）。近年、様々な糖が付いた形態のＭＡＡｓが微細藻類に存在し、それは抗酸化機能に優れることが報告されている（非特許文献５）。また、ＭＡＡｓは、紫外線遮断能だけでなく、酸化、浸透及び熱ストレスに対する抵抗性などを付与することが知られている（非特許文献１１，１３）。
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しかし、微細藻類内で生産されるＭＡＡｓの量が数μｇレベルと非常に低く、微細藻類を培養してＭＡＡｓを分離、抽出、精製する条件が複雑であるので、ＭＡＡｓ素材を大量生産するのは困難であるという問題がある。
本発明者らは、微生物においてＭＡＡｓの生産を増加させるために鋭意努力した結果、ＭＡＡｓを生産する微生物において３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）タンパク質の活性を不活性化させる多方面の研究によりＭＡＡｓの生産が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明は、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のタンパク質活性が非改変微生物に比べて不活性化された、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記微生物を培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からマイコスポリン様アミノ酸を回収するステップとを含む、マイコスポリン様アミノ酸の生産方法を提供することを目的とする。
本発明の微生物は、マイコスポリン様アミノ酸の生産能が向上するので、マイコスポリン様アミノ酸の生産に効率的に用いられる。
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本明細書で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。さらに、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本明細書に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、このような等価物も本発明に含まれることが意図されている。
前記目的を達成するための本発明の一態様は、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のタンパク質活性が非改変微生物に比べて不活性化された、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物を提供する。
本発明における「３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）」とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的には３−デヒドロキナ酸（3-dehydroquinate）を３−デヒドロシキミ酸（3-dehydroshikimate）に変換するものであるが、これに限定されるものではない。
本発明における「不活性化」とは、本来微生物が有する酵素タンパク質の内在性活性又は修飾前の活性に比べてその活性が低下することや、タンパク質が全く発現しないことや、発現してもその活性がないことを意味する。前記不活性化は、酵素をコードするポリヌクレオチドの変異などにより酵素自体の活性が本来微生物が有する酵素の活性より低下したり、除去された場合や、酵素をコードする遺伝子の発現阻害又は翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が天然の微生物より低下したり、除去された場合や、酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失した場合や、それらの組み合わせを含む概念であるが、これらに限定されるものではない。「非改変微生物」とは、比較対象微生物の特定タンパク質が自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親菌株が本来有していた特定タンパク質の活性を有する微生物を意味する。本発明における「非改変微生物」は、遺伝的変異が起こらない「内在性活性を有する微生物」と混用されてもよい。
前記酵素活性の不活性化は、当該分野で公知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、１）前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、２）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変する方法、３）前記タンパク質の活性が欠失又は低下するようにタンパク質をコードする染色体上の遺伝子配列を改変する方法、４）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、５）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、６）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering, RTE）などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法は、微生物内の染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部のヌクレオチド配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。このようなポリヌクレオチドの全部又は一部を欠失させる方法の一例として、相同組換えによりポリヌクレオチドを欠失させる方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
前記発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
前記染色体上の遺伝子配列を改変する方法は、前記酵素の活性がさらに低下するように、遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された遺伝子配列又は活性がなくなるように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
前記ポリヌクレオチドは、機能するポリヌクレオチドの集合体であれば、遺伝子ともいう。本願において、ポリヌクレオチドと遺伝子は混用されてもよく、ポリヌクレオチド配列とヌクレオチド配列は混用されてもよい。
前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類により異なり、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、さらに具体的には１〜５０個であるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明の微生物は、さらに２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）、トランスケトラーゼ（transketolase I/II）及び３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）からなる群から選択される少なくとも１つの活性、具体的には１つ以上、２つ以上、３つ以上又は全ての酵素の活性が非改変微生物より強化されてもよい。
前記２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的には３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロン酸７−リン酸（3-deoxy-arabino-heptulosonate 7-phosphate）を合成することができるが、これに限定されるものではない。
前記ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的にはホスホエノールピルビン酸を合成することができるが、これに限定されるものではない。
前記トランスケトラーゼ（transketolase I/II）とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味する。
前記３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的には３−デヒドロキナ酸（3-dehydroquinate, 3-DHQ）を合成することができるが、これに限定されるものではない。
本発明における「活性の強化」とは、酵素タンパク質の活性が導入されるか、微生物が有する内在性活性又は修飾前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記活性の「導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が自然に又は人為的に現れるようにすることを意味する。例えば、前記活性の強化には、外来の２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び／もしくは３−デヒドロキナ酸シンターゼを導入して強化すること、又は内在性２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び／もしくは３−デヒドロキナ酸シンターゼの活性を強化することが全て含まれる。具体的には、本願における活性強化の方法は、１）前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変、３）前記酵素の活性を強化する染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）それらの組み合わせにより強化する改変などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われてもよい。また、コピー数の増加の一態様として、酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記酵素と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。前記導入は、公知の形質転換法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより酵素が生成されるので、その活性が増加する。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれてもよい。
具体的には、ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーターなどが挙げられる。より具体的には、コリネバクテリウム属由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献１）又はＣＪ７プロモーター（特許文献２）に作動可能に連結されることにより、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これらに限定されるものではない。
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行われてもよい。
最後に、４）前記１）〜３）の組み合わせにより強化する改変は、前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現を増加させる発現調節配列の改変、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、及び前記酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチド又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの改変の少なくとも１つの方法を共に適用することにより行われてもよい。
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
本発明に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、細胞内染色体挿入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれてもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明における標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。
前記３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び３−デヒドロキナ酸シンターゼの遺伝的情報は、公知のデータベースから得られ、例えば米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information; NCBI）のＧｅｎＢａｎｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び３−デヒドロキナ酸シンターゼは、微生物の種又は微生物に応じて活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、その由来や配列に限定されるものではない。
具体的には、前記３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼは、配列番号７２又は８０のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び３−デヒドロキナ酸シンターゼは、それぞれ配列番号７４、７６、７８、８４のアミノ酸配列を含むタンパク質であるが、これらに限定されるものではない。本発明における「アミノ酸配列を含むタンパク質」は、「アミノ酸配列を有するタンパク質」又は「アミノ酸配列からなるタンパク質」という表現と混用されてもよい。
また、本発明における前記酵素には、各酵素と同一又は相当する生物学的活性を有するものであれば、前述した配列番号だけでなく、前記アミノ酸配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質が含まれてもよい。
さらに、前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に前述した配列番号の酵素タンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
本発明の３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドには、前述した各酵素と同一又は相当する生物学的活性を有するものであれば、前述した配列番号のアミノ酸配列又は前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれてもよい。
また、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、前記ポリヌクレオチドは、各酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
さらに、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより前記３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ及び３−デヒドロキナ酸シンターゼ酵素タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。
本発明における「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％の相同性」と表される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件（stringent condition）下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に公知の方法（例えば、非特許文献２２、２３）で決定されてもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。例えば、このような条件は文献（例えば、非特許文献２２）に具体的に記載されている。
本発明における「マイコスポリン様アミノ酸（mycosporine-like amino acids; MAAs）」とは、紫外線を吸収する環型化合物を意味する。本発明におけるマイコスポリン様アミノ酸は、紫外線を吸収するものであればいかなるものでもよく、具体的にはシクロヘキサノン（cyclohexanone）又はシクロヘキセンイミン（cyclohexenimine）の中心環を有する化合物、又は前記中心環にアミノ酸などの様々な物質が結合された化合物であってもよく、より具体的にはマイコスポリン−２−グリシン（Mycosporine-2-glycine）、パリチノール（Palythinol）、パリテン酸（Palythenic acid）、デオキシガズソール（deoxygadusol）、マイコスポリン−メチルアミン−トレオニン（Mycosporine-methylamine-threonine）、マイコスポリン−グリシン−バリン（Mycosporine-glycine-valine）、パリチン（Palythine）、アステリナ−３３０（Asterina-330）、シノリン（Shinorine）、ポルフィラ−３３４（Porphyra-334）、オイハロテセ−３６２（Euhalothece-362）、マイコスポリン−グリシン（Mycosporine-glycine）、マイコスポリン−オルニチン（Mycosporine-ornithine）、マイコスポリン−リシン（Mycosporine-lysine）、マイコスポリン−グルタミン酸−グリシン（Mycosporine-glutamic acid-glycine）、マイコスポリン−メチルアミン−セリン（Mycosporine-methylamine-serine）、マイコスポリン−タウリン（Mycosporine-taurine）、パリテン（Palythene）、パリテン−セリン（Palythine-serine）、パリテン−セリン−サルフェート（Palythine-serine-sulfate）、パリチノール（Palythinol）、ウスジレン（Usujirene）又はそれらの組み合わせであってもよい。
本発明におけるマイコスポリン様アミノ酸は、ＭＡＡやＭＡＡｓと混用されてもよい。
本発明における「マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物」とは、マイコスポリン様アミノ酸の生合成に関与する酵素の遺伝子又は前記遺伝子のクラスターを含む微生物を意味する。また、本発明における「マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子」とは、マイコスポリン様アミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を意味し、前記遺伝子のクラスターも含まれる。前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子には、それを含む微生物がマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば、微生物の外来及び／又は内在性遺伝子が全て含まれる。前記外来遺伝子は、同種及び／又は異種であってもよい。
前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、それを含む微生物がマイコスポリン様アミノ酸生合成に関与する酵素を生産して結果としてマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば、前記遺伝子の由来微生物種はいかなるものでもよく、具体的にはシアノバクテリア（cyanobacteria）であるアナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）、ノデュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、シアノセイス属ＰＣＣ７４２４（Cyanothece sp. PCC 7424）、リングビア属ＰＣＣ８１０６（Lyngbya sp. PCC 8106）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、ミクロコレス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、シアノセイス属ＡＴＣＣ５１１４２（Cyanothece sp. ATCC 51142）、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属ＣＣＹ０１１０（Cyanothece sp. CCY 0110）、シリンドロスペルマム・スタグナレ属ＰＣＣ７４１７（cylindrospermum stagnale sp,PCC 7417）、アファノテーケ・ハロフィチカ（Aphanothece halophytica）もしくはトリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）であるか、又は菌類（fungi）であるマグナポルテ・オリゼ（Magnaporthe oryzae）、ピレノフォラ・トリチシ・レペンチス（Pyrenophora tritici-repentis）、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Nectria haematococca）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、バーティシリウム・アルボ・アトラム（Verticillium albo-atrum）、ボトリオチニア・フッケリアナ（Botryotinia fuckeliana）、ファエオスファエリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）であるか、又はネマトステラ・ベクテンシス（Nematostella vectensis）、ヘテロカプサ・トリケトラ（Heterocapsa triquetra）、オキシリス・マリナ（Oxyrrhis marina）、カルロディニウム・ミクルム（Karlodinium micrum）、アクチノシネマ・ミルム（Actinosynnema mirum）などであるが、これらに限定されるものではない。
一実施例によれば、本発明のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子を含む。
具体的には、前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、微生物がマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば酵素名や由来微生物が限定されるものではなく、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）及びＣ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）からなる群から選択される少なくとも１つ、具体的には１つ以上、２つ以上、３つ以上又は全ての酵素タンパク質、又はそれと同一及び／もしくは類似の活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
例えば、前記２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）は、セドヘプツロース−７−リン酸（sedoheptulose-7-phosphate）を２−ジメチル−４−デオキシガズソール（2-demethyl-4-deoxygadusol）に変換する酵素である。前記Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）は２−ジメチル−４−デオキシガズソール（2-demethyl-4-deoxygadusol）を４−デオキシガズソール（4-deoxygadusol）に変換する酵素であり、前記４−デオキシガズソール（4-deoxygadusol）のグリシル化（glycylation）は前記Ｃ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）により触媒される。
また、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、マイコスポリン様アミノ酸にさらなるアミノ酸残基を付加する活性を有する酵素の遺伝子又は前記遺伝子のクラスターを含んでもよい。前記遺伝子又は前記遺伝子のクラスターは、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物が少なくとも２つのアミノ酸残基が付加されたマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば酵素名や由来微生物が限定されるものではなく、具体的には非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase: NRPS）、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素（non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme）及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼ（D-Ala D-Ala ligase: DDL）からなる群から選択される少なくとも１つ、具体的には１つ以上、２つ以上、３つ以上又は全ての酵素タンパク質、又はそれと同一及び／もしくは類似の活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。一部のマイコスポリン様アミノ酸は、マイコスポリン−グリシンに２番目のアミノ酸残基を含む。前記非リボソームペプチドシンテターゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素は、マイコスポリン−グリシンに２番目のアミノ酸残基を付加することができる。
一実施例によれば、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、非リボソームペプチドシンテターゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼのように、マイコスポリン−グリシンに２番目のアミノ酸を付加する活性を有する酵素であれば酵素名や由来微生物種はいかなるものでもよい。
一例として、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）内の非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素（Ava_3855）、又はノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）内のＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼ（NpF5597）は、マイコスポリン−グリシンにセリン残基を付加してシノリンを形成させることができる。他の例として、マイコスポリン−２−グリシンは、アファノテーケ・ハロフィチカ（Aphanothece halophytica）内のＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼホモログ（Ap_3855）による２番目のグリシン残基の付加により形成されてもよい。同様に、アクチノシネマ・ミルム（Actinosynnema mirum）においては、Ｄ−アラニンＤ−アラニンリガーゼによりセリン又はアラニンが付加されてシノリン又はマイコスポリン−グリシン−アラニンが形成されてもよい。本発明の一実施例による微生物は、前述した酵素又はそれと同一及び／又は類似の活性を有する酵素から、目的とするマイコスポリン様アミノ酸生産に適したものを選択して含んでもよい。
本発明に用いられる前記２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−Ｎリガーゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素及び／又はＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼは、由来する微生物種が限定されるものではなく、同一及び／又は類似の機能及び役割を有する酵素として公知のものであればいかなるものでもよく、それらの相同性数値範囲も限定されるものではない。例えば、シリンドロスペルマム・スタグナレＰＣＣ７４１７（C. stagnale PCC 7417）のＭｙｌＡ、ＭｙｌＢ、ＭｙｌＤ、ＭｙｌＥ及びＭｙｌＣは、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）及びノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）由来の２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−Ｎリガーゼ及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼに対応し（homologous）、それらの類似度は約６１〜８８％である（非特許文献１７，１４）。すなわち、本発明に用いられる酵素は、同一及び／又は類似の機能及び効果を示すことが知られているものであれば、由来する微生物種や配列相同性が限定されるものではない。また、先行技術文献として挙げた非特許文献は、全て本明細書に参照として含まれる。
また、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、配列番号２、４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２又は１０４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよいが、これらに限定されるものではない。
さらに、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、配列番号２、４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２又は１０４のアミノ酸配列と５０％、６０％又は７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、一層具体的には９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、微生物がマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば、前記相同性を有しないタンパク質をコードするヌクレオチド配列のいかなるものを含んでもよい。具体的には、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、配列番号１、３、８５、８４、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３のヌクレオチド配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
また、前記配列と相同性を有する配列であって、実質的に前述した配列番号のタンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
さらに、前記ヌクレオチド配列は、コドンの縮退（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、マイコスポリン様アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば本発明に全て含まれる。
あるいは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによりマイコスポリン様アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードする配列であれば本発明に全て含まれる。
一実施例によれば、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、由来が異なるマイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子を含んでもよい。
本発明において、タンパク質の不活性化、タンパク質の活性強化及び／又は遺伝子の導入は、順序に関係なく同時、順次、逆順に行われてもよい。
本発明における「マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物」は、前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子を内在的に及び／又は外部から導入して有するので、マイコスポリン様アミノ酸を生産することができ、さらに内在性の３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を不活性化することにより、マイコスポリン様アミノ酸の生産能が向上した微生物であってもよい。前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子の導入と３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼの不活性化は、順序に関係なく同時、順次、逆順に行われてもよい。
また、本発明の微生物は、前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子を本来有する天然の微生物であってもよく、異種及び／又は同種由来マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子が導入された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明の微生物は、内在性及び／又は導入されたマイコスポリン様アミノ酸生合成関連遺伝子がコードする酵素の活性が強化された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明の微生物は、改変前に３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼタンパク質活性を有するものであればいかなるものでもよく、具体的にはコリネバクテリウム属微生物、エシェリキア属微生物又は酵母である。
前記コリネバクテリウム属微生物は、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであり、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これらに限定されるものではない。
前記エシェリキア属微生物は、具体的にはエシェリキア・アルベルティイ（Escherichia albertii）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、エシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）、エシェリキア・ヘルマンニイ（Escherichia hermannii）、エシェリキア・バルネリス（Escherichia vulneris）などであり、より具体的にはエシェリキア・コリであるが、これらに限定されるものではない。
前記酵母は、具体的には子嚢菌門（Ascomycota）であるサッカロミケス亜門（Saccharomycotina）、タフリナ菌亜門（Taphrinomycotina）、又は担子菌門（Basidiomycota）であるハラタケ亜門（Agaricomycotina）、サビキン亜門（Pucciniomycotina）などに属する微生物であり、より具体的にはサッカロマイセス（Saccharomyces）属微生物、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属微生物、ファフィア（Phaffia）属微生物、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属微生物、ピキア（Pichia）属微生物、カンジダ（Candida）属微生物であり、さらに具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であるが、これらに限定されるものではない。
本発明におけるマイコスポリン様アミノ酸を生産する酵母は、前記３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝子が導入されてもよく、３−デヒドロキナ酸シンターゼ活性が強化されてもよい。例えば、前記酵母内の３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ活性を不活性化するためにＡＲＯ１を一部又は全部欠損させると、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）酵素機能が喪失し、３−ＤＨＱを合成することが困難になる。よって、酵母内のＡＲＯ１遺伝子が一部又は全部欠損すると、３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝子（例えば、ａｒｏＢ遺伝子）が導入されるが、これに限定されるものではない。
本発明の他の一態様は、本願の微生物を培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からマイコスポリン様アミノ酸を回収するステップとを含むマイコスポリン様アミノ酸の生産方法を提供する。
「微生物」及び「マイコスポリン様アミノ酸」については前述した通りである。
本発明における「培養」とは、前記微生物を好適に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行われてもよい。このような培養過程は、選択される微生物に応じて当業者が容易に調整して用いることができる。前記微生物を培養するステップは、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行われてもよい。本発明の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば特に限定されるものではなく、いかなるものでも用いることができ、具体的には本発明の微生物を好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内において、好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節して培養することができる。具体的には、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節することができるが、これらに限定されるものではない。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、培養温度は２０〜４５、具体的には２５〜４０に維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよいが、これに限定されるものではない。
さらに、用いられる培養用培地において、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
前記培養により生産されたＭＡＡｓは、培地中に分泌されるか、細胞内に残留する。
本発明における「培地」とは、本願の微生物を培養して得られた産物を意味する。前記培地は、微生物を含む形態、及び前記微生物を含む培養液から遠心分離、濾過などにより微生物を除去した形態をどちらも含む概念である。
本発明の前記培養するステップで生産されたＭＡＡｓを回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法により培養液から目的とするＭＡＡｓを回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養された微生物又は培地から目的とするＭＡＡｓを回収することができる。前記ＭＡＡｓを回収するステップは、分離工程及び／又は精製工程をさらに含んでもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
＜大腸菌由来ＭＡＡｓ生産組換え微生物の作製及びそれを用いたＭＡＡｓ生産＞
微細藻類由来シノリン生合成遺伝子を過剰発現するベクターの作製
Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓベースのシノリン生合成遺伝子クラスターは、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）、Ｃ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）及び非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase）の４つの遺伝子で形成されており、藍藻類の一種であるＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅも、それを用いてシノリンを生産することができる。Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３及びＮ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＡＴＣＣ２９１３３のゲノムＤＮＡを用いてシノリン生合成遺伝子クラスターを同定した。２種のベクターｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｔｒｃ＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ及びｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｃｊ１＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いて、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３及びＮ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＡＴＣＣ２９１３３由来のシノリン生合成遺伝子（Ａｖａ＿ＡＢＣＤ及びＮｐｒ＿ＡＢＣＤ）をそれぞれ含む４種のベクターを作製した。前記４種のシノリン生合成遺伝子発現ベクターの名称とベクターを作製するために用いた各鋳型及びプライマーを表１に示す。
Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓベースのシノリン生合成遺伝子クラスターは、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）、Ｃ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）及び非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase）の４つの遺伝子で形成されており、藍藻類の一種であるＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅも、それを用いてシノリンを生産することができる。Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３及びＮ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＡＴＣＣ２９１３３のゲノムＤＮＡを用いてシノリン生合成遺伝子クラスターを同定した。２種のベクターｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｔｒｃ＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ及びｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｃｊ１＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いて、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３及びＮ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＡＴＣＣ２９１３３由来のシノリン生合成遺伝子（Ａｖａ＿ＡＢＣＤ及びＮｐｒ＿ＡＢＣＤ）をそれぞれ含む４種のベクターを作製した。前記４種のシノリン生合成遺伝子発現ベクターの名称とベクターを作製するために用いた各鋳型及びプライマーを表１に示す。
前記鋳型とプライマーを用いて遺伝子断片を得た。その後、各遺伝子断片は、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｔｒｃ＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ及びｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｃｊ１＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＲ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）を用いてライゲーション（ligation）した。各発現ベクターをｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ、ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ1＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ、ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ｎｐｒ＿ＡＢＣＤ及びｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ1＿Ｎｐｒ＿ＡＢＣＤという。各発現ベクターをシーケンシングにより全て確認した。Ａｖａ＿ＡＢＣＤ及びＮｐｒ＿ＡＢＣＤのヌクレオチド及びアミノ酸配列を配列番号１、２、３及び４に示す。
シノリン生合成遺伝子過剰発現ベクターが導入された菌株のシノリン生産能の評価
大腸菌におけるＭＡＡｓ生産能を確認するために、実施例１で作製した４種のプラスミドを野生型大腸菌であるＷ３１１０菌株に導入してシノリン生合成を強化した菌株を作製した。カナマイシン（kanamycine）を含むＬＢ固体培地にこのように生産した菌株を塗抹し、３７℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍｌの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．３ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．６ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ １．２ｇ／Ｌ，酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表２に示す。
大腸菌におけるＭＡＡｓ生産能を確認するために、実施例１で作製した４種のプラスミドを野生型大腸菌であるＷ３１１０菌株に導入してシノリン生合成を強化した菌株を作製した。カナマイシン（kanamycine）を含むＬＢ固体培地にこのように生産した菌株を塗抹し、３７℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍｌの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．３ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．６ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ １．２ｇ／Ｌ，酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表２に示す。
表２に示すように、Ｗ３１１０にシノリン生合成遺伝子を導入すると、シノリンが生産可能であることが確認された。また、プロモーターの強度を増加（プロモーターＰＣＪ１導入）させると、生合成経路の強化によりシノリン生産量が増加することが確認された。
３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）が不活性化された菌株の作製
微細藻類におけるＭＡＡｓ生合成の１番目の遺伝子であるＡｖａ−Ａは、ｓｈｉｋｉｍａｔｅ経路中のＤＨＱ（3-dehydroquinate）とＰｅｎｔｏｓｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ経路中のＳＨ−７Ｐ（sedoheptulose 7-phosphate）を共有して基質として用いる。ａｒｏＤ遺伝子が欠損して３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）が不活性化された菌株を作製するために、ラムダレッドリコンビナーゼ（lambda red recombinase）による相同組換え法を用いた。遺伝子導入マーカーとしてｐＫＤ３のクロラムフェニコール（chloramphenicol）耐性遺伝子を用い、ａｒｏＤ遺伝子の一部分とｐＫＤ３プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｒｏＤ欠損カセットは、配列番号９（正方向）及び１０（逆方向）のプライマーを用いてＰＣＲにより作製した。ａｒｏＤ遺伝子（配列番号７１及び７２）を欠損させる菌株（野生型大腸菌Ｗ３１１０）を準備し、その後前記菌株にラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を含むｐＫＤ４６プラスミドを形質転換し、ａｒａｂｉｎｏｓｅを用いて当該遺伝子の発現を誘導することによりコンピテント細胞を作製した。前記コンピテント細胞にａｒｏＤ欠損カセットをエレクトロポレーションにより導入し、その後クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌ含むＬＢ固体培地に塗抹した。このようにして得た菌株を配列番号１１（正方向）及び１２（逆方向）のプライマーでＰＣＲし、１３００ｂｐの増幅した断片を観察してａｒｏＤ遺伝子欠損を確認した。
微細藻類におけるＭＡＡｓ生合成の１番目の遺伝子であるＡｖａ−Ａは、ｓｈｉｋｉｍａｔｅ経路中のＤＨＱ（3-dehydroquinate）とＰｅｎｔｏｓｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ経路中のＳＨ−７Ｐ（sedoheptulose 7-phosphate）を共有して基質として用いる。ａｒｏＤ遺伝子が欠損して３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）が不活性化された菌株を作製するために、ラムダレッドリコンビナーゼ（lambda red recombinase）による相同組換え法を用いた。遺伝子導入マーカーとしてｐＫＤ３のクロラムフェニコール（chloramphenicol）耐性遺伝子を用い、ａｒｏＤ遺伝子の一部分とｐＫＤ３プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｒｏＤ欠損カセットは、配列番号９（正方向）及び１０（逆方向）のプライマーを用いてＰＣＲにより作製した。ａｒｏＤ遺伝子（配列番号７１及び７２）を欠損させる菌株（野生型大腸菌Ｗ３１１０）を準備し、その後前記菌株にラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を含むｐＫＤ４６プラスミドを形質転換し、ａｒａｂｉｎｏｓｅを用いて当該遺伝子の発現を誘導することによりコンピテント細胞を作製した。前記コンピテント細胞にａｒｏＤ欠損カセットをエレクトロポレーションにより導入し、その後クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌ含むＬＢ固体培地に塗抹した。このようにして得た菌株を配列番号１１（正方向）及び１２（逆方向）のプライマーでＰＣＲし、１３００ｂｐの増幅した断片を観察してａｒｏＤ遺伝子欠損を確認した。
３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼが不活性化された菌株のシノリン生産能の評価
実施例３で作製したａｒｏＤ遺伝子が欠損した菌株に、実施例１で作製した４種のプラスミドのうちＰＣＪ１プロモーターにより発現が調節される２種のプラスミドを導入し、その後カナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した（Ｗ３１１０ΔａｒｏＤ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ及びＷ３１１０ΔａｒｏＤ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ｎｐｒ＿ＡＢＣＤ）。ａｒｏＤが欠損した菌株とａｒｏＤが欠損していない菌株のそれぞれを３７℃の培養器で一晩培養し、その後２５ｍＬの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．３ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．６ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ １．２ｇ／Ｌ，酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表３に示す。
実施例３で作製したａｒｏＤ遺伝子が欠損した菌株に、実施例１で作製した４種のプラスミドのうちＰＣＪ１プロモーターにより発現が調節される２種のプラスミドを導入し、その後カナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した（Ｗ３１１０ΔａｒｏＤ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ及びＷ３１１０ΔａｒｏＤ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ｎｐｒ＿ＡＢＣＤ）。ａｒｏＤが欠損した菌株とａｒｏＤが欠損していない菌株のそれぞれを３７℃の培養器で一晩培養し、その後２５ｍＬの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４０．３ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．６ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ １．２ｇ／Ｌ，酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表３に示す。
表３に示すように、ａｒｏＤが欠損した菌株から生産されたシノリン濃度は、ａｒｏＤが欠損していない菌株から生産されたシノリン濃度に比べて、それぞれ１９４％及び１８２％増加した。前記ａｒｏＤが欠損した菌株であるＷ３１１０ΔａｒｏＤ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株、Ｗ３１１０ΔａｒｏＤ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ｎｐｒ＿ＡＢＣＤ菌株をそれぞれＣＢ０６−００１７、ＣＢ０６−００１８と命名し、ブダペスト条約に基づいて２０１７年６月２６日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託し、前記記載順にそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２０４４Ｐ、ＫＣＣＭ１２０４５Ｐが与えられた。
２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉ／ＩＩの活性強化菌株の作製
ＭＡＡｓを生産する微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉ／ＩＩの活性を強化した。具体的には、大腸菌Ｗ３１１０由来遺伝子３種、ａｒｏＧ（２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ；配列番号７３及び７４）、ｐｐｓＡ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；配列番号７５及び７６）、ｔｋｔＡ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉ／ＩＩ；配列番号７７及び７８）をさらに導入した。ａｒｏＧ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ遺伝子の強化のために、ｐＳＫＨ１３０−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡプラスミドを作製した。前記ｐＳＫＨ１３０−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡプラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表４に示す。
ＭＡＡｓを生産する微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉ／ＩＩの活性を強化した。具体的には、大腸菌Ｗ３１１０由来遺伝子３種、ａｒｏＧ（２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ；配列番号７３及び７４）、ｐｐｓＡ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；配列番号７５及び７６）、ｔｋｔＡ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉ／ＩＩ；配列番号７７及び７８）をさらに導入した。ａｒｏＧ、ｐｐｓＡ、ｔｋｔＡ遺伝子の強化のために、ｐＳＫＨ１３０−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡプラスミドを作製した。前記ｐＳＫＨ１３０−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡプラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表４に示す。
前記鋳型及びプライマーを用いてａｒｏＧ、ｐｐｓＡ及びｔｋｔＡのそれぞれの遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し、その後ＢａｍＨ１−Ｐｓｔ１制限酵素で切断したｐＳＫＨ１３０−ΔｆｈｕＡベクターにそれぞれ導入した。前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後野生型大腸菌Ｗ３１１０及びａｒｏＤが欠損した大腸菌Ｗ３１１０ΔａｒｏＤ菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換した遺伝子は、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミド部位を除去（excision）した。前記２次組換えが完了した大腸菌形質転換株は、配列番号１９（正方向）及び２０（逆方向）のプライマーを用いてａｒｏＧ、ｐｐｓＡ及びｔｋｔＡ遺伝子導入を確認した。
２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ Ｉ／ＩＩの活性強化菌株のシノリン生産能の評価
実施例５で作製したａｒｏＧ、ｐｐｓＡ及びｔｋｔＡ遺伝子導入菌株に、実施例１で作製した４種のうちＰＣＪ１プロモーターにより発現が調節される２種のプラスミドをそれぞれ導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後実施例４の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表５に示す。
実施例５で作製したａｒｏＧ、ｐｐｓＡ及びｔｋｔＡ遺伝子導入菌株に、実施例１で作製した４種のうちＰＣＪ１プロモーターにより発現が調節される２種のプラスミドをそれぞれ導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後実施例４の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表５に示す。
表５に示すように、遺伝子３種（ａｒｏＧ，ｐｐｓＡ，ｔｋｔＡ）が強化された菌株から生産されたシノリン濃度は、対照群に比べて約３００％増加した。
ａｖａ＿ＡＢＣＤ染色体挿入ベクター及び菌株の作製
大腸菌にシノリン生合成遺伝子を導入するために、ｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ａｖａ−ＡＢＣＤプラスミドを作製した。ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号２１（正方向）及び２２（逆方向）のプライマー対を用いてＡｖａ＿ＡＢＣＤをＰＣＲした。約７ｋｂのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩとＰｓｔＩ制限酵素で処理したｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clontech）ライゲーションしてｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。その後、Ａｖａ−ＡＢＣＤの発現量を調節するために、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、並びに配列番号２５及び２７の正方向及び逆方向プライマー対でそれぞれＰｔｒｃ、ＰＣＪ１、プロモーター断片をＰＣＲし、それらをＳｃａＩ制限酵素で処理したｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ａｖａ＿ＡＢＣＤベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clontech）ライゲーションしてｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ｐｔｒｃ−Ａｖａ−ＡＢＣＤ、ｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：ＰＣＪ１−Ａｖａ−ＡＢＣＤを作製した。前記組換えプラスミドを実施例５で作製したＷ３１１０ΔａｒｏＤΔｆｈｕＡ：：Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡ菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からターゲット遺伝子以外のベクター部分を除去（excision）した。
大腸菌にシノリン生合成遺伝子を導入するために、ｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ａｖａ−ＡＢＣＤプラスミドを作製した。ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号２１（正方向）及び２２（逆方向）のプライマー対を用いてＡｖａ＿ＡＢＣＤをＰＣＲした。約７ｋｂのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩとＰｓｔＩ制限酵素で処理したｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clontech）ライゲーションしてｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。その後、Ａｖａ−ＡＢＣＤの発現量を調節するために、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、並びに配列番号２５及び２７の正方向及び逆方向プライマー対でそれぞれＰｔｒｃ、ＰＣＪ１、プロモーター断片をＰＣＲし、それらをＳｃａＩ制限酵素で処理したｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ａｖａ＿ＡＢＣＤベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clontech）ライゲーションしてｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：Ｐｔｒｃ−Ａｖａ−ＡＢＣＤ、ｐＳＫＨ１３０ΔｐｉｎＲ：：ＰＣＪ１−Ａｖａ−ＡＢＣＤを作製した。前記組換えプラスミドを実施例５で作製したＷ３１１０ΔａｒｏＤΔｆｈｕＡ：：Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡ菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からターゲット遺伝子以外のベクター部分を除去（excision）した。
前記２次組換えが完了した大腸菌形質転換株を対象に、配列番号２８（正方向）及び２９（逆方向）のプライマーを用いたＰＣＲによりＡｖａ＿ＡＢＣＤ遺伝子導入を確認した。
ａｖａ＿ＡＢＣＤ染色体挿入菌株のシノリン生産能の評価
実施例７で作製した菌株をＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃の培養器で一晩培養した。その後、実施例４の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表６に示す。
実施例７で作製した菌株をＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃の培養器で一晩培養した。その後、実施例４の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表６に示す。
表６に示すように、Ａｖａ−ＡＢＣＤを染色体上に導入すると、シノリンが生産されることが確認され、プロモーターの強度に応じた濃度の増加が確認された。しかし、プラスミドで生合成を強化した菌株に比べてシノリン生産量が減少することが確認された。染色体上でＡｖａ−ＡＢＣＤを導入した菌株にｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドをさらに導入すると、染色体にのみ導入した菌株（ＣＪ１プロモーター基準）、プラスミドのみ導入した菌株に比べて、シノリン生産量がそれぞれ３５３％、１５２％増加することが観察された。
ＭＡＡｓ遺伝子過剰発現ベクターの作製及びＭＡＡｓ生産能の評価
４−デオキシガズソール（4-Deoxygadusol）及びマイコスポリングリシン（Mycosporine glycine）は、シノリン生合成過程で生成される中間産物であると同時に紫外線遮断効能を有するＭＡＡである。大腸菌ＡｒｏＤを欠損させた菌株においてこの物質が生産可能か否かを確認するためのベクターを作製した。それを表７に示す。
４−デオキシガズソール（4-Deoxygadusol）及びマイコスポリングリシン（Mycosporine glycine）は、シノリン生合成過程で生成される中間産物であると同時に紫外線遮断効能を有するＭＡＡである。大腸菌ＡｒｏＤを欠損させた菌株においてこの物質が生産可能か否かを確認するためのベクターを作製した。それを表７に示す。
ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号３０及び３１、配列番号３０及び３２のプライマー対を用いてＰｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢ及びＰｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣをＰＣＲした。ＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ１１７ Ｐｒｃ ＧＦＰベクターにライゲーションしてｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢ及びｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣを作製した。また、同様にｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号３０及び３１、配列番号３０及び３２のプライマー対を用いてＰＣＲした断片をＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ１１７ Ｐｃｊ１ ＧＦＰベクターにライゲーションしてｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢ及びｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣを作製した。前記Ａｖａ＿ＡＢとＡｖａ＿ＡＢＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号８５〜８８に示す。
このように作製したベクターは、実施例８において用いたＷ３１１０ΔａｒｏＤΔｆｈｕＡ：：Ｐｎ−ａｒｏＧ−Ｐｎ−ｐｐｓＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡ菌株に通常用いられる電気パルス法で形質転換し、各菌株をＬＢ固体培地にそれぞれ塗抹し、３７℃の培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を実施例４の２５ｍＬの力価培地に接種し、温度３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養し、培養終了後に液体高速クロマトグラフィーを用いてＭＡＡｓの生産量を測定した。実験した各菌株における培養液中のＭＡＡｓ濃度を表８に示す。
表８に示すように、Ａｖａ＿ＡＢ及びＡｖａ＿ＡＢＣ遺伝子を導入すると４−Ｄｅｏｘｙｇａｄｕｓｏｌ及びＭｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ ｇｌｙｃｉｎeが生産されることが確認され、プロモーターの強度を強化するとその量も増加することが確認された。
＜コリネバクテリウム・グルタミカム由来ＭＡＡｓ生産組換え微生物の作製及びそれを用いたＭＡＡｓ生産＞
シノリン生合成遺伝子過剰発現ベクター導入菌株のシノリン生産能の評価
コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＭＡＡｓ生産能を確認するために、実施例１で作製した４種のプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２菌株に導入してシノリン生合成を強化した菌株を作製し、Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅを含むＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。ＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，酵母抽出物５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表９に示す。
コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＭＡＡｓ生産能を確認するために、実施例１で作製した４種のプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２菌株に導入してシノリン生合成を強化した菌株を作製し、Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅを含むＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。ＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，酵母抽出物５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表９に示す。
表９に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２にシノリン生合成遺伝子を導入すると、シノリンが生産可能であることが確認され、プロモーターの強度に応じて生産量が３７５％まで増加することが確認された。
シノリン生合成遺伝子染色体導入ベクターの作製及び菌株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカムにシノリン生合成遺伝子を導入するために、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドを作製した。ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号３３（正方向）及び３４（逆方向）のプライマー対を用いてＡｖａ＿ＡＢＣＤをＰＣＲした。約７ｋｂのＰＣＲ断片をＮｄｅＩ制限酵素で処理したｐＤＣ ΔＮ１０２１ベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clonteh）ライゲーションしてｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。その後、Ａｖａ＿ＡＢＣＤの発現量を調節するために、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、並びに配列番号３９及び４０の正方向及び逆方向プライマー対でＣＪ７、Ｌｙｓｃ８、Ｏ２プロモーター断片をＰＣＲし、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤをＮｄｅＩ制限酵素で処理したベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clonteh）ライゲーションしてｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ｐｃｊ７＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ｐｌｙｓｃ８＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。
コリネバクテリウム・グルタミカムにシノリン生合成遺伝子を導入するために、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドを作製した。ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号３３（正方向）及び３４（逆方向）のプライマー対を用いてＡｖａ＿ＡＢＣＤをＰＣＲした。約７ｋｂのＰＣＲ断片をＮｄｅＩ制限酵素で処理したｐＤＣ ΔＮ１０２１ベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clonteh）ライゲーションしてｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。その後、Ａｖａ＿ＡＢＣＤの発現量を調節するために、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、並びに配列番号３９及び４０の正方向及び逆方向プライマー対でＣＪ７、Ｌｙｓｃ８、Ｏ２プロモーター断片をＰＣＲし、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤをＮｄｅＩ制限酵素で処理したベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎ（clonteh）ライゲーションしてｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ｐｃｊ７＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿Ｐｌｙｓｃ８＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ、ｐＤＣ ΔＮ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。
前記組換えプラスミドを野生のコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し（van der Rest et al. 1999）、前記プラスミドは、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミドを除去（excision）した。
前記２次組換えが完了したコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、各遺伝子特異的プライマー（gene-specific primer）対である配列番号３３及び３４を用いたＰＣＲによりＡｖａ＿ＡＢＣＤ遺伝子の導入を確認した。
シノリン生合成遺伝子染色体導入菌株のシノリン生産能の評価
シノリン生産能を確認するために、全ての菌株をＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。ＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を実施例１１の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１０に示す。
シノリン生産能を確認するために、全ての菌株をＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。ＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を実施例１１の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１０に示す。
表１０に示すように、シノリン生合成遺伝子を野生型コリネバクテリウムに１ｃｏｐｙ導入すると、３６ｍｇ〜１７３ｍｇ生産できることが確認された。
コリネバクテリウムａｒｏＤ（３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）欠損ベクター及び菌株の作製
実施例３と同様に、ａｒｏＤ（３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の欠損によりシノリン生産量が増加するか否かを確認するために欠損菌株を作製した。コリネバクテリウム・グルタミカムの部位特異的ａｒｏＤ遺伝子（配列番号７９及び８０）欠失菌株を作製するために、ａｒｏＤのオープンリーディングフレーム（open reading frame）が内部で欠失したｐＤＣ−ΔａｒｏＤプラスミドを作製した。前記ｐＤＣ−ΔａｒｏＤの内部での遺伝子消失は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１及び４２、並びに配列番号４３及び４４の正方向及び逆方向プライマー対で交差ＰＣＲを行って生成した遺伝子断片をｐＤＣベクターに導入することにより作製した。前記組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２ ΔＮ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤにエレクトロポレーションにより形質転換し（van der Rest et al. 1999）、前記プラスミドは、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミドを除去（excision）した。
実施例３と同様に、ａｒｏＤ（３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）の欠損によりシノリン生産量が増加するか否かを確認するために欠損菌株を作製した。コリネバクテリウム・グルタミカムの部位特異的ａｒｏＤ遺伝子（配列番号７９及び８０）欠失菌株を作製するために、ａｒｏＤのオープンリーディングフレーム（open reading frame）が内部で欠失したｐＤＣ−ΔａｒｏＤプラスミドを作製した。前記ｐＤＣ−ΔａｒｏＤの内部での遺伝子消失は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１及び４２、並びに配列番号４３及び４４の正方向及び逆方向プライマー対で交差ＰＣＲを行って生成した遺伝子断片をｐＤＣベクターに導入することにより作製した。前記組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２ ΔＮ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤにエレクトロポレーションにより形質転換し（van der Rest et al. 1999）、前記プラスミドは、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミドを除去（excision）した。
前記２次組換えが完了したコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、各遺伝子特異的プライマー（gene-specific primer）対である配列番号４１及び４４を用いたＰＣＲによりａｒｏＤ遺伝子の欠失を確認した。
コリネバクテリウムａｒｏＤ（３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）欠損の評価
コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２ ΔＮ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株のデヒドロキナ酸デヒドラターゼが欠損してＤＨＱが蓄積されるであろうと予想される菌株をＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。ＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，酵母抽出物５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１１に示す。
コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２ ΔＮ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株のデヒドロキナ酸デヒドラターゼが欠損してＤＨＱが蓄積されるであろうと予想される菌株をＢＨＩＳ固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。ＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地［培地の組成：ブドウ糖４０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，酵母抽出物５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１１に示す。
表１１に示すように、ａｒｏＤを欠損すると、シノリン濃度が対照群に比べて２３９％増加し、ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤで生合成をさらに強化すると、それに伴ってシノリン濃度が増加することが確認された。前記ａｒｏＤが欠損した菌株、ｃ．ｇｌ １３０３２ Ｎ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ＿ΔａｒｏＤをＣＢ０６−００１９と命名し、ブダペスト条約に基づいて２０１７年６月２６日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託番号ＫＣＣＭ１２０４６Ｐとして寄託した。
＜Ｙｅａｓｔ由来ＭＡＡｓ生産組換え微生物の作製及びそれを用いたＭＡＡｓ生産＞
微細藻類由来シノリン生合成遺伝子過剰発現ｙｅａｓｔベクターの作製
Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３及びＮ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＡＴＣＣ２９１３３ゲノムＤＮＡを用いてシノリン生合成遺伝子が導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅベクターを作製した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ、ＴＥＦ、ＧＰＤプロモーターを用いてベクターを作製した。全２４種のシノリン生合成遺伝子発現ベクターを作製するために用いた各鋳型及びプライマーを表１２に示す。Ａｖａ＿Ａ、Ａｖａ＿Ｂ、Ａｖａ＿Ｃ、Ａｖａ＿Ｄ、Ｎｐｒ＿Ａ、Ｎｐｒ＿Ｂ、Ｎｐｒ＿Ｃ、Ｎｐｒ＿Ｄのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を前記酵素の順に配列番号８９〜１０４に示す。
Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３及びＮ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＡＴＣＣ２９１３３ゲノムＤＮＡを用いてシノリン生合成遺伝子が導入されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅベクターを作製した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ、ＴＥＦ、ＧＰＤプロモーターを用いてベクターを作製した。全２４種のシノリン生合成遺伝子発現ベクターを作製するために用いた各鋳型及びプライマーを表１２に示す。Ａｖａ＿Ａ、Ａｖａ＿Ｂ、Ａｖａ＿Ｃ、Ａｖａ＿Ｄ、Ｎｐｒ＿Ａ、Ｎｐｒ＿Ｂ、Ｎｐｒ＿Ｃ、Ｎｐｒ＿Ｄのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を前記酵素の順に配列番号８９〜１０４に示す。
鋳型とプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ技法により得た遺伝子断片とＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ制限酵素で処理したｐ４１３／４１４／４１５／４１６−ｐＡＤＨ／ｐＴＥＦ／ｐＧＰＤ−ＣＹＣ１＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒベクターをＴ４ ｌｉｇａｓｅ酵素（ＮＥＢ）によりライゲーションしてｐ４１３／４１４／４１５／４１６−ｐＡＤＨ／ｐＴＥＦ／ｐＧＰＤ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄベクター２４種を作製した。各発現ベクターの作製の有無及び遺伝子配列はシーケンシング法で全て確認した。前述したように作製した発現ベクターを野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に導入してシノリンを生産する菌株を作製した。
シノリン生合成遺伝子過剰発現ベクター導入菌株のシノリン生産能の評価
ＹｅａｓｔにおけるＭＡＡｓ生産能を確認するために、サッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ）菌株に実施例１５で作製した２４種のプラスミドを導入してシノリン生合成を強化した菌株を作製し、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。その後、一晩培養した菌株を表１３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３０、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表１４に示す。
ＹｅａｓｔにおけるＭＡＡｓ生産能を確認するために、サッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ）菌株に実施例１５で作製した２４種のプラスミドを導入してシノリン生合成を強化した菌株を作製し、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。その後、一晩培養した菌株を表１３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３０、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表１４に示す。
これらの結果から、酵母菌株であるサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１ＤにおいてＡｖａ Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤよりＮｐｒ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ遺伝子のほうが活性が高いことが確認された。また、プロモーターの強度に応じて遺伝子の発現量が調節され、それに伴ってシノリン生産量が変化することが確認された。特に、ＧＰＤ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）プロモーターベースのＮｐｒ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄベクターを導入すると、シノリン生産量が５２１ｍｇ／ｌであり、最も高いことが確認された。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＲＯ１欠損及び大腸菌ａｒｏＢ導入によるｓｈｉｎｏｒｉｎｅ生産量の増加
Ｙｅａｓｔにおいて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ不活性によりシノリンの生産能が向上するか否かを確認するために、サッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１ＤからＡＲＯ１遺伝子を欠損させた。前記サッカロマイセス・セレビシエのＡＲＯ１遺伝子は５つの機能を有する遺伝子であり、ＡＲＯ１を欠損させると大腸菌ａｒｏＢに該当する３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）酵素機能が喪失し、３−ＤＨＱを合成することができなくなる。よって、染色体上で大腸菌ａｒｏＤ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅであるサッカロマイセス・セレビシエＡＲＯ１遺伝子（配列番号８１及び８２）を欠損させ、その後同一位置にＧＰＤプロモーターベースの大腸菌ａｒｏＢ遺伝子（配列番号８３及び８４）を挿入した。用いた各鋳型及びプライマーを表１５に示す。ＡＲＯ１が欠損して大腸菌ａｒｏＢ遺伝子が導入されたサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に実施例１５で作製した２４種のプラスミドを導入し、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。その後、一晩培養した菌株を表１３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３０、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表１６に示す。
Ｙｅａｓｔにおいて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ不活性によりシノリンの生産能が向上するか否かを確認するために、サッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１ＤからＡＲＯ１遺伝子を欠損させた。前記サッカロマイセス・セレビシエのＡＲＯ１遺伝子は５つの機能を有する遺伝子であり、ＡＲＯ１を欠損させると大腸菌ａｒｏＢに該当する３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）酵素機能が喪失し、３−ＤＨＱを合成することができなくなる。よって、染色体上で大腸菌ａｒｏＤ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅであるサッカロマイセス・セレビシエＡＲＯ１遺伝子（配列番号８１及び８２）を欠損させ、その後同一位置にＧＰＤプロモーターベースの大腸菌ａｒｏＢ遺伝子（配列番号８３及び８４）を挿入した。用いた各鋳型及びプライマーを表１５に示す。ＡＲＯ１が欠損して大腸菌ａｒｏＢ遺伝子が導入されたサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に実施例１５で作製した２４種のプラスミドを導入し、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、３０培養器で一晩培養した。その後、一晩培養した菌株を表１３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、３０、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表１６に示す。
表１６に示すように、ＡＲＯ１が欠損し、大腸菌ａｒｏＢ遺伝子が導入され、３−ＤＨＱ生産能が強化された菌株において、ＷＴに比べてシノリン生産量が３倍以上増加することが確認された。Ａｖａ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄに比べてＮｐｒ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ遺伝子の活性が高いことがさらに確認され、プロモーターの強度が増加するにつれてシノリン生産量が増加することが確認された。特に、ＧＰＤプロモーターベースのＮｐｒ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄベクターを導入すると、シノリン生産量が１．６ｇ/Ｌであり、最も高いことが確認された。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Claims (7)
- ３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のタンパク質活性が非改変微生物に比べて不活性化され、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子を含み、前記マイコスポリン様アミノ酸が、マイコスポリン−２−グリシン（Mycosporine-2-glycine）、パリチノール（Palythinol）、パリテン酸（Palythenic acid）、デオキシガズソール（deoxygadusol）、マイコスポリン−メチルアミン−トレオニン（Mycosporine-methylamine-threonine）、マイコスポリン−グリシン−バリン（Mycosporine-glycine-valine）、パリチン（Palythine）、アステリナ−３３０（Asterina-330）、シノリン（Shinorine）、ポルフィラ−３３４（Porphyra-334）、オイハロテセ−３６２（Euhalothece-362）、マイコスポリン−グリシン（Mycosporine-glycine）、マイコスポリン−オルニチン（Mycosporine-ornithine）、マイコスポリン−リシン（Mycosporine-lysine）、マイコスポリン−グルタミン酸−グリシン（Mycosporine-glutamic acid-glycine）、マイコスポリン−メチルアミン−セリン（Mycosporine-methylamine-serine）、マイコスポリン−タウリン（Mycosporine-taurine）、パリテン（Palythene）、パリテン−セリン（Palythine-serine）、パリテン−セリン−サルフェート（Palythine-serine-sulfate）、パリチノール（Palythinol）及びウスジレン（Usujirene）からなる群から選択される少なくとも１つである、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
- 前記微生物は、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）及びＣ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
- 前記微生物は、非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase）、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素（non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme）及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼ（D-Ala D-Ala ligase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
- 前記微生物は、さらに２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）、トランスケトラーゼ（transketolase I/II）及び３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質活性が非改変微生物より強化された、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物、エシェリキア属微生物又は酵母である、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
- 前記酵母は、３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）をコードする遺伝子が導入されたものである、請求項５に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物を培養するステップと、
前記培養した微生物又は培地からマイコスポリン様アミノ酸を回収するステップとを含む、マイコスポリン様アミノ酸の生産方法。
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